Summary
'Germinosomes' 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.
Abstract
포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 그들의 미세한 분석에 어려움이 발생할. 슈퍼 해상도 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM)이이 장애물을 극복 하 고 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 발 아 과정의 분자 세부 정보를 공개 하는 유망한 도구입니다. 여기, 우리는 수정 된 SIMcheck (ImageJ)를 사용 하 여 설명-보조 3D 이미징 프로세스 및 형광 기자 단백질 B. subtilis 포자 germinosomes, 발 아 단백질의 클러스터의 시뮬레이션입니다. 우리는 또한 FM4-64 B. subtilis 포자 막의 얼룩에 대 한 (표준) 3D 시뮬레이션 이미징 절차를 제시. 이 절차를 사용 하 여 우리는 germinosome 지역화에 대 한 탁월한 해상도 얻을 하 고 표시 > B. subtilis KGB80 정의 된 최소 MOPS 매체에 포자 형성 후 얻은 휴면 포자의 80%는 하나 또는 두 개의 식도 GFP와 GerKB-mCherry 포커스입니다. 밝은 foci에서 관찰된 FM4-64 스테인드 포자 3D 시뮬레이션 이미지 내부 막 지질 도메인 가능성이 다른 유동성의 존재를 제안 했다. 공동 지역화를 평가 하 고 따라서 내부 포자 막에서 균 발 아 단백질의 조직에 대 한 최적의 개요를 얻을을 더블 라벨 막 염료와 germinosome 프로시저 기자 단백질을 사용 하는 연구는 더 가능.
Introduction
Bacillales 및 Clostridiales의 포자 metabolically 휴면 하 고 가혹한 오염 정권에 매우 저항력이 있지만 그들은 발 아 하지 않는 인간1해로운 효과 일으킬 수 없습니다. 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 영양소 germinant 트리거 발 아, 개시 이벤트는 germinant 수용 체 (GRs) 포자의 내부 막 (IM)에 위치한 germinant 바인딩입니다. 그 후,는 GRs transduce 메신저에 있는 또한 SpoVA 채널 단백질에 신호. 이 포자 코어 피리 딘-2, 6-dicarboxylic 산 (dipicolinic 산; 교류의 결과 DPA; 포자 코어 건조 중량의 20% 함유) SpoVA 채널을 통해 물에 대 한. 그 후, DPA 릴리스 트리거 피 peptidoglycan 가수분해의 활성화 고 추가 물 통풍 관2,,34. 이러한 이벤트 코트 레이어, 그것의 연속적인 파열, 파생물의 발병에 기계적 스트레스를 리드 하 고, 마지막으로, 식물 성장. 그러나, 발 아 과정의 정확한 분자 세부 정보는 여전히 멀리에서 해결 되었습니다.
포자 발 아에 대 한 주요 질문 임 발 아 단백질 IM SpoVA 채널 단백질 주변의 지질 생물 속성을 염려 한다. 이 크게 움직이지 IM 지질 bilayer 일부는 포자 코어 또는 식물 세포 세포질5,6에 그들의 활동을 발휘 하는 독성 화학 방부 제, 포함 하는 많은 작은 분자에 대 한 주요 침투성 방 벽 이다. 메신저5모바일 지질의 중요 한 일부분 이지만 메신저 지질 bilayer 젤 상태에서 가능성이 높습니다. 포자의 메신저는 또한 중요 한 확장5에 대 한 잠재력이 있다. 따라서, 메신저의 표면적 증가 하면 추가 막 합성 없이 발 아 시이 막의 특성 낮은 침투성 및 지질 부동5,6의 손실에 의해 동반입니다.
B. subtilis 포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 도전을 제기 발 아 단백질의 활성화 및 포자에 IM 지질 조직 분자 세부 연구를 위한 매력적인 주제는, 에 현미경 분석입니다. 그리피스 그 외 여러분 epifluorescence 현미경 증거 돋보이는, B. subtilis 포자에 비 계 단백질 식도 3 GR 소 단위 (A, B 및 C) 게 라, B 및 K GRs 구성 제안 형광 기자 발 아 단백질, 융합을 사용 하 여 클러스터7에서. 그들은 발 아 단백질의이 클러스터에 대 한 'germinosome' 라는 용어를 만들어낸 고 ~ 300 nm 큰 메신저 단백질 foci8구조 설명. 포자 발 아의 시작, 시와 형광 패턴, 분산 foci 궁극적으로 변화에 더 큰 형광 germinosome > 포자에이 패턴을 표시 하는 포자 인구의 75% L valine81 h에 대 한 출 아 했다. Note 사용 위에서 언급 한 종이 이미지 사진의 연속 형광, 통계 전원 낮은 형광 신호 이미징 동안 관찰의 장애물을 극복 하기를 수십에서 평균. 세균성 포자에 이러한 구조의이 시각화 했다 이란 기술적으로 가능한 클래식 미세한 도구와 단일 포자에서 foci의 금액의 두 평가의 가장자리에도 그들의 더 상세한 subcellular 지 방화 했다 이 방법으로 가능 합니다.
여기, 우리 상세한 시각화를 구조화 조명 현미경 (SIM)의 사용 및 B. subtilis, 뿐만 아니라 그들의 IM 지질 도메인9의 포자에서 germinosome(s)의 정량화를 보여 줍니다. 프로토콜은 또한 ImageJ10,,1112뿐만 아니라 포자 형성, 슬라이드 준비와 SIMcheck (v1.0, imageJ 플러그인) 이미지 분석에 대 한 지침을 포함합니다.
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Protocol
1. B. subtillis 포자 형성 (타이밍: 현미경 관찰 하기 전에 7 일)
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주 1
- Luria Bertani 국물 (파운드) 한 천 격판덮개 (1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 1 %NaCl, 1 %agar)13 에 세균성 문화를 행진 하 고 단일 식민지를 37 ° C에서 밤새 품 어. B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이, 게르트 gfp 칸) 긴장을 사용 하 여 그 부모 배경 스트레인 B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) 앞에서 설명한7.
참고: ΔcotEΔgerE 배경으로 포자를 사용 하 여 최소화 포자 외 투 레이어7의 autofluorescence germinosome 시각화에 필수적 이다. - 모든 미디어, 튜브, pipets 및 다른 문화 자료 적절 한 방법으로 사용할 수를 소독.
- Luria Bertani 국물 (파운드) 한 천 격판덮개 (1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 1 %NaCl, 1 %agar)13 에 세균성 문화를 행진 하 고 단일 식민지를 37 ° C에서 밤새 품 어. B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이, 게르트 gfp 칸) 긴장을 사용 하 여 그 부모 배경 스트레인 B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) 앞에서 설명한7.
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주 2
- 이른 아침에에서 단일 식민지 파운드 매체의 5 mL에 접종 하 고 OD600 0.3-0.4 (약 7 h)를 도달할 때까지 200 rpm/min와 37 ° C에서 스크류 캡 튜브에 지속적인 동요에서 문화를 품 어.
- MOPS 매체 (pH 7.5)의 500 mL를 만들기 포함 3 nM (NH4)6개월7O24·4H2O, 0.4 μ M H3보3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1.32 m K m2HPO4, 0.4 m m MgCl2·6H2O, 0.276 m K m2이렇게4, 0.01 m m FeSO4·7H2O, O20.14 m m CaCl2·2H 80 m m MOPS 변경, 4 m m Tricine, 0.1 m m MnCl2·2H2O 10 m m D-포도 당-토스, 그리고 10 mM NH4Cl
- 스크류 캡 튜브 10-1-5 mL에 파운드 문화의 10-7 직렬 희석에에서 MOPS 매체를 준비 하 고 하룻밤 200 rpm/min와 37 ° C에서 연속 교 아래 문화를 품 어
참고: 여기 준비 직렬 희석 다음 날 아침에 일찍 지 수 단계에 희석을 목표로 합니다. 이 단계와 다음 단계는 MOPS 버퍼링 된 성장 매체에 맞게 셀 수 있도록 필요.
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3 일
- 0.3-0.4의 OD600 와 MOPS 희석 중 하나를 선택 합니다. 미리 데워 진 (37 ° c) MOPS 매체의 20 mL 원뿔 250 mL 플라스 크에 문화의 0.2 mL를 접종 하 고 OD600 0.3-0.4 (~ 7 h)를 도달할 때까지 지속적인 동요에서 품 어.
- 1% (v/v) 사전 문화 단계의 1.3.1 MOPS 기반으로 포자 형성 매체 (250 mL)을 inoculate 하 고 지속적인 동요에서 원뿔 리터 플라스 크에서 37 ° C에서 3 일 동안 품 어. FM4-64 PS4150 포자의 얼룩, 2 µ g/mL FM4-64 프로브 ( 재료의 표참조) 포자 형성 매체 1 또는 2 h 피크의 식물 성장 (일반적으로 약 2) OD600 값에 도달 하면 추가 허용 하는 문화 이후 빛5에서 그것을 보호 하는 동안 sporulate.
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제 7 일: 포자의 수확
- 100 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 구별 단계 어두운 세포에서 단계 밝은 포자와 포자 가능성이 비 성숙 하 포자 형성 수확량 (포자 vs 식물 세포)를 결정 합니다. 90% 단계 밝은 포자 수확량으로 예상 된다.
- 둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 4 ° C에서 15 분 동안에 4,270 x g 에서 포자 작은 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 ( 재료의 표참조)에 2-3 회 살 균 매우 순수한 타입 1 광된 물 40 mL와 포자 펠 릿을 세척. 스핀-다운 4,270 x g 15 분 (4 ° C)에서 각 세척에.
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제 7 일: 포자 정화
- 정화 포자: 포자 펠 릿 20% 비 밀도 그라데이션 매체의 750 µ L에서 일시 중지 ( 재료의 표참조) 소독된 microcentrifuge 튜브에 50% 비 밀도 그라데이션 매체의 800 µ L에 로드. 60 분 21500 x g에서 원심 분리기. 얻은 펠 릿 무료 포자를 포함 합니다. 20% 비 밀도 그라데이션 매체의 200 µ L에서 포자 펠 릿을 일시 중단 하 고 50% 비 밀도 그라데이션 매체는 microcentrifuge와 21500 x g에서 15 분 동안 원심 분리기의 1 mL에 로드 합니다.
- 세척 최종 포자 준비 및 저장: 순화 된 휴면 포자 얻은 펠 릿에 포함 되어 있습니다. 워시 2-3 회 살 균 매우 순수한 타입 1의 1.5 mL와 포자 펠 릿 물 ( 재료의 표참조) 및 스핀-다운 사이 9560 x g 4 ° c.에 15 분에서 마지막으로, 대략 30의 최종 세600 살 균 매우 순수한 타입 1 물에 펠 릿을 일시 중단 합니다. 포자의 aliquots 8 주14-80 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. decoating
- PS4150 포자를 치료와 0.1 m M NaCl/0.1 M NaOH/1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) / 1 h. 70 ° C에서 0.1 M dithiothreitol (DTT) 세척 소독된 매우 순수한 타입 1 물15,16와 10 번 포자. 이렇게 함으로써, 어떤 FM4-64 프로브 포자의 외부 막에 흡착 하 고 외부 레이어를 제거 됩니다.
3. Coverslip 및 슬라이드 준비11 (타이밍: 관찰 하기 전에 1 시간)
- 정리 전 높은 정밀도 coverslips ( 재료의 표참조) 부드럽게 흔들어 물 욕조에 30 분 동안 1 M HCl와. 매우 순수한 타입 1 물에 두 번 coverslips를 세척 하 고 100% (vol/vol) EtOH에에서 저장. 그들은 건조 하 고 사용 하기 전에 그들의 선명도 확인 하자. 70%의 유리 슬라이드를 미리 청소 EtOH. 그들은 건조 하 고 사용 하기 전에 그들의 선명도 확인 하자.
4. 샘플링 형광 스피어 또는 포자 진 프레임에서 슬라이드10 (15 분 타이밍)
- 미리 두 70 %EtOH 청소 따뜻한 고 말린된 유리 슬라이드 ( 재료의 표참조) 70 ° C가 열 블록에 몇 초 동안, 한 유리 슬라이드 위에 70 ° C에서 개최 하는 멸 균된 2 %agarose 65 μ 드롭 공기와 agarose b 확산 위에 다른 유리 슬라이드를 배치 etween 슬라이드. Agarose 패치는 약 5 분에 건조 됩니다.
- 유리 슬라이드 중 하나를 제거한 후 agarose 패치를 1 x 1 cm 섹션에 잘라, 형광 스피어 (~ 108/mL의 포자), 샘플의 0.4 μ를 추가 하 고 패치에 coverslip 배치 하 여 높은 정밀도 coverslip에 패치를 전송 및 떨어져 슬라이딩.
- 에 coverslip 현미경 검사 법에 사용 하기 위해 슬라이드를 따라서 완료 프레임의 모든 모서리를 닫는 배치는 말린된 슬라이드에 유전자 프레임 (1.5 x 1.6 cm2, 65 µ L)를 수정 합니다.
5. 영상11,17(타이밍: 1 시간)
- 빨간색의 혼합 뿐만 아니라 포자의 전송 및 형광 이미지를 캡처하고 구조화 조명 현미경에 카복실산 수정 형광 스피어 노란색-녹색 석유 객관적인 (x 100 장착 ( 자료의 표참조) 수 가늠 구멍 = 1.49), CCD 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어 ( 재료의 표참조). 주변광의 방해 없이 실 온에서 모든 이미지를 생성 합니다. 항상 객관적이 고 슬라이드 이미징 하기 전에 75% 에탄올 x 100를 청소 있는지 확인 합니다.
- 100 nm (직경) 형광 스피어에 집중 하 고 대칭 psf 이미지의 최소화 얻을 때까지 100 x 목표의 수정 반지를 조정 하 여 점 퍼짐 기능 (psf)를 최적화. Psf는 임펄스 응답 또는 포인트 소스 또는 지점 개체에 대 한 이미징 시스템의 응답.
- 약 10 라운드 형광 스피어와 보기의 필드를 선택 합니다. 격자를 적용 초점 모두 561에 대 한 조정 및 이미지 분석 소프트웨어에 대 한 가이드로 488 nm 여기 웨이브 길이.
- 전송 빛 포자를 집중 하 고 각 이미지에 대 한 200 ms 노출으로 16 × 평균 모드에서 전송 빛 이미지를 캡처.
- 14-비트, 그리고 175에서 EM 이득에서 조명 모드 "3D-SIM", 판독 모드 전자 멀티 (EM) 이득 10 MHz에 카메라 설정 포자의 3D 시뮬레이션 원시 형광 이미지를 캡처하십시오. 20% 레이저 전력, 561 nm 레이저 빛 PS4150 포자에서 FM4-64 프로브와 400 ms의 조명 시간을 자극 합니다.
- GerKB-mCherry 자극 및 KGB80에 게르트 GFP 포자와, 각각, 561 nm 레이저 광 레이저 30% 전력 1 s, 및 488 nm 레이저 빛 60 %3 미 Z 스택 설정은 위에서 바닥 모드, 0.2 µ m / 단계, 7 단계 및 germinosome에 대 한 20 단계에 대 한 레이저 출력 및 임 분석, 각각.
참고: 이러한 레이저 매개 변수는 약 4000의 히스토그램 윈도우의 최대 밝기 값을 보장 하기 위해 적용 되었다.
6. 3D SIM FM4-64 PS4150 포자 스테인드의 Raw 이미지 재구성
- FM4-64 스테인드 PS4150 포자 원시 데이터에 대 한 N-SIM 슬라이스 재구성을 수행 합니다. N-SIM 슬라이스 개조 창을 열려면 N SIM 패드 탭 시트에 재구성 조각 Param 단추 클릭 합니다.
- N-SIM 슬라이스 개조 창에서 재건 매개 변수를 설정 합니다. 완벽 한 복원된 이미지를 얻으려면 N SIM 지침의 제안에 따라 하 고 조명 변조 대비 (IMC) 설정 자동, 높은 N-SIM 슬라이스 재건 창에서 적절 한 컨트롤에 클릭 해상도 잡음 억제 (HRNS) 1.00을 시작 지점으로 0.05에 초점 흐림 억제 (OFBS)에서 .
- 재구성 슬라이스 단추 이미지를 재구성 하 N SIM 슬라이스 개조 창에서 클릭 합니다. 고속 푸리에 변환 (FFT) 이미지 재건12후 표시 재건 점수에 의해 재구성 된 이미지의 품질을 평가 합니다.
- 0.10에서 HRNS 조정 5.00 및 OFBS 0.01에서 0.50 최고의 매개 변수 설정을 얻을 수 있습니다 때까지 N-SIM 슬라이스 개조 창에서 해당 컨트롤을 클릭 하 여.
- 변경 된 매개 변수를 적용 하려면 N SIM 슬라이스 Reconstuction 창에서 적용 단추를 클릭 합니다. 창을 닫으려면 닫기 단추를 클릭 합니다.
- FM4-64 PS4150 포자 raw 이미지를 활성 및 N-SIM 패드 탭 시트에 슬라이스 재구성 단추 클릭 스테인드 조각 개조를 실행을 확인 합니다. 복원된 이미지를 저장 합니다.
7. 이미지 분석
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KGB80 germinosome의 의사 Widefield 이미지 변환
- ImageJ 플러그인 의사-Widefield12 SIMcheck 유틸리티 원시 데이터 시 왼쪽된 클릭으로 활성화 하 여 의사-Widefield 이미지에 3D SIM KGB80의 원시 이미지를 변환 합니다. 의사-Widefield 원시 SIM 데이터에서 이미지를 평균 하 고 비교를 위해, 기존의 widefield 조명12에 해당 이미지를 조립. ImageJ 자체에 대 한 https://imagej.net/Welcome를 참조 하십시오. 형광 의사 Widefield 이미지에 나중에 germinosome 분석에 대 한 각 거꾸로 전송 이미지에 25 포자를 임의로 선택 합니다.
- 두 개의 슬라이드에서 14 시야에 총 약 350 (이 예에서 346) KGB80 포자에서 선택 합니다. 선택한 KGB80 포자에 게르트 GFP와 GerKB mCherry 형광 foci 숫자는 두 연구원에 의해 독립적으로 세어 져야 한다. 연구원은 포자에 별도 형광 germinosome foci의 존재의 의심에 때마다 3D SIM raw 이미지를 다시 참조할 수 있습니다.
- 각 게르트 GFP와 GerKB mCherry 초점의 최대 농도 각 KGB80 포자의 3D 이미지 ImageJ의 통합된 강도 평가 합니다.
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의사-Widefield KGB80 germinosome의 이미지 분석
- KGB80 포자의 통합된 신호 강도로 7 스택 의미 통합된 강도 값을 사용 합니다. 동일한 설정을 사용 하 여 배경 스트레인 PS4150 이미징 하 여 배경 농도 결정 합니다. 대해 형광 명소 개별 KGB80 포자에 germinosome foci로 그들은 배경에서 명확 하 게 구별 합니다.
- 적용 소프트웨어 근원 9.0 중요성 결정에 대 한 단방향 ANOVA 테스트. P 값을 고려 하면 < 0.05 통계적으로 중요 한. Spearman의 순위 상관 계수18 를 사용 하 여 식도 GFP와 GerKB mCherry foci 번호의 상관 관계와 통합 된 신호 강도의 측정 평가.
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Representative Results
현재 프로토콜 세균성 포자에 대 한 SIM 현미경 이미징 절차를 제공합니다. 포자 형성 및 슬라이드 준비 절차 이미징 하기 전에 그림 1 에 표시 된 대로 실행 되었다. 이미징 및 분석 절차 적용 후, 모두 (발 아 단백질을 분류 하는 형광 단백질)을 흐리게 하 고 밝은 (닥터지 프로브 IM 스테인드) 포자 샘플 다음 텍스트와 같이.
B. subtilis 포자에 germinosomes의 지역화
위 식도 역류와 GerKB는 보고 포자, 당 3500 ~와 ~ 700 분자 각각 풍부한 포자 형성 중간19에 포자에서 추출의 서쪽 오 점 분석에 따라. KGB80 스트레인에 게르트 gfp 와 gerKB mCherry 유전자 그들의 네이티브 promotor의 통제 하에 있습니다. 그것은 SIM 재구성 알고리즘 같은 희미 한 원시 SIM 이미지를 재구성 하기가 그래서 이미징, 하는 동안 낮은 형광 신호를 led 융합 단백질의 상대적 낮은 풍부. 그러나, 비록 원시 SIM 이미지 SIMcheck (ImageJ 플러그인) 여 의사-Widefield 심상으로 개조 되었다 SIM 현미경 germinosome 이미지 수집에 대 한 적용 아직도 했다. 또한, 7 스택 3D 이미징이 IM 초점의 더 나은 개요 구현 되었습니다. 그림 2의 왼쪽 패널에 표시 된 것 처럼 다른 스택 두 foci 게르트 GFP의 등장. 총, 3 식도 GFP foci 복합적인 열 Z3 스택에서 흰색 화살표로 표시 됩니다. 그림 2 의 오른쪽 패널 복합 열 Z4 스택에 있는 흰색 화살표에 의해 입증으로 포자에서 하나만 게르트 GDP 초점으로 포자를 보여 줍니다. 총, 약 40%와 50% 포자의 했다 2 또는 한 게르트 GFP와 GerKB-mCherry 클러스터, 각각 (표 1). 346 포자 검사, 중 2 4 식도 GFP foci 졌고 한 포자 5 게르트 GFP foci 했다. 두드러지게, 우리의 손, 게르트 GFP와 GerKB mCherry foci 같은 포자 수가 했다 항상 동일한18. SIM 현미경 단계 대비 옵션을 했다, 우리는 포자 지역화에 대 한 전송 가벼운 현미경 검사 법을 사용 합니다. 따라서, 포자는 어둡고 짙은 코어 밝은 후광으로 둘러싸여 나타납니다.
ImageJ KGB80 포자의 통합된 형광 강도 측정 했다. 포자, 0, 4, 또는 5 foci 낮은 주파수로 인해 우리의 통계 분석에 포함 되지 않았다. 게르트-GFP와 GerKB-mCherry 통합 농도 사이 높은 긍정 상호 관계 했다 (Spearman 순위 상관 계수 = 0.73). 게르트-GFP 비 계 단백질의 통합된 강도 다른 인구 (그림 3C) 사이 다른 동안, 다른 인구 (그림 3D)에서 동일에 대 한 GerKB mCherry의 통합된 강렬이 했다. 게르트-GFP와 GerKB mCherry foci의 최대 형광 강도 감소는 포자 했다 여러 foci (그림 3A, B) 경향이 있었다. 모든 밝은 반점, germinosome foci로 간주의 최대 형광 PS4150 포자 (KGB80; 배경 스트레인에서 포자의 최대 자동 형광 보다 높았다 그림 3A B)입니다.
내 막의 조직
소개에서 설명 했 듯이, germinosome 단백질 포자의 인스턴트 메신저에 있습니다. 그러나, 몇 가지 세부 사항은이 크게 움직이지 막의 생물 속성에 대 한 알려져 있다. 메신저의 지역 조직, 등 자세한 내용은 탐험 IM 단백질, 특정 GRs에 채널 단백질의 조직에 대 한 이해를 홍보 것입니다. B. subtilis 포자는 여러 개의 동심 층으로 구성 된 구조 그리고 닥터지 프로브 통과할 수 없습니다 쉽게 이러한 여러 레이어 얼룩 포자 코어를 둘러싼 IM를. 이러한 프로브의 통로 대부분 단백질이 풍부한 코트 레이어 및 아마 또한 외부 막20,21에 의해 방해 됩니다. 이 문제를 해결 하려면 질 성 막 염료 FM4-64는 포자 형성 동안에 PS4150 문화에 추가 되었습니다. 이렇게 함으로써, PS4150 식물 세포 막 FM4-64, 의해 스테인드 했다 고 따라서 비대칭 포자 형성 세포 분열 및 후속 forespore engulfment에서이 문화에서 얻은 forespores에 막5스테인드 잘 됩니다. 따라서, 성숙한 포자의 막 구상 될 수 있다. 이전 연구는 대부분 하지 않을 경우 모든 FM4-64의 청소 포자5임에서은 표시. 보육 및 포자 정화 치료는 약 2 주 기간 동안 적용 세척 절차 외부 막, 효과적으로 decoating 치료 다음 제거 되 고 후자와 광범위 한 세척 단계에서 어떤 FM4-64을 제거 그러나 5., decoating 절차는 메신저에서 아무 FM4-64 제거도 germinosome foci5,6에 어떤 영향. 무엇이 우리를 흥분은 밝은 FM4-64 명소 germinosome foci 비슷한 두 그대로 (그림 4A, B)에 나타난 PS4150 포자의 포자 (그림 4C, D) decoated. 이러한 밝은 FM4-64 관광 명소는 임에서 germinosome 단백질의 클러스터링에 참여 수 있습니다.
그림 1: 포자 형성 및 슬라이드 준비의 개요. 이미징 하기 전에 필요한 초기 단계를 표시 하는 개요. 자세한 정보는 프로토콜에서 제공 됩니다. (A)에서 정의 된 최소 MOPS 포자 형성 절차의 회로도 매체. B. subtilis PS4150 (PS832 Δ기어::spc Δ코트::tet) 또는 KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이 게르트 gfp 칸) 단일 식민지 파운드 풍부한 매체의 5 mL에 교양 있었다 및 5 mL 및 MOPS의 20 mL에 매체, 그리고 마지막으로 MOPS 매체의 250 ml에서 sporulated. 초기 지 수 단계 문화 (OD600, 0.3-0.4) 모든 중간 문화에서 사용 됩니다. FM4-64 (2 µ g/mL) 포자 막 피크 OD600 값에 도달 후 1 또는 2 h 얼룩에 대 한 PS4150 포자 형성 매체에 추가 되었습니다. (B) 수확 MOPS 포자 형성 문화에서 포자 및 포자 농도 기온 변화도 원심 분리에 의해 정화의 방법. (C) 유전자 프레임 챔버에 1 %agarose 패드에 포자를 안정화의 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 두 KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이 게르트 gfp 칸) 휴면 포자의 3D 시뮬레이션 raw 이미지에 게르트 GFP와 GerKB mCherry foci의 대표 의사 Widefield (PWF) 3D 이미지 (561nm, 30% 레이저 전원, 듀얼 채널 여기 찍은 1 s, 그리고 488nm, 60% 레이저 출력, 3 s) 아래로 Z 더미 위에서 7 단계를 사용 하 여. 그 후, 원시 SIM 이미지 ImageJ 플러그인 SIMcheck 의사 Widefield 3D 심상으로 개조 되었다. 왼쪽에서 오른쪽, 3D 이미지 (Z2-Z5) 게르트-GFP (녹색), GerKB-mCherry (빨강)와 두 개의 KGB80 포자 (i 및 ii)의 해당 합성 이미지는 패널에 표시 됩니다. (I 및 ii) 2 개의 포자의 가벼운 이미지를 전송 (트랜스) 밝은 후광으로 둘러싸인 어두운 짙은 이미지로 나타나는 포자의 위치 표시. 눈금 막대 = 1 µ m 및 모든 패널은 동일한 확대에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이 게르트 gfp 칸) 휴면 포자에 게르트 GFP의 최대 형광 강도 및 임의 단위 PS4150 포자의 최대 자동 형광 강도. 모든 포자에 의해 조명 된 설정을 표시 합니다 프로토콜. 패널 (A)와 (B) 게르트 GFP와 GerKB mCherry foci의 최대 형광 강도 각각에 표시 KGB80 휴면 포자 또한 경우에 두 부모 PS4150 포자의 최대 자동 형광 강도. 패널 (C)와 (D) B. subtilis KGB80 휴면 포자에 각각, 게르트 GFP foci의 통합된 형광 강도 및 GerKB mCherry foci의 통합된 형광 강도 표시. 최대 초점 강도 및 소프트웨어 근원 9.0 통합된 포자 형광 강도 차이의 중요성을 위한 일방통행 ANOVA 테스트를 사용 하는 우리 P 값을 고려 하 고 < 중요 한으로 0.05. 4 또는 5 foci와 포자 그들의 낮은 풍부 때문에 분석에서 제외 했다. 데이터는 노치 boxplots로 표시 됩니다. 음모에 노치 관찰 그들의 폭 interquartile 범위 (IQR)에 비례 평균 값 주위에 있다. 표시 된 수염 1.5의 최대는 IQR을 나타냅니다. 별표 중간 값의 상당한 차이 나타냅니다. 게르트-GFP와 GerKB-mCherry 통합 형광 강도 강한 긍정적인 상관 관계 (Spearman 상관 계수 = 0.73)18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 의사 Widefield (PWF) 이미지 (A와 C) 그리고 FM4-64의 재건축된 시뮬레이션 이미지 (B와 D) 스테인드 B. subtilis PS4150의 메신저 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) 포자. FM-464 포자 형성 중 포자로 통합 되었다. 3D 시뮬레이션 raw 이미지 그대로 포자 (A 와 B)와 (C , D) decoated 포자의 한 채널 여기 (561 nm 레이저, 20% 레이저 전원, 400 ms)와 함께 찍은 25 단계 위에서 아래로 Z-스택 사용 하 여. 그 후, 원시 SIM 데이터 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 개축 되었다 ( 재료의 표참조) 3D 시뮬레이션 이미지로 PWF SIMcheck (ImageJ 플러그인)에 의해 변환 또는. 청록색 화살표 B 와 D패널에서 임에서 FM4-64 foci 가리킵니다. 눈금 막대 = 1 μ m 및 모든 패널은 동일한 확대에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 스트레인 | 계산 하는 포자 | 포커스 | 포자 (%) 당 포커스 | |||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
| KGB80 | 346 | 게르트-GFP | 2 | 46 | 40 | 11 | 1 | 0 | ||
| GerKB-mCherry | 2 | 53 | 40 | 5 | 0 | 0 | ||||
표 1: KGB80 포자에 foci의 존재. B. subtilis KGB80 라는 이중의 인구에 포자 당 germinosome foci 번호 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이 게르트-gfp 칸) 휴면 포자. 포자에서 형광의 초점을 최대 강도 PS4150의 최대 강도 자동 형광 강도 보다 높은 때 germinosome foci로 간주 되었다 (PS832 Δ기어::spc Δ코트::tet) 휴면 포자 KGB80 포자로 동일한 조명 설정에 의해 흥분된.
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Discussion
제시 하는 프로토콜 FM4-64 스테인드 B. subtilis 포자 포자 형성, 슬라이드 준비와 이미징 프로세스의 분석을 위한 표준 3D-SIM 절차를 포함 합니다. 또한, 프로토콜 설명 수정된 SIMcheck (ImageJ)-3D 이미징 B. subtilis 포자 germinosomes 형광 기자 표시의 SIM 현미경 검사 법에 대 한 프로세스를 지원. 후자의 절차를 사용 하 여 향상 된 콘트라스트와 함께 희미 한이 구조를 관찰할 수 있었습니다. 두 가지 이미징 절차, 커플링 하 여 발 아 과정의 기계 론 적인 이해에 대 한 우리의 기초 향상 같은 SIM 현미경 같은 포자에서 개별 하위 구조를 시각화 가능 하다. 절차 ~ 100의 측면 해상도에서 작동 하는 유의 nm와 ~ 200-250의 축 해상도 nm. 이것은 그리피스7에서 사용 하는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 넓은 필드 현미경 접근 보다 낫다입니다. 시간이 해결 발 아의 시작 시 germinosome 외관의 분석 원하는 다음 단계 것입니다. 불행 하 게도, 비록 SIM 현미경 원리와 호환에 germinosome의 dim 특성상 라이브 영상 신호 같은 시간 해결 SIM, 분석 이미지 수집 동안 샘플의 급속 한 표백으로 인해 실현 되지 않습니다. 분석에 대 한 충분 한 포자를 얻으려면 그 포자 형성 효율적으로 수행 되도록 결정적 이다. 연구팀은 따라서 대상으로 90% 효율으로 꼼꼼하게 포자 형성 효율을 확인 해야 합니다. 대표 결과에서 휴면 포자에서 각각 50%와 40%의 모든 포자 있고 하나 또는 두 개의 게르트 GFP GerKB mCherry foci (표 1). 2 포커스와 포자의 백분율은 그리피스에 의해 보고는 보다 훨씬 더 높은 이전7. 현재 작업에서 다른 결과 설명할 수 있는 몇 가지 이유가 있다. 첫째, 3D 이미징 프로세스 용이 하 게 하는 더 많은 foci의 검색 수 있습니다. 그림 1에서 보듯이 같은 포자에서 다른 foci 수직 방향에서 서로 다른 위치에 있습니다. 둘째, CCD 카메라 (자료 테이블)과 레이저 화합 SIM 현미경을 크게 기여할 이미징 결과. 셋째, 그리피스의 접근7 평균 수십 더 나은 이미지 분석을 위한 연속 이미지와 유사한, 의사-Widefield 이미지는 germinosome의 원시 심 이미지 (5 단계와 3 방향 이미지)에서 평균 이미지도 했다. 마지막으로, 포자 형성 매체와 포자 형성 조건, 포자 속성 결정에 중요 한 변수는 우리의 일에서 이전에 사용 하는 다릅니다. 그리피스 외.7 사용 풍부한 2 x 쉐 퍼의 포도 당 (2 SG x) 정의 된 최소 MOPS 동안 포자 형성을 위한 중간 버퍼 매체 고용 했다 여기. 몇몇 종이 포자 형성 매체 및 저항, 단백질 구성에 대 한 중요 한 효력이 있고 B. subtilis 의 발 아 포자22,,2324 증명 , 25. 실제로, 보였다 GR subunits의 레벨 3-에 8 배 낮은에 있는 포자 리치 매체에 얻은 대 가난한 매체에. 게르트 수준 가난한 중간 포자에서 약 3.5-fold 낮은 또한 되었고 이러한 포자 포자 발 아26시작 하 긴 했다. 그러나, 그것은 포자 형성 조건 또한 관찰 된 germinosome foci의 수에 영향 여부를 명확 하지입니다.
라미 레 스-페 랄 타 외.' s 결과26 표시 인구 수준에서 포자의 영양 발 아의 발 아 단백질 및 식도의 수준에 의해 크게 좌우 된다. 당 통합된 형광 강렬에서 포자 경우 형광 기자는 직접 식도 및 GerKB 융합 단백질의 수준에 비례, 두 융해 단백질의 레벨에서에서 넓게 다르다 KGB80 포자, 이전 작업 와는 7.이 단백질 레벨이 단일 포자 수준에서 관찰 하는 포자 발 아가 관련이 있을 수 있습니다 및 germinosome foci 수 포자 발 아가 기여 하는 또 다른 요인은 될 수 있습니다. 추가 실험 germinosome foci 수가 가능한 효과의 분석에 집중할 것 이다 고 foci 발 아 단백질 구성 (모든 germinosomes 발 아 단백질 구성에 있어 동등 수 있습니다) 수 발이. 데이터를 포함 하 여 현재 연구 질문의 숫자 상승 했다: 나) 임; GRs의 클러스터링에 GerD의 역할은 무엇 인가 그리고 ii) 두 가지는 어떻게 다른 GRs, 게 라 및 GerB, 포자 임 조직?
희미 하 고 밝은 포자 샘플에 대 한 프로토콜 SIM 현미경 검사 법에 의해 같은 포자에서 개별 하위 구조를 시각화할 수 있습니다. 포자에서 관찰 된 밝은 FM4-64 명소 메신저27의 광범위 한 접는 때문일 수도. 또는, 우리는이 지역 어디 염료 보다 쉽게 액세스할 수를 증가 지방 임 유동성 때문 임의 분야는 가설. 같은 지역의 증가 유동성 (RIFs) cytoskeletal 걸 homologue MreB, 유체 짧은 acyl 체인 지질28,29의 그것의 농도 위해 유명 하 여 구성할 수 있습니다. 눈에 띄게, 포자는 또한 밝은 FM4-64 장소 (우리의 되지 않은 관찰)의 비슷한 패턴을 리드 야생-타입 B. subtilis 에 동일한 절차를 적용. B. subtilis 식물 세포, 에서 축소 된 막 잠재력 MreB 및 RIFs29의 클러스터링 결과. 휴면 포자 가능성이의 내부 막 상대 낮은 막 잠재적인20,21 있으며 높은 유동성29의 큰 도메인에 RIFs의 클러스터링으로 이어질 수도 있습니다 MreB30 의 감지 수준을 포함 . 같은 도메인 germinosomes의 존재와 일치 수 있는지 여부를 현재 조사 받고 있다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
저자는 SIM 이미징 동안 그의 도움에 대 한 크리스 쳔 Zeelenberg 감사합니다. JW 박사 화목을 위한 중국 장학금 위원회를 인정 하 고 아이 린 Stellingwerf 이미징의 기본 단계 그녀의 도움에 대 한 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| ImageJ | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
