Summary
Proteomisk profilering af tyrosin-nitrerede proteiner har været en udfordrende teknik på grund af den lave overflod af 3-nitrotyrosin modifikation. Her beskriver vi en ny metode til tilsætning af nitropeptid og profilering ved hjælp af angiotensin II som model. Denne metode kan udvides til andre in vitro -eller in vivo -systemer.
Abstract
Protein nitrering er en af de vigtigste post-translationelle modifikationer (PTM) på tyrosin rester og det kan induceres ved kemiske handlinger af reaktive oxygenarter (ROS) og reaktive nitrogen arter (RNS) i eukaryotiske celler. Præcis identifikation af nitrerings steder på proteiner er afgørende for forståelsen af de fysiologiske og patologiske processer relateret til protein nitrering, såsom inflammation, aldring og kræft. Da de nitro-holdige proteiner er af lav overflod i cellerne selv under inducerede forhold, er der ikke udviklet universelle og effektive metoder til profilering og identificering af protein nitreringssteder. Her beskriver vi en protokol for tilsætning af nitropeptid ved hjælp af en kemisk reduktions reaktion og biotin mærkning, efterfulgt af høj opløsning massespektrometri. I vores metode kan nitropeptidderivater identificeres med høj nøjagtighed. Vores metode udviser to fordele i forhold til de tidligere rapporterede metoder. Første, dimethyl mærkning bruges til at blokere den primære Amin på nitropeptider, som kan bruges til at generere kvantitative resultater. For det andet anvendes en disulfid obligation indeholdende NHS-biotin reagens til tilsætning, som kan reduceres yderligere og alkyleres for at forbedre detektionssignalet på et massespektrometer. Denne protokol er blevet anvendt med succes på model peptid angiotensin II i det aktuelle papir.
Introduction
Nitrering af tyrosin rester i proteiner til dannelse af 3-nitrotyrosin regulerer mange biologiske processer. På grund af de forskellige kemiske egenskaber mellem tyrosin og 3-nitrotyrosin, et nitreret protein kan have forstyrres signalering aktivitet1,2. Derfor er det vigtigt at udvikle metoder, der kan berige og identificere nitrerings steder på proteiner effektivt. Da 3-nitrotyrosin er en lav overflod modifikation på proteiner i forhold til andre former for PTM, såsom fosforylering og acetyl lation, det er udfordrende at identificere endogene nitrering steder direkte fra cellelinjer eller vævsprøver. Ikke desto mindre er metoden til brug af massespektrometri (MS) til at karakterisere fragmenterings mønstret for nitrotpeptid blevet udviklet (f. eks. Zhan & Desiderio3), som lægger fundamentet for nye metoder til nitroproteomik.
I øjeblikket er et berignings trin efterfulgt af MS den mest effektive strategi for nitropeptid-profilering4,5. Berignings metoderne kan inddeles i to klasser. En klasse er baseret på antistoffer, der kan genkende 3-nitrotyrosin specifikt, mens den anden klasse er baseret på den kemiske afledningen, der reducerer en Nitro gruppe til en Amin gruppe4,5. For den antistof-baserede metode anvendes nitrotyrosinaffinitet kolonne til berigelse, hvorfra elueret materiale er yderligere løst og analyseret af høj opløsning MS6,7. For den kemiske aflednings baserede metode skal amingrupperne ved N-endepunkt for peptid eller lysin blokeres i første trin enten ved at acetyl-, isobarisk-Tags for relative og absolutte kvantitation (itraq) eller tandem Mass Tags (TMT) reagenser. Næste, en reduktionssystem bruges til at reducere nitrotyrosin til amino tyrosin efterfulgt af at ændre den nydannede Amin gruppe, som omfatter biotin ligation, sulphydryl peptid konvertering, eller andre typer af tagging systemer8,9, 10,11. De fleste af de hidtidige protokoller er baseret på in vitro -over-nitrerede proteiner i stedet for endogent nitrerede proteiner.
I nærværende undersøgelse er der udviklet en modificeret procedure for kemisk afsaetning af nitrotyrosin til tilsætning og identifikation af nitropeptid, hvilket viser øget følsomhed under MS-påvisning og er egnet til kvantificerings formål. Vores nylige undersøgelse anvender denne metode i biologiske systemer identificeret, at nitrering af lymfocyt-specifikke protein tyrosinkinase (LCK) på Tyr394 af RNS fremstillet af myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs) spiller en vigtig rolle i immunsuppression af tumormikromiljøet12. Derfor kan vores metode til identifikation af nitropeptid også anvendes på komplekse biologiske prøver. Her beskriver vi vores protokol ved hjælp af model peptid angiotensin II, som fragmenterings mønstret er kendt og udbredt i nitroprotemiske undersøgelser8,9,10,11, som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nitrering af angiotensin II
- Til generering af nitreret peptid fortyndes 10 μL angiotensin II (DRVYIHPF) stamopløsning (2 mM i vand) i 390 μL PBS opløsning (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4) ved den endelige koncentration på 50 μM.
- Der tilsættes 10 μL peroxynitrit (200 mM i 4,7% NaOH) til angiotensin II-opløsningen for at opnå den endelige koncentration af peroxynitrit 5 mM.
Bemærk: peroxynitrit er ustabil og let at løse, når det er i syre form, så den overordnede opløsning af peroxynitrit opbevares i grundlæggende opløsning og opbevares i-80 °c. - Opløsningens pH-værdi justeres til 7-8 med 1 M HCl. For at påbegynde nitrerings reaktionen rystes røret ved 400 rpm i 5 min.
- Brug en kommercielt tilgængelig omvendt fase SPE kolonne (Se tabel over materialer) for afsaltning.
- Forbered 2 løsninger til afsaltning, 5% methanol i vand til vask og 80% methanol i vand til eluering.
- Der tilsættes 500 μl methanol efterfulgt af 500 μl vand for at forkonditionere kolonnen, læg 1 ml pipette med spidsen på toppen af søjlen, tryk pipetteller for at accelerere flowet.
- Der indlæses 410 μL af prøven i trin 1,3 på søjlen, og gennemstrømningen kasseres.
- Efter vask med 500 μL 5% methanol skal du bruge 300 μL 80% methanol til at elutere nitropeptid, som derefter tørres helt af Speed-VAC i standardindstillingen ved stuetemperatur.
Bemærk: afsaltning er meget vigtigt for reaktionerne, da opløsningsmidlet tilbage i det foregående trin kan have en negativ effekt på de næste trin.
2. alkylering af primære aminer ved dimethylmærkning
- Rekonstruere den pulveriserede Nitro-angiotensin II i 100 μL af 100 mM triethylammonium bicarbonat (TEAB) opløsning.
Bemærk: pH-værdien af opløsningen skal være mellem 7 og 9, og sørg for, at der ikke tilsættes primær Amin i opløsningen. - Der tilsættes 4 μL 4% formaldehyd til opløsningen, blandes kortvarigt.
Forsigtig: formaldehyd dampe er giftige; udføre forsøgene i en stinkhætte. - Der tilsættes 4 μL 0,6 M NaBH3cn til opløsningen, ryst røret ved 400 rpm i 1 time ved stuetemperatur.
- Mærknings reaktionen dæmps ved tilsætning af 16 μL 1% ammoniakopløsning, der inkuperer ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Der tilsættes 8 μL myresyre for at foracificere opløsningen og udføre afsaltning ved hjælp af reverse-fase SPE-søjlen som beskrevet i trin 1,4.
3. reduktion af nitrotyrosin til amino tyrosin
- Rekonstruere dimethylmærket Nitro-angiotensin II i 500 μL PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4).
- Der tilsættes 10 μL 1 M natriumdithionat til opløsningen, og der inkupereres ved stuetemperatur i 1 time. Efter reduktions reaktionen bliver opløsningens gule farve klar.
Bemærk: veje 174,1 mg natrium dithionat og opløse det i vand for at gøre den endelige volumen er 1 mL. Denne opløsning kan opbevares ved-20 °C ikke længere end en uge. - Brug den omvendte fase SPE-kolonne til afsaltning som beskrevet i trin 1,4.
4. biotinylering, berigelse og påvisning
- Rekonstruere dimethylmærket amino angiotensin II i 500 μL PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4).
- Der tilsættes 5 μL 40 nM NHS-S-S-biotin, opløst i DMSO, til opløsningen, efter 2 timer inkubation ved stuetemperatur, brug 1 μL 5% hydroxylamin til at slukke reaktionen.
- I mellemtiden er ækvibrate streptavidin agopstået perler ved tilsætning af 500 μL PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4), centrifuger ved 580 x g i 5 min ved stuetemperatur og kasserende supernatanten. Udfør ækvilibreringen 3 gange.
- Tilsæt 100 μL streptavidin agopstået perler til reaktionssystemet, inkuperer 1 h på en roterende shaker ved stuetemperatur. Vask 4 gange med PBS (10 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,4). For hvert vaske trin tilsættes 500 μL PBS til perlerne, blandes godt, derefter centrifugeres ved 580 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og kasseres supernatanten.
- Der anvendes 400 μL 10 mM dithiothreitol (DTT) til at inkube med agopstået perler ved 50 °C i 45 min., spin ned ved 580 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér perlerne, tilsæt 20 ΜL 0,5 M idoacetamid (IAM) til supernatanten i 20 minutter i mørke.
Bemærk: DTT bruges til at bryde disulfid bindingen mellem forbindelsen mellem biotin og peptid, sidstnævnte frigives fra perler og yderligere alkyleres af IAM. - Brug den omvendte fase SPE-kolonne til afsaltning vist i trin 1,4.
- Efter løsning af de tørre peptider i 20 μL af 0,1% myresyre (FA), underkastes produktet af hver sektion til væskekromatografi med tandem-massespektrometri (LC-MS/MS) analyse.
- Adskil de modificerede Ang II-peptider med et 60 minutters gradient eluering (0-8 min., 2% b; 8-10 min, 5% b; 10-35 min, 18% b; 35-50 min, 28% b; 50-52 min, 80% b; 52-58 min, 80% b; 58-59 min, 2% b; 59-60 min, 2% b) ved en strømningshastighed på 0,300 μl/min med nano-HPLC-system, som er direkte forbundet med massespektrometer med høj opløsning.
Bemærk: den analytiske kolonne er i 75 μm ID, 150 mm længde, pakket med C-18 harpiks. Mobil fase A bestod af 0,1% myresyre, og den mobile fase B bestod af 100% acetonitril og 0,1% myresyre. - Betjen massespektrometer i den dataafhængige anskaffelses tilstand, sæt et enkelt Full-Scan-massespektrum (300-1800 m/z, 60 000 opløsning) efterfulgt af 20 dataafhængige MS/MS-scanninger ved 28% normaliseret kollisionsenergi.
- Åbn massespektra data og Identificer toppene af produktet i hvert trin for at bekræfte, at den kemiske reaktion er blevet udført korrekt.
- Adskil de modificerede Ang II-peptider med et 60 minutters gradient eluering (0-8 min., 2% b; 8-10 min, 5% b; 10-35 min, 18% b; 35-50 min, 28% b; 50-52 min, 80% b; 52-58 min, 80% b; 58-59 min, 2% b; 59-60 min, 2% b) ved en strømningshastighed på 0,300 μl/min med nano-HPLC-system, som er direkte forbundet med massespektrometer med høj opløsning.
5. kvantificering af nitropeptid
- Forbered 3 sæt Nitro-angiotensin II-opløsninger fra trin 1,4, hvert sæt indeholdende 2 koncentrationer af Nitro-angiotensin II: sæt #1, 20 nmol i tube A og 20 nmol i tube B, hver i 100 μl TEAB-opløsning; Sæt #2, 10 nmol i tube C og 20 nmol i tube D, hver i 100 μl TEAB opløsning; Sæt #3, 40 nmol i tube E og 10 nmol i rør F, hver i 100 μl TEAB opløsning.
Bemærk: de to koncentrationer af Nitro-angiotensin II i hvert sæt anvendes til dimethylmærkning, til at reagere med formaldehyd (lys) og formaldehyd-D2 (tung) hhv. - For hvert sæt tilsættes 4 μL 4% formaldehyd og formaldehyd-D2 til prøven, der skal mærkes som henholdsvis let og tung. Følg trinene 2,3 til 2,5 for at afslutte dimethyl-mærkning.
- Bland de lyse og tunge mærkede prøver.
- Følg trinene fra 3,1 til 4,6 for reduktion, biotinylering, berigelse og detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rutediagrammet for nitropeptidprofilering i dette manuskript er vist i figur 1. Figur 2, 3, 4 og 5 viser Massespektra af angiotensin II, nitro-angiotensin II, dimethyl mærket Nitro-ANGIOTENSIN II og dimethyl mærket amino angiotensin II, hhv. Stoffets molekylvægt kan afspejles i m/z-værdierne af toppen af mono-isotop i hver figur, hvilket indikerer, at den kemiske modifikation af angiotensin II blev opnået med succes for hvert trin. Figur 6 viser det endelige produkt i trin 4,7 detekteret og karakteriseret ved LC-MS/MS. figur 7 viser de kvantitative resultater af nitropeptid ved dimethylmærkning. De relative mængder af lys og tung blev bestemt ved sammenligningen af intensiteten af mono-isotop Peak i hver gruppe, som giver os mulighed for at kvantificere de beriget nitropeptider fra forskellige grupper.
Figur 1 . Arbejdsgangen i den kemiske aflednings metode til berigende og detekterende Nitro-angiotensin II. Først, angiotensin II er nitreret af peroxynitrit, efter afsaltning, dimethylmærkning bruges til at blokere den primære Amin på peptid. Derefter anvendes natriumdithionat til at reducere nitrotyrosin til amino tyrosin, som yderligere reagerede med NHS-S-S-biotin. Efter tilsætning af streptavidin perler, er peptid skåret af DTT efterfulgt af alkylering og detekteres af LC-MS/MS. Dette tal er blevet ændret fra12, figur 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Masse spektret af angiotensin II. Dette tal viste, at mono-isotop Peak på m/z 523,78 matchede vidyasagar opladet peptid (op) og MS/MS fragmentering mønster af angiotensin II (nederst). Dette tal er blevet ændret fra12, figur S2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Masse spektret af Nitro-angiotensin II. Dette tal viste, at den mono-isotop Peak på m/z 546,28 matchede vidyasagar opladet peptid (op) og MS/MS fragmentering mønster af Nitro-angiotensin II (bund). Dette tal er blevet ændret fra12, figur S2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Masse spektret af dimethyl mærket Nitro-angiotensin II. Dette tal viste, at den mono-isotop Peak på m/z 560,29 matchede vidyasagar opladet peptid (op) og MS/MS fragmentering mønster af dimethyl mærket Nitro-angiotensin II (bund). Dette tal er blevet ændret fra12, figur S2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Masse spektret af dimethyl mærket amino angiotensin II. Dette tal viste, at mono-isotop Peak på m/z 545,31 matchede vidyasagar opladet peptid (op) og MS/MS fragmentering mønster af dimethyl mærket amino angiotensin II (nederst). Dette tal er blevet ændret fra12, figur S2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Masse spektret af det endelige produkt. Dette tal viste, at mono-isotop Peak på m/z 617,82 matchede vidyasagar opladet peptid (op) og MS/MS fragmentering mønster af det endelige produkt (midten) og zoom-in spektrum fra 400 til 1000 m/z udstillet mere detaljeret fragmentering mønster (nederst) . Dette tal er blevet ændret fra12, figur S2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . Masse spektrene af kvantificerings resultaterne af nitropeptiderne ved dimethylmærkning. Lyset til tunge forhold er 1:1 (op), 1:2 (midterste) og 4:1 (nederst) hhv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen her beskriver tilsætning af nitropeptid og profilering. Ved hjælp af angiotensin II som model peptid, illustrerede vi den procedure, der er vist i figur 1. Efter at have fået Nitro-angiotensin II, bør den primære Amin på peptid blokeres for at undgå yderligere Amin konjugering, som er et af de mest kritiske trin i protokollen. I den nuværende protokol bruges dimethyl-mærkning til at blokere de primære aminer af to grunde: for det første gør den det muligt at erhverve kvantitative resultater; for det andet er omkostningerne ved denne reaktion lavere end den NHS-baserede reaktion, og blokerings effektiviteten er høj13. For kvantificeringen er de målte lys til tunge nøgletal meget tæt på de forventede nøgletal (figur 7), fejlene beregnes mindre end 10%.
Et andet kritisk trin i protokollen er reduktionen af 3-nitrotyrosin på dimethyl mærket peptid til amino tyrosin af natriumdithionat, som reagerer hurtigt og effektivt. Den nyligt genererede Amin gruppe er yderligere mærket med 4-5 folder overskydende af NHS-S-S-biotin. Mindre eller flere NHS-S-S-biotin ville føre til ufuldstændig mærkning reaktion eller ufuldstændig berigelse, hhv. DTT kan fuldt ud bryde disulfid obligation og frigive beriget peptid fra streptavidin perler, som er alkylerede af IAM og analyseret af LC-MS/MS.
Denne protokol er velegnet til at identificere og kvantificere nitropeptider i både biokemisk system og biologiske materialer såsom celler eller væv. Da biotinberigelse og IAM-alkylering kan øge følsomheden betydeligt, bliver de lavtrigelige nitropeptider detekterbare af MS. For eksempel brugte vi denne protokol til at profilere endogene nitropeptider af isolerede infiltrerende T-celler fra murine prostata og lunge karcinom modeller12. Vi identificerede Nitro-Tyr294 af protein lck og udførte funktionelle undersøgelser for at vise, at denne modifikation kan spille en afgørende rolle i processen med immunsuppression af mdscs12.
Anvendelsen af vores teknik er begrænset af to faktorer: for det første, den lave overflod af nitropeptider i celler og væv dikterer, at få nitropeptider kan identificeres; for det andet den iboende lave detektionsfølsomhed for MS sammenlignet med de meget følsomme metoder, såsom enkelt celle genomisk og transcriptomic sekventering. Vi forestiller os, at anvendelsen af denne protokol til andre patologiske tilstande vil hjælpe med at definere mere protein nitrering PTMs med tidligere ukendte funktioner i sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af American Cancer Society institutions forskning Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon stack er Principal Investigator; X.L. er en under modtager investigator). Denne publikation blev muliggjort med delvis støtte fra Grant Numbers KL2 TR002530 og UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) fra National Institutes of Health, National Center for fremrykning af translationelle videnskaber, klinisk og translational Sciences Award. X. L. er modtager af Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. er understøttet af Walther Cancer Foundation fremme grundlæggende Cancer tilskud. X. W. understøttes af National Natural Science Foundation of China General program (Grant No. 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
