Summary
Ici, nous présentons un protocole pour mesurer l'engagement cible de KDM1A dans une cellule humaine ou animale, des échantillons de tissu ou de sang traités avec des inhibiteurs de KDM1A. Le protocole emploie le marquage de chemoprobe de l'enzyme libre de KDM1A et la quantification directe de l'occupation cible utilisant des immuno-tests à base de chemoprobe et peuvent être employés dans des études précliniques et cliniques.
Abstract
L'évaluation de l'engagement cible, défini comme l'interaction d'un médicament avec la protéine pour laquelle il a été conçu, est une exigence fondamentale pour l'interprétation de l'activité biologique de tout composé dans le développement de médicaments ou dans les projets de recherche fondamentale. En épigénétique, l'engagement des cibles est le plus souvent évalué par l'analyse des marqueurs proxy au lieu de mesurer l'union du composé à la cible. Les résultats biologiques en aval qui ont été analysés comprennent la modulation de la marque histone ou les changements d'expression génique. KDM1A est une lysine demethylase qui élimine les groupes méthyliques du H3K4 mono et diméthylé, une modification associée au silence de l'expression génique. La modulation des marqueurs proxy dépend du type de cellule et de la fonction de la composition génétique des cellules étudiées, ce qui peut rendre l'interprétation et la comparaison entre les cas assez difficiles. Pour contourner ces problèmes, un protocole polyvalent est présenté pour évaluer les effets de dose et la dynamique de l'engagement cible direct de KDM1A. Le test décrit fait usage d'une chimioprobe KDM1A pour capturer et quantifier l'enzyme décomplexée, peut être largement appliqué aux cellules ou des échantillons de tissus sans avoir besoin de modification génétique, a une excellente fenêtre de détection, et peut être utilisé à la fois pour la recherche fondamentale et l'analyse d'échantillons cliniques.
Introduction
Lysine spécifique deméthylase 1 (KDM1A)1 est une deméthylase impliquée dans le contrôle de la transcription génique. Cette protéine est apparue comme une cible pharmacologique candidate2 en oncologie; y compris la leucémie myéloïde aigue3 (LAM), le syndrome de myélodie (SMD)4, myélofibrose (MF)5,6, Cancer du poumon à petites cellules (SCLC)7; dans la maladie des cellules de Sickle (SCD)8,9, et dans les maladies du système nerveux central, y compris la maladie d'Alzheimer (MA), la sclérose en plaques (SEP); et dans l'agression10.
La plupart des composés inhibiteurs du KDM1A dans le développement clinique sont des dérivés de cyclopropylamine et inhibent la protéine par liaison covalente à son dinucleotide d'adénine de flavine (FAD) cofacteur11. L'inhibition de KDM1A induit des changements d'expression génique, mais ces changements varient énormément selon les tissus, les types de cellules ou les cas de maladie. L'inhibition de KDM1A change également histone marques12, mais ces changements sont généralement produites localement à un site spécifique dans le génome, et sont à nouveau, fortement tissu et cellulaire spécifique.
Le protocole a été développé pour mesurer directement l'engagement cible de KDM1A dans des échantillons biologiques et a été optimisé pour l'utilisation avec des inhibiteurs dérivés de la cyclopropylamine. L'essai est basé sur la technologie ELISA et analyse, en parallèle, Total et Free (c'est-à-dire non lié par l'inhibiteur) KDM1A dans un extrait de protéine indigène d'un échantillon biologique dans une phase d'analyse solide. Dans un premier temps, l'échantillon biologique est lysé en présence de la chimioprobe sélective KDM1A biotinylated OG-88113,14, dérivée de l'inhibiteur sélectif KDM1A ORY-1001 (iadademstat), un inhibiteur puissant de KDM1A en clinique développement pour le traitement des maladies oncologiques. La chimioprobe a un IC50 pour KDM1A de 120 nM et comprend une moiety de liaison FAD liée à un polyéthylène glycol biotinylated (PEG)-queue. La chimioprobe se lie exclusivement au KDM1A libre, mais pas au KDM1A lié par l'inhibiteur dans l'échantillon. Après la liaison de chemoprobe, les complexes de KDM1A contenant dans l'échantillon sont capturés sur des plaques de microtiter avec la surface enduite de streptavidin pour déterminer KDM1A libre, ou sur des plaques enduites d'un anticorps de capture anti-KDM1A monoclonal pour déterminer kDM1A total. Après le lavage, les deux plaques sont incubées avec un anticorps anti-KDM1A de détection, lavées encore, et incubées avec un anticorps anti-lapin d'igG d'âne HRP-conjugué secondaire pour la détection utilisant un substrat luminescent et la quantification en mesurant le relatif d'unités légères (RLU) dans un luminomètre (Figure 1).
Figure 1. Schema of ELISA Enzyme linked chemoprobe immunoabsorbent as for KDM1A target engagement: A) Determination of total KDM1A using sandwich ELISA and B) Determination of free KDM1A using chemoprobe ELISA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Une courbe standard est incluse dans les deux plaques ELISA pour vérifier la linéarité de chaque analyse. La détermination de l'engagement cible de KDM1A dans chaque échantillon est ensuite calculée comme valeur relative à l'échantillon pré-dose ou véhicule traité.
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Protocol
Des échantillons de sang ont été prélevés auprès de l'Instituto de Investigacion Biomédica Sant Pau Biobank selon la législation espagnole (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) et l'approbation des comités d'éthique locaux. Les études sur les tissus animaux ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (directive 86/609/CEE du Conseil des Communautés européennes) établie par le Comité d'éthique pour l'expérimentation animale PRAAL-PCB.
1. Préparation d'échantillons biologiques pour l'analyse.
CAUTION: Ce protocole implique la manipulation d'échantillons biologiques qui peuvent être soumis à la norme des agents pathogènes de la borde de sang (OSHA) (29 CFR 1910.1030), directive 2000/54/CE du Parlement européen et de la Conseil du 18 septembre 2000 ou règlements équivalents. En outre, les échantillons biologiques peuvent contenir des traces de composés chimiques d'investigation biologiquement actifs et le protocole peut impliquer une manipulation plus poussée de ces composés. Examiner la fiche de données sur l'innocuité (SDS) des composés utilisés avant le début de l'expérience et observer strictement toutes les mesures de sécurité applicables établies dans le centre de recherche, y compris l'utilisation d'équipements de protection individuelle adéquats (EPI). Portez des vêtements de protection appropriés et utilisez un blindage approprié au cours de l'expérience. Jeter les résidus dans les contenants de déchets appropriés (déchets biologiques/cytotoxiques).
REMARQUE : Ce protocole commence par des cellules ou des échantillons de sujets traités avec un inhibiteur de KDM1A et leurs contrôles non traités ou traités par véhicule/placebo3.
- Cellules traitées avec un véhicule ou un inhibiteur kDM1A in vitro
- Pour les cellules cultivées en suspension, comme 10 ml cultures, transférer les suspensions en tubes coniques propres de 15 ml et procéder à 1.1.3.
- Pour les cellules adhérentes (cultivées en flacons de 75 cm2), retirer le milieu du flacon et laver brièvement à l'aide de 4 ml de PBS. Détachez les cellules de leurs vaisseaux à l'aide de 1,5 ml de 0,5 % de trypsine-EDTA pendant 2 à 5 min (les conditions d'essaipinisation peuvent varier, suivez les recommandations du fournisseur pour la lignée cellulaire), ajoutez 4 mL de PBS et transférez les cellules en tubes coniques propres de 15 ml.
- Insérez les tubes dans une centrifugeuse de présethet et collectez les cellules par centrifugation pendant 5 min à 400 x g à 4 oC. Retirez le supernatant, suspendez la pastille dans 1 ml de PBS distribué à l'aide d'une micropipette et transférez la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
- Insérer les échantillons dans une centrifugeuse microtube et les centrifuger pendant 5 min à 400 x g à 4 oC. Retirez le PBS par aspiration avec une micropipette et gardez les granulés sur la glace et passez à l'étape 2; ou congeler les granulés sur de la glace sèche et les conserver à -80 oC jusqu'à l'étape 3.
- Échantillons de sujets ou d'animaux traités avec un véhicule/placebo ou un inhibiteur du KDM1A
- Tissus : Couper le tissu en petits morceaux de 1 cm3 à l'aide d'un scalpel. Congeler les morceaux de tissus dans le liquide N2 dans un contenant Dewar et les conserver à -80 oC jusqu'à l'étape 3.
- Cellules mononucléaires du sang polymorphe (PBMC) : Diluer 10 ml de sang frais (processus maximum 2 h après le prélèvement sanguin) recueillis dans les tubes K2-EDTA avec 2 volumes de PBS dans un tube conique de 50 ml. Isoler les PBMC du sang à l'aide de tubes de séparation PBMC obtenus commercialement selon les instructions du fabricant. Gardez les granulés sur la glace et passez à l'étape 3.2; ou congeler les granulés sur de la glace sèche et les conserver à -80 oC jusqu'à l'étape 3.
REMARQUE : Une pastille de cellules humides de 20 à 50 L contient 1 x 107 cellules, selon la taille de la cellule. Une pastille PBMC humide obtenue à partir de 10 ml de sang humain sain a un volume de 20 L et contient 1 x 107 PBMC. Les tissus ou les granulés de cellules peuvent être stockés à -80 oC pendant jusqu'à 6 mois.
2. Préparation de la solution
- Préparer une solution de travail OG-881 de 2 M M - 881 : Prenez un aliquot à usage unique de 10 ll de la solution de stock OG-881 de 20 mM de la sonde biotinylated DE 4 oC et laissez-le à température ambiante (RT) pendant 10 min. Préparer la solution de travail de 2 MM par dilution en série de la solut de stock OG-881 ion dans PBS, en utilisant une micropipette avec des pointes de filtre et en changeant la pointe entre les différentes étapes de dilution.
- Préparer 10x inhibiteur de la protéase : dissoudre 1 comprimé dans 1 mL de PBS dans un tube de microcentrifuge.
- Préparer le volume désiré de 1x Tampon de lyse cellulaire avec 25 nM OG-881 chimioprobe. Pour chaque mL, mélanger 100 L obtenus commercialement 10x Tampon de lyse cellulaire, 150 l d'inhibiteur de protéase 10x, 12,5 l de 2 M OG-881, et 737,5 oL d'eau double distillée de type 1.
- Préparer le volume souhaité de 1x Tampon de lyse cellulaire, mais avec 25 nM ORY-1001 au lieu de OG-881 comme à l'étape 2.3. Des inhibiteurs moins puissants peuvent être utilisés, mais peuvent nécessiter des concentrations plus élevées, pour une utilisation dans le contrôle positif avec inhibition de 100% (voir l'étape 3.5).
REMARQUE : Prenez les mesures appropriées pour éviter toute contamination involontaire de solutions ou d'échantillons avec les solutions de stock d'inhibiteurs OG-881 ou KDM1A. Pour calculer le volume souhaité de 1x tampon de lyse cellulaire avec 25 nM OG-881, supposons que 400 L sont nécessaires par 40 mg de tissu pulvérisé, ou 200 L par granule humide de 107 cellules.
3. Extraction de protéines indigènes
- Des tissus :
- Pulvériser et homogénéiser un cube de tissu congelé de 1 cm3 avec un mortier et un pilon refroidis sur de la glace sèche. Aliquot les échantillons dans des flacons à usage unique contenant 40 mg de poudre de tissu, éviter de dégeler en tout temps. Passez à l'étape 3.1.2. pour un traitement ou un stockage immédiat à -80 oC.
- Resuspendre 40 mg de tissu en poudre dans 400 l de 1x tampon de lyse cellulaire avec 25 nM OG-881, vortex pour 10 s, et forcer l'échantillon au moins cinq fois à travers une aiguille de seringue émoussée de 18 calibres jusqu'à ce que la lyse du tissu soit atteint et qu'une suspension jaune-orange de lumière turbide soit Obtenu. Évitez la formation de bulles.
- Continuer jusqu'à l'étape 3.3
- À partir de granulés cellulaires (PBMC et lignées cellulaires) :
- Resuspendre une pastille de 1 x 107 cellules dans 200 l de tampon de lyse 1x cellules contenant 25 nM OG-881. Vortex les échantillons brièvement et les garder sur la glace pendant 5 min.
- Sonicate les échantillons dans un sonicator en utilisant 3 impulsions de 20 s chacun à 45 kHz; les placer sur la glace pendant 20 s entre les impulsions.
REMARQUE : Dès que les échantillons biologiques ont été suspendus dans le tampon de lyse 1x cellulaire, gardez-les sur la glace pendant le reste du processus.
- Conserver les échantillons sur la glace pendant 5 min de plus, le vortex brièvement et la centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 x g dans une centrifugeuse pré-réfrigérée à 4 oC.
- À l'aide d'une micropipette de 1 ml, transférer les supernatants dans des tubes de microcentrifuge frais de 1,5 ml et les laisser sur la glace pendant 2 h. Continuer jusqu'à l'étape 4.
- En option, un contrôle positif pour simuler un engagement cible de 100 % peut être préparé comme suit :
- Resuspendre la pastille cellulaire ou le tissu en poudre d'un véhicule ou d'un échantillon non traité (prédose) dans le volume requis de 1x Cell Lysis buffer avec 25 nM ORY-1001 et le processus tel que décrit à l'étape 3.1 à 3.3.
- Transférer les supernatants du contrôle positif dans des tubes microcentrifugefrais de 1,5 ml et les laisser sur la glace pendant 1 h. ORY-1001 inhibent volontairement la liaison KDM1A et bloquent la chimioson.
- Ajouter 5 'L de 2 'M OG-881 solution de travail au supernatant de contrôle positif (volume pour le contrôle positif généré à partir d'un échantillon de tissu de 40 mg) ou 2,5 'L de 2 'M OG-881 solution de travail (volume pour le contrôle positif généré à partir d'un échantillon de 107cellules) pour obtenir la même concentration d'OG-881 que les autres échantillons et laisser sur la glace pendant 2 h. Continuer jusqu'à l'étape 4.
4. Quantification des protéines indigènes à l'aide de l'analyse de Bradford
- Diluer le réactif d'assay de protéine bradford d'origine commerciale 5 fois avec l'eau distillée double de type 1 de H2O. Calculer le volume du réactif requis pour la quantité totale d'échantillons et de normes (1 ml par échantillon ou standard de 5 ml de volume excédentaire).
- Pour la courbe standard de l'albumine de sérum bovin (BSA), préparez un tube de microcentrifuge avec une solution diluée bradford Protein Assay de 1 ml (blanc) et sept tubes de microcentrifuge avec 995 l de la solution diluée Bradford Protein Assay. Ajouter 5 ll de chacune des normes BSA (concentration allant de 125 à 2 000 g/mL) à chacun des 7 tubes de microcentrifuge et les mélanger en inversant doucement les tubes plusieurs fois. Incuber pendant 5 min à RT.
- Transférer les normes diluées aux cuvettes et lire l'OD des échantillons blancs et bovineS Serum Albumin Standard dans un spectrophotomètre à 280 nm.
- Pour les échantillons biologiques, préparez un tube de microcentrifuge avec 1 ml dilué Bradford Protein Assay solution (blanc) et autant de tubes microcentrifuge avec 999 L du réactif dilué Bradford Protein Assay que les échantillons qui doivent être quantifiés. À l'aide d'une micropipette Automatique P2, ajouter 1 l d'extrait de protéine indigène préparé à l'étape 3 à chaque tube de microcentrifuge et mélanger en inversant doucement les tubes plusieurs fois. Incuber les échantillons 5 min à RT.
- Transférer les volumes en cuvettes et lire l'OD des échantillons dans un spectrophotomètre à 280 nm.
- Préférentiel, passez immédiatement à l'étape 5. Vous pouvez également conserver les extraits de protéines indigènes à -80 oC jusqu'à l'étape 5. Évitez les cycles de dégel.
5. ELISAs Luminescent pour la détermination de Total et free KDM1A
REMARQUE : Maintenir la température du laboratoire constante à 23-24 oC (RT).
- Revêtement de plaques de microtiter avec anticorps KDM1A de capture ou Streptavidin
- Total KDM1A ELISA : pour chaque plaque, préparez 10 ml d'anticorps de capture KDM1A à une concentration finale de 2 g/mL en PBS. Transférer 100 l dans chaque puits de la plaque.
- Gratuit KDM1A ELISA: pour chaque assiette, préparer 10 ml de streptavidin à 10 g/mL en PBS. Transférer 100 l dans chaque puits de la plaque.
- Garnir les plaques Total et Free KDM1A ELISA avec du film adhésif et incuber les assiettes pendant la nuit à 4 oC dans le réfrigérateur.
- Laver et bloquer les plaques
- Sortez les assiettes du réfrigérateur et laissez-les ajuster pendant environ 45 minutes à RT avant de les utiliser.
- Préparer un tampon de lavage de 1 000 ml (0,1 % de tween en PBS) et un tampon de blocage de 50 ml (1 % de BSA en PBS) par plaque.
- Laver les assiettes 3 fois avec un tampon de lavage. Dans cette étape et les étapes suivantes, appuyez sur la plaque sur des essuie-tout après chaque étape de lavage pour enlever la solution résiduelle.
- Ajouter 200 l de tampon de blocage par puits aux deux plaques, sceller les deux plaques à l'aide d'un film adhésif et incuber 2 h à RT.
- Préparation biologique de l'échantillon
- Diluer les extraits de protéines indigènes obtenus à la fin de l'étape 3 à la concentration appropriée à l'aide de PBS. La concentration recommandée variera en fonction du niveau d'expression KDM1A dans l'échantillon biologique. Des exemples de plages appropriées sont (1) Granulés de cellules : 0,5 à 10 g par puits. (2) PBMCs : 5 à 30 g par puits. (3) Tissu pulvérisé (cerveau, poumon, peau) : 20 à 100 g par puits. Conserver les échantillons sur la glace pendant la préparation. Dans la mesure du possible, exécuter des analyses techniques d'échantillons triplicate.
- Préparer une courbe standard à l'aide de l'homme rKDM1A:
- Pour préparer la solution de travail Standard KDM1A, épileron le volume approprié de rKDM1A pour une concentration finale de 25 pg/L, ajouter 75 L de 2 M OG-881, et compléter avec 1 x PBS à un volume total de 6 ml dans un tube de faucon de 15 ml. Maintenez la solution de travail Standard KDM1A sur la glace pendant 1 h et mélangez la solution doucement en inversant le tube de faucon de 15 ml plusieurs fois toutes les 20 minutes.
- Préparer la série de dilution standard KDM1A dans des tubes microcentrifuges de 1,5 ml selon le tableau 1 (préparation standard), en volume suffisant pour l'analyse triplicate de deux plaques de microtimètre de 96 puits.
| SÉRIE STANDARD | Solution de travail standard KDM1A | |
| (pg KDM1A/puits) | PBS (L) | |
| 2500 pour C- | 800 Annonces | - |
| en 2500, | 800 Annonces | - |
| en 1750, | 560 Annonces | 240, états-unis |
| 1250 Annonces | 400 Ans et plus | 400 Ans et plus |
| 750 Annonces | 240, états-unis | 560 Annonces |
| 250 Annonces | 80 Ans, états-unis ( | 720 Annonces |
| 25 Annonces | 8 Annonces | 792 Annonces |
| 0 (en) | 0 (en) | 800 Annonces |
| note: | ||
| (1) Le volume préparé de chaque dilution est suffisant pour fonctionner en triplicate 2 plaques d'essai. | ||
| (2) La plage recommandée se situe entre 2,5 et 5 000 pg / puits | ||
| Pour le contrôle négatif C-, sans anticorps de détection KDM1A | ||
Tableau 1 : Préparation standard. Pour préparer la série standard de protéines KDM1A, pipette les volumes indiqués de la solution de travail KDM1A Standard et PBS en huit tubes microcentrifuges de 1,5 ml correctement étiquetés.
Tableau 2 : Conception de plaques Deep Well. Normes (bleu) et échantillons (jaune) de l'étape 5.4.2. ont été acheminés dans les positions réfléchies de la plaque Deep Well pour faciliter le chargement dans les plaques ELISA suivant la direction des flèches bleues (standard) et jaunes (échantillons). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau 3 : Conception des plaques ELISA. La plaque d'ascompte comprend la courbe standard avec des quantités décroissantes de la cible Recombinante KDM1A (en bleu); les échantillons biologiques (S) en jaune; et les contrôles négatifs correspondants (contiennent les échantillons mais pas l'anticorps de détection primaire) en blanc, à charger sur les plaques ELISA de la plaque Deep Well. Le blanc (0 dans la courbe standard) contient tous les réactifs de capture et de détection, mais aucun échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
- Elisa
- (Suite à partir de l'étape 5.2.4.) Après 2 h d'incubation, jetez le tampon de blocage et lavez les plaques avec un tampon de lavage.
- Transférer les échantillons correctement dilués (extraits de protéines indigènes et courbe standard de l'étape 5.3.) dans un bloc de stockage réfrigéré de 96 puits profonds suivant la distribution des plaques indiquée dans le tableau 2 (Deep Well Plate Design).
- Gardez ce bloc sur la glace jusqu'à ce que l'échantillon de 100 l / puits dans les plaques Total et Free ELISA suivant la distribution des plaques indiquée dans le tableau 3 (ELISA Plate Design).
- Incuber pendant 1 h à RT, jeter les échantillons et laver les assiettes 5 fois avec un tampon de lavage.
- Préparer 20 mL d'anticorps de détection anti-KDM1A de lapin à 0,125 g/mL dans le tampon de blocage, ajouter 100 l par puits dans chaque plaque de l'analyse, sauf dans les puits correspondant aux contrôles négatifs C-. Garnir la plaque et couver 1 h à RT.
- Jetez la solution d'anticorps de détection et lavez les plaques 6 fois avec un tampon de lavage.
- Préparer 25 mL d'anticorps anti-lapin de chèvre secondaire HRP à une dilution 1:5,000 dans le tampon de blocage, ajouter 100 l par puits aux plaques de microtiter; et incuber 1 h à RT.
-
Détection chemiluminescente
- 30 min avant la fin de l'étape 5.4.7. et dans des conditions de lumière douce, mélanger des parties égales de Luminol-Enhancer et Peroxide Solution (10,5 ml : 10,5 ml, pour 2 assiettes) dans une bouteille d'ambre et la laisser à RT.
REMARQUE : Gardez la solution de travail Luminol dans une bouteille d'ambre et évitez une exposition prolongée à toute lumière intense. L'exposition à court terme à l'éclairage de laboratoire typique ne nuira pas à la solution de travail. - Au moins 20 min avant de mesurer la luminescence, allumez le lecteur de microplaque à 25 oC et installez des récusations à 1 000 ms de temps d'intégration et 150 ms de temps de tassement. Les paramètres peuvent nécessiter une optimisation en fonction de l'instrument.
- Après 1 h d'incubation à l'étape 5.4.7., jetez la solution d'anticorps secondaire et lavez les plaques 6 fois avec un tampon de lavage.
- Pipette 100 l par puits de la solution de travail Luminol (Substrat chemiluminescent) préparé à l'étape 5.5.1. Pipette très lentement et éviter la formation de bulles. Utilisez une minuterie pour contrôler le temps entre l'ajout de la solution et la mesure de la luminescence des plaques et de garder ce temps constant pour atteindre une bonne reproductibilité d'arrêt.
- Garnir les plaques et la centrifugeuse à 500 x g à RT pour 45 s dans une centrifugeuse de plaque pour éliminer les bulles restantes. Incuber les assiettes pendant 1 min sur un shaker à 100 tr/min.
- Insérez la plaque à l'intérieur du lecteur et laissez-la pendant 3 min pour stabiliser la température à 25 oC (sans film adhésif). Commencez toujours par la plaque ELISA gratuite.
- Lisez les unités de luminescence relatives (RLU) de chaque analyse de plaque ELISA (gratuit et total KDM1A).
- Enregistrez et copiez les valeurs Raw RLU des fichiers Raw Data Excel pour une analyse plus approfondie des résultats.
- 30 min avant la fin de l'étape 5.4.7. et dans des conditions de lumière douce, mélanger des parties égales de Luminol-Enhancer et Peroxide Solution (10,5 ml : 10,5 ml, pour 2 assiettes) dans une bouteille d'ambre et la laisser à RT.
6. Calcul de l'engagement cible
- Dans un logiciel de tableur, calculez les valeurs rLU Free et RLU Total des échantillons SX et des échantillons de référence REF (échantillon non traité, véhicule ou pré-dose) à partir de leur réplique technique Données brutes comme détaillé ci-dessous:
- Entrez les données individuelles Raw RLUi Total et Raw RLUi Free à partir de blancs, de courbes standard, de contrôles négatifs C- et d'échantillons biologiques (SX et REF) dans la feuille de données d'analyse (p. ex. Excel). En outre, entrez les montants (en pg) de KDM1A de la courbe standard dans la feuille de données.
- Calculez le RLU moyen raw, les écarts types -RLU, et le coefficient de variation CVRLU à partir des données individuelles Raw Total et Raw Free RLUi pour chaque point de données de repli technique.
- Appliquer l'élimination aberrante (exemple pour les tripliates): pour chaque individu Raw RLU Total et Raw RLU Free point de données RLUi à partir d'un point de données triplant technique, appliquer les critères Grubbs lorsque le CV pour le triplicate -gt; 0,15, et de rejeter la valeur suspecte unique Raw RLU quand
,
par cas Z 1,148 pour n ' 3 et 90 % intervalle de confiance (CI). - Si l'élimination aberrante a été appliquée, recalculer la moyenne Raw RLU, déviation standard -RLU et CVRLU à partir des valeurs brutes RLUi Total et Raw RLUi Free non rejetées (nr) pour chaque point de données.
- Appliquer la correction de fond : Calculez les valeurs moyennes RLU Free et RLU Total pour chaque échantillon standard, et chaque échantillon SX et échantillon de référence REF comme :
- Représenter graphiquement les données comme suit :
- Tracez les valeurs RLUFree et RLUTotal (axe Y) par rapport à leur identification d'échantillon (axe X) dans un graphique à barres.
- Tracer également les valeurs RLU (axe Y) des normes dans une parcelle de dispersion par rapport à leur quantité de pg de protéines rKDM1A (X-axe) pour les mesures libres et totales, ainsi que les lignes de tendance linéaires correspondantes et calculer le r2 (le carré de la linéaire coefficient de corrélation).
- Calculer l'engagement cible (TE); c.-à-d. le pourcentage de KDM1A lié par l'inhibiteur KDM1A dans chaque échantillon SX par rapport à un échantillon de référence REF (échantillon non traité, véhicule ou pré-dose) comme suit :
- Calculez le ratio R des valeurs moyennes RLU Free to Total pour les échantillons SX et REF comme :
- Ensuite, calculez l'engagement cible (TE) de l'échantillon SX comme :
Facultatif : (1) Si des expériences de repli biologique n ont été menées, chacune avec n répliques techniques; calculer d'abord le TESX pour les ensembles de réplique technique. Par la suite, calculez les valeurs moyennes TE, SD et CV pour l'ensemble de réplique biologique.
- Calculez le ratio R des valeurs moyennes RLU Free to Total pour les échantillons SX et REF comme :
- Réviser si les critères d'acceptation de l'analyse sont remplis : Vérifiez que (1) l'arrière-plan d'analyse est acceptable et que l'indice Moyen Blank 'lt; 0,05 x 107 RLU; (2) l'auto-luminescence de l'échantillon est absente et les RLUS des contrôles négatifs C- sont inférieurs à la limite inférieure de quantification (LLOQ - Mean Blank - 10x SD); (3) la courbe standard rKDM1A est linéaire et r2 0,98; (4) les échantillons biologiques ont des valeurs RLU qui tombent dans la plage dynamique et linéaire de l'analyse, c'est-à-dire entre LLOQ et 2 500 pg/puits.
REMARQUE : Étapes 6.1. à 6,4. peut être facilement automatisé dans une feuille de données de calcul. - Exporter les données TE vers un logiciel statistique open source ou obtenu commercialement de choix pour la représentation graphique des valeurs TE et des évaluations statistiques supplémentaires.
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Representative Results
La linéarité de la détermination De Total et Free KDM1A.
Une série standard a été préparée comme décrit dans l'étape 5.3.2., utilisant 0 à 2500 pg de l'enzyme recombinante humaine de KDM1A. Les valeurs RLU de Total et Free rKDM1A ont été évaluées pour vérifier la linéarité (figure 2A et 2B). Les données sont représentées comme moyen de 3 expériences avec 3 répliques techniques (n) et SD. Les valeurs RLU de Total et Free KDM1A détectées dans les PBMC humains à partir du sang de 3 volontaires indépendants sont superposées sur la courbe standard dans la figure 2C et 2D. Des échantillons de sang ont été prélevés auprès de l'Instituto de Investigacion Biomédica Sant Pau Biobank selon la législation espagnole (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) et l'approbation des comités d'éthique locaux.
Figure 2. Détermination de Total et free rKDM1A dans pbMCs de volontaires en bonne santé. RLU valeurs de Total rKDM1A évalué par ELISA (A) et de Free rKDM1A évalué par la chimioson capture ELISA (B). Les données ont été obtenues à partir de 3 expériences de repli, chacune analysée en triplicate (N ' 3; n '3). Valeurs RLU de Total KDM1A évaluées par ELISA (C) et de Free KDM1A (D) pour les PBMC de 3 volontaires indépendants non traités (carrés rouges, bleus et verts) superposés sur la courbe standard. Les données ont été obtenues à partir d'une expérience analysée en triplicate (N ' 1; n '3). Les valeurs représentées sont les moyens de SD. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Analyse de l'engagement cible de KDM1A dans les cellules
Les cellules AML ont été cultivées suivant des recommandations de fournisseur. Les cellules ont été traitées avec un véhicule ou ORY-1001 à différentes concentrations (0,25; 0,5; 1; 5 et 25 nM) (figure 3). Les extraits indigènes de protéine ont été obtenus en présence de 25 nM OG-881 chimioprobe. 0,5 g de protéines totales a été utilisé pour effectuer l'analyse d'engagement cible telle que décrite précédemment. Le total et le KDM1A gratuit ont été déterminés, et le pourcentage de l'engagement cible d'ORY-1001 à KDM1A a été calculé par rapport au véhicule tel que décrit.
Figure 3. Dose-réponse de l'engagement cible de KDM1A dans une ligne humaine de cellules de LAM. Les cellules ont été traitées avec un véhicule ou un ORY-1001 à des concentrations différentes (0,25; 0,5; 1; 5 et 25 nM) et utilisées pour déterminer l'engagement visé tel que décrit. Les données ont été obtenues à partir de 3 expériences de repli, chacune analysée en triplicate (N ' 3, n '3). Les valeurs représentées sont les moyens de SD. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Analyse de l'engagement cible in vivo de KDM1A
L'objectif de cette expérience était de caractériser l'engagement cible d'ORY-1001 dans différents tissus de rat, en fonction du niveau de dose. Pour atteindre cet objectif, 15 rats Sprague-Dawley (200-250 g) ont été logés dans une salle de sécurité cytostatique afin d'éviter une contamination potentielle par le composé testé. Un maximum de 3 rats/cage ont été aléatoirement assignés à 5 groupes d'étude. Les 5 différents groupes d'étude ont reçu, respectivement, le véhicule; 1; 3; 10 ou 30 g / kg d'ORY-1001 par administration orale pendant 4 jours consécutifs. Des solutions de stock composés ont été préparées quotidiennement. Les animaux ont été pesés avant chaque administration pour ajuster le volume requis. Tous les animaux étaient logés à température ambiante constante (20 - 24 oC) et à l'humidité relative (45 - 65 %) sous un cycle clair-obscurité de 12 h (lumières allumées à 6h00). Nourriture et eau étaient disponibles ad libitum. Des échantillons de sang ont été prélevés 2 h après la dernière administration dans les tubes K2EDTA et les PBMC ont été isolés selon la procédure décrite précédemment à l'étape 1.2.2. et conservés à -80 oC jusqu'à l'extraction de protéines indigènes. Des échantillons de poumons ont également été prélevés 2 h après la dernière administration de médicaments, congelés immédiatement dans de l'azote liquide et stockés à -80 oC. Les études ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (directive 86/609/CEE du Conseil des Communautés européennes) établies par le Comité éthique pour l'expérimentation animale au PRAAL-PCB.
Après la pulvérisation, les extraits indigènes de protéine du poumon ont été obtenus comme décrit et quantifié. 5 g de protéines totales provenant de PBMC mis en commun ou 7,5 g de protéines totales provenant de 3 animaux ont été utilisés par groupe de dose pour exécuter l'essai d'engagement cible KDM1A.
La dose-réponse de l'engagement cible de KDM1A dans les PBMC et dans le traitement pulmonaire des rats avec ORY-1001 par gavage oral, calculée par rapport au groupe de véhicule est montrée dans la figure 4A et 4B. Comme on peut le voir dans la figure 4C, l'incubation ex vivo avec 25 nM ORY-1001 d'extraits de protéines pulmonaires des animaux traités par véhicule donne encore de l'ET complète, mais n'augmente pas encore l'ET dans les échantillons de rats traités pendant 4 jours avec 30 g/kg ORY-1001 , confirmant que KDM1A était déjà entièrement inhibé in vivo.
Figure 4. Engagement cible KDM1A in vivo et ex vivo. Dose-réponse de l'engagement cible de KDM1A dans pbMCs (A) et échantillons de poumon (B) des rats traités avec ORY-1001 pendant 4 jours consécutifs (p.o). Les données ont été obtenues à partir d'extraits de PBMC regroupés de 3 animaux par cohorte, analysés en double (N ' 1, n ' 2) ou à partir des poumons de 3 animaux individuels par cohorte, analysés en triplicate (N ' 3, n '3). C. Comparaison de l'TE dans les extraits de protéines pulmonaires en commun des rats traités avec un véhicule (à gauche) ou 30 g/kg ORY-1001; après 1 h d'incubation ex vivo des extraits sans (barres grises) ou avec 25 nM ORY-1001 (barres bleues) (N 3, n ' 3). Toutes les données sont représentées comme des moyens - SD. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole présenté ici a été développé pour mesurer directement l'engagement cible De KDM1A à l'aide d'un nouveau ELISA basé sur la capture de chimioprobe KDM1A. La méthode a été validée sur des lignées cellulaires humaines cultivées et des échantillons ex vivo de l'homme, du rat et de la souris et du babouin (y compris les PBMC, les poumons, le cerveau, la peau, les tumeurs), mais peut être facilement appliquée à d'autres espèces dans lesquelles l'anticorps KDM1A cible épitopes et catalytique centre sont conservés. Comme OG-881 est une chimioson basée sur l'activité, la qualité de l'échantillon est importante et une manipulation et une conservation adéquates des échantillons doivent être poursuivies, en particulier pendant les premières étapes du protocole, afin de s'assurer que l'activité KDM1A est conservée.
Le protocole expérimental actuel a été optimisé pour analyser l'engagement cible de KDM1A par des inhibiteurs covalents de ciblage de la FAD. Il peut également être utilisé avec des inhibiteurs réversibles qui bloquent l'accès au cofacteur FAD de KDM1A. Les inhibiteurs réversibles puissants avec de longs temps de résidence peuvent employer le protocole non modifié.
La chimioprobe OG-881 peut ne pas convenir aux inhibiteurs réversibles à faible puissance avec des taux de congé élevés. La chimioprobe particulière utilisée dans ce manuscrit n'est pas pénétrante cellulaire et donc des analyses sont effectuées ex vivo sur des échantillons lysed.
La méthode peut être utilisée sur des instruments largement disponibles dans les laboratoires de recherche et d'analyse; il n'exige pas des modifications génétiques pour être introduits dans les cellules, et il peut facilement être appliqué à différents types d'échantillons. Un autre avantage est qu'il peut être utilisé sur des échantillons provenant de différentes espèces qui sont fréquemment utilisés dans les études précliniques de preuve de concept et dans les modèles toxicologiques et qu'il a été traduit avec succès pour analyser des échantillons cliniques.
D'autres méthodes ont été utilisées pour l'analyse de l'engagement cible KDM1A. Beaucoup de ces méthodes utilisent des marqueurs proxy comme les changements de la marque h3K4me2 histone, en utilisant AlphaLisa15; ou l'induction de marqueurs d'expression à l'aide de l'analyse qRT-PCR ou FACS16. Cependant, dans les cellules ou les tissus, les marques histones sont contrôlées par de multiples facteurs, et les essais qui mesurent les changements dans la marque histone ne fournissent pas toujours une bonne plage dynamique pour l'analyse. L'inhibition de KDM1A peut induire des changements puissants dans l'expression de gène et de protéine, mais la réponse tend à le contexte très hétérogène et fortement de cellules dépendant, qui peut compliquer des analyses de la réponsededose 3,7.
L'évaluation directe de l'occupation de la cible est donc la meilleure option pour mesurer l'engagement des cibles. Un exemple qui a été proposé à cet effet est l'analyse thermique cellulaire (CETSA), basée sur l'augmentation de la stabilité thermique des protéines cibles lors de la liaison des inhibiteurs. Cette méthode peut, en principe, être appliquée aux cellules non modifiées et différents types de tissus et a récemment été utilisée pour évaluer l'activité cellulaire des inhibiteurs de KDM1A dans les cellules cultivées17. Cependant, cette technologie a rarement été utilisée pour les études pharmacodynamiques in vivo18 et, au meilleur de notre connaissance, son utilisation n'a pas été rapportée dans les essais cliniques.
Le protocole fourni ici décrit une méthode entièrement validée à base de chemoprobe qui a été utilisée pour déterminer l'engagement cible De KDM1A dans les cellules et les échantillons de tissus. La méthode a été traduite avec succès pour analyser des échantillons de sujets humains traités avec un inhibiteur kDM1A19 et sera d'une grande utilité pour modéliser les réponses PK/PD dans les essais cliniques.
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Disclosures
L'auteure Tamara Maes est directrice exécutive et actionnaire, et les auteurs Cristina Mascaro et Raquel Ruiz Rodriguez sont des employés d'Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. qui développe des inhibiteurs KDM1A et détient des brevets couvrant les composés et les méthodes utilisés dans cet article.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, et partiellement appuyé par le programme de collaboration CIIP-20152001 et RETOS RTC-2015-3332-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. , WO2017158136 (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
