Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

Published: April 15, 2019 doi: 10.3791/59388
Automatic Translation
1, 1, *2,3, *4, *1
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health
* These authors contributed equally

Summary

Germinant receptor eiwitten cluster in 'germinosomes' in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.

Abstract

De geringe omvang van de sporen en de relatief lage abundantie van kiemkracht eiwitten, veroorzaken moeilijkheden in hun microscopische analyses met behulp van microscopie van epifluorescence. Super resolutie driedimensionale gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM) is een veelbelovende instrument om deze hindernis overwinnen en onthullen de moleculaire details van het proces van ontkieming van sporen van Bacillus subtilis (B. subtilis). Hier beschrijven we het gebruik van een gemodificeerde SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging proces en fluorescerende verslaggever eiwitten voor SIM microscopie van B. subtilis sporen germinosomes, cluster (s) van kiemkracht eiwitten. Ook presenteren wij een procedure (standaard) 3D-SIM imaging voor FM4-64 kleuring van B. subtilis spore membranen. Met behulp van deze procedures, we verkregen onovertroffen resolutie voor germinosome lokalisatie en tonen aan dat > 80% van B. subtilis KGB80 slapende sporen na sporevorming op een gedefinieerde minimale MOPS voedingsbodem verkregen hebben één of twee GerD-GFP en GerKB-mCherry Foci. Heldere foci werden ook waargenomen in FM4-64 gekleurd sporen 3D-SIM beelden suggereren dat binnenste membraan lipide domeinen van verschillende vloeibaarheid waarschijnlijk bestaan. Verdere zijn studies die dubbele etikettering procedures met membraan kleurstoffen en germinosome verslaggever eiwitten gebruiken om te beoordelen co lokalisatie en dus krijgt een optimaal overzicht van de organisatie van Bacillus kiemkracht eiwitten in het membraan van de innerlijke spore mogelijk.

Introduction

Sporen van de orders, Bacillales en Clostridiales zijn metabolisch slapende en buitengewoon resistent tegen harde decontaminatie regimes, maar tenzij ze ontkiemen, geen schadelijke effecten in mens1. In voedende germinant geactiveerde kieming van sporen van Bacillus subtilis (B. subtilis) is de inleiding gebeurtenis germinant binding aan germinant receptoren (GRs) gelegen in de spore binnenste membraan (IM). Vervolgens transduce de GRs signalen aan de SpoVA kanaal proteïne ook gelegen in de IM. Dit resulteert in het begin van de uitwisseling van spore kern pyridine-2,6-dicarbon zuur (dipicolinic zuur; DPA; bestaande uit 20% van de spore kern dry wt) voor water via het SpoVA-kanaal. Vervolgens de release DPA activeert de activering van de cortex peptidoglycaan hydrolyse en extra water opname volgt2,3,4. Deze gebeurtenissen leiden tot mechanische belasting op de vacht lagen, zijn latere breuk, het begin van de uitgroei en, ten slotte, vegetatieve groei. De exacte moleculaire details van het proces van ontkieming zijn echter nog lang niet opgelost.

Een belangrijke vraag over spore kiemkracht betreft de biofysische eigenschappen van de vetten rondom de IM kiemkracht eiwitten evenals de IM SpoVA kanaal eiwitten. Deze grotendeels immobiel IM lipide dubbelgelaagde is de belangrijkste permeabiliteit barrière voor vele kleine molecules, met inbegrip van toxische chemische conserveringsmiddelen, waarvan sommige hun optreden in de kern van de spore of vegetatieve cel cytoplasma5,6 oefenen. De IM lipide dubbelgelaagde is waarschijnlijk in een gel staat, hoewel er een significante fractie van mobiele lipiden in de IM-5. De spore IM heeft ook het potentieel voor aanzienlijke uitbreiding5. Dus, de oppervlakte van de IM 1.6-fold verhoogt op kiemkracht zonder extra membraan synthese en gepaard gaat met het verlies van dit membraan de karakteristieke lage permeabiliteit en lipide immobiliteit5,6.

Hoewel de moleculaire details van de activering van kiemkracht eiwitten en organisatie van IM lipiden in sporen zijn aantrekkelijke onderwerpen voor studie, vormen de geringe omvang van B. subtilis sporen en de relatief lage overvloed van kiemkracht eiwitten, een uitdaging voor microscopische analyses. Griffiths et al. dwingende epifluorescence Microscoop bewijs, suggereert met behulp van fluorescerende verslaggevers aan kiemkracht eiwitten, gesmolten dat in B. subtilis sporen de steiger proteïne GerD organiseert drie GR subeenheden (A, B en C) voor de GerA, B en K GRs, in een cluster7. Zij bedacht de term 'germinosome' voor dit cluster van kiemkracht eiwitten en de structuren als ~ 300 nm groot IM eiwit foci8beschreven. Na de inleiding van spore kiemkracht, dispergeren fluorescerende germinosome foci uiteindelijk veranderen in grotere fluorescerende patronen, met > 75% van de populaties van de spore weergeven van dit patroon in sporen ontkiemd voor 1 h met L-valine8. Merk op dat het papier bovengenoemde gebruikte gemiddeld beelden uit tientallen opeenvolgende fluorescerende afbeeldingen, tot statistische macht bezaten en overwinnen van de horde van lage fluorescerende signalen waargenomen tijdens de beeldvorming. Deze visualisatie van deze structuren in bacteriële sporen was aan de rand van wat technisch haalbaar met klassieke microscopische tools en noch een evaluatie van de hoeveelheid foci in een enkele spore is noch hun meer gedetailleerde subcellular localisatie was mogelijk met deze aanpak.

Wij tonen hier, het gebruik van gestructureerde verlichting microscopie (SIM) te verkrijgen van een gedetailleerde visualisatie en kwantificering van de germinosome(s) in de sporen van B. subtilis, alsmede van hun IM lipide domeinen9. Het protocol bevat ook instructies voor de sporevorming, prepareren van objectglaasjes en beeldanalyse door SIMcheck (v1.0, een imageJ plugin) evenals ImageJ10,11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. B. subtillis sporevorming (Timing: 7 dagen vóór de microscopische observatie)

  1. Dag 1
    1. Strijk een bacteriële cultuur op een Luria Bertani Bouillon (LB) agar plaat (1% trypton gistextract 0,5%, 1% NaCl, 1% agar)13 en na een nacht bebroeden bij 37 ° C te verkrijgen van enkele kolonies. Gebruik de B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat, gerD-gfp kan) stam en zijn achtergrond ouderstam B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) zoals eerder beschreven7.
      Opmerking: Het gebruik van sporen met de achtergrond van de ΔcotEΔgerE is van essentieel belang in germinosome visualisatie, om te minimaliseren van de autofluorescence van de spore vacht lagen7.
    2. Het steriliseren van alle media, buizen, pipets en andere materialen van de cultuur met passende methoden worden gebruikt.
  2. Dag 2
    1. Enten van een één kolonie in 5 mL van LB medium vroeg in de ochtend en de cultuur onder continu roeren in een schroefdop buis bij 200 rpm/min en 37 ° C te incuberen totdat de OD600 0,3-0,4 (ongeveer 7 h tot).
    2. 500 mL van MOPS medium (pH 7.5) maken met 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0.276 mM K2zo4, 0,01 mM FeSO4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM WIPES, Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glucose-monohydraat 4 mM en 10 mM NH4Cl.
    3. Bereiden in schroefdop buizen 10-1- 10-7 seriële verdunningen van de LB-cultuur in 5 mL MOPS medium en Incubeer de culturen 's nachts onder voortdurende agitatie bij 200 rpm/min en 37 ° C.
      Opmerking: De seriële verdunningen bereid hier streven naar het verkrijgen van een verdunning in vroege exponentiële fase in de volgende ochtend. Deze stap en de volgende stap zijn nodig om de cellen aan te passen aan de MOPS gebufferde groeimedium toestaan.
  3. Dag 3
    1. Selecteer een van de verdunningen van de MOPS met een OD600 van 0,3-0,4. Inoculeer 0,2 mL van de cultuur tot voorverwarmde (37 ° C) 20 mL MOPS voedingsbodem in een conisch 250 mL-kolf en incubeer onder continu roeren totdat de OD600 0,3-0,4 (~ 7 h tot).
    2. Beënt de MOPS gebaseerde sporevorming medium (250 mL) met 1% (v/v) pre cultuur uit stap 1.3.1 en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C in een conische liter kolf onder continu roeren. Voor FM4-64 kleuring van PS4150 sporen, voeg 2 µg/mL FM4-64 probe (Zie Tabel van materialen) tot de sporevorming medium 1 of 2 uur na het bereiken van de top600 OD-waarde van vegetatieve groei (in het algemeen ongeveer 2) en laat de cultuur vervolgens sporulate terwijl het beschermen van lichte5.
  4. Dag 7: Oogsten van sporen
    1. Het bepalen van de sporevorming opbrengst (sporen vs vegetatieve cellen) gebruik van fase contrast microscopie bij 100 X vergroting om te onderscheiden van de fase lichte sporen van donkere cellen in de fase en eventueel niet-oudere sporen. Een rendement van 90% fase heldere spore wordt verwacht.
    2. Pellet de sporen bij 4270 x g gedurende 15 min bij 4 ° C in ronde onderkant centrifuge buizen. De spore pellet 2 - 3 keer met 40 mL steriele Ultra zuivere Type 1 gedemineraliseerd water wassen in 50 mL conische centrifuge buizen (Zie Tabel van materialen). Spin-down op elke wassen bij 4270 x g gedurende 15 minuten (4 ° C).
  5. Dag 7: Spore zuivering
    1. Spore zuivering: Suspendeer de pellet spore in 750 µL van 20% nonionic dichtheid kleurovergang medium (Zie tabel van materialen) en laden op 800 µL van 50% nonionic dichtheid kleurovergang medium in gesteriliseerde microcentrifuge buizen. Centrifugeer gedurende 60 min bij 21.500 x g. De pellet verkregen bevat de vrije sporen. Suspendeer de pellet spore in 200 µL van 20% nonionic dichtheid kleurovergang medium en op 1 mL voor 50% nonionic dichtheid kleurovergang medium in een microcentrifuge buis, en Centrifugeer gedurende 15 min bij 21.500 x gladen.
    2. Wassen van de voorbereiding van de definitieve spore en opslag: de pellet verkregen bevat de gezuiverde slapende sporen. Wash de spore pellet 2 - 3 keer met 1,5 mL steriele Ultra zuivere Type 1 water (Zie Tabel van materialen) en spin-down tussendoor bij 9,560 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Tot slot, het opschorten van de pellet in steriele Ultra Zuiver Type 1 water tot een definitieve OD600 van ongeveer 30. Hoeveelheden van de sporen kunnen worden achtergelaten bij-80 ° C gedurende 8 weken14.

2. decoating

  1. Behandelen van PS4150 sporen met 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) / 0,1 M dithiothreitol (DTT) bij 70 ° C gedurende 1 h. wassen de sporen 10 keer met gesteriliseerde Ultra zuivere Type 1 water15,16. Door dit te doen, om het even welk geadsorbeerde FM4-64 sonde in de buitenmembraan spore en buitenste lagen worden verwijderd.

3. dekglaasje aan en prepareren van objectglaasjes11 (Timing: 1 H voor observatie)

  1. Vooraf schone hoge precisie coverslips (Zie tabel van materialen) met 1 M HCl gedurende 30 minuten in een waterbad voorzichtig schudden. De coverslips tweemaal in de ultra zuivere Type 1 water wassen en ze opslaan in 100% (vol/vol) EtOH. Laten drogen en controleren hun duidelijkheid vóór gebruik. Vooraf schoon glas dia's in 70% EtOH. Laten drogen en controleren hun duidelijkheid vóór gebruik.

4. de monstername fluorescerende microsferen of sporen in het gen Frame dia10 (Timing 15 Min)

  1. Vooraf warm twee 70% EtOH gereinigd en lucht gedroogd glas dia's (Zie tabel van materialen) voor enkele seconden op een blok van de verwarming 70 ° C, drop 65 μL van gesteriliseerde 2% agarose gehouden bij 70 ° C op de top van een glasplaatje en plaats de andere glasplaatje boven te verspreiden van de agarose b etween de dia's. De agarose patch zal droog in ongeveer 5 min.
  2. Snijd de agarose patch in een sectie van 1 x 1cm na het verwijderen van een van de dia's van glas, Voeg 0.4 l sample (fluorescerende microsferen of sporen van ~ 108/mL) en overdracht van de patch op de hoge precisie dekglaasje aan door het plaatsen van het dekglaasje aan op de patch en het glijdt.
  3. Een Gene Frame (1,5 x 1,6 cm2, 65 µL) vast te stellen op de gedroogde dia, waarop het dekglaasje aan sluiten alle hoeken van het frame ligt, dus de voltooiing van de dia voor gebruik in microscopie.

5. beeldvorming11,17(Timing: 1 H)

  1. Vastleggen van de beelden van het transmissie- en fluorescentie van sporen en een mengsel van rood en geel-groen carboxylaat gemodificeerde fluorescerende microsferen op een gestructureerde verlichting Microscoop (Zie tabel van materialen) uitgerust met een 100 x objectieve () olie Numerieke diafragma = 1,49), een CCD camera en beeld de software van de analyse (Zie tabel van materialen). Alle afbeeldingen op kamertemperatuur zonder de verstoring van het omgevingslicht te genereren. Zorg ervoor dat altijd schoon de 100 x doelstelling en de dia met 75% ethanol voor imaging.
  2. Focus op 100 nm (diameter) TL microbolletjes en optimaliseren van het punt verspreiden functie (psf) door de ring van de correctie op de doelstelling van 100 x aan te passen totdat een symmetrische psf is verkregen, dus het minimaliseren van vervagen van het beeld. De psf is de impuls antwoord of de reactie van een imaging systeem op een puntbron of een object point.
  3. Selecteer een gezichtsveld met ongeveer 10 ronde TL microsferen. Een rooster van toepassing focus aanpassing voor beide 561 nm en 488 nm excitatie golflengten als de gids voor de software van de analyse van de afbeelding.
  4. Focus van de sporen met het licht van de transmissie en een transmissie lichte opname in de 16 × gemiddelde modus met 200 ms posities voor elke afbeelding.
  5. 3D-SIM rauwe fluorescerende foto's vastleggen van de sporen met de wijze van de verlichting "3D-SIM", de camera-instellingen te-afleestoestand elektron te vermenigvuldigen (EM) winst 10MHz op 14-bits, en EM winst op 175. De sonde FM4-64 in PS4150 sporen met 561 nm laserlicht op 20% laser kracht, en een tijd van de verlichting van 400 ms opwekken.
  6. Wekken van de GerKB-mCherry en GerD-GFP in KGB80 sporen met, respectievelijk, 561 nm laserlicht op 30% laser kracht voor 1 s en 488 nm laserlicht op 60% laser macht voor 3 s. Z-Stack-instellingen zijn in de top naar bodem modus, 0,2 µm / stap 7 stappen en 20 stappen voor germinosome en IM analyse, respectievelijk.
    Opmerking: Deze laser parameters werden toegepast om zich te verzekeren van een waarde van de maximale helderheid van het histogram venster van ongeveer 4.000.

6. reconstrueren 3D-SIM Raw-afbeeldingen van FM4-64 gekleurd PS4150 sporen

  1. De N-SIM segment wederopbouw voor de FM4-64 gekleurd PS4150 sporen ruwe gegevens uitvoeren Klik op de knop van de Param voor Reconstrueren Slice op de N-SIM pad tabblad om de N-SIM segment wederopbouw-venster te openen.
  2. De wederopbouw parameters instellen in het venster van de N-SIM segment wederopbouw . Om perfect gereconstrueerde beeld, de suggestie van de N-SIM instructies volgt en klik op de gewenste besturingselementen in het venster van de N-SIM segment wederopbouw om de Verlichting modulatie Contrast (IMC) ingesteld op Auto, High Resolutie ruis onderdrukking (HRNS) 1,00 en Uit de Focus vervagen onderdrukking (OFBS) naar 0,05 als uitgangspunt.
  3. Klik op de knop Reconstrueren Slice in het venster van de N-SIM segment wederopbouw te reconstrueren van de afbeelding. Evalueren van de kwaliteit van de gereconstrueerde beelden door de Fast Fourier getransformeerd (FFT) beelden en de wederopbouw score, welke na wederopbouw12worden weergegeven.
  4. Aanpassen van de HRNS van 0,10 tot 5,00 en OFBS van 0,01 naar 0,50 door te klikken op de gewenste besturingselementen in de N-SIM segment wederopbouw venster totdat de beste parameterinstellingen worden verkregen.
  5. Klik op de knop toepassen in het venster van de N-SIM segment Reconstuction toe te passen van de gewijzigde parameters. Klik op de knop sluiten om het venster te sluiten.
  6. Maak een FM4-64 gekleurd PS4150 sporen raw-afbeeldingen actieve en klik op de knop Reconstrueren Slice op de N-SIM Pad tabblad te voeren Segment wederopbouw. Sla het gereconstrueerde beeld.

7. de beeldanalyse

  1. Converteren van Pseudo-Widefield beelden van de KGB80 germinosome
    1. 3D-SIM raw-afbeeldingen van KGB80 converteren door Pseudo-Widefield beelden door te activeren met een linker muisknop de ImageJ plugin SIMcheck nut, Raw Data SI Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield gemiddelden van beelden van de ruwe gegevens van de SIM- en assembleert, ter vergelijking, een afbeelding gelijk aan conventionele widefield verlichting12. Zie https://imagej.net/Welcome voor ImageJ zelf. Selecteer willekeurig ~ 25 sporen in elk beeld van de omgekeerde transmissie voor latere analyse van de germinosome in de fluorescerende Pseudo-Widefield beelden.
    2. In totaal ongeveer 350 (in dit voorbeeld, 346) KGB80 sporen in 14 gezichtsveld van twee dia's selecteren De GerD-GFP en GerKB-mCherry fluorescerende foci nummers in geselecteerde KGB80 sporen moeten onafhankelijk worden geteld door twee onderzoekers. De onderzoeker kan terug verwijzen naar de 3D-SIM raw beelden wanneer in twijfel van de aanwezigheid van afzonderlijke fluorescerende germinosome foci in sporen.
    3. De maximale intensiteiten van elke GerD-GFP en GerKB-mCherry focus en de geïntegreerde intensiteit van elke KGB80 spore 3D beeld met ImageJ beoordelen.
  2. Analyseren van Pseudo-Widefield beelden van de KGB80 germinosome
    1. De intensiteitswaarde van de gemiddelde geïntegreerde van 7 stapels gebruiken als de geïntegreerde signaal intensiteit van de spore KGB80. Achtergrond intensiteit bepalen door imaging de achtergrond stam PS4150 met identieke instellingen. Betreft fluorescerende vlekken in individuele KGB80 sporen germinosome foci wanneer ze duidelijk te onderscheiden van de achtergrond zijn.
    2. Toepassing one-way ANOVA-tests voor de bepaling van de betekenis met software oorsprong 9.0. overwegen van P-waarden < 0.05 als statistisch significant. Gebruik van de Spearman rank correlatiecoëfficiënt18 om te evalueren van de correlatie van GerD-GFP en GerKB-mCherry foci nummer en de metingen van de geïntegreerde signaal intensiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het huidige protocol presenteert een SIM Microscoop imaging procedure voor bacteriële sporen. De voorbereiding van de procedures sporevorming en dia werden uitgevoerd zoals aangegeven in Figuur 1 voor imaging. Later, de beeldvorming en analyse procedures werden toegepast zowel voor dim (fluorescent proteïne label kiemkracht eiwitten) en lichte (lipofiele sonde gekleurd IM) spore monsters zoals in de volgende tekst wordt weergegeven.

Lokalisatie van germinosomes in B. subtilis sporen

Niveaus van GerD en GerKB zijn gemeld dat ~ 3.500 en ~ 700 moleculen per spore, respectievelijk, op basis van analyses van de westelijke vlek van fragmenten van sporen in een rijke sporevorming middellange19opgesteld. GerD-gfp zowel de gerKB-mCherry genen in de KGB80-stam zijn onder de controle van hun eigen promotor. De relatieve lage abundantie van de fusie-eiwitten die leidde tot een laag fluorescent signaal tijdens imaging, dus het was moeilijk te reconstrueren van dergelijke dim rauwe SIM beelden door de SIM-wederopbouw algoritme. De SIM-Microscoop was echter nog steeds toegepast voor de germinosome image aquisition, hoewel de raw SIM-beelden werden omgebouwd tot Pseudo-Widefield beelden door SIMcheck (ImageJ plugin). Daarnaast werd een zeven stapel 3D-beeldbewerking geïmplementeerd om een beter overzicht van deze IM-focus te krijgen. Zoals u in het linker deelvenster van Figuur 2, verscheen twee foci van GerD-GFP in verschillende stapels. De, in totaal drie foci van GerD-GFP worden aangegeven door de witte pijlen in de compositive kolom Z3 stapel. Het paneel van de rechterhand van Figuur 2 toont een spore met slechts één GerD-BBP focal point in de spore blijkens de witte pijl in van de samengestelde kolom Z4 stapel. In totaal ongeveer 40% en 50% van de sporen had twee of één GerD-GFP en GerKB-mCherry-cluster, respectievelijk (tabel 1). Onder de 346 sporen onderzocht, twee hadden 4 GerD-GFP foci, en één spore zelfs 5 GerD-GFP foci. Merkbaar, in onze handen waren het aantal GerD-GFP en GerKB-mCherry foci in de dezelfde spore niet altijd de zelfde18. Als de SIM-Microscoop had geen fase contrast andere keuze, hebben we de lichte microscopie van transmissie gebruikt voor spore lokalisatie. Deze manier, sporen worden weergegeven met een donker en dichte kern omgeven door een helderder halo.

De intensiteit van de geïntegreerde fluorescentie van KGB80 sporen werd gemeten door ImageJ. Sporen, die had 0, 4 of 5 foci werden niet opgenomen in onze statistische analyse als gevolg van hun lage frequentie. Er was een hoge positieve correlatie tussen GerD-GFP en GerKB-mCherry geïntegreerd intensiteiten (Spearman rank correlatiecoëfficiënt = 0,73). Terwijl de geïntegreerde intensiteit van het eiwit van de steiger GerD-GFP verschilde tussen verschillende populaties (Figuur 3 c), was de geïntegreerde intensiteit van GerKB-mCherry ongeveer hetzelfde in verschillende populaties (figuur 3D). De intensiteit van de maximale fluorescentie van GerD-GFP en GerKB-mCherry foci neiging dalen, toen de spore had meerdere foci (figuur 3A, B). De maximale fluorescentie van alle heldere vlekken, beschouwd als germinosome foci, was hoger dan de maximale auto-fluorescentie van PS4150 sporen (de sporen van de achtergrond stam KGB80; Figuur 3A B).

Organisatie van het binnenste membraan

Zoals vermeld in de inleiding, bevinden germinosome eiwitten zich in de spore IM. Enkele details zijn echter bekend over de biofysische eigenschappen van dit grotendeels immobiel membraan. Verkennen van meer details, zoals de lokale organisatie van de IM's, zou het begrip van de organisatie van IM eiwitten, in bepaalde GRs en kanaal eiwitten bevorderen. B. subtilis sporen hebben een structuur bestaande uit meerdere concentrische lagen, en een lipofiele sonde kan niet gemakkelijk passeren deze meerdere lagen de IM rond de kern van de spore vlek. De passage van deze sondes wordt waarschijnlijk belemmerd door de eiwitrijke vacht lagen en misschien ook de buitenmembraan20,21. Om dit probleem te verhelpen, werd de lipofiele membraan kleurstof FM4-64 toegevoegd aan een PS4150 cultuur tijdens sporevorming. Door dit te doen, de vegetatieve celmembraan van PS4150 was gekleurd door FM4-64, en dus membranen in forespores verkregen van deze cultuur bij de afdeling van de cel van de asymmetrische sporevorming en latere forespore engulfment5goed zijn gekleurd. Bijgevolg kunnen de volwassen spore membranen worden gevisualiseerd. Een vorige onderzoek is gebleken dat de meeste zo niet alle van de FM4-64 is in de IM in schoongemaakte sporen5. Tijdens een periode van ongeveer 2 weken van incubatie en spore zuivering behandelingen verwijderen de toegepaste procedures voor wassen elke FM4-64 uit de buitenmembraan, de laatste effectief wordt verwijderd na de decoating behandeling en uitgebreide wassen stappen 5. echter de decoating procedure verwijderd het IM geen FM4-64, noch heeft enig effect op de germinosome foci5,6. Wat ons enthousiast is dat helderder FM4-64 spots vergelijkbaar met germinosome foci in beide intact (figuur 4A, B verscheen) en sporen (figuur 4C, D) decoated van PS4150 sporen. Deze helderder FM4-64 vlekken kunnen worden betrokken bij de clustering van germinosome eiwitten in IM.

Figure 1
Figuur 1: overzicht van sporevorming en dia voorbereiding. Een overzicht weergeven van de eerste stappen die nodig zijn voor de beeldvorming. Gedetailleerde informatie is opgenomen in het protocol. (A) het schema van de procedure van de sporevorming in gedefinieerde minimale MOPS medium. De PS4150 van een B. subtilis (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) of KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat gerD-gfp kan) één kolonie was gekweekte in 5 mL van LB rijk medium, en aangepast in 5 mL en 20 mL MOPS medium op zijn beurt, en ten slotte sporevorm in 250 mL MOPS voedingsbodem. Een vroege fase van de exponentiële cultuur (OD600, 0,3-0,4) wordt gebruikt in alle tussenliggende culturen. FM4-64 (2 µg/mL) werd toegevoegd aan het PS4150 sporevorming medium voor spore membraan kleuring van 1 of 2 h na het bereiken van de piekwaarde van de OD-600 . (B) methode van oogsten sporen van MOPS sporevorming cultuur en zuiveren van sporen door dichtheid kleurovergang centrifugeren. (C) Procedure voor het stabiliseren van de sporen op 1% agarose pad in een gen frame kamer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Vertegenwoordiger Pseudo-Widefield (PWF) 3D beelden van GerD-GFP en GerKB-mCherry foci in twee KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat gerD-gfp kan) slapende sporen 3D-SIM raw-beelden werden genomen met dual-channel excitatie (561nm, 30% laser power, 1 s, en 488nm, 60% laser macht, 3 s) met behulp van de 7 stappen van boven naar beneden Z-stacks. Vervolgens werden de raw beelden van SIM omgezet in Pseudo-Widefield 3D-beelden door de ImageJ plugin SIMcheck. Van links naar rechts, 3D beelden (Z2-Z5) van GerD-GFP (groen), worden GerKB-mCherry (rood) en de bijbehorende samengestelde afbeeldingen van twee sporen van de KGB80 (i en ii) weergegeven in het deelvenster. De licht beelden transmissie (Trans) van twee sporen (i en ii) aangegeven de locatie van de sporen die als donkere dichte afbeeldingen verschijnen, omgeven door een helderder halo. Schaal bar = 1 µm en alle panelen zijn op de dezelfde vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: De intensiteit van de maximale fluorescentie van GerD-GFP in KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat gerD-gfp kan) slapende sporen, en de intensiteit van de maximale auto-fluorescentie van PS4150 sporen in willekeurige eenheden. Alle sporen werden verlicht door de instellingen aangegeven het protocol. Panelen (A) en (B) vertonen de maximale fluorescentie-intensiteit van de foci GerD-GFP en GerKB-mCherry, respectievelijk KGB80 slapende sporen zo goed zoals in beide gevallen de maximale auto-fluorescentie-intensiteit van de bovenliggende PS4150 sporen. Panelen (C) en (D) de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van de foci GerD-GFP en de intensiteit van de geïntegreerde fluorescentie van de GerKB-mCherry-foci, respectievelijk, in B. subtilis KGB80 slapende sporen weergeven. We gebruikten one-way ANOVA-tests voor de bepaling van de betekenis van verschillen in brandpunt maximale intensiteit en geïntegreerde spore fluorescentie intensiteiten met software oorsprong 9.0 overwegen van P-waarden < 0.05 belangrijk. Sporen met 4 of 5 foci werden uitgesloten van de analyse vanwege hun lage overvloed. De gegevens is in ingekeepte boxplots vertegenwoordigd. De inkepingen in de percelen zijn rond de mediane waarden waargenomen met hun breedte evenredig aan de interkwartielafstand (IQR). De snorharen weergegeven vertegenwoordigen een maximum van 1.5 de IQR. Sterretjes geven een significant verschil met gemiddelde waarden. GerD-GFP en GerKB-mCherry geïntegreerd fluorescentie intensiteiten hebben een sterke positieve correlatie (Spearman correlatiecoëfficiënt = 0,73)18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Vertegenwoordiger Pseudo-Widefield (PWF) beelden (A en C) en gereconstrueerde SIM beelden (B en D) van de FM4-64 gekleurd IM van B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) sporen. FM-464 was in sporen tijdens sporevorming opgenomen. 3D-SIM raw-afbeeldingen van intact sporen (A en B) en decoated sporen (C en D) werden genomen met één kanaal excitatie (561 nm laser, 20% laser power, 400 ms) met behulp van een 25 stap van boven naar beneden Z-stack. Vervolgens de onbewerkte gegevens van de SIM werd gereconstrueerd door de Microscoop denkbaar software (Zie Tabel van materialen) in 3D-SIM beelden, of omgezet in PWF door SIMcheck (ImageJ plugin). De cyaan pijlen wijzen naar FM4-64 foci in de IM in deelvenster B en D. Schaal bar = 1 μm en alle panelen zijn op de dezelfde vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Stam Sporen geteld Foci Foci per spore (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 GerD-GFP 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Tabel 1: Aanwezigheid van foci in KGB80 sporen. Het germinosome foci nummer per spore in een populatie van dual label B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry-kat gerD-gfp kan) slapende sporen. Fluorescentie in sporen werd meegeteld als germinosome foci wanneer een focus maximale intensiteit hoger was dan de intensiteit van de auto-fluorescentie, die de maximumlichtsterkte van PS4150 was (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) slapende sporen opgewonden door dezelfde verlichting instellingen als de sporen van de KGB80.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol gepresenteerd bevat een procedure van de standaard 3D-SIM voor analyse van FM4-64 gekleurd van B. subtilis sporen die sporevorming, prepareren van objectglaasjes en imaging processen omvat. Bovendien, het protocol beschrijft een gemodificeerde SIMcheck (ImageJ)-3D-imaging proces voor SIM microscopie van B. subtilis spore germinosomes gelabeld met de fluorescerende verslaggevers bijgestaan. De laatste procedure konden we observeren deze dim substructuur met verbeterde contrast. Door de koppeling van twee beeldvormende procedures, is het mogelijk om te visualiseren discrete sub structuren in de dezelfde spore met de dezelfde SIM Microscoop, dus de verbetering van onze basis voor een mechanistische begrip van het proces van ontkieming. Merk op dat de procedure bij een laterale resolutie van ~ 100 verloopt nm en een axiale resolutie van ~ 200-250 nm. Dit is beter dan de differentiële interferentie Contrast (DIC) breed-gebied microscopie aanpak door Griffith7gebruikt. Tijd opgelost analyse van germinosome verschijning op inleiding van kiemkracht zou een gewenste volgende stap. Helaas, hoewel SIM microscopie is in beginsel verenigbaar is met live-imaging, het dim karakter van de germinosome signalen dergelijke tijd-opgelost-SIM, analyses zijn niet haalbaar vanwege het snelle bleken van de monsters tijdens Beeldacquisitie. Met het oog op een voldoende sporen voor analyse, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat sporevorming plaatsvindt efficiënt. Onderzoekers moeten daarom controleren sporevorming efficiëntie zorgvuldig met 90% rendement als doel. In de representatieve resultaten hebben slapende sporen, respectievelijk ~ 50% en 40% van alle sporen één of twee GerD-GFP en GerKB-mCherry foci (tabel 1). Het percentage sporen met twee foci is veel hoger dan dat gemeld door Griffiths eerder7. Er zijn verschillende redenen die de verschillende resultaat in het huidige werk kunnen verklaren. Ten eerste kan de 3D-imaging proces vergemakkelijken de detectie van meer foci. Verschillende foci in de dezelfde spore bevinden zich op verschillende locaties in verticale richting, zoals afgebeeld in Figuur 1. Ten tweede, de CCD-camera (Tabel van materialen) en laser-eenheid uitgerust om de SIM-Microscoop aanzienlijk bijdragen tot de resultaten van beeldvorming. Derde, gelijkaardig aan de Griffiths aanpak7 tot gemiddelde tientallen opeenvolgende beelden voor betere beeldanalyse, de Pseudo-Widefield beeld van de germinosome was ook een gemiddelde beeld van raw SIM-afbeeldingen (5 fasen en 3 beelden van de richtsnoeren). Tot slot verschillen de sporevorming medium en sporevorming voorwaarden, een belangrijke variabele bij het bepalen van de eigenschappen van de spore, in ons werk van die eerder gebruikt. Griffiths et al.7 gebruikt rijk 2 x Schaeffers-glucose (2 x SG) medium voor sporevorming, terwijl een gedefinieerde minimale MOPS gebufferde medium werkte hier. Diverse kranten hebben aangetoond dat sporevorming medium en omstandigheden aanzienlijke gevolgen voor de samenstelling van eiwit, weerstand hebben, en ontkieming van B. subtilis 22,23,24 sporen , 25. inderdaad, het is aangetoond dat niveau van GR subeenheden 3 zijn-tot 8 keer lager in sporen verkregen op een slechte medium versus verkregen op rich-medium. GerD niveaus waren ook ongeveer 3.5-fold lager in arme middellange sporen, en deze sporen duurde langer spore kiemkracht26starten. Het is echter niet duidelijk of sporevorming voorwaarden ook het aantal waargenomen germinosome foci beïnvloeden.

Ramirez-Peralta et al..' s resultaten26 aangegeven dat de tarieven van nutriënten kieming van sporen op populatieniveau aanzienlijk worden beïnvloed door de niveaus van kiemkracht eiwitten en GerD. Als de geïntegreerde fluorescerende intensiteiten per spore van de fluorescerende verslaggevers rechtstreeks in verhouding staan tot de niveaus van GerD en GerKB fusie-eiwitten, niveaus van beide fusie-eiwitten verschillen sterk in KGB80 sporen, die is in overeenstemming met eerdere werk 7. deze eiwit niveau heterogeniteit waarschijnlijk gerelateerd aan spore kiemkracht heterogeniteit waargenomen op het niveau van één spore en germinosome foci nummer misschien wel een andere factor die bijdraagt tot spore kiemkracht heterogeniteit. Verdere experimenten zal zich richten op een analyse van het mogelijke effect dat germinosome foci nummer en foci kiemkracht eiwit samenstelling (niet alle germinosomes wellicht gelijk in kiemkracht eiwit samenstelling) kon hebben op kiemkracht heterogeniteit. De gegevens gaf aanleiding tot een aantal huidige onderzoeksvragen met inbegrip van: ik) wat is de rol van GerD de clustering van GRs in de IM; en ii) hoe zijn de twee andere GRs, GerA en GerB, georganiseerd in de spore IM?

Het protocol gepresenteerd voor dim en bright spore monsters maakt het mogelijk om te visualiseren discrete sub structuren in de dezelfde spore door SIM-microscopie. De lichtpuntjes van FM4-64 die werden waargenomen in de sporen kunnen worden veroorzaakt door uitgebreide vouwen van de IM-27. Als alternatief, we veronderstellen dat deze regio's gebieden van de IM waar de kleurstof gemakkelijker toegang tot als gevolg van verhoogde lokale IM vloeibaarheid krijgen kan. Dergelijke regio's van verhoogde vloeibaarheid (RIFs) kunnen worden georganiseerd door de cytoskeletal actine homologe MreB, goed-gekend voor zijn concentratie van de vloeistof korte acyl keten lipiden28,29. Merkbaar, dezelfde procedure toe te passen op wild-type B. subtilis sporen leidt ook tot een vergelijkbaar patroon van FM4-64 lichtpuntjes (onze niet-gepubliceerde opmerkingen). B. subtilis vegetatieve cellen, resulteert een samengevouwen membraanpotentiaal in de bundeling van MreB en RIFs29. Het binnenste membraan van slapende sporen waarschijnlijk heeft een relatief lage membraan potentiële20,21 en bevat detecteerbare niveaus van MreB30 , die leiden kunnen tot de clustering van RIFs in grotere domeinen van hoge vloeibaarheid29 . Of dergelijke domeinen met de aanwezigheid van germinosomes samenvallen kunnen wordt momenteel onderzocht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Christiaan Zeelenberg voor zijn hulp tijdens de SIM beeldvorming. JW erkent de China Scholarship Council for een PhD fellowship en Irene Stellingwerf Bedankt voor haar hulp tijdens de primaire fase van de beeldvorming.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).

Tags

Bioengineering kwestie 146 gram-positieve bacteriën Bacillales microscopie microbiologie organismen bacteriën analytische diagnostische en therapeutische technieken en apparatuur onderzoekstechnieken Life sciences Life Sciences (generaal) Bacillus Sporen kiemkracht eiwitten Germinosomes Spore binnenste membraan super resolutie microscopie fluorescentie microscopie
Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van <em>Bacillus subtilis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M.… More

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M. M., Setlow, P., Brul, S. Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (146), e59388, doi:10.3791/59388 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter