Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Visualisering av Germinosomes og interne membran i Bacillus subtilis Spores

Published: April 15, 2019 doi: 10.3791/59388
Automatic Translation
1, 1, *2,3, *4, *1
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health
* These authors contributed equally

Summary

Germinant reseptor proteiner klynge i 'germinosomes' i indre membran av Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver en protokoll som super-oppløsning mikroskopi og fluorescerende reporter proteiner for å visualisere germinosomes. Protokollen identifiserer også spore indre membran domener som er fortrinnsvis beiset med membran fargestoff FM4-64.

Abstract

Den lille størrelsen på sporer og relativt lav overflod av spiring proteiner, føre til vanskeligheter i sine mikroskopiske analyser bruker epifluorescence mikroskopi. Super-oppløsning tredimensjonalt strukturert belysning mikroskopi (3D-SIM) er et lovende verktøy for å overvinne dette hinderet og avsløre molekylær detaljer av spiring av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Her beskriver vi bruk av en modifisert SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D avbildingsprosessen og fluorescerende reporter proteiner for SIM mikroskopi av B. subtilis spores germinosomes, sektorgruppene spiring proteiner. Vi presenterer også en (standard) 3D-SIM tenkelig prosedyre for FM4-64 farging av B. subtilis spore membraner. Ved hjelp av disse prosedyrene, vi fikk uovertruffen løsning for germinosome lokalisering og viser at > 80% av B. subtilis KGB80 sovende sporer innhentet etter sporulation på definerte minimal MOPPER medium har én eller to GerD-GFP og GerKB-mCherry Foci. Lyse foci ble også observert i FM4-64 farget spores 3D-SIM bilder foreslå at indre membran lipid domener av ulike flyt sannsynlig finnes. Videre er studier som bruker dobbel merking prosedyrer med membran fargestoffer og germinosome reporter proteiner vurdere co lokalisering og dermed få en optimal oversikt over organiseringen av Bacillus spiring proteiner i indre spore membranen mulig.

Introduction

Sporer av Bacillales og Clostridiales er metabolically sovende og ekstremt motstandsdyktig mot harde dekontaminering regimer, men med mindre de spire, kan forårsake skadelige effekter i mennesker1. Næringsstoff germinant utløste spiring av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer er hendelsen innvielse germinant binding til germinant reseptorer (GRs) i spore's indre membran (IM). Deretter transduce GRs signal å SpoVA kanal protein også plassert i chat. Dette resulterer i utbruddet av utveksling av spore kjernen pyridine-2,6-dicarboxylic syre (dipicolinic acid; DPA; bestående av 20% av spore kjernen tørr wt) for vann via SpoVA kanalen. Deretter DPA utgivelsen utløsere aktivering av cortex Peptidoglykan hydrolyse og vann opptak følger2,3,4. Disse hendelsene fører til mekanisk stress på frakken lagene, det påfølgende bruddet, utbruddet av utvekst og, endelig, vegetativ vekst. Men er den eksakte molekylære detaljer om spiring prosessen fortsatt langt fra løst.

Viktige spørsmål om spore spiring bekymringer Biofysiske egenskapene av lipider rundt IM spiring proteiner som IM SpoVA kanal proteiner. Denne hovedsakelig immobile IM lipid bilayer er den viktigste permeabilitet barrieren for mange små molekyler, inkludert giftige kjemiske konserveringsmidler, noen som utøver sin handling i spore kjernen eller vegetative cellen cytoplasma5,6. IM lipid bilayer er sannsynlig i gel tilstand, selv om det er en betydelig andel av mobile lipider i IM5. Spore's IM også har potensial for betydelig utvidelse5. Dermed øker arealet av chat 1.6-fold på spiring uten ekstra membran syntese og ledsages av tap av denne membranen karakteristiske lav permeabilitet og lipid ubevegelighet5,6.

Mens molekylær detaljer om aktivering av spiring proteiner og organisering av IM lipider i sporene er attraktive emner for studier, utgjør den lille størrelsen på B. subtilis sporer og relativt lav overflod av spiring proteiner, en utfordring til mikroskopiske analyser. Griffiths et al. overbevisende epifluorescence mikroskop bevis, antyder bruke fluorescerende journalister smeltet spiring proteiner, at i B. subtilis sporer stillaset protein GerD organiserer tre GR underavdelinger (A, B og C) for GerA, B og K GRs, i en klynge7. De innførte begrepet "germinosome" for denne klyngen spiring proteiner og beskrevet strukturer som ~ 300 nm store IM protein foci8. Ved innvielsen av spore spirende, fluorescerende germinosome foci slutt endre i større spre fluorescerende mønstre, med > 75% av spore befolkningsgrupper viser dette mønsteret i sporer spirer 1t med L-Valin8. Merk at papiret nevnt ovenfor brukte gjennomsnitt bilder fra dusinvis av påfølgende fluorescerende bilder, å få statistisk makt og overvinne hinder lav fluorescerende signaler observert under bildebehandling. Denne effekten av disse strukturene i bakteriell sporer var på kanten av det er teknisk mulig med klassisk mikroskopiske verktøy og verken en evaluering av fokus i en enkelt spore eller deres mer detaljert subcellular lokalisering var mulig med denne tilnærmingen.

Her viser vi bruk av strukturert belysning mikroskopi (SIM) å få en detaljert visualisering og måling av germinosome(s) i sporer av B. subtilis, samt deres IM lipid domener9. Protokollen inneholder også instruksjoner sporulation, lysbilde og bildeanalyse av SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) og ImageJ10,11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. B. subtillis Sporulation (Timing: 7 dager før mikroskopiske observasjon)

  1. Dag 1
    1. Strek en bakteriell kultur på en Luria-Bertani kjøttkraft (LB) agar plate (1% tryptone 0,5% gjærekstrakt 1% NaCl, 1% agar)13 og ruge over natten på 37 ° C å få enkelt kolonier. Bruke B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katten, gerD-gfp kan) belastning og dens overordnede bakgrunn belastning B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) som beskrevet tidligere7.
      Merk: Bruk av sporer med ΔcotEΔgerE bakgrunn er viktig i germinosome visualisering, for å minimere autofluorescence av spore pels lag7.
    2. Sterilisere alle medier, rør, Pipetter for flergangsbruk og andre kultur materialer for bruk med egnede metoder.
  2. Dag 2
    1. Vaksinere en enkelt koloni i 5 mL av LB medium tidlig på morgenen og ruge kulturen under kontinuerlig uro i et skrukork rør på 200 rpm/min og 37 ° C til OD600 når 0.3-0,4 (ca 7 h).
    2. Gjøre 500 mL MOPPER medium (pH 7.5) som inneholder 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1.32 mM K2HPO4, 0.4 mM MgCl2·6H2O, 0.276 mM K2så4, 0,01 mM FeSO4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPPER, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glukose-monohydrat, og 10 mM NH4Cl.
    3. Forberede i skrukork rør 10-1- 10-7 føljetong fortynninger av LB kulturen i 5 mL MOPPER medium hver og ruge kulturer over natten under kontinuerlig agitasjon på 200 rpm/min og 37 ° C.
      Merk: De serielle fortynninger forberedt her mål å få en fortynning i eksponentiell tidligfasen i neste morgen. Dette trinnet og det neste trinnet er nødvendig for at cellene å tilpasse seg MOPPER bufrede vekstmediet.
  3. Dag 3
    1. Velg ett av MOPPER fortynninger med et OD600 av 0.3-0,4. Vaksinere 0,2 mL kulturen til forvarmes (37 ° C) 20 mL MOPPER medium i en konisk 250 mL kolbe og ruge under kontinuerlig agitasjon til OD600 når 0.3-0,4 (~ 7 h).
    2. Vaksinere MOPPER basert sporulation mediet (250 mL) med 1% (v/v) før kultur fra trinn 1.3.1 og ruge for 3 dager på 37 ° C i en konisk liter kolbe under kontinuerlig agitasjon. For FM4-64 flekker av PS4150 sporer, legge 2 µg/mL FM4-64 sonde (se Tabell of Materials) til sporulation medium 1 eller 2 h etter å ha nådd toppen OD600 verdien av vegetativ vekst (vanligvis ca 2) og tillate kulturen til senere sporulate mens beskytte det fra lys5.
  4. Dag 7: Høsting av sporer
    1. Bestemme sporulation avkastningen (sporer vs vegetative celler) bruker fase kontrast mikroskopi på 100 X forstørrelse for å skille fase lyse spores fra fase mørke celler og muligens ikke moden spores. En 90% fase lyse spore yield ventes.
    2. Pellets spores 4,270 x g i 15 min på 4 ° C i runde bunnen sentrifuge rør. Vask spore pellet 2 - 3 ganger med 40 mL steril ultra ren Type 1 fullt demineralisert vann i 50 mL konisk sentrifuge rør (se Tabell for materiale). Spinn ned hver vask 4,270 x g i 15 min (4 ° C).
  5. Dag 7: Spore rensing
    1. Spore rensing: avbryte spore pellet 750 µL av 20% ikke-ionisert tetthet gradert medium (se tabell av materialer) og laste opp 800 µL av 50% ikke-ionisert tetthet gradert medium i steriliserte microcentrifuge rør. Sentrifuger for 60 min 21,500 x g. Pellet innhentet inneholder gratis spores. Avbryte spore pellet 200 µL av 20% ikke-ionisert tetthet gradert medium og laste inn 1 mL av 50% ikke-ionisert tetthet gradert medium i en microcentrifuge rør, og sentrifuger i 15 min 21,500 x g.
    2. Vaske den endelige spore forberedelse og lagring: pellet innhentet inneholder renset sovende spores. Vask spore pellet 2 - 3 ganger med 1,5 mL steril ultra ren Type 1 vann (se Tabell for materiale) og spin-ned mellom 9,560 x g i 15 min på 4 ° C. Til slutt, utsette pellets i sterilt ultra ren Type 1 vann til en siste OD600 på ca 30. Dele spores kan lagres ved-80 ° C i 8 uker14.

2. decoating

  1. Behandle PS4150 sporer med 0.1 M NaCl/0.1 M NaOH/1% natrium dodecyl sulfate (SDS) / 0.1 M dithiothreitol (DTT) ved 70 ° C i 1 h. vaske spores 10 ganger med sterilisert ultra ren Type 1 vann15,16. Dermed noen adsorbert FM4-64 sonde i spore's ytre membran og ytre lag vil bli fjernet.

3. dekkglassvæske og lysbildet forberedelse11 (Timing: 1t før observasjon)

  1. Pre ren høy presisjon coverslips (se tabell av materialer) med 1 M HCl i 30 minutter i en forsiktig risting vannbad. Vask coverslips to ganger i ultra ren Type 1 vann, og lagre dem i 100% (vol/vol) EtOH. La dem tørke og bekrefte deres klarhet før bruk. Pre rent glass lysbildene i 70% EtOH. La dem tørke og bekrefte deres klarhet før bruk.

4. prøvetaking fluorescerende mikrosfærer eller Spores i genet rammen Skyv10 (Timing 15 Min)

  1. Forvarm to 70% EtOH renset og luft tørket glass lysbilder (se tabell av materialer) i flere sekunder på 70 ° C oppvarming blokk, slippe 65 μL sterilisert 2% agarose på 70 ° C over et glass lysbilde og plasser den andre objektglass på å spre agarose b mellom lysbildene. Agarose oppdateringen vil tørke i ca 5 min.
  2. Cut agarose oppdateringen til en 1 x 1cm inndeling etter fjerning av en glass lysbildene, tilsett 0,4 μL av prøven (fluorescerende mikrosfærer eller sporer av ~ 108/mL) og overføre oppdateringen på høy presisjon dekkglassvæske ved å plassere dekkglassvæske på oppdateringen og glir det av.
  3. Fikse en Gene Frame (1,5 x 1.6 cm2, 65 µL) på tørket lysbildet som dekkglassvæske plasseres lukke alle hjørnene i rammen, derfor fullfører lysbildet for bruk i mikroskopi.

5. imaging11,17(Timing: 1t)

  1. Fange overføring og fluorescens bilder av sporer og en blanding av rød og gul-grønne carboxylate endret fluorescerende mikrosfærer på strukturert belysning mikroskop (se tabell av materialer) utstyrt med 100 x olje objektiv ( Numerisk Aperture = 1,49), en CCD kamera og bildet analyseprogramvare (se tabell av materialer). Generere alle bilder ved romtemperatur uten forstyrrelse av omgivelseslys. Kontroller at du rengjør alltid 100 x mål og lysbildet med 75% etanol før bildebehandling.
  2. Fokus på 100 nm (diameter) fluorescerende mikrosfærer og optimalisere funksjonen Poenget spredning (psf) ved å justere korreksjon ringen på 100 x målet til en symmetrisk psf er oppnådd, således minimere sløret av bildet. Psf er impuls svar eller svar av en tenkelig system til et punkt kilde eller punkt objekt.
  3. Velg en synsfelt med ca 10 runde fluorescerende mikrosfærer. Bruke en rist fokus justering for både 561 nm og 488 nm eksitasjon bølge lengder som guide for bildet analyseprogramvare.
  4. Fokus spores med overføring lys og få overføring lys bildet i 16 × gjennomsnittlig modus med 200 ms eksponeringer for hvert bilde.
  5. Fange 3D-SIM fluorescerende råbilder av spores med belysning modus "3D-SIM", kamerainnstillingene avlesning modus Electron multiplisere (EM) få 10MHz på 14-bits, og EM gevinst på 175. Opphisse FM4-64 sonden i PS4150 spores med 561 nm laserlys på 20% laser makt og en belysning tid på 400 ms.
  6. Opphisse GerKB-mCherry og GerD-GFP i KGB80 sporer med henholdsvis 561 nm laserlys på 30% laser makt for 1 s og 488 nm laserlys på 60% laser makt for 3 s. Z-Stack innstillinger er i topp til bunn modus, 0,2 µm / steg, 7 trinn og 20 trinn for germinosome og IM analyse, henholdsvis.
    Merk: Parameterne laser ble brukt for å sikre maksimal lysstyrkeverdien vinduet histogrammet på rundt 4000.

6. rekonstruere 3D-SIM rå bilder av FM4-64 farget PS4150 sporer

  1. Utføre N-SIM skive gjenoppbygging for FM4-64 farget PS4150 spores rådata. Klikk Param for Rekonstruere stykke på N-SIM pad kategorisiden åpne N-SIM skive gjenoppbygging.
  2. Angi parametere for gjenoppbygging i vinduet N-SIM skive gjenoppbygging . For å få perfekte rekonstruert bilder, følger av N-SIM instruksjonene og klikk på de aktuelle kontrollene i vinduet N-SIM skive rekonstruksjon sette Belysning modulering kontrast (IMC) til Auto, høy Oppløsning støy undertrykkelse (HRNS) til 1.00 og Ut av fokus Blur undertrykkelse (OFBS) til 0,05 som utgangspunkt.
  3. Klikk Rekonstruere skive i vinduet N-SIM skive rekonstruksjon å rekonstruere bildet. Vurdere kvaliteten på rekonstruert bildene av Fast Fourier transformeres (FFT) bilder og gjenoppbygging score, som viser etter gjenoppbygging12.
  4. Justere HRNS fra 0,10 5.00 og OFBS 0,01 til 0,50 ved å klikke på riktige kontroller i vinduet N-SIM skive gjenoppbygging til beste parameterinnstillingene er oppnådd.
  5. Klikk Bruk -knappen i vinduet N-SIM Slice Reconstuction gjelder endret parametere. Klikk Lukk for å lukke vinduet.
  6. Gjøre en FM4-64 farget PS4150 sporer råbildebehandling aktiv og klikk knappen Rekonstruere stykke på kategorisiden N-SIM Pad å utføre Skive gjenoppbygging. Lagre rekonstruert bildet.

7. bildeanalyser

  1. Konvertere Pseudo-Widefield bilder av KGB80 germinosome
    1. Konvertere 3D-SIM rå bilder av KGB80 i Pseudo-Widefield bilder av med venstre klikk ImageJ plugin SIMcheck verktøyet Rå Data SI Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield gjennomsnitt bilder fra SIM rådata og samler, for sammenligning, et bilde tilsvarende konvensjonell widefield belysning12. ImageJ se selv https://imagej.net/Welcome. Tilfeldig velge ~ 25 sporer i hvert invertert overføring bilde for senere germinosome analyse i fluorescerende Pseudo-Widefield bilder.
    2. Velg i totalt ca 350 (i denne eksempel 346) KGB80 sporer i 14 synsfelt fra to lysbilder. GerD-GFP og GerKB-mCherry fluorescerende foci tallene i valgte KGB80 sporer skal telles uavhengig av to forskere. Forskeren kan referere tilbake til 3D-SIM raw-bilder når du er i tvil av tilstedeværelsen av separate fluorescerende germinosome foci i sporene.
    3. Vurder de maksimale intensitet hver GerD-GFP og GerKB-mCherry fokus og integrert intensiteten av hver KGB80 spore's 3D image med ImageJ.
  2. Analysere Pseudo-Widefield bilder av KGB80 germinosome
    1. Bruke mener integrert intensitetsverdien av 7 stabler som integrert signal intensiteten av KGB80 spore. Bestemme bakgrunn intensiteter av imaging bakgrunn belastningen PS4150 med identiske innstillinger. Hensyn fluorescerende flekker i individuelle KGB80 sporer som germinosome foci når de er klart kan skilles fra bakgrunnen.
    2. Bruke enveis ANOVA-tester for betydning vilje med programvare opprinnelse 9.0. vurderer P-verdier < 0,05 som statistisk signifikant. Bruk Spearmans rang korrelasjonskoeffisienten18 å vurdere sammenhengen til GerD-GFP og GerKB-mCherry foci og målinger av integrert signal intensiteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gjeldende protokollen presenterer en SIM mikroskop tenkelig prosedyre for bakteriell sporer. Sporulation og skyv forberedelse prosedyrene ble utført som vist i figur 1 før bildebehandling. Senere, bildebehandling og analyse prosedyrene ble brukt både for dim (fluorescerende protein merket spiring proteiner) og lyse (lipofile sonde farget IM) spore prøver som vist i følgende tekst.

Lokalisering av germinosomes i B. subtilis sporer

GerD og GerKB rapporteres å være ~ 3500 og ~ 700 molekyler per spore, henholdsvis basert på Western blot analyser av ekstrakter fra spores i en rik sporulation middels19. Både gerD-gfp og gerKB-mCherry gener i KGB80 belastningen er under kontroll av deres opprinnelige promotor. Relative lave overflod av fusion proteiner førte til et lite lysstoffrør signal under bildebehandling, så det var vanskelig å rekonstruere slik svak rådatafiler fra SIM av SIM rekonstruksjon algoritmen. Imidlertid ble SIM mikroskopet fortsatt brukt til germinosome bilde oppkjøpet, men rå SIM bildene ble omgjort til Pseudo-Widefield bilder av SIMcheck (ImageJ plugin). I tillegg ble en syv stabel 3D-bildebehandling gjennomført for å få bedre oversikt over dette IM fokus. Som vist i det venstre panelet i figur 2, to foci av GerD-GFP dukket opp i forskjellige stabler. Totalt tre GerD-GFP fokus indikeres av de hvite pilene i compositive kolonnen Z3 stabel. Det høyre panelet på figur 2 viser en spore med bare ett samlingspunkt for GerD BNP i spore som gjenspeiles av den hvite pilen i sammensatte kolonnen Z4 stabel. Totalt rundt 40% og 50% av sporer hadde to eller en GerD-GFP og GerKB-mCherry cluster, henholdsvis (tabell 1). Blant 346 spores undersøkt, to fikk 4 GerD-GFP foci, og en spore hadde 5 GerD-GFP foci. Merkbart, i våre hender var antall GerD-GFP og GerKB-mCherry fokus på samme spore ikke alltid de samme18. SIM mikroskopet hadde ingen fase kontrast alternativet, brukte vi overføring * lys for spore lokalisering. Dermed vises spores med en mørk og tett kjerne omgitt av en lysere halo.

Integrert fluorescens intensiteten av KGB80 sporer ble målt ved ImageJ. Sporer, som hadde 0, 4 eller 5 foci var ikke inkludert i våre statistisk analyse på grunn av deres lave frekvenser. Det var en høy positiv korrelasjon mellom GerD-GFP og GerKB-mCherry integrert intensiteter (Spearman rang korrelasjonskoeffisienten = 0.73). Mens integrert intensiteten av GerD-GFP stillaset protein var forskjellig mellom ulike befolkningsgrupper (Figur 3 c), var integrert intensiteten av GerKB-mCherry om det samme i ulike befolkningsgrupper (figur 3D). Maksimal fluorescens intensiteten av GerD-GFP og GerKB-mCherry foci tendens til å redusere, når spore hadde flere foci (figur 3A, B). Den maksimale fluorescensen av alle lyse flekker, betraktes som germinosome foci, var større enn den maksimale auto-fluorescensen av PS4150 sporer (sporer fra bakgrunnen stammen KGB80; Figur 3A B).

Organisering av interne membran

Som nevnt i innledningen, ligger germinosome proteiner i spore's IM. Imidlertid er få detaljer kjent om Biofysiske egenskapene til denne hovedsakelig immobile membranen. Utforske flere detaljer, for eksempel det IM lokal organisasjon, ville fremme forståelsen av organiseringen av IM proteiner, bestemt GRs og kanal proteiner. B. subtilis sporer har en struktur bestående av flere konsentriske lag, og en lipofile sonde ikke kan lett passere gjennom disse flere lag til stain IM rundt spore kjernen. Passasjen av slike sonder er sannsynligvis hindret av proteinrik pels lag og kanskje også ytre membran20,21. Du løser dette problemet, lagt lipofile membran fargestoff FM4-64 til en PS4150 kultur under sporulation. Dermed PS4150 vegetative cellemembranen var farget av FM4-64, og dermed membraner i forespores fra denne kulturen asymmetrisk sporulation celledeling og påfølgende forespore engulfment er også farget5. Derfor kan den eldre spore membraner visualiseres. En tidligere studie viste at de fleste om ikke alle av FM4-64 er i chat i renset sporer5. Under en ca 2 uker av inkubasjon og spore rensing behandlinger fjerne vask prosedyrer brukes enhver FM4-64 fra den ytre membranen, sistnevnte effektivt blir fjernet etter decoating behandling og omfattende vaske trinn 5. men decoating prosedyren fjerner ingen FM4-64 fra IM, heller ikke har noen effekt på germinosome foci5,6. Hva gleder oss er at lysere FM4-64 flekker som ligner germinosome foci dukket opp i både intakt (figur 4A, B) og decoated sporer (figur 4C, D) av PS4150 sporer. Disse lysere FM4-64 flekker kan være involvert i klynger av germinosome proteiner i chat.

Figure 1
Figur 1: oversikt over sporulation og skyv forberedelse. En oversikt viser de første stegene nødvendig før bildebehandling. Detaljert informasjon er gitt i protokoll. (A) skjematisk av sporulation prosedyren i definerte minimal MOPPER medium. En B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) eller KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt gerD-gfp kan) enkelt kolonien ble dyrket i 5 mL av LB rik medium, og tilpasset i 5 mL og 20 mL MOPPER middels sporulated igjen, og til slutt i 250 mL av MOPPER medium. En eksponentiell tidligfasen kultur (OD600, 0.3-0,4) brukes i alle mellomliggende kulturer. FM4-64 (2 µg/mL) ble lagt til PS4150 sporulation mediet for spore membran flekker 1 eller 2 h etter å ha nådd toppen OD600 verdien. (B) metode for høsting sporer fra MOPPER sporulation kultur og rensende sporer av tetthet gradert sentrifugering. (C) prosedyre til å stabilisere spores på 1% agarose pad i et gen ramme kammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representant Pseudo-Widefield (PWF) 3D bilder av GerD-GFP og GerKB-mCherry foci i to KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt gerD-gfp kan) sovende spores 3D-SIM rå bilder ble tatt med tokanals eksitasjon (561nm, 30% laser makt, 1 s og 488nm, 60% laser makt, 3 s) ved hjelp av 7 trinn fra topp til bunn Z-stabler. Deretter ble rå SIM bildene omgjort til Pseudo-Widefield 3D-bilder av ImageJ plugg SIMcheck. Fra venstre til høyre, 3D bilder (Z2-Z5) av GerD-GFP (grønn) vises GerKB-mCherry (rød) og tilsvarende sammensatte bilder av to KGB80 sporer (i og ii) i panelet. Overføring (Trans) lys bilder av to sporer (i og ii) angitt plasseringen av spores som vises som mørke tett bilder omgitt av en lysere halo. Skala bar = 1 µm og alle paneler er på samme forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Maksimal fluorescens intensiteten av GerD-GFP i KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt gerD-gfp kan) sovende sporer og maksimal auto-fluorescens intensiteten av PS4150 sporer i vilkårlig enheter som. Alle sporene ble opplyst av innstillingene angitt protokollen. Paneler (A) og (B) vise maksimal fluorescens intensiteten av fokuspunktene GerD-GFP og GerKB-mCherry, henholdsvis i KGB80 sovende sporer så vel som i begge tilfeller maksimal auto-fluorescens intensiteten av overordnede PS4150 spores. Paneler (C) og (D) viser integrert fluorescens intensitet på GerD-GFP bildet og integrert fluorescens intensiteten av GerKB-mCherry-foci, henholdsvis i B. subtilis KGB80 sovende sporer. Vi brukte enveis ANOVA-tester for betydning vilje forskjeller i maksimal fokuspunkt intensitet og integrert spore fluorescens intensiteter med programvare opprinnelse 9.0 vurderer P-verdier < 0,05 som betydelig. Sporer med 4 eller 5 foci ble ekskludert fra analysen på grunn av sin lave overflod. Dataene er representert i hakk boxplots. Hakkene i tomter er rundt median verdiene observert med bredden proporsjonalt med interquartile rekkevidde (IQR). Kinnskjegg vises representerer maksimalt 1,5 IQR. Stjernene angir en betydelig forskjell på median verdier. GerD-GFP og GerKB-mCherry integrert fluorescens intensiteter har en sterk positiv korrelasjon (Spearman korrelasjonskoeffisienten = 0.73)18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representant Pseudo-Widefield (PWF) bilder (A og C) og rekonstruert SIM bilder (B og D) av FM4-64 farget IM av B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) sporer. FM-464 ble innlemmet i sporer under sporulation. 3D-SIM rå bilder av intakt sporer (A og B) og decoated sporer (C og D) ble tatt med én kanal eksitasjon (561 nm laser, 20% laser makt, 400 ms) bruker en 25 trinn topp til bunn Z stabel. Deretter SIM rådata ble rekonstruert av mikroskopet tenkelig programvare (se Tabell for materiale) i 3D-SIM bilder, eller konverteres til PWF av SIMcheck (ImageJ plugin). De cyanfargede pilene peker til FM4-64 foci im i panelet B og D. Skala bar = 1 μm og alle paneler er på samme forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Belastning Sporer telt Foci Foci per spore (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 GerD-GFP 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Tabell 1: Tilstedeværelse i fokus i KGB80 spores. Hvor germinosome foci per spore i en befolkning tokanals merket B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katten gerD-gfp kan) sovende sporer. Fluorescens i sporene ble regnet som germinosome foci når fokus maksimale intensitet var høyere enn auto-fluorescens intensiteten, som var den maksimale intensiteten av PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) sovende sporer opphisset av samme belysning innstillinger som KGB80 spores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen presentert inneholder en standard 3D-SIM fremgangsmåte for analyse av FM4-64 farget B. subtilis spores som inkluderer sporulation, lysbilde forberedelse og imaging prosesser. I tillegg protokollen beskriver en modifisert SIMcheck (ImageJ)-assistert 3D bildeprodukter prosessen for SIM mikroskopi av B. subtilis spore germinosomes merket med fluorescerende journalister. Sistnevnte prosedyren tillatt oss å observere denne dim underlaget med utvidet kontrast. Ved å koble to tenkelig prosedyrer, er det mulig å visualisere diskret understrukturer i samme spore med samme SIM mikroskopet, dermed forbedre våre grunnlaget for en mekanistisk forståelse av spiring. Merk at prosedyren opererer med en lateral oppløsning ~ 100 nm og en aksial oppløsning på ~ 200-250 nm. Dette er bedre enn differensial forstyrrelser kontrast (DIC) wide-field mikroskopi fremgangsmåten som brukes av Griffith7. Tid løst analyse av germinosome utseendet på initiering av spiring ville være en ønsket neste steg. Dessverre skjønt SIM mikroskopi er prinsipielt kompatibel med live-imaging, på grunn av svak natur germinosome signaler slik tid-løst SIM, analyser er ikke gjennomførbart på grunn av rask bleking av prøvene under bildeopptak. For å få tilstrekkelig sporer for analyse, er det avgjørende å sørge for at sporulation effektivt finner sted. Forskere må derfor sjekke sporulation effektivitet omhyggelig med 90% effektivitet som mål. I representant resultatene har i sovende sporer, henholdsvis ~ 50% og 40% av alle sporene én eller to GerD-GFP og GerKB-mCherry foci (tabell 1). Prosentandelen av sporer med to fokus er mye høyere enn rapportert av Griffiths tidligere7. Det er flere grunner som kan forklare ulike resultatet i arbeidet. Først kunne 3D bildeprodukter prosessen lette oppdagelsen av flere foci. Forskjellige foci i samme spore ligger på forskjellige steder i den loddrette retningen som vist i figur 1. Andre bidrar CCD kamera (Tabell for materiale) og laser enhet utstyrt til SIM mikroskopet betydelig til bildebehandling resultater. Tredje, ligner på Griffithss tilnærming7 til gjennomsnittlig dusinvis av påfølgende bilder for bedre bildeanalyser, Pseudo-Widefield bildet av germinosome var også et gjennomsnittlig bilde fra raw SIM-bilder (5 faser og 3 orientering bilder). Endelig er sporulation medium og sporulation forhold, en viktig variabel ved spore egenskaper, forskjellig i vårt arbeid fra brukt tidligere. Griffiths et al.7 brukes rik 2 x Schaeffer's-glukose (2 x SG) medium for sporulation, mens en definert minimal MOPPER bufrede medium var ansatt her. Flere aviser har vist at sporulation medium og forhold har signifikant effekt på protein sammensetningen, motstand, og spiring av B. subtilis sporer22,23,24 , 25. faktisk det har vist at GR underenheter er 3 - til 8 ganger lavere i spores fått på et dårlig versus de innhentet på rik-medium. GerD nivåer var også rundt 3.5-fold lavere i dårlig middels sporer, og disse sporer tok lenger tid å starte spore spiring26. Det er imidlertid ikke klart om sporulation forhold påvirker også antall observert germinosome foci.

Ramirez-Peralta et al." s resultater26 indikerte at utbredelsen av næringsstoffer spiring av sporer på innbyggere nivåer er betydelig påvirket av nivåene av spiring proteiner og GerD. Hvis integrert fluorescerende intensiteten per spore fra fluorescerende journalister er direkte proporsjonal med nivåene av GerD og GerKB fusion proteiner, nivåer av begge fusion proteiner variere mye i KGB80 spores, som er i tråd med tidligere arbeid 7. dette protein nivå heterogenitet kan være knyttet til spore spiring heterogenitet observert på enkelt spore nivå og germinosome foci nummer kan være en annen faktor som bidrar til spore spiring heterogenitet. Ytterligere eksperimenter vil fokusere på en analyse av mulig effekt germinosome foci nummer og foci spiring protein komposisjon (ikke alle germinosomes kan være like spiring protein sammensetning) kunne ha på spiring heterogenitet. Dataene ga opphav til en rekke aktuelle problemstillinger inkludert: jeg) Hva er rollen av GerD i klynger av GRs im; og ii) hvordan er to andre GRs og GerA GerB, organisert i spore IM?

Protokollen presentert for dim og lyse spore prøver gjør det mulig å visualisere diskret understrukturer i samme spore ved SIM mikroskopi. Lyspunkter i FM4-64, som ble observert i sporer kan skyldes omfattende folding av IM27. Også hypothesize vi at disse områdene er områder im hvor fargen kan lettere få tilgang til på grunn av økt lokal IM flyt. Slike områder av økt flyt (RIFs) kan organiseres av cellen cytoskjelett begrepsordbok homologue MreB, kjent for sin konsentrasjon av væske kort acyl kjeden lipider28,29. Merkbart, bruke samme fremgangsmåte til å vill-type B. subtilis sporer også fører til et lignende mønster av FM4-64 lyspunkter (våre upubliserte observasjoner). I B. subtilis vegetative celler, resulterer en skjult membran potensialet i klynger av MreB og RIFs29. Indre membran av sovende sporer sannsynlig har en relativt lav membran potensielle20,21 og inneholder Detektbart nivåer av MreB30 som kan føre til klyngene for RIFs i større domener av høy flyt29 . Om slike domener kunne sammenfalle med tilstedeværelse av germinosomes er under etterforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Forfatterne takker Christiaan Zeelenberg for hans hjelp under SIM avbilding. JW erkjenner Kina stipend Rådet for en PhD fellesskap og takk Irene Stellingwerf for hennes hjelp under den primære stadiet av tenkelig.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).

Tags

Bioteknologi problemet 146 Gram-Positive bakteriene Bacillales mikroskopi mikrobiologi organismer bakterier Analytical diagnostiske og terapeutiske teknikker og utstyr undersøkende teknikker biovitenskap biovitenskap (generelt) Bacillus Sporer spiring proteiner Germinosomes Spore indre membran super-oppløsning mikroskopi fluorescens mikroskopi
Visualisering av Germinosomes og interne membran i <em>Bacillus subtilis</em> Spores
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M.… More

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M. M., Setlow, P., Brul, S. Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (146), e59388, doi:10.3791/59388 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter