Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in Bacillus subtilis spore

Published: April 15, 2019 doi: 10.3791/59388
Automatic Translation
1, 1, *2,3, *4, *1
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health
* These authors contributed equally

Summary

Cluster di proteine recettoriali germinant in 'germinosomes' nella membrana interna di spore di Bacillus subtilis . Descriviamo un protocollo utilizzando super risoluzione di microscopia e fluorescenti di proteine reporter per visualizzare germinosomes. Il protocollo identifica anche domini di membrana interna di spore che sono preferenzialmente colorate con il colorante di membrana FM4-64.

Abstract

Le piccole dimensioni delle spore e la relativamente bassa abbondanza di proteine di germinazione, causare difficoltà nelle loro analisi microscopiche mediante epifluorescenza. Microscopia di Super-risoluzione tridimensionale strutturato illuminazione (3D-SIM) è uno strumento promettente per superare questo ostacolo e rivelare i dettagli molecolari del processo di germinazione delle spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis). Qui, descriviamo l'uso di un SIMcheck modificato (ImageJ)-processo di imaging 3D assistente e proteine reporter fluorescenti per microscopia SIM di germinosomes di b. subtilis spore, interumana delle proteine di germinazione. Presentiamo anche una procedura di imaging 3D-SIM (standard) per la colorazione delle membrane di spore di Bacillus subtilis FM4-64. Utilizzando queste procedure, abbiamo ottenuto la risoluzione insuperabile per la localizzazione di germinosome e mostrano che > 80% dei KGB80 di b. subtilis spore dormienti ottenute dopo la sporulazione su medium MOPS minimo definito hanno uno o due GerD-GFP e GerKB-mCherry fuochi. I fuochi luminosi erano anche osservato in FM4-64 macchiati immagini 3D-SIM spore suggerendo che domini lipidici della membrana interna di differenti fluidità probabile che esistano. Ulteriori studi che utilizzano la doppia etichettatura procedure con membrana coloranti e germinosome proteine reporter per valutare co-localizzazione e quindi ottenere una panoramica ottimale dell'organizzazione delle proteine di germinazione del bacillo nella membrana interna spora sono possibile.

Introduction

Spore degli ordini Bacillales e Clostridiales sono metabolicamente dormienti e straordinariamente resistente ai regimi di decontaminazione duro, ma a meno che non germinano, non possono causare effetti deleteri in esseri umani1. In nutrienti germinant innescata germinazione di spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), l'evento di iniziazione è germinant legame ai recettori germinant (GRs) situato nella membrana interna di spore (IM). Successivamente, il GRs trasdurre segnali alla proteina canale SpoVA anche situato nel IM. Questo provoca l'inizio dello scambio di spora core piridina-2,6-dicarbossilico (acido dipicolinico; DPA; composto da 20% di spora core asciutto wt) per l'acqua tramite il canale di SpoVA. Successivamente, il rilascio DPA innesca l'attivazione di idrolisi di peptidoglicano di corteccia, e l'assorbimento di acqua supplementare segue2,3,4. Questi eventi conducono allo sforzo meccanico degli strati di cappotto, sua rottura successiva, l'insorgenza di conseguenza e, infine, lo sviluppo vegetativo. Tuttavia, lungi dal vengono risolti i dettagli molecolari del processo di germinazione.

Una domanda importante sulla germinazione delle spore riguarda le proprietà biofisiche dei lipidi che circonda le proteine di germinazione di IM come pure le proteine canale IM SpoVA. Questo doppio strato lipidico in gran parte immobile IM è la barriera di permeabilità principale per molte piccole molecole, tra cui conservanti chimici tossici, alcuni dei quali esercitano la loro azione nel nucleo di spora o cellula vegetativa citoplasma5,6. Il doppio strato lipidico IM è probabilmente in uno stato di gel, anche se c'è una frazione significativa dei lipidi mobile in IM5. IM della spora ha anche il potenziale per un'espansione significativa5. Quindi, l'area della superficie dell'IM aumenta 1.6-fold su germinazione senza sintesi ulteriori della membrana ed è accompagnata dalla perdita di questa membrana caratteristica bassa permeabilità e lipidica immobilità5,6.

Mentre i dettagli molecolari dell'organizzazione dei lipidi IM in spore e l'attivazione delle proteine di germinazione sono argomenti interessanti per lo studio, la piccola dimensione delle spore di Bacillus subtilis e l'abbondanza relativamente basso di proteine di germinazione, rappresentano una sfida per analisi al microscopio. Griffiths et al epifluorescenza microscopio prova coercitiva, utilizzando reporter fluorescenti fuso a proteine di germinazione, suggerisce che nel b. subtilis spore la proteina dell'impalcatura GerD organizza tre subunità GR (A, B e C) di GerA, B e K GRs, in un cluster7. Hanno coniato il termine 'germinosome' per questo cluster di proteine di germinazione e descritto le strutture come ~ 300 nm grande IM proteina fuochi8. All'inizio della germinazione delle spore, fluorescente germinosome i fuochi alla fine trasformarsi in grandi disperdere modelli fluorescente, con > 75% delle popolazioni di spora visualizzano questo modello in spore germinati per 1 h con L-valina8. Si noti che il libro citato sopra usate media immagini da decine di immagini consecutive fluorescente, per guadagnare potere statistico e superare l'ostacolo dei segnali fluorescenti Bassi osservato durante la formazione immagine. Questa visualizzazione di queste strutture in spore batteriche era ai margini di ciò che è tecnicamente fattibile con strumenti microscopici classici e né una valutazione della quantità di fuochi in una singola spora né era loro localizzazione subcellulare più dettagliate possibile con questo approccio.

Qui, dimostriamo che l'uso della microscopia di illuminazione strutturata (SIM) per ottenere una visualizzazione dettagliata e quantificazione di germinosome(s) le spore di Bacillus subtilis, nonché dei loro domini lipidici IM9. Il protocollo contiene anche le istruzioni per la sporulazione, la preparazione del vetrino e l'analisi di immagine di SIMcheck (v 1.0, un plugin di imageJ) così come ImageJ10,11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. b. subtillis sporulazione (Timing: 7 giorni prima dell'osservazione microscopica)

  1. 1 ° giorno
    1. Inoculare una coltura batterica su una piastra (tryptone di 1%, 0,5% di Estratto di lievito, 1% NaCl, 1% agar) agar di brodo di Luria-Bertani (LB)13 ed incubare per una notte a 37 ° C per ottenere singole colonie. Utilizzare il ceppo di Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto, gerD-gfp kan) e ceppo parentale sfondo PS4150 di b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) come descritto in precedenza7.
      Nota: L'uso di spore con lo sfondo di ΔcotEΔgerE è essenziale nella visualizzazione germinosome, al fine di ridurre al minimo l'autofluorescenza della spora cappotto strati7.
    2. Sterilizzare tutti i media, provette, pipette e altri materiali di cultura per essere utilizzato con metodi appropriati.
  2. 2 ° giorno
    1. Inoculare una colonia singola in 5 mL di terreno LB al mattino presto e incubare la cultura sotto agitazione continua in una provetta con tappo a vite a 200 giri/min e 37 ° C fino a quando raggiunge il OD600 0.3-0.4 (circa 7 h).
    2. Fare 500 mL di terreno di MOPS (pH 7,5) contenente 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0,276 mM K2così4, 0,01 mM FeSO4·7H2O, O a 0,14 mM CaCl2·2H2, 80mm MOP, 4mm Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glucosio-monoidrato e 10mm NH4Cl.
    3. Preparare nel tappo a vite tubi 10-1- 10-7 diluizioni seriali della cultura LB in 5ml MOPS supporto ogni e incubare le colture durante la notte sotto agitazione continua a 200 giri/min e 37 ° C.
      Nota: Le diluizioni seriali preparate qui lo scopo di ottenere una diluizione in fase esponenziale in anticipo la mattina successiva. Questo passaggio e quello successivo sono necessari per consentire alle cellule di adattarsi al mezzo di crescita tampone MOPS.
  3. 3 ° giorno
    1. Selezionare una delle diluizioni MOPS con un OD600 di 0.3-0.4. Inoculare 0,2 mL della cultura al pre-riscaldato (37 ° C) 20 mL di terreno di MOPS in un pallone da 250 mL conica e incubare sotto agitazione continua fino a quando raggiunge il OD600 0.3-0.4 (~ 7 h).
    2. Inoculare il mezzo di base sporulazione MOPS (250 mL) con 1% (v/v) pre-cultura dal passaggio 1.3.1 e incubare per 3 giorni a 37 ° C in un matraccio conico litro sotto agitazione continua. Per FM4-64 la colorazione delle spore PS4150, aggiungere 2 µ g/mL FM4-64 sonda (Vedi Tabella materiali) per la sporulazione medio 1 o 2 h dopo aver raggiunto il picco valore600 OD di crescita vegetativa (generalmente circa 2) e consentire la cultura di successivamente sporulare proteggendo da luce5.
  4. Giorno 7: Raccolta di spore
    1. Determinare il rendimento di sporulazione (cellule vegetative di vs di spore) usando microscopia di contrasto di fase a 100 ingrandimenti per distinguere le spore brillante fase da cellule scure fase e possibilmente non maturo spore. Una resa brillante spora 90% fase è previsto.
    2. A pellet le spore a 4.270 x g per 15 min a 4 ° C in provette per centrifuga fondo tondo. Lavare la pallina di spora 2 - 3 volte con 40 mL di acqua di tipo 1 demineralizzata ultrapura sterile in provette centrifuga a fondo conico da 50 mL (Vedi Tabella materiali). Rallentamento a ogni lavaggio a 4.270 x g per 15 min (4 ° C).
  5. Giorno 7: Purificazione di spore
    1. Purificazione di spore: sospendere il pellet di spora in 750 µ l del 20% non ionici densità gradiente medio (Vedi tabella dei materiali) e caricare su 800 µ l di terreno gradienti di densità non ionici di 50% in microcentrifuga sterilizzato. Centrifuga per 60 min a 21.500 x g. Il pellet ottenuto contiene le spore gratis. Sospendere il pellet di spora in 200 µ l di 20% medio gradiente di densità non ionici e caricare su 1 mL di 50% non ionici densità gradiente medio in un tubo del microcentrifuge e centrifugare per 15 min a 21.500 x g.
    2. La spora finale preparazione e deposito di lavaggio: il pellet ottenuto contiene le spore dormienti purificate. Lavare il pellet di spora 2 - 3 volte con 1,5 mL di sterile ultrapura Type 1 acqua (Vedi Tabella materiali) e spin-down in mezzo a 9.560 x g per 15 min a 4 ° C. Infine, sospendere il pellet in acqua ultrapura sterile di tipo 1 a un finale OD600 di circa 30. Aliquote delle spore possono essere conservate a-80 ° C per 8 settimane14.

2. decoating

  1. Spore di PS4150 di trattare con 0,1 M NaCl 0,1 M NaOH/1% sodio dodecil solfato (SDS) / 0,1 M ditiotreitolo (DTT) a 70 ° C per 1 h. lavare le spore 10 volte con sterilizzato ultra-puro tipo 1 acqua15,16. In questo modo, qualsiasi adsorbito FM4-64 sonda nella membrana esterna di spora e strati esterni verranno rimossi.

3. vetrino coprioggetto e preparazione del vetrino11 (Timing: 1 H prima dell'osservazione)

  1. Vetrini coprioggetto pre-pulito ad alta precisione (Vedi tabella materiali) con 1M HCl per 30 min in un bagno d'acqua agitando delicatamente. Lavare i vetrini coprioggetti due volte in acqua ultra-pura di tipo 1 e memorizzarli in 100% EtOH (vol/vol). Lasciate asciugare e verificare la loro chiarezza prima dell'uso. Pre-pulire il vetro scorre in 70% EtOH. Lasciate asciugare e verificare la loro chiarezza prima dell'uso.

4. il campionamento microsfere fluorescenti o spore nel Frame Gene Slide10 (tempo 15 Min)

  1. Pre-riscaldare due 70% EtOH pulita e aria secca vetrini (Vedi tabella materiali) per alcuni secondi su un blocco di riscaldamento 70 ° C, goccia 65 μL di agarosio al 2% sterilizzata tenuto a 70 ° C sulla cima di un vetrino e adagiarvi l'altro vetrino per diffondere la b di agarosio tra le diapositive. La patch di agarosio asciugherà in circa 5 min.
  2. Tagliare la patch di agarosio in una sezione di 1 x 1cm dopo la rimozione di una delle lastre di vetro, aggiungere 0,4 μL di campione (microsfere fluorescenti o spore di ~ 108/ml) e trasferire la patch sul coprioggetto di alta precisione posizionando il coprioggetto sul patch e facendolo scorrere.
  3. Fissare un Gene Frame (1,5 x 1.6 cm2, 65 µ l) della diapositiva secca, sul quale il coprioggetto è inserito tutti gli angoli del telaio, completando così il vetrino per uso in microscopia di chiusura.

5. imaging11,17(Timing: 1 H)

  1. Catturare le immagini di fluorescenza e di trasmissione delle spore nonché una combinazione di rosso e giallo-verde per volta carbossilato microsfere fluorescenti su un microscopio illuminazione strutturata (Vedi tabella materiali) dotato di un 100 x (obiettivo di olio Apertura numerica = 1.49), un software di analisi di immagine e telecamera CCD (Vedi tabella dei materiali). Generare tutte le immagini a temperatura ambiente senza il disturbo della luce ambientale. Assicurarsi di pulire sempre il 100x obiettivo e lo scivolo con etanolo 75% prima di formazione immagine.
  2. Concentrarsi sulle microsfere fluorescenti di 100 nm (diametro) e ottimizzare la funzione di diffusione del punto (psf) regolando l'anello di correzione sull'obiettivo 100x fino ad ottenuta un psf simmetrico, riducendo così al minimo sfocatura dell'immagine. Il psf è la risposta di impulso o la risposta di un sistema di imaging a sorgente puntiforme o punto all'oggetto.
  3. Selezionare un campo di vista con circa 10 microsfere fluorescenti rotonde. Applicare una grata concentrarsi regolazione per entrambi 561 nm e 488 lunghezze d'onda di eccitazione di nm come la guida per il software di analisi di immagine.
  4. Concentrarsi le spore con la luce di trasmissione e catturare un'immagine di luce di trasmissione in modalità media 16 × con esposizioni di 200 ms per ogni immagine.
  5. Catturare immagini fluorescenti raw 3D-SIM delle spore con la modalità di illuminazione "3D-SIM", le impostazioni della fotocamera per modalità di indicazione elettrone moltiplicando (EM) guadagno 10MHz a 14-bit e guadagno di EM a 175. Eccitare la sonda FM4-64 in spore di PS4150 con la luce di laser 561 nm al 20% di potenza laser e un tempo di illuminazione di 400 ms.
  6. Eccitare la GerKB-mCherry e GerD-GFP in KGB80 spore con, rispettivamente, 561 nm luce laser al potere del laser di 30% per 1 s e 488 nm laser al 60% potenza del laser per 3 s. impostazioni di Z-Stack sono in cima al fondo modalità, 0,2 µm / step, 7 punti e 20 passi per germinosome e Analisi IM, rispettivamente.
    Nota: Questi parametri del laser sono stati applicati al fine di assicurare un valore massimo di luminosità della finestra istogramma di circa 4.000 persone.

6. ricostruire immagini Raw 3D-SIM di FM4-64 macchiato PS4150 spore

  1. Eseguire la ricostruzione di fetta di N-SIM per FM4-64 macchiato dati grezzi PS4150 spore. Fare clic sul pulsante Param per Ricostruire fetta sulla scheda pad N-SIM per aprire la finestra di N-SIM fetta ricostruzione.
  2. Impostare i parametri di ricostruzione nella finestra N-SIM fetta ricostruzione . Per ottenere immagini ricostruite perfetti, seguire il suggerimento delle istruzioni N-SIM e fare clic su controlli appropriati nella finestra N-SIM fetta ricostruzione per impostare il Contrasto di modulazione (IMC) di illuminazione per Auto, alta Soppressione di rumore ad alta risoluzione (HRNS) 1.00 e Fuori Focus Blur soppressione (OFBS) a 0,05 come punti di partenza.
  3. Fare clic sul pulsante Fetta di ricostruire nella finestra Ricostruzione fetta N-SIM per ricostruire l'immagine. Valutare la qualità delle immagini ricostruite dalle immagini trasformato FFT (Fast Fourier) e Punteggio di ricostruzione, che visualizza dopo ricostruzione12.
  4. Regolare il HRNS da 0,10 a 5,00 e OFBS da 0,01 a 0,50 cliccando sui controlli appropriati nella finestra N-SIM fetta ricostruzione fino a quando non si ottengono le migliori impostazioni di parametro.
  5. Fare clic sul pulsante applica nella finestra N-SIM fetta emolienti per applicare i parametri modificati. Fare clic sul pulsante Chiudi per chiudere la finestra.
  6. Rendere un FM4-64 macchiato immagine raw di spore di PS4150 attivo e fare clic sul pulsante di Ricostruire fetta sulla scheda SIM N Pad per eseguire la Ricostruzione di fetta. Salvare l'immagine ricostruita.

7. image Analysis

  1. Convertire le immagini di Pseudo-Widefield della germinosome di KGB80
    1. Convertire immagini in formato raw 3D-SIM di KGB80 in Pseudo-Widefield immagini attivando con un click sinistro il plugin di ImageJ SIMcheck utilità Raw Data SI a Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield medie immagini dai dati grezzi di SIM e assembla, per confronto, un'immagine equivalente al convenzionale widefield illuminazione12. Per ImageJ stesso vedere https://imagej.net/Welcome. Selezionare casualmente ~ 25 spore in ogni immagine di trasmissione invertito per un'analisi successiva di germinosome nelle immagini Pseudo-Widefield fluorescente.
    2. Selezionare in totale circa 350 (in questo esempio, 346) KGB80 spore in 14 campi di vista da due diapositive. I numeri di fuochi fluorescente GerD-GFP e GerKB-mCherry in selezionati KGB80 spore dovrebbero essere contati in modo indipendente da due ricercatori. Il ricercatore può fare riferimento per le immagini raw di 3D-SIM in caso di dubbio la presenza di fuochi separati germinosome fluorescente in spore.
    3. Valutare le intensità massime di ogni focus GerD-GFP e GerKB-mCherry e l'intensità integrata dell'immagine 3D di ogni spora KGB80 con ImageJ.
  2. Analizzare le immagini di Pseudo-Widefield della germinosome di KGB80
    1. Utilizzare il valore di intensità media integrato di 7 stack come l'intensità di segnale integrato della spora KGB80. Determinare intensità di sfondo da imaging il ceppo di sfondo PS4150 utilizzando impostazioni identiche. Riguardo macchie fluorescenti in singoli KGB80 spore come i fuochi di germinosome quando sono chiaramente distinguibili dallo sfondo.
    2. Applicare il One-way ANOVA-test per la determinazione del significato con software origine 9.0. considerando i valori di P < 0,05 come statisticamente significativo. Utilizzare di rango coefficiente di correlazione di Spearman18 per valutare la correlazione di GerD-GFP e GerKB-mCherry numero di focolai e le misure dell'intensità del segnale integrato.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il protocollo attuale presenta una procedura di imaging microscopio SIM per le spore batteriche. Le procedure di preparazione di sporulazione e diapositiva sono state effettuate come mostrato nella Figura 1 prima di formazione immagine. Più tardi, sono state applicate le procedure di imaging e l'analisi sia per dim (proteina fluorescente etichettata proteine germinazione) e brillante spora (sonda lipofilica macchiato IM) campioni come indicato nel testo seguente.

Localizzazione di germinosomes in b. subtilis spore

Livelli di GerD e GerKB sono segnalati per essere molecole 3.500 ~ e ~ 700 per spore, rispettivamente, basato su analisi di Western blot di estratti da spore preparate in un media di sporulazione ricca19. Il gerD-gfp e la gerKB-mCherry geni del ceppo di KGB80 sono sotto il controllo del loro promotore nativo. L'abbondanza relativa di basso di proteine di fusione che ha portato a un basso segnale fluorescente durante imaging, quindi era difficile ricostruire tali immagini dim raw SIM mediante l'algoritmo di ricostruzione di SIM. Tuttavia, il microscopio SIM è stato ancora applicato per l'acquisizione di immagini di germinosome, anche se le immagini raw di SIM sono convertite in immagini di Pseudo – Widefield utilizzando SIMcheck (plugin di ImageJ). Inoltre, un imaging 3D sette dello stack è stato implementato per ottenere una migliore visione di questo fuoco IM. Come mostrato nel riquadro a sinistra della Figura 2, due fuochi di GerD-GFP è apparso in diversi stack. La, in totale, tre fuochi di GerD-GFP sono indicati da frecce bianche nello stack di Z3 compositiva della colonna. Il pannello di destra della Figura 2 Mostra una spora con un solo punto focale di GerD-PIL in spora, come evidenziato dalla freccia bianca nello stack di Z4 della colonna composita. In totale, circa il 40% e il 50% delle spore aveva due o uno GerD-GFP e GerKB-mCherry cluster, rispettivamente (tabella 1). Tra le 346 spore esaminate, due hanno avuti 4 fuochi di GerD-GFP, e una spora aveva anche 5 fuochi di GerD-GFP. Notevolmente, nelle nostre mani, il numero dei fuochi di GerD-GFP e GerKB-mCherry nella spora stesso non era sempre le stesse18. Come il microscopio SIM non aveva alcuna opzione di contrasto di fase, abbiamo usato la microscopia chiara trasmissione per la localizzazione di spora. Così, le spore vengono visualizzati con un nucleo scuro e denso circondato da un alone luminoso.

ImageJ è stata misurata l'intensità di fluorescenza integrata delle spore di KGB80. Spore, che avevano 0, 4 o 5 fuochi non sono stati inclusi nella nostra analisi statistica a causa della loro bassa frequenza. C'era un'alta correlazione positiva tra GerD-GFP e intensità di GerKB-mCherry integrato (coefficiente di correlazione di Spearman rank = 0,73). Mentre l'intensità integrata della proteina dell'impalcatura GerD-GFP era differente fra diverse popolazioni (Figura 3), l'intensità integrata di GerKB-mCherry era circa lo stesso in diverse popolazioni (Figura 3D). L'intensità di fluorescenza massima dei fuochi di GerD-GFP e GerKB-mCherry ha teso a diminuire, quando la spora aveva fuochi multipli (Figura 3A, B). La fluorescenza massima di tutti i punti luminosi, considerati come i fuochi di germinosome, era superiore alla massima auto-fluorescenza di PS4150 spore (spore dal ceppo sfondo KGB80; Figura 3A B).

Organizzazione della membrana interna

Come accennato nell'introduzione, germinosome proteine si trovano a IM di spore. Tuttavia, alcuni dettagli sono noti circa le proprietà biofisiche di questa membrana in gran parte immobile. Esplorare più dettagli, come ad esempio organizzazione locale di IM, promuoverebbe la comprensione dell'organizzazione delle proteine IM, in particolare GRs e proteine canale. Spore di Bacillus subtilis hanno una struttura composta da più strati concentrici, e una sonda lipofilica non può facilmente passare attraverso questi strati multipli per macchiare il IM che circonda il nucleo di spora. Il passaggio di tali sonde molto probabilmente è ostacolato dagli strati ricchi di proteine cappotto e forse anche la membrana esterna20,21. Per ovviare a questo problema, il colorante lipofilico membrana FM4-64 è stato aggiunto ad una cultura di PS4150 durante la sporulazione. Così facendo, la membrana delle cellule vegetativa di PS4150 era macchiata di FM4-64 e così membrane in forespores ottenuta da questa cultura presso la divisione cellulare asimmetrica sporulazione e successive prespora engulfment sono ben macchiate5. Di conseguenza, le membrane di spora matura possono essere visualizzate. Uno studio precedente ha indicato che la maggior parte se non tutti del FM4-64 è nel IM in spore puliti5. Durante un periodo di circa 2 settimane di incubazione e trattamenti di purificazione di spora, le procedure di lavaggio applicate rimuovere qualsiasi FM4-64 dalla membrana esterna, quest'ultimo in modo efficace viene rimosso a seguito del trattamento decoating e ampie fasi di lavaggio 5. Tuttavia, la procedura di decoating non rimuove nessun FM4-64 dal IM, né ha alcun effetto sui fuochi5,germinosome6. Che cosa ci ha eccitato è che macchie luminose FM4-64 simili ai fuochi di germinosome apparso in entrambi intatto (Figura 4A, B) e disassemblata spore (Figura 4, D) di spore di PS4150. Queste macchie luminose di FM4-64 potrebbero essere implicate in clustering di proteine germinosome nel IM.

Figure 1
Figura 1: Panoramica di preparazione sporulazione e diapositiva. Una panoramica visualizzati i passi iniziali necessari prima di formazione immagine. Dettagliate informazioni sono riportate nel protocollo. (A), lo schema della procedura di sporulazione in definito MOPS minimo medio. Un PS4150 di b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) o KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto gerD-gfp kan) singola Colonia è stato coltivato in 5 mL di terreno ricco di LB e adattato in 5 mL e 20 mL di MOPS medio a sua volta e infine sporulate in 250 mL di terreno di MOPS. Una cultura di inizio fase esponenziale (OD600, 0.3-0.4) viene utilizzata in tutte le culture intermedie. FM4-64 (2 µ g/mL) è stato aggiunto al medium della sporulazione PS4150 per membrana spora colorazione 1 o 2 h dopo aver raggiunto il valore di picco OD600 . (B) metodo di raccolta spore dalla cultura di sporulazione MOPS e purificante spore di centrifugazione in gradiente di densità. (C) la procedura di stabilizzazione spore sul pad di agarosio 1% in un alloggiamento del telaio di gene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rappresentativo Pseudo-Widefield (PWF) 3D immagini di GerD-GFP e GerKB-mCherry fuochi in immagini raw di due KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto gerD-gfp kan) dormiente spore 3D-SIM sono state scattate con eccitazione a doppio canale (561nm, potere del laser di 30%, 1 60% s e 488nm, laser di potenza, 3 s) con 7 passaggi dall'alto verso il basso Z-stack. Successivamente, le immagini raw di SIM sono convertite in immagini 3D Pseudo-Widefield utilizzando il plugin di ImageJ SIMcheck. Da sinistra a destra, 3D immagini (Z2-Z5) di GerD-GFP (green), GerKB-mCherry (rosso) e le corrispondenti immagini composite di due spore di KGB80 (i e ii) sono mostrate nel pannello. Immagini di illuminazione di trasmissione (Trans) delle due spore (i e ii) ha indicato la posizione delle spore che vengono visualizzati come immagini dense scuri circondati da un alone luminoso. Barra della scala = 1 µm e tutti i pannelli sono allo stesso ingrandimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'intensità di fluorescenza massima di GerD-GFP in KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto gerD-gfp kan) dormiente spore e l'intensità massima auto-fluorescenza di PS4150 spore in unità arbitrarie. Tutte le spore sono state illuminate dalle impostazioni indicate il protocollo. Pannelli (A) e (B) Mostra l'intensità della fluorescenza massima dei fuochi GerD-GFP e GerKB-mCherry, rispettivamente, a KGB80 dormiente spore anche come in entrambi i casi l'intensità massima auto-fluorescenza delle spore padre PS4150. Pannelli (C) e (D) mostrano l'intensità di fluorescenza integrata dei fuochi GerD-GFP e l'intensità di fluorescenza integrata dei fuochi GerKB-mCherry, rispettivamente, in b. subtilis KGB80 spore dormienti. Abbiamo usato il One-way ANOVA-test per la determinazione del significato delle differenze nel punto focale massima intensità e intensità di fluorescenza di spora integrato con software origine 9.0 considerando i valori di P < 0,05 come significativi. Spore con i fuochi di 4 o 5 sono stati esclusi dall'analisi a causa della loro scarsa abbondanza. I dati sono rappresentati in dentellato BoxPlot. Le tacche nelle trame sono attorno ai valori mediani osservati con loro larghezza proporzionali per lo scarto interquartile (IQR). I baffi mostrati rappresentano un massimo di 1.5 la differenza Interquartile. Gli asterischi indicano una differenza significativa di valori mediani. GerD-GFP e intensità di fluorescenza GerKB-mCherry integrato hanno una forte correlazione positiva (coefficiente di correlazione di Spearman = 0,73)18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rappresentativo Pseudo-Widefield (PWF) immagini (A e C) e immagini ricostruite di SIM (B e D) del FM4-64 macchiato IM di b. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) spore. FM-464 fu incorporata di spore durante la sporulazione. Immagini raw 3D-SIM di spore intatte (A e B) e disassemblate spore (C e D) sono state scattate con l'eccitazione di un canale (561 nm laser, potenza laser 20%, 400 ms) utilizzando un alto 25 passo verso il basso dello stack Z. Successivamente, i dati grezzi di SIM è stati ricostruiti dal microscopio software di imaging (Vedi Tabella materiali) in immagini 3D-SIM, o convertiti in PWF di SIMcheck (plugin di ImageJ). Le frecce ciano puntano ai fuochi di FM4-64 nel IM nel pannello B e D. Barra della scala = 1 μm e tutti i pannelli sono allo stesso ingrandimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ceppo Spore contate Fuochi Fuochi a spora (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 GerD-GFP 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Tabella 1: Presenza di fuochi in spore KGB80. Il numero di fuochi germinosome per spore in una popolazione di dual etichettato KGB80 di b. subtilis (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto gerD-gfp kan) spore dormienti. In spore di fluorescenza è stato contato come i fuochi di germinosome quando intensità massima un focus' era superiore all'intensità di auto-fluorescenza, che è stata l'intensità massima del PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) dormiente spore eccitato dalle stesse impostazioni di illuminazione come le spore di KGB80.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il protocollo presentato contiene una procedura di 3D-SIM standard per l'analisi di FM4-64 macchiato di spore di Bacillus subtilis che include la sporulazione, preparazione del vetrino e processi di imaging. Inoltre, il protocollo descrive un SIMcheck modificato (ImageJ)-assistita processo per microscopia SIM di germinosomes di spore di Bacillus subtilis etichettati con reporter fluorescenti di imaging 3D. La procedura di quest'ultima ci ha permesso di osservare questa sottostruttura dim con maggiore contrasto. Accoppiando due procedure di imaging, è possibile visualizzare sub-strutture discrete nella stessa spora con il microscopio SIM stesso, migliorando così la nostra base per una comprensione meccanicistica del processo di germinazione. Si noti che la procedura funziona a una risoluzione laterale di ~ 100 nm e una risoluzione assiale di ~ 200-250 nm. Questo è meglio che l'approccio di largo campo microscopia di contrasto di interferenza differenziale (DIC) utilizzato da Griffith7. Analisi dell'aspetto di germinosome all'inizio della germinazione sarebbe un passo successivo desiderato risolta in tempo. Purtroppo, anche se SIM microscopia è in linea di principio compatibile con live-imaging, a causa della natura dim del germinosome segnala tale SIM risolta in tempo, analisi non sono fattibili a causa di candeggio rapido dei campioni durante l'acquisizione di immagini. Al fine di ottenere sufficiente spore per l'analisi, è fondamentale per assicurarsi che quello Sporulazione avviene in modo efficiente. I ricercatori devono pertanto controllare efficienza di sporulazione meticolosamente con 90% di efficienza come destinazione. Nei risultati della rappresentativi, in spore dormienti, rispettivamente ~ 50% e il 40% di tutte le spore hanno uno o due GerD-GFP e fuochi GerKB-mCherry (tabella 1). La percentuale di spore con due fuochi è molto superiore a quello riportato da Griffiths precedentemente7. Ci sono diversi motivi che potrebbero spiegare il risultato diverso nel lavoro attuale. In primo luogo, il processo di imaging 3D potrebbe facilitare il rilevamento di altri fuochi. Diversi fuochi in spora stesso si trovano in posizioni diverse in direzione verticale come mostrato nella Figura 1. In secondo luogo, la telecamera CCD (Tabella materiali) e l'unità laser attrezzato al microscopio SIM contribuire in modo significativo i risultati di formazione immagine. In terzo luogo, simile all' approccio di Griffiths7 media decine di immagini consecutive per una migliore analisi di immagine, l'immagine di Pseudo-Widefield del germinosome era anche un'immagine media da immagini raw di SIM (5 fasi e 3 orientamenti immagini). Infine, la sporulazione medio e condizioni di sporulazione, una variabile importante nella determinazione delle proprietà di spora, sono nel nostro lavoro diverse da quello utilizzato in precedenza. Griffiths et al.7 utilizzato ricco 2 x di Schaeffer-glucosio (2 x SG) medio per sporulazione, mentre un definito MOPS minimo mezzo tamponato lavorava qui. Diversi lavori hanno dimostrato che condizioni e media di sporulazione avere effetti significativi sulla composizione proteica, resistenza, e germinazione di b. subtilis spore22,23,24 , 25. infatti, è stato dimostrato che i livelli delle subunità GR sono 3 - 8 volte inferiore in spore ottenute su un mezzo povero rispetto a quelli ottenuti su rich-media. GerD livelli erano inoltre circa 3.5-fold più bassi in spore medie scarse, e queste spore ha richiesto più tempo per iniziare la germinazione di spore26. Tuttavia, è non chiaro se sporulazione condizioni influenzano anche il numero dei fuochi di germinosome osservato.

Ramirez-Peralta et al..' s risultati26 hanno indicato che i tassi di nutrienti germinazione delle spore a livelli di popolazione sono influenzati significativamente dai livelli di proteine di germinazione e GerD. Se le intensità fluorescente integrate a spore da reporter fluorescenti sono direttamente proporzionali ai livelli di GerD e GerKB proteine di fusione, livelli di entrambe le proteine di fusione differiscono da ampiamente nelle spore KGB80, che è in accordo con precedenti lavori 7. questa eterogeneità di livello di proteina potrebbe essere correlata a eterogeneità di germinazione di spore osservato a livello di singola spora, e germinosome i fuochi numero potrebbe essere un altro fattore che contribuisce all'eterogeneità di germinazione di spore. Ulteriori esperimenti si concentreranno sull'analisi dei possibili effetti che germinosome il numero dei fuochi e composizione di proteine germinazione fuochi (non tutti i germinosomes può essere uguale nella composizione proteica di germinazione) potrebbe avere sulla eterogeneità di germinazione. I dati hanno dato origine a un numero di domande di ricerca correnti tra cui: i) Qual è il ruolo di GerD in clustering di GRs a IM; e ii) sono come le due altre GRs, GerA e GerB, organizzati presso la spora IM?

Il protocollo presentato per i campioni di spora fioco e luminoso rende possibile visualizzare sub-strutture discrete in spora stessa da microscopia SIM. FM4-64 punti luminosi che sono stati osservati in spore potrebbero essere a causa di vasto pieghevole dell' IM27. In alternativa, possiamo ipotizzare che queste regioni sono aree di IM dove la tintura potrebbe più facilmente accedere a causa di una maggiore fluidità IM locale. Tali regioni di maggiore fluidità (RIFs) può essere organizzato dall'omologo dell'actina del citoscheletro MreB, ben noto per la sua concentrazione del fluido acil breve catena lipidi28,29. Notevolmente, applicando la stessa procedura di selvaggio-tipo Bacillus subtilis spore porta anche a un simile modello di punti luminosi FM4-64 (nostre osservazioni non pubblicate). In cellule vegetative di Bacillus subtilis , un potenziale di membrana compresso provoca il clustering di MreB e RIFs29. La membrana interna del dormiente spore probabile ha una relativa membrana basso potenziale20,21 e contiene livelli rilevabili di MreB30 che potrebbe condurre al clustering di RIFs in domini di grandi dimensioni di elevata fluidità29 . Se tali domini potrebbero coincidere con la presenza di germinosomes è attualmente sotto inchiesta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Conflitti di interesse non dichiarati.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Christiaan Zeelenberg per la sua assistenza durante l'imaging di SIM. JW riconosce il Consiglio di borsa di studio di Cina per una borsa di dottorato e grazie Irene Stellingwerf per il suo aiuto durante la fase primaria di imaging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).

Tags

Bioingegneria problema 146 batteri Gram-positivi Bacillales microscopia microbiologia organismi batteri analitica diagnostico e terapeutico tecniche e attrezzature tecniche Investigative scienze biologiche Scienze della vita (generale) Bacillus Spore proteine di germinazione Germinosomes membrana interna di Spore super microscopia ad alta risoluzione microscopia a fluorescenza
Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in <em>Bacillus subtilis</em> spore
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M.… More

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M. M., Setlow, P., Brul, S. Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (146), e59388, doi:10.3791/59388 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter