Summary
Koronar Flow Reserve (CFR), er definert som forholdet mellom maksimal koronar blodstrøm til hvile koronar blodstrøm. Vi presenterer en protokoll for å evaluere CFR i rotter via ultralyd, som gir mulighet til å forutsi kardiovaskulære risikofaktorer i fravær av obstruktiv koronar sykdom.
Abstract
Koronar arteriesykdom er den ledende dødsårsaken over hele verden. Etter et akutt hjerteinfarkt, tidlig og vellykket hjerteinfarkt intervensjon via recanalization av koronar er den mest effektive strategien for å redusere størrelsen på iskemiske myokard. Koronar microvasculature kan ikke visualisere og avbildet in vivo, men det er flere invasive og ikke-invasiv teknikker som kan brukes til å vurdere parametre som er direkte avhengig av koronar mikrovaskulær funksjon. Endothelial funksjonen etter iskemi reperfusion kan vurderes også på nivået av koronar sirkulasjon via koronar Flow Reserve (CFR). I denne studien, peak hastighet av venstre fremre synkende (LAD) koronar arterier ble målt i rotter in vivo via Transthoracic Doppler ekkokardiografi under hvile og stress utfordring (indusert av dobutamin). Et normalt hjerte kan øke sin koronar blodstrøm opp til fire ganger over hvile verdiene under stress induksjon. Etter iskemi reperfusion, fant vi en betydelig redusert CFR, som kan brukes som en markør for koronar mikrovaskulær dysfunksjon. CFR har åpnet et vindu på viktigheten av mikrovaskulær dysfunksjon og har vist å forutsi kardiovaskulær risiko uavhengig av om den alvorlige obstruktiv sykdom er til stede.
Introduction
Hjerteinfarkt iskemi reperfusion (IR) er en tilstand der blodtilførselen er begrenset til hjertet etterfulgt av restaurering av og samtidig reoksygeneringsskader1. Okklusjon av koronar arterier kan være forårsaket av en embolus eller kolesterol plakk brudd, noe som resulterer i en alvorlig ubalanse av metabolsk forsyning og etterspørsel, forårsaker vev hypoksi. Berging av jeopardized myokard, forbedre venstre ventrikkel funksjon, og øke overlevelse hos pasienter med akutt hjerteinfarkt har blitt observert av reperfusion terapi. Men etter recanalization av koronar, kan funksjonelle unormalt av små koronar fartøy forekomme2,3,4,5. En betydelig andel av pasientene, kanskje så mange som 40%, ikke gjenvinne mikrovaskulær og hjerteinfarkt til tross for restaurering av koronar flyt. Visualisering og evaluering av koronar microvasculature kan være vanskelig in vivo, men det finnes en rekke invasive og ikke-invasive teknikker som kan brukes til å vurdere parametre direkte avhengig av koronar mikrovaskulær funksjon6 ,7. Dessuten kan endothelial funksjonen vurderes på nivået av koronar sirkulasjon via CFR5.
Transthoracic Doppler ekkokardiografi er et ikke-invasiv verktøy som tillater oss å studere koronar flyt hastighet og CFR5. CFR representerer forholdet mellom maksimal koronar blodstrøm til hvile koronar blodstrøm8. Under stress utfordring, et normalt hjerte øker koronar blodstrøm opp til fire ganger over hvile verdi. Kardiovaskulær risiko øker når CFR er redusert9. Ishihara et al viste at CFR ble alvorlig svekket umiddelbart etter koronar angioplastikk5. I fravær av koronar stenose, CFR avtar under koronar mikrovaskulær dysfunksjon og er til stede i omtrent halvparten av pasientene med stabil koronar arteriesykdom10.
Det overordnede målet med denne metoden er ikke-invasiv visualisering av venstre fremre synkende koronar arterie (LAD) funksjon i rotter via ekkokardiografi, som kan brukes til å beregne CFR. Dette gir et viktig vurderingsverktøy for diagnostisering av mikrovaskulær dysfunksjon og evaluering av potensielle terapeutiske behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med protokoller godkjent av University of Louisville institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC-godkjent protokoll 18223) og NIH guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr11.
1. dyr
- Bruk 4-måneders-gamle kvinnelige Fisher 344 rotter (BW ~ 150-180 g) for studien.
2. Ultralyd Imaging før IR kirurgi
- Bedøve rotta med isoflurane-induksjon kammer for 5% med 1.5 – 2.0 L/min O2 flyte føle etter av 1.5 – 2.0% med 1.5 – 2.0 L/min O2 flyte. Denne anestesi opprettholdes gjennom hele eksperimentet, under hvile og stress stadier.
- Plasser dyret i en liggende posisjon og barbere thorax. Oppretthold kroppstemperaturen ved 37-38 ° c ved hjelp av den innebygde oppvarmingen plattformen. Overvåk pulsen ved hjelp av programvaren.
Merk: riktig anestesi er avgjørende for å opprettholde hjertefrekvensen ved normale fysiologiske rater (mellom 295-350 beats/min). - Påfør øye veterinær salve for å hindre tørrhet i øynene før bildebehandling.
- Utfør ekkokardiografi ved hjelp av 13 – 24 MHz lineær sonde (f.eks. MS250) (figur 1a).
- Plasser dyret i liggende posisjon på den oppvarmede plattformen. Sørg for at anestesi styres via nese membranen. Plasser deretter proben for å få parasternal kort akse-visning (PSAX) ved hjelp av skinnesystemet (figur 1B).
- Beveg sonden i rostral retning fra PSAX, Finn lungearterien (figur 1B).
- Beveg sonden litt i retning caudal fra lungearterien for å se LAD og lagre bildet.
Merk: LAD er vanskelig å finne uten Color Doppler, så B-modus bilder av LAD er ikke alltid mulig. - Når enkelte forskjeller gjør det vanskelig å finne LAD koronar, følg teknikken som er nevnt nedenfor:
- Beveg sonden sideveis til lungearterien.
- Vinkel plattformen slik at dyret er tilbøyelig, invertert, eller litt mot høyre side slik at venstre ventrikkel er lettere synlig med sonden.
- Når bildet i B-modus er fanget eller Cine-lagret, klikker du på Color Doppler på berøringsskjermen (figur 1C). Visualiser koronar (hvit pil indikerer LAD) på den korte aksen (figur 1C). Den røde fargen, som sett i sanntid, er en indikasjon på retningen av flyten (dvs. blodstrømmen er mot sonden).
- Etter å ha visualisere LAD på en Color-Doppler-modus, endrer du modusen til puls bølgen (pw)-modus. Se etter tilstedeværelsen av en gul-indikator linje på koronar (figur 2a).
- Plasser den gule PW-line i midten av koronar. Sørg for at vinkelen er parallell til retningen av flyten.
Merk: hastigheten på flyten er svært avhengig av vinkelen på PW-linjen, så pass på å matche vinkelen på skjermen sonden med vinkelen på LAD. Bruk berøringsskjermen for å justere vinkelen; PW vinkelen skal være mindre enn 60 °. - Bruk Cine butikken for å fange hastigheten på hvile Lad koronar flyt på toppen diastolen som bølgeformer (figur 2b).
- Etter få av hviler LAD Flow hastighet, måle den maksimale strømningshastighet av LAD under stress å beregne CFR. For å måle maksimal strømningshastighet under stress, sette mot dobutamin i en dose på 20 μg/kg/min via hale vene8 (figur 2C).
Merk: dobutamin infusjon bør ikke være mer enn 8 min. Bruk en infusjons pumpe og sett diameteren på infusjons pumpen til 14,43 for BD 10 mL sprøyte.- Bruk 25-G infusjon Butterfly satt for halen vene kanyleringen. For å plassere infusjons nålen, Plasser en liten stripe av gasbind rundt undersiden av rotte halen, deretter Grip med hemostats og vri tourniquet for å legge trykk og føre til at venen å forstørre.
- Plasser nålen mens den er koblet direkte til dobutamin sprøyte.
Merk: ta ekstra forsiktighet for ikke å tilfeldigvis innføre stoffet når du tegner opp blod for å sikre riktig plassering av nålen i halen blodåre. Sørg også for å unngå å innføre en luftboble i venen, som en emboli kan være dødelig for dyret. - Når nålen er plassert, stabilisere den med et lim og et stykke kirurgisk tape, sikring av infusjons linjen til halen.
- Fjern hemostats og tourniquet for å gjenopprette flyten.
- Plasser dobutamin sprøyten i infusjons pumpen og sett den til å injisere 20 μg/kg/min.
- Under dobutamin infusjon, overvåke LAD topp og hjertefrekvens nøye. Med jevne mellomrom registreres LAD PW-topper i Doppler-modus, spesielt når det øker som svar på dobutamin.
Merk: stress utfordringen indusert av dobutamin fører til at hjertet til å jobbe hardere; Dette resulterer ofte i bevegelsen av hjertet og LAD. Vær forberedt på å flytte dyret, sonden, eller begge for å holde LAD i sikte. - Etter LAD topper og hjertefrekvens har plateaued under utfordringen, stoppe dobutamin infusjon, fjerne halen vene infusjon sett og fjerne dyret fra plattformen. Tillate det dyr å komme seg inne dens hjem bur.
- Velg peak vel verktøy for å få topp diastolisk hastigheter fra bildene som vises i figur 2b og C.
- Beregn CFR index som forholdet mellom LAD stress (dobutamin) peak diastolisk strømningshastighet til hvile LAD peak diastolisk strømningshastighet (figur 2a).
3. iskemi reperfusion skade
- Bedøve rotte med isoflurane-induksjon kammer på 5% med 1.5 – 2,0 L/min O2 Flow etterfulgt av 1.5 – 2,0% med 1.5 – 2,0 L/min O2 Flow.
- Bekreft dybden av anestesi ved mangelen på pedalen tilbaketrekking refleks. Bruk øye veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet. Oppretthold riktig kroppstemperatur på 37-38 ° c ved hjelp av en varmepute eller en kontroller for dyre temperatur.
- Administrere pre-kirurgisk meloksikam, 5 mg/kg intramuskulært, 15 min før operasjonen, etterfulgt av 2 mL subkutan bolus på 0,9% saltvann for å hindre dehydrering under operasjonen. Sterile hansker og instrumenter ble brukt, og aseptisk teknikk ble benyttet. Ved hjelp av fiberoptisk lyskilde, intubere rotte ved hjelp av 18-gauge IV kateter og koble til ventilatoren.
- Ombinde LAD bruker 8-0 monofilament Sutur gjennom 15 mm åpning på 5th interkostalrom plass. Tie en vanlig knute og la i 30 min. visuelt bekrefte iskemi i alle rotter via misfarging av hjertet overflaten12. Slipp ligatur etter 30 min og Verifiser reperfusion ved rødhet av det tidligere misfarget området av hjertemuskelen i 1-2 min12.
- Lukk ribbeinet buret med 4-0 absorberbare Sutur med en avbrutt Sutur mønster, deretter lukker huden ved hjelp av 5-0 ikke-absorberbare silke Sutur med kontinuerlig Sutur mønster.
- Fjern dyret fra anestesi. Tillate det dyr å komme seg inne hjemmet bur. 5 mg/kg meloksikam ble injisert intramuskulær i hver 24 timer før euthanizing dyret (72hours etter operasjonen).
4. ultralyd bilde etter IR-kirurgi
- 72 h etter IR kirurgi, måle koronar flyt og CFR igjen. Sammenlign målingene med før IR-målinger. Gjenta trinn 2,1 til 2,15 som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For denne studien, brukte vi 12 kvinnelige Fisher 344 rotter. Vi utførte en stress test med dobutamin og målte LAD koronar hastighet før og 72 timer etter IR kirurgi. Før IR kirurgi ble hvile LAD koronar hastighet målt som 423 ± 59 mm/s, som ble økt etter dobutamin infusjon (1005 ± 77mm/s) (figur 3a). Etter 72 h av iskemi reperfusion, hviler LAD koronar arterie hastighet var signifikant høyere sammenlignet med hvile LAD koronar hastighet før IR kirurgi (743 ± 40mm/s vs 423 ± 59 mm/s) (figur 3a). Stress respons på dobutamin test etter IR kirurgi ble betydelig redusert i forhold til før IR kirurgi svar (937 ± 67ms/s vs 1005 ± 77mm/s) (figur 3a).
CFR beregnes som forholdet mellom maksimal strømningshastighet under stress (dobutamin) til hvile strømningshastigheten (målt før dobutamin infusjon)8. CFR var 2,1 ± 0,35 i unge rotter før IR kirurgi (figur 3b), men betydelig redusert (1,1 ± 0,25) etter 72 h av IR kirurgi, selv om hvile Lad koronar hastighet var høyere i disse rottene i forhold til data innhentet før IR kirurgi ( Figur 3C). I tillegg var det ingen vesentlige endringer i systolisk funksjon av venstre ventrikkel i rotter etter 72 h av IR kirurgi (figur 3c).
Figur 1: koronar plassering. A. probe posisjon på rotte mens du SKAFFER Lad koronar hastighet. B. kort akse anatomisk representasjon av lungearterien, aorta, og lad koronar. C. anatomisk VISUALISERING av Lad koronar arterie på ekkokardiografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Pulse Wave Velocity Imaging av Lad koronar. A. representasjon av puls bølge hastighet sensor plassering på Lad koronar. B. Lad koronar puls bølge bilde under resten tilstand. C. Lad koronar puls bølge bilde under stress (dobutamin) tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Måling av koronar flyt ved hjelp av Doppler ekkokardiografi. A. Pulse bølge hastighet målt i kontroll under resten (CONT B) og under dobutamin infusjon (CONT D) og dyr etter 72 h av IR kirurgi under resten (IR B) og under dobutamin utfordring (IR D), p ≪ 0,05 CONT b vs ischemia reperfusion B (*). B. CFR ble beregnet fra puls bølge i forsøks dyrene (n = 9), p ≪ 0,05 CONT vs. IR (*). C. brøkdel forkortelse vurdering fra eksperimentelle grupper (n = 9). Data presenteres som Mean ± SD, analysert med enveis ANOVA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigste funnene fra dagens studie er at IR øker hviler LAD koronar hjerte hastighet og svekker CFR, selv i fravær av eventuelle rester angiografiske stenose.
Å forstå koronar fysiologi er en viktig del av den kliniske beslutningsprosessen for kardiologer å behandle koronar arteriesykdom. CFR er en av de viktigste funksjonelle parametre for å forstå patofysiologi av koronar mikrosirkulasjonen7,13. CFR er en ikke-invasiv metode for å vurdere både koronar stenose og koronar mikrovaskulær sirkulasjon og er en indikator på hjerteinfarkt blodtilførsel, eksplisitt evne til Coronaries å øke blodstrømmen under stress forhold7. En normal CFR (>2,0) gjenspeiler ofte en god prognose, mens CFR mindre enn 1,90 gir trinnvis diagnostisk informasjon for identifisering av høy risiko koronar blodsykdom14,15,16.
Våre resultater viser at selv om systolisk funksjon ble bevart etter iskemi reperfusion (figur 3c), ble CFR betydelig lavere (figur 3b). Således, recanalization av stenotic koronar arterier ikke bedre mikrovaskulær. Redusert CFR muliggjør påvisning av nedsatt mikrovaskulær vasodilatasjon etter iskemi reperfusion.
Denne studien demonstrerer de serielle CFR-evalueringer for å utforske effekten av ulike farmakologiske behandlinger ved hjelp av ikke-invasiv transthoracic Doppler-ekkokardiografi. Denne metoden av koronar funksjonell vurdering kan brukes i små dyr forskning som et gjennomførbart og levedyktig klinisk diagnostisk verktøy. Dette vil føre til minimere kravet om dyr bruk, dødshjelp, eller obduksjon i de små dyremodeller. Kritiske skritt i denne protokollen er å visualisere koronar og få PW hastighet bilder av god kvalitet. Et annet kritisk trinn er å opprettholde LAD-visualiseringen under stress tilstanden. Under dobutamin utfordring øker hjerterytmen, og LAD kan bevege seg fra synsfeltet; Forskerne bør være forberedt på å flytte feltet for å følge koronar. Begrensningene i den aktuelle studien inkluderer den relativt lille utvalgsstørrelsen, mangelen på korrelasjon mellom CFR og diameter for lumen i koronar åre i rotter, på grunn av vanskeligheter med å oppnå nøyaktig visualisering for størrelses måling av koronar. Men metodene som er beskrevet her er pålitelige, reproduserbar, og tilbyr innsiktsfull informasjon om skaden påført CARDIAC microvasculature følgende iskemi reperfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Helmsley fundament for å gi ultralyd utstyr for å utføre våre eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av NIA R01 053585-stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz linear probe | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma | D0676-10mg | |
| Isoflurane | RRC | 27376 | |
| Legato 100 Syringe pump | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Winged infusion set, 27G x 1/2", | Medline.com | TMOSV27ELZ |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- French, C. J., Zaman, A. K., Sobel, B. E. Failure of erythropoietin to render jeopardized ischemic myocardium amenable to incremental salvage by early reperfusion. Coronary Artery Disease. 20 (4), 295-299 (2009).
- Marzilli, M., Mariani, M. Ischemia-reperfusion and microvascular dysfunction: implications for salvage of jeopardized myocardium and reduction of infarct size. Italian Heart Journal. 2 Suppl 3, 40s-42s (2001).
- Prasad, A., Gersh, B. J. Management of microvascular dysfunction and reperfusion injury. Heart (British Cardiac Society). 91 (12), 1530-1532 (2005).
- Ishihara, M., et al. Impaired coronary flow reserve immediately after coronary angioplasty in patients with acute myocardial infarction. British heart journal. 69 (4), 288-292 (1993).
- Camici, P. G., d'Amati, G., Rimoldi, O. Coronary microvascular dysfunction: mechanisms and functional assessment. Nature Reviews Cardiology. 12 (1), 48-62 (2015).
- Chung, K. S., Nguyen, P. K. Non-invasive measures of coronary microcirculation: Taking the long road to the clinic. Journal of Nuclear Cardiology. , (2017).
- Kelm, N. Q., et al. Adipose-derived cells improve left ventricular diastolic function and increase microvascular perfusion in advanced age. PLoS One. 13 (8), e0202934 (2018).
- Pan, M., et al. Late recovery of coronary flow reserve in patients successfully treated with a percutaneous procedure. Revista Española de Cardiología. 56 (5), 459-464 (2003).
- Samim, A., Nugent, L., Mehta, P. K., Shufelt, C., Bairey Merz, C. N. Treatment of angina and microvascular coronary dysfunction. Current treatment options in cardiovascular medicine. 12 (4), 355-364 (2010).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health (2011).
- Ciuffreda, M. C., et al. Rat experimental model of myocardial ischemia/reperfusion injury: an ethical approach to set up the analgesic management of acute post-surgical pain. PloS one. 9 (4), e95913-e95913 (2014).
- van de Hoef, T. P., Siebes, M., Spaan, J. A. E., Piek, J. J. Fundamentals in clinical coronary physiology: why coronary flow is more important than coronary pressure. European Heart Journal. 36 (47), 3312-3319 (2015).
- Naya, M., et al. Preserved coronary flow reserve effectively excludes high-risk coronary artery disease on angiography. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (2), 248-255 (2014).
- Cortigiani, L., et al. Diagnostic and prognostic value of Doppler echocardiographic coronary flow reserve in the left anterior descending artery. Heart (British Cardiac Society). 97 (21), 1758 (2011).
- Kawata, T., et al. Prognostic value of coronary flow reserve assessed by transthoracic Doppler echocardiography on long-term outcome in asymptomatic patients with type 2 diabetes without overt coronary artery disease. Cardiovascular diabetology. 12, 121-121 (2013).
