Summary
El perfilado proteómico de las proteínas nitratodeadas por tirosina ha sido una técnica desafiante debido a la baja abundancia de la modificación de 3-nitrotirosina. Aquí describimos un enfoque novedoso para el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos mediante el uso de Angiotensin II como modelo. Este método se puede extender para otros sistemas in vitro o in vivo.
Abstract
La nitración proteica es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes (PTM) en residuos de tirosina y puede ser inducida por acciones químicas de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) en células eucariotas. La identificación precisa de los sitios de nitración en las proteínas es crucial para comprender los procesos fisiológicos y patológicos relacionados con la nitración de proteínas, como la inflamación, el envejecimiento y el cáncer. Dado que las proteínas nitradas son de baja abundancia en células incluso en condiciones inducidas, no se han desarrollado métodos universales y eficientes para la elaboración de perfiles e identificación de sitios de nitración proteica. Aquí describimos un protocolo para el enriquecimiento de nitropéptidos mediante el uso de una reacción de reducción química y etiquetado de biotina, seguido de espectrometría de masas de alta resolución. En nuestro método, los derivados de nitropéptidos se pueden identificar con alta precisión. Nuestro método exhibe dos ventajas en comparación con los métodos reportados anteriormente. En primer lugar, el etiquetado de dimetil se utiliza para bloquear la amina primaria en nitropéptidos, que se puede utilizar para generar resultados cuantitativos. En segundo lugar, se utiliza un enlace de disulfuro que contiene reactivo de biotina NHS para el enriquecimiento, que se puede reducir y alquilar aún más para mejorar la señal de detección en un espectrómetro de masas. Este protocolo se ha aplicado con éxito al péptido modelo Angiotensin II en el documento actual.
Introduction
La nitración de residuos de tirosina en proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muchos procesos biológicos. Debido a las diferentes propiedades químicas entre tirosina y 3-nitrotirosina, una proteína nitrada puede haber perturbado la actividad de señalización1,2. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos que puedan enriquecer e identificar los sitios de nitración en las proteínas de manera eficiente. Como la 3-nitrotirosina es una modificación de baja abundancia en las proteínas en comparación con otras formas de PTM, como la fosforilación y la acetilación, es difícil identificar los sitios de nitración endógenas directamente a partir de líneas celulares o muestras de tejido. Sin embargo, se ha desarrollado la metodología de uso de espectrometría de masas (Em) para caracterizar el patrón de fragmentación del nitrotpéptido (por ejemplo, Zhan & Desiderio3), que sienta las bases para nuevos métodos de nitroproteómica.
Actualmente, un paso de enriquecimiento seguido por la EMes la estrategia más poderosa para el perfilado de nitropéptidos 4,5. Los métodos de enriquecimiento se pueden clasificar en dos clases. Una clase se basa en anticuerpos que pueden reconocer 3-nitrotirosina específicamente, mientras que la otra clase se basa en la derivación química que reduce un grupo de nitro a un grupo de aminas4,5. Para el método basado en anticuerpos, la columna de afinidad de nitrotyrosina se utiliza para el enriquecimiento, a partir del cual el material eludado se resuelve y analiza más adelante por la alta resolución MS6,7. Para el método basado en derivación química, los grupos de amina en el N-terminus del péptido o lisina deben ser bloqueados en el primer paso ya sea por acetilación, etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ), o reactivos de etiquetas de masa en tándem (TMT). A continuación, se utiliza un reductor para reducir la nitrotirosina a la aminotyrosina seguido de la modificación del grupo de aminas recién formado, que incluye ligadura de biotina, conversión de péptido sulfícula u otros tipos de sistemas de etiquetado8,9, 10,11. La mayoría de los protocolos establecidos hasta ahora se basan en proteínas con sobrenitrato in vitro, en lugar de proteínas nitratos endógenas.
En el presente estudio, se desarrolla un procedimiento modificado de derivación química de nitrotirosina para el enriquecimiento e identificación de nitropéptidos, que muestra una mayor sensibilidad durante la detección de LA MS y es adecuado para fines de cuantificación. Nuestro estudio reciente que emplea este método en sistemas biológicos identificó que la nitración de la tetirosina quinasa de proteína específica de linfocitos (LCK) en Tyr394 por RNS producido a partir de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) juega un papel importante en el inmunosupresión del microambiente tumoral12. Por lo tanto, nuestro método de identificación de nitropéptidos también se puede aplicar a muestras biológicas complejas. Aquí, describimos nuestro protocolo utilizando el péptido modelo Angiotensin II, del cual el patrón de fragmentación es conocido y ampliamente utilizado en estudios nitroproteómicos8,9,10,11, como ejemplo.
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Protocol
1. Nitration of Angiotensin II
- Para generar solución primaria de péptido nitrado, diluir 10 ml de solución padre de angiotensina II (DRVYIHPF) (2 mM en agua) en una solución de PBS de 390 ml (10 mM NaH2PO4,150 mM naCl, pH 7.4) a la concentración final de 50 oM.
- Añadir 10 l de peroxinitrita (200 mM en 4,7% NaOH) a la solución de Angiotensina II para realizar la concentración final de peroxinitrita de 5 mM.
NOTA: La peroxinitrita es inestable y fácil de resolver cuando está en forma ácida, por lo que la solución padre de peroxinitrita se mantiene en solución básica y se almacena en -80 oC. - Ajuste el valor de pH de la solución a 7-8 por 1 M HCl. Para iniciar la reacción de la nitración, agitar el tubo a 400 rpm durante 5 minutos.
- Utilice una columna SPE de fase inversa disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)para la desalación.
- Preparar 2 soluciones para la desalación, 5% de metanol en agua para el lavado y 80% de metanol en agua para la elución.
- Añadir 500 l de metanol, seguido de 500 l de agua para pre-acondicionar la columna, poner 1 mL pipeteador con la punta en la parte superior de la columna, presione el pipeteador para acelerar el flujo.
- Cargue 410 l de la muestra en el paso 1.3 de la columna, deseche el flujo.
- Después de lavar con 500 s de metanol al 5%, utilice 300 ml de metanol al 80% para eluir el nitropéptido, que luego se seca completamente por la velocidad-vac en el ajuste predeterminado a temperatura ambiente.
NOTA: La desalación es muy importante para las reacciones, ya que el disolvente dejado en el paso anterior puede tener un efecto negativo en los siguientes pasos.
2. Alquilación de aminas primarias por etiquetado de dimetil
- Reconstituir la solución de nitro-angiotensina II en polvo en 100 ml de trietilammonio de 100 mM (TEAB).
NOTA: El valor de pH de la solución debe estar entre 7 y 9, y asegúrese de que no se añade ninguna amina primaria en la solución. - Añadir 4 sL de 4% de formaldehído a la solución, mezclar brevemente.
ADVERTENCIA: Los vapores de formaldehido son tóxicos; realizar los experimentos en una campana de humo. - Añadir 4 l de 0,6 M NaBH3CN a la solución, agitar el tubo a 400 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
- Atemple la reacción de etiquetado añadiendo 16 sl de solución de amoníaco al 1%, incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir 8 l de ácido fórmico para acidificar la solución y realizar la desalación utilizando la columna SPE de fase inversa como se describe en el paso 1.4.
3. Reducción de la nitrotirosina a la aminotirosina
- Reconstituir el dimetil etiquetado nitro-angiotensina II en 500 oL de PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4).
- Añadir 10 ml de ditiónantia de sodio de 1 M a la solución e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Después de la reacción de reducción, el color amarillo de la solución se vuelve claro.
NOTA: Pesar 174,1 mg de ditión de sodio y disolverlo en agua para hacer que el volumen final sea de 1 ml. Esta solución se puede almacenar a -20 oC no más de una semana. - Utilice la columna SPE de fase inversa para la desalación como se describe en el paso 1.4.
4. Biotinylación, enriquecimiento y detección
- Reconstituir el dimetil etiquetado amino angiotensina II en 500 l de PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4).
- Añadir 5 l de 40 nM NHS-S-S-biotina, disuelto en DMSO, a la solución, después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, utilizar 1 l de hidroxilamina al 5% para saciar la reacción.
- Mientras tanto, equilibra las perlas de agarosa de estreptavidina añadiendo 500 éL de PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4), centrifugando a 580 x g durante 5 min a temperatura ambiente y descartando el sobrenadante. Realice el equilibrio 3 veces.
- Añadir 100 l de estreptavidina de agarosa al sistema de reacción, incubar 1 h en una coctelera rotativa a temperatura ambiente. Lavar 4 veces con PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4). Para cada paso de lavado, añadir 500 sl de PBS a las perlas, mezclar bien, luego centrifugar a 580 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
- Utilice 400 éL de ditiothreitol de 10 mM (TDT) para incubar con perlas de agarosa a 50 oC durante 45 min, girar a 580 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y desechar las perlas, añadir 20 ml de 0,5 M idotamiacede (IAM) al supernadante durante 20 minutos de oscuridad.
NOTA: La TDT se utiliza para romper el vínculo de disulfuro entre el enlace de la biotina y el péptido, este último se libera de las cuentas y se alquila aún más por IAM. - Utilice la columna SPE de fase inversa para la desalación que se muestra en el paso 1.4.
- Después de resolver los péptidos secos en 20 ml de ácido fórmico (FA) al 0,1%, someta el producto de cada sección a cromatografía líquida con análisis de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).
- Separe los péptidos Ang II modificados por una elución de gradiente de 60 minutos (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) a un caudal 0.300 l/min con sistema nano-HPLC que se interconecta directamente con el espectrómetro de masas de alta resolución.
NOTA: La columna analítica está en ID de 75 mm, 150 mm de longitud, embalado con resina C-18. La fase móvil A consistía en 0,1% de ácido fórmico, y la fase móvil B consistía en 100% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico. - Operar el espectrómetro de masas en el modo de adquisición dependiente de datos, establecer un único espectro de masa de exploración completa (300-1800 m/z, resolución 60 000) seguido de 20 escaneos MS/MS dependientes de datos a 28% de energía de colisión normalizada.
- Los datos de espectros de masas abiertos e identificar los picos del producto en cada paso para confirmar que la reacción química se ha realizado con éxito.
- Separe los péptidos Ang II modificados por una elución de gradiente de 60 minutos (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) a un caudal 0.300 l/min con sistema nano-HPLC que se interconecta directamente con el espectrómetro de masas de alta resolución.
5. Cuantificación del nitropéptido
- Preparar 3 juegos de soluciones de nitro-Angiotensina II del paso 1.4, cada conjunto que contiene 2 concentraciones de nitro-angiotensina II: Set #1, 20 nmol en el tubo A y 20 nmol en el tubo B, cada uno en solución TEAB de 100 l; Fije #2, 10 nmol en el tubo C y 20 nmol en el tubo D, cada uno en solución TEAB de 100 l; Ajuste #3, 40 nmol en el tubo E y 10 nmol en el tubo F, cada uno en solución TEAB de 100 l.
Nota: Las dos concentraciones de nitro-angiotensina II en cada conjunto se utilizan para el etiquetado de dimetil, para reaccionar con formaldehído (ligero) y formaldehído-D2 (pesado), respectivamente. - Para cada conjunto, agregue 4 sl de formaldehído y formaldehído-D2 a la muestra que se etiquetará como ligera y pesada, respectivamente. Siga los pasos 2.3 a 2.5 para terminar el etiquetado de dimetils.
- Mezclar las muestras etiquetadas ligeras y pesadas.
- Siga los pasos de 3.1 a 4.6 para la reducción, biotinylación, enriquecimiento y detección.
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Representative Results
El diagrama de flujo para la elaboración de perfiles de nitropéptidos en este manuscrito se muestra en la Figura1. Las figuras 2, 3, 4 y 5 muestran los espectros de masa de Angiotensina II, nitro-angiotensina II, dimetil etiquetado nitro-angiotensina II y dimetil etiquetado como amino angiotensina II, respectivamente. El peso molecular del compuesto puede reflejarse en los valores m/z del pico mono-isótopo en cada figura, lo que indica que la modificación química de la angiotensina II se logró con éxito para cada paso. La Figura 6 muestra el producto final en el paso 4.7 detectado y caracterizado por LC-MS/MS. La Figura 7 muestra los resultados cuantitativos del nitropéptido por etiquetado de dimetil. Las cantidades relativas de luz y pesado se determinaron mediante la comparación de la intensidad del pico mono-isótopo en cada grupo, lo que nos permite cuantificar los nitropéptidos enriquecidos de diferentes grupos.
Figura 1 . El flujo de trabajo del método de derivación química para enriquecer y detectar la nitro- angiotensina II. En primer lugar, la angiotensina II es nitrada por peroxinitrita, después de la desalación, etiquetado de dimetil se utiliza para bloquear la amina primaria en el péptido. Entonces el ditionato de sodio se utiliza para reducir la nitrotirosina a la aminotyrosina, que se reacciona aún más con NHS-S-S-biotina. Después de enriquecido con perlas de estreptavidina, el péptido es cortado por TDT seguido de alquilación y detectado por LC-MS/MS. Esta cifra se ha modificado a partir de12, Figura 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . El espectro de masas de la angiotensina II. Esta cifra mostró que el pico mono-isótopo a m/z 523.78 coincidía con el péptido cargado de duplo (arriba) y el patrón de fragmentación MS/MS de angiotensina II (abajo). Esta cifra se ha modificado a partir de12, Figura S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . El espectro de masa de nitro-angiotensina II. Esta cifra mostró que el pico mono-isótopo en m/z 546.28 coincidía con el péptido cargado de duplo (arriba) y el patrón de fragmentación MS/MS de nitro-angiotensina II (abajo). Esta cifra se ha modificado a partir de12, Figura S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . El espectro de masa de dimetil etiquetado nitro-angiotensina II. Esta cifra mostró que el pico mono-isótopo en m/z 560.29 coincidía con el péptido cargado de duplo (arriba) y el patrón de fragmentación MS/MS de dimetil etiquetado nitro-angiotensina II (abajo). Esta cifra se ha modificado a partir de12, Figura S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . El espectro de masa de dimetil etiquetado amino Angiotensina II. Esta cifra mostró que el pico mono-isótopo en m/z 545.31 coincidía con el péptido cargado de duplo (arriba) y el patrón de fragmentación MS/MS de dimetil etiquetado como amino Angiotensina II (abajo). Esta cifra se ha modificado a partir de12, Figura S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . El espectro de masa del producto final. Esta cifra mostró que el pico mono-isótopo en m/z 617.82 coincidía con el péptido cargado de duplo (arriba) y el patrón de fragmentación MS/MS del producto final (medio) y el espectro de zoom de 400 a 1000 m/z exhibieron un patrón de fragmentación más detallado (abajo) . Esta cifra se ha modificado a partir de12, Figura S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 . Los espectros de masa de los resultados de cuantificación de los nitropéptidos por etiquetado de dimetil. Las relaciones ligeras a pesadas son 1:1 (arriba), 1:2 (medio) y 4:1 (abajo), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo aquí describe el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos. Utilizando Angiotensin II como péptido modelo, ilustramos el procedimiento que se muestra en la Figura1. Después de obtener la nitro-angiotensina II, la amina primaria en el péptido debe bloquearse para evitar la conjugación de amina adicional, que es uno de los pasos más críticos dentro del protocolo. En el protocolo actual, el etiquetado de dimetil según se utiliza para bloquear las aminas primarias por dos razones: en primer lugar, permite la adquisición de resultados cuantitativos; en segundo lugar, el costo de esta reacción es menor que la reacción basada en nhS y la eficiencia de bloqueo es alta13. Para la cuantificación, las relaciones de luz a pesadamedidas están muy cerca de las relaciones esperadas (Figura 7), los errores se calculan menos del 10%.
Otro paso crítico del protocolo es la reducción de la 3-nitrotirosina en el péptido etiquetado dimetil a aminotyrosina por ditionato de sodio, que reacciona rápida y eficientemente. El grupo de aminas recién generado se etiqueta aún más con 4-5 veces el exceso de NHS-S-S-biotina. Menos o más NHS-S-S-biotina conduciría a una reacción de etiquetado incompleta o enriquecimiento incompleto, respectivamente. La TDT puede romper completamente el enlace de disulfuro y liberar el péptido enriquecido de las perlas de estreptavidina, que son alquiladas por IAM y analizadas por LC-MS/MS.
Este protocolo es adecuado para identificar y cuantificar nitropéptidos tanto en el sistema bioquímico como en materiales biológicos como células o tejidos. Dado que el enriquecimiento de la biotina y la alquilación del IAM pueden mejorar significativamente la sensibilidad, los nitropéptidos de bajo abundante crecimiento se vuelven detectables por la EP. Por ejemplo, utilizamos este protocolo para perfilar nitropéptidos endógenos de células T infiltrantes aisladas de los modelos12de la próstata murina y del carcinoma pulmonar. Identificamos nitro-Tyr294 de la proteína LCK y realizamos estudios funcionales para demostrar que esta modificación puede desempeñar un papel crítico en el proceso de inmunosupresión por MDSCs12.
La aplicación de nuestra técnica está limitada por dos factores: en primer lugar, la baja abundancia de nitropéptidos en células y tejidos dicta que pocos nitropéptidos pueden ser identificados; en segundo lugar, la sensibilidad inherente de baja detección de la EP en comparación con las metodologías altamente sensibles, como la secuenciación genómica y transcriptomica de una sola célula. Prevemos que la aplicación de este protocolo a otras condiciones patológicas ayudará a definir más PRM de nitración proteica con funciones previamente no reconocidas en la progresión de la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack es Investigador Principal; X.L. es un investigador subreceptor). Esta publicación fue posible gracias al apoyo parcial de Grant Numbers KL2 TR002530 y UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) de los Institutos Nacionales de Salud, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. es galardonado con el Premio Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. cuenta con el apoyo de las subvenciones Walther Cancer Foundation Advancing Basic Cancer. X. W. cuenta con el apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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