Chemistry

מבצע ספקטרוסקופיית על חלקיקי פלמונית עם מיקרוסקופ ניגוד מבוסס שידור מסוג Nomarski הפרעות דיפרנציאליות

Published: June 5, 2019 doi: 10.3791/59411

¹Department of Chemistry and Biochemistry, Ohio University

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לפרט גישה מוכחת להכנת דגימות הפלמונית ננו-חלקיק ולביצוע ספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים עליהם בעזרת מיקרוסקופ בניגוד להפרעות דיפרנציאליות (DIC).

Abstract

מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי (DIC) הוא כלי דימות רב עוצמה הנפוץ ביותר עבור אובייקטים של מיקרוגוני דימות באמצעות אור גלוי לטווח. מטרת פרוטוקול זה היא לפרט שיטה מוכחת להכנת דגימות פלננו-חלקיק וביצוע ספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים עליהם עם מיקרוסקופ DIC. יש לעקוב אחר מספר צעדים חשובים על מנת לבצע ניסויים ספקטרוסקופית הניתנים לשחזור. ראשון, ציוני דרך יכולים להיות חרוט לתוך המצע לדוגמה, אשר מסייע באיתור משטח המדגם לעקוב אחר אזור העניין במהלך ניסויים. לאחר מכן, על המצע להתנקות כראוי מפסולת ומזהמים שעלולים להפריע או לטשטש בדיקה אחרת של המדגם. לאחר שמדגם מוכן כראוי, הנתיב האופטי של המיקרוסקופ חייב להיות מיושר, באמצעות תאורה קוסלר. עם תקן Nomarski בסגנון מיקרוסקופ DIC, סיבוב של המדגם עשוי להיות נחוץ, במיוחד כאשר חלקיקים פלמונית מציגים תכונות אופטיות תלויי אוריינטציה. מכיוון שמיקרוסקופיה הDIC מכיל שני שדות פולריזציה מנוגדים, תבנית הניגודיות הDIC התלויה באורך הגל חושפת את כיוון הננו-חלקיקים מפלסטיק בצורת מוט. לבסוף, יש לבצע בקפידה את רכישת הנתונים וניתוחי הנתונים. מקובל לייצג נתוני ספקטרוסקופיה מבוססי DIC כערך ניגודיות, אך ניתן גם להציג אותו כנתוני עוצמה. בהפגנה זו של DIC עבור ספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים, המוקד הוא על כדורי חלקיקי זהב בצורת מוט.

Introduction

מאז שנות השמונים, מיקרוסקופ הפרעות הדיפרנציאליות (DIC) הוצג בעיקר כשיטת דימות חשובה השמורה לאובייקטים מיקרוקשקשים בתוך המדעים הביולוגיים. עם זאת, במהלך התפתחותו בשנות ה-50 וה-60, היא נועדה להיות טכניקה של מדעי החומרים¹. עם הפיתוחים האחרונים במדעי החומרים הקשורים לחלקיקי פלמונית, התרחש עניין מוגבר באפיון חומרים עם מיקרוסקופ אופטי.

טכניקות אופטיות רבות זמינות בהחלט עבור אפיון ננו (למשל, שדה חשוך, ברייטפילד, אור מקוטב, זריחה, וכו '). השדה האפל פופולרי מאוד במחקר ננו-חלקיק, אבל הוא מסתמך אך ורק על אוסף של פיזור ומספק מידע מוגבל על דגימות מורכבות². הקרינה הפלואורסצנטית יכול להיות שימושי, אבל רק עם דגימות כי האור או זה יכול להיות מוכתם כראוי. מיקרוסקופ DIC יש מספר תכונות העושות את זה כלי רב ערך לניתוח של חלקיקים. היתרונות הבולטים ביותר של DIC בהשוואה לשיטות אחרות ולגבי חלקיקי פלמונית הם: אין צורך בצביעת מדגם, אין השפעות ההילה, עומק שדה רדוד ורזולוציה גבוהה לרוחב³. DIC כולל עוצמות נוספות החשובות לחקר הפלמונית ננו-חלקיק. קודם כל, שני שדות הפולריזציה הטבועים והאנכיים נמצאים, וניתן למדוד אותם בו למטרות ספקטרוסקופיה². שנית, האות מקוטב של חלקיקי חלקיקים לא נלכד בתמונה הסופית², אשר יכולה להיות סיבה לדאגה רצינית במדידות בשדה הכהה ספקטרוסקופיית.

מטרתה של מאמר זה היא לספק מתודולוגיה ברורה לשימוש במיקרוסקופיה DIC של נוארסקי משודרים לביצוע ספקטרוסקופיה על חלקיקי פלמונית. למרות DIC היא טכניקה רבת עוצמה אשר ניתן להחיל על חומרים מגוונים מאוד, היא גם טכניקה הדורשת מיומנות גדולה והבנה כדי להפעיל אותו כראוי כאשר הדמיה חלקיקים. מיקרוסקופיה DIC מבוססת שידור יש מסלול אור מורכב¹ שייבדק רק בקצרה כאן. הרכבת האופטית של DIC מוצגת באיור 1. אור מועבר דרך המיקרוסקופ על ידי הראשון עובר דרך מקטפה ומנסרה הקרן הפיצול Nomarski לפני ההתמקדות על ידי הקבל על המטוס לדוגמה. לאחר שעבר דרך המטרה, האור נתקל בקרן-שילוב של פריזמה Nomarski ומנתח לפני היציאה לגלאי. שני מקטני הקיטוב והפריזנוארסקי הינם קריטיים להיווצרות הדימוי הDIC, והינם אחראים להפקת שדות הפולריזציה האורתוגונתיים של DIC¹. עבור הקורא המעוניין לדעת יותר על עקרונות העבודה והנתיב האופטי של מיקרוסקופים DIC של נוארסקי, או ההבדלים בין נוארסקי DIC וסגנונות אחרים של DIC, עיין בחשבונות אחרים הנכתבים בנושאים הבאים¹^, ^ד ^, מיכל ⁵ ^, מיכל בן ⁶ ^, ⁷. לאחר מכן

חשוב באותה מידה להבין את האופי הבסיסי של חלקיקי הפלמונית לפני שמנסים לבצע ספקטרוסקופיה עליהם, בין אם מדובר בנוארסקי DIC, בשדה החשוך או בכל טכניקה מיקרוסקופית אחרת. בתחום הפלמונניקס, חלקיקי חלקיקים מוגדרים כחלקיקים עם ממדים בקנה מידה של 10-100 ננומטר⁸^,⁹. חלקיקים יכולים לקחת על צורות רבות (למשל, כדורים, מוטות, כוכבים, מטומטם, וכו '), ואת רוב התכונות החשובות שלהם נובעים אינטראקציות עם אור אולטרה סגול-גלוי ליד טווח אינפרא אדום של הספקטרום האלקטרומגנטי. המונח "פלמונית" אינו מוגבל לחלקיקים¹⁰; עם זאת, כאשר דנים חלקיקים, הוא משמש התייחסות מקומי פלמון משטח תהודה (LSPR). LSPR היא תופעה שבה אלקטרונים ההולכה ב ננו-חלקיק נדנוד בשל האינטראקציה עם הקולון עם קרינה אלקטרומגנטית של להקה בתדר מאוד ספציפי וצרה יחסית⁸. באותם תדרים, חלקיקים פלמונית התערוכה הגדילו את ספיגת האור ופיזור האורות, מה שהופך אותם להיות נצפה עם מיקרוסקופ אופטי. במקרים רבים, מעדיפים להתבונן חלקיקים תוך הצבת מסננים bandpass לפני העבה², כדי לשפר את הניגודיות הדמיה כדי לחסל את האור שנכשל לגרום לאפקט LSPR. שימוש במסננים גם מאפשר לבצע ניסויים ספקטרוסקופית חלקיקים בודדים.

התנהגות אופטית הקשורה ל-LSPR תלויה מאוד בגודל ובצורה של חלקיקי החלקיקים, והיא יכולה להיחקר עם טכניקות רבות של מיקרוסקופ אופטי. עם זאת, כדי לפענח מידע כיוון של חלקיקים פלמונית עם הצורה אניסוטרופי (כלומר, לא כדורי), יש צורך להשתמש בקיטוב של השדה האור. על-ידי סיבוב בזהירות של שדה הקיטוב או המצע לדוגמה בקפיצות קטנות, ניתן לנטר את תכונות הספקטרוסקופיות תלויי האוריינטציה של חלקיקים בודדים. סיבוב ופולריזציה יכול גם לסייע בקביעה אם תכונה ספקטרלית בשל תנודה בסדר קשר קואורדינטיבי או גבוה יותר של אלקטרונים השטח של ננו-חלקיק. עם זאת, במקרה של איזוטרופי (כלומר, כדורי) חלקיקי חלקיקים, הפרופיל הספקטרלי נותר במהותו ללא שינוי בעת סיבוב המדגם תחת אור מקוטב.

כאשר מתבוננים דרך מיקרוסקופ DIC (איור 2), לחלקיקים יש דיסק אוורירי עם מראה לבן ושחור של עופרת-יצוקה כנגד רקע אפור. חלקיקים כדוריים ישמרו זה מראה תחת סיבוב עם שינוי של מסנני bandpass; עם זאת, החלקיקים ייעלמו בהדרגה מן התצוגה כמו אורך הגל המרכזי של הפילטר הופך להיות מופרד עוד יותר הספרה היחידה של LSPR הספירה של הדור¹¹. הופעתו של nanorods יכול לשנות באופן דרמטי למדי כפי שהם מסובבים². Nanorods יש שתי להקות lspr עם התנהגות קשר קואורדינטיבי, המיקום של אשר מבוססים על הממדים הפיזיים של nanorods. כאשר ציר האורך של nanorod מונחה במקביל לאחד השדות הפולריזציה DIC, הדיסק האוורירי יופיע כולו לבן או כל שחור אם הוא מוצג עם מסנן מעבר בנדנה המשויך לאורך הגל זה LSPR. לאחר סיבוב המדגם 90 °, זה יהיה לקחת על הצבע הנגדי. לחילופין, מאז ציר רוחבי של nanorod ניצב לציר האורך, המוט ייקח על הצבע המנוגד בעת מעבר בין מסננים התואמים את אורכי גל LSPR עבור שני הצירים. בכיוונים אחרים והגדרות מסנן, nanorods יופיע יותר כמו כדורים, הצגת מגוון רחב של דפוסי הצללה של דיסק אוורירי. עבור nanorods עם ציר רוחבי < 25 ננומטר, זה יכול להיות קשה לזהות את האות ב-אורך הגל של LSPR באמצעות מיקרוסקופ DIC.

כדי לבצע ספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים, חשוב להשתמש ברכיבים האופטיים הנכונים וליישר אותם כהלכה. יש להשתמש במטרה לבצע מיקרוסקופ DIC. עבור ניסויים חלקיקים בודדים, 80 x או 100x יעדי הנפט הם אידיאליים. נוארסקי מהפריזאים בדרך כלל מגיעים בשלושה זנים: סטנדרטי, ניגודיות גבוהה ורזולוציה גבוהה. הסוג האידיאלי תלוי מאוד במטרת הניסוי ובגודל של חלקיקי חלקיקים. הפריסמות הרגילות הן בסדר לניסויים רבים; אבל כאשר עובדים עם חלקיקים קטנים יותר (< 50 ננומטר), מפריזחדות גבוהה יכול להועיל, מאז ניגודיות החלקיקים פוחתת כאשר החלקיקים יורדים בגודל¹¹. התאמת הניגודיות DIC מושגת על-ידי סיבוב מקטפה או על-ידי תרגום אחד מהפריזמות הDIC, בהתאם למותג המיקרוסקופ או לדגם⁶.

לאחר הגדרת התאורה של קולר והגדרות הקיטוב, חיוני שלא לקרוא הגדרות אלה בלבד בעת איסוף נתוני ספקטרוסקופיה. יתרה מזאת, יש לשמור על אות רקע ממוצע קבוע בכל עת במהלך איסוף הנתונים, גם בעת מעבר בין מסננים והגדרות זווית. ערך הרקע האידיאלי בפועל תלוי בטווח הדינמי של המצלמה המדעית, אך באופן כללי, הרקע אמור להיות בטווח של 15%-40% מרמת הזיהוי המירבית של המצלמה. זה מפחית את הסבירות של השבת חיישן המצלמה תוך הפיכת ניגודיות החלקיקים אופטימלית. לאיסוף נתוני ספקטרוסקופיית, יש צורך לעבוד עם מצלמה מדעית הלוכד תמונות בשחור-לבן, בניגוד למצלמת צבע.

הכנה לדוגמה היא היבט קריטי נוסף של חלקיקי פלמונית הדמיה. הכרחי שמפעילים של מיקרוסקופ DIC מבינים את המאפיינים האופטיים של המדגם ושל מצע המדגם. "ניקוי מראש" זכוכית מיקרוסקופ אינו מוכן מספיק עבור חלקיקי הדמיה, וזה חייב להיות מחדש כראוי ניקה לפני לדוגמה התצהיר כדי להבטיח התבוננות ללא השגחה של המדגם. פרוטוקולי ניקוי רבים עבור שקופיות מיקרוסקופ תועדו בעבר¹², אבל זה לא צעד שבדרך כלל מדווח במחקרים ניסיוניים.

לבסוף, שיטות ניתוח נתונים הן הרכיב הסופי לספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים. את העוצמות המרביות והמינימליות של כל ננו-חלקיק יש למדוד, כמו גם את ממוצע הרקע המקומי. חלקיקים של עניין צריך להיות ממוקם באזורים ללא שרידים ברקע, פגמים במצע, או תאורה מחוספס. שיטה אחת לקביעת פרופיל ספקטרלי של ננו-חלקיק היא על ידי חישוב ניגודיות החלקיקים בכל אורך הגל, באמצעות המשוואה מתחת¹¹^,¹³^,¹⁴^,¹⁵:

Equation

לחילופין, ניתן לפצל את הספקטרום של חלקיק יחיד לרכיבי האות המרביים והמינימליים הבודדים, המייצגים את שני השדות הפולריזציה של DIC, ובכך מציגים את שני הספקטרום התלוי-בו של המנהל, דרך שתי המשוואות:

Equation

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה לדוגמא בעזרת שקופיות מיקרוסקופית זכוכית סטנדרטיות

הכינו שקופיות של מיקרוסקופ זכוכית. לקבלת עדות לדוגמא
הערה: בנסיבות מסוימות, זה עשוי להיות מתאים יותר לאחסן את הזכוכית במים באולטרסאונד במקום אתנול. עם זאת, אחסון במים או באוויר גורם הידרופובי זכוכית לאורך זמן.
1. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לרכוש מיקרוסקופ זכוכית או קוורץ וכיסוי זכוכית.
2. באמצעות עט שרבוטים, מניחים סימן שריטה רדוד וקצר על המרכז של כל שובר כיסוי זכוכית.
3. נקה את כל זכוכית המיקרוסקופ, גם אם הוא נרכש "מנוקה מראש", כדי להסיר רסיסי זכוכית, אבק, אבקה, שאריות אורגניים, וכל מזהמים אחרים המשפיעים על איכות ההדמיה או לדוגמה תצהיר.
  הערה: שיטת הניקוי הבאה פועלת היטב עבור סוגי הדגימות המתוארות כאן ונמנעת השימוש בכימיקלים קשים. כימיקלים בעלי כימיה חמורה יותר יכולים לחרוט את הזכוכית ודורשים טיפול נוסף בטיפול וסילוק.
  1. להניח זכוכית מיקרוסקופ על ארונות אחסון ולאחר מכן לתוך גביע, או לתוך צנצנת מכתים. אין למקם זכוכית מיקרוסקופ בחלק התחתון של כוסות וכלי מעבדה אחרים ללא שברי, כי כל פיסת משטח של זכוכית מיקרוסקופ צריך להיות חשוף לחלוטין לסוכני ניקוי.
  2. יוצקים ~ 1 מ ל של נוזל ניקוי נוזלי (טבלה של חומרים) לתוך המיכל ולמעלה את המיכל עם מים. . Sonicate במשך 30 דקות
    הערה: לאחר שתהליך הניקוי מתחיל, יש לטפל רק בזכוכית תוך כדי לבישת כפפות, כדי למנוע השארת שאריות טביעות אצבע על הזכוכית.
  3. יוצקים את התוכן הנוזלי של מיכל הניקוי לכיור. לשטוף את המיכל מספר פעמים עם מים אלקטרופורזה כדי להסיר את כל המראה של כביסה. ממלאים את המיכל עם מים באולטרטהורים. Sonicate את המיכל עם זכוכית מיקרוסקופ עבור 30 דקות נוספות.
  4. חזור על השלב הקודם לפחות פעם נוספת. לבצע סיבובים נוספים של sonication במים עד שברור כי כל עקבות של חומרי הניקוי הוסרו.
  5. שופכים את התוכן של מכולה לניקוי. לשטוף את המיכל עם מים באולטרסאונד. למלא את המיכל עם אתנול. זכוכית מיקרוסקופ Sonicate עבור 30 דקות.
  6. שופכים את תכולת מיכל הניקוי למכל פסולת. מילוי עם אתנול. לכסות את המיכל כדי למנוע אובדן של אתנול באמצעות התאיידות. אחסן את זכוכית המיקרוסקופ במיכל זה עד לזמן הניסוי. השקופיות נשארות נקיות ושימושיות כל עוד הן נשארות מכוסות באתנול בתוך מיכל מכוסה.
הכנת התמיסה הננו-חלקיק
1. באמצעות מיקרופיפטה, להסיר 100 μl סדרת מחלקים של 0.05 mg/mL זהב פתרון ננו-חלקיק מתוך מיכל האחסון המקורי שלה להוציא את הפתרון לתוך שפופרת צנטריפוגה ל 1.5 mL.
2. צנטריפוגה את המדגם עבור 10 דקות ב 6,000 x g.
3. הסר את הסופרנטנט עם מיקרופיפטה, כדי להסיר את החומרים העודפים.
4. באמצעות מיקרופיפטה, המקום 100 μL של מים אולטרה טהורים לתוך צינור הצנטריפוגה.
  הערה: אם לא כל הסופרנטאנט ניתן להסיר בניסיון הראשון, חזור על הצעדים הצנטריפוגה וההשעיה.
5. בקצרה מערבולת הדגימה כדי להשעות מחדש את הגלולה. Sonicate מיד לאחר מכן עבור 20 דקות כדי להשהות במלואה ולשבור את ננו-חלקיק אגרגטים.
  הערה: אם המדגם אינו משמש באופן מיידי, זה צריך להיות sonicated שוב 20 דקות לפני הפקדת הפתרון על זכוכית מיקרוסקופ.
עדות לדוגמא
1. הסר תעודות מכסות מנוקות ושקופיות מיקרוסקופ ממיכלי האחסון שלהם. תנשוף את הזכוכית. עם חנקן או ארגון
2. באמצעות מיקרופיפטה, drop-יצוקה 6 μL של פתרון ננו-חלקיק משלב 1.2.5 על שובר הכיסוי. כדי לפזר את ה-droplet באופן שווה, המקום בזהירות, פיסת מיקרוסקופ גדולה יותר על גבי שובר הכיסוי, כגון תעודת כיסוי שנייה או שקופית מיקרוסקופ. להימנע מקבלת בועות אוויר לכודים בין שתי חתיכות של זכוכית.
  1. הפוך את מצע המדגם מעל, ואטום את הקצוות של שובר הכיסוי עם קו צר של לק על מנת למנוע אידוי של הפתרון הבינוני.
  2. לחילופין, כדי לדמות את המדגם "יבש", לאפשר לפתרון לעמוד 5 – 15 דקות על שובר הכיסוי, לפני הסרת פיסת זכוכית לא רצויה. לפוצץ בעדינות את שובר הכיסוי. עם חנקן מווסת או ארגון
3. אם אפשר, דגימות תמונה מיד לאחר ההכנה. אם אין זה אפשרי, יש לאחסן דגימות במיכל מכוסה, כגון צלחת פטרי עד להדמיה.

2. הדמיה DIC

ליישר את המטרה ואת הקבל.
1. לאחר הצבת המדגם על המיקרוסקופ, למצוא את המטוס מוקד עם המדגם על זה. תחילה אתר והתמקד בסימן הטיוטה שנוצר קודם לכן. אז בסדר לכוונן את הפוקוס עד חלקיקים לבוא לראות.
2. כדי לקבוע את המיקום המדויק של הקבל, לנצל את השיטה תאורה קוסלר. ⁵ התאורה קולר בהגדלה גבוהה (80x, 100x) מושגת בקלות רבה יותר על ידי הגדרה ראשונה של התאורה הקוסלר בהגדלה נמוכה יותר, כגון 20x.
  הערה: בדרך כלל אין צורך להתאים מחדש את התאורה במהלך הדמיה של מדגם אחד. עם זאת, מומלץ לוודא שהתאורה של קוסלר מוגדרת כראוי בעת מעבר לשקופית מיקרוסקופ חדשה.
מטב את הגדרות הניגודיות.
1. בחר אזור מעניין בדוגמה לדימות. מרכז את האזור בשדה התצוגה של המצלמה והתאם את המיקוד לפי הצורך.
  1. אם המיקרוסקופ יש את העיצוב דה Senarmont, להתחיל עם הקיטוב להגדיר ליד להכחדה ברקע המרבי ובהדרגה לסובב את הקיטוב לקראת ירידה ברקע הכחדה. עוצמת הרקע תעלה בהדרגה.
  2. אם המיקרוסקופ אין עיצוב דה Senarmont, להתחיל עם הרכבת האופטית להגדיר ברקע המרבי הכחדה. במקרה זה, להתאים בהדרגה את העמדה מנסרה המטרה להפחתת הכחדה ברקע.
    הערה: ההגדרה האידיאלית מושגת כאשר חלקיקים מגיעים ההבדל האינטנסיביות הגדול ביותר שלהם (כלומר, ניגודיות) מערך הרקע המקומי הממוצע. עבור חלקיקים פלמונית, ניגודיות אופטימלית מושגת בדרך כלל עם רקע כהה יחסית, ולכן על הגדרות ליד הכחדה מקסימלית הרקע.
. צלם את הדגימה
1. כבה את תאורת החדר כדי למנוע הפעלה של תאורה תועה עם התהליך.
2. בזמן הצגת חלקיקים עם מצלמת דימות מדעית, לקבוע את רמת הרקע האופטימלי. באמצעות 10 ננומטר רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) מסנן bandpass עם הגל המרכזי שלו ממוקם יחד עם ה-LSPR הראשי אורך הגל, להציג את האזור של הריבית. כוונן את עוצמת המנורה או את זמן החשיפה עד שרמת הרקע תהיה בטווח של 15%-40% מרמת הקיבולת המרבית של המצלמה וללא אובייקטים באזור של עוצמות האות של התערוכה שיחרגו מ-90% מרמת העוצמה המירבית של המצלמה.
  הערה: המטרה של step 2.3.2 היא למנוע שיקוף החיישן בעת מעבר בין מסננים. רמת הרקע האידיאלית תשתנה בין דגימות ומצלמות. לאחר שלב זה הושלמה, זמן חשיפה ניתן לכוונן אך לא את עוצמת המנורה.
3. תמונה את המדגם עם סדרה של מסנני bandpass כי לכל אחד יש FWHM של 10 ננומטר וכי כולה לאפשר הדמיה לאורך אורך הגל כולו של הריבית. ודא שעוצמת הרקע נשארת עקבית מהתמונה לתמונה (בתוך ~ 5% אחד מהשני) על-ידי התאמת זמן החשיפה. לאחר החלפת מסננים, התמקד מחדש בדגימה לפני לכידת התמונה.
4. שמור את התמונות כקובצי TIFF לא דחוסים ו/או בתבנית הקובץ המקורית של התוכנה, כדי לשמר את כל המידע.
סובב את המדגם.
1. לאחר איסוף תמונות של המדגם במיקומה המקורי, המדגם יכול עכשיו להיות מסובב והתמונה בכיוונים נוספים בנתיב האור. בצע סיבוב במרווחי זמן קבועים (לדוגמה, 10 ° או 15 °) על-פני טווח של 180 ° או 360 °.
  הערה: סיבוב דורש שלב לדוגמה rotatable.
2. כמו בסעיפים 2.1-2.3, התאימו את הגדרות המצלמה כדי לספק רמת רקע עקבית מהתמונה לתמונה.
  הערה: אין לעשות התאמה לתאורה של קוסלר.

3. ניתוח נתונים באמצעות ImageJ

הערה: ניתן לבצע את החישובים הבאים במגוון חבילות תוכנה, ולעיתים בתוכנית המקורית המשמשת לאיסוף התמונות. ImageJ היא תוכנה זמינה באופן חופשי מן המכונים הלאומיים לבריאות (NIH).

חישוב ניגודיות או אינטנסיביות של חלקיקים.
1. פתחו את התמונה באמצעות ImageJ.
2. בחרו בכלי מלבן וציירו מלבן מסביב לאזור העניינים העיקרי.
3. בסרגל הכלים, בחרו תמונהולאחר מכן הרחק מתצוגה, ולאחר מכן לבחירה. חלון ההדמיה יופיע בתצוגה מקדימה של האזור שנבחר.
4. בסרגל הכלים, בחר תמונהולאחר מכן התאם, לאחר מכן בהירות /ניגודיות. מופיע חלון חדש. כדי לאפשר תצוגה טובה יותר של אזור הדגימה, התאם את ארבע ההגדרות: מינימום, מקסימום, בהירות וניגודיות. התאמות אלה אינן משנות את הנתונים המדעיים, הן רק מאפשרות ניראות טובה יותר של אזור המדגם.
  הערה: שלבים 3.1.3 ו-3.1.4 עשויים להתבצע מספר פעמים ובסדר הפוך.
5. באמצעות הכלי מלבן שוב, צייר תיבה מסביב לננו-חלקיק הראשונה שיש למדוד. התיבה צריכה להיות גדולה במקצת מהדיסק האוורירי של הננו-חלקיק.
6. בסרגל הכלים, בחר באפשרות ניתוחולאחר מכן מדידה. מופיע חלון חדש המדווח על מינימום, מקסימום וממוצע עוצמות עבור הפיקסלים הממוקמים בתוך התיבה שנבחרה.
7. גרור את התיבה המשמשת למדידת הננו-חלקיק לאזור הסמוך לחלקיק, כאשר הניגודיות ברקע היא יחסית אפילו ולא קיימים חלקיקים או מזהמים. שמור על הגודל המקורי של התיבה.
8. השתמשו בכלי מדידה כדי לקבוע את עוצמת הממוצע של אזור הרקע.
9. מדדו את החלקיקים הנותרים ואת אזור הרקע הסמוך לכל.
10. חזור על התהליך עבור כל חלקיק בכל התמונות בסדרה.
11. יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את הניגודיות או האינטנסיביות של כל חלקיק, בכל אורכי הגל והזוויות.
12. חשב את הניגודיות של כל חלקיק, תוך שימוש במשוואה הבאה¹³^,¹⁴^,¹⁵:
  
  הערה: שימוש במשוואה זו, על ניגודיות החלקיקים להיות תמיד > 0.
13. לחשב את הערך המרבי של החלקיקים המותאם לרקע על-ידי חלוקת עוצמת החלקיקים המרבית שנמדדו באמצעות ממוצע הרקע:
14. באופן דומה, חשב את הערך המינימלי שהותאם לרקע על-ידי חלוקת עוצמת החלקיקים המינימלית הנמדדת על-ידי ממוצע הרקע:
  
  הערה: כמחושב, המקסימום צריך להיות בעל ערך גדול מאחד, בעוד שהמינימום יהיה פחות מאחד. מקובל להחסיר כל ערך ב-"1", כך שהרקע הממוצע הוא אפס, המקסימום מיוצג כערך חיובי והערך המינימלי מוקצה ערך שלילי¹⁶. גישה זו מאפשרת לאנליסט לשקול בנפרד את מה שמתרחש לאורך כל אחד מהשדות הפולריזציה, שהוא שימושי בעת לימוד חלקיקים אניסוטרופיים.
15. לגרף את הפרופיל הספקטרלי במיקום ננו-חלקיק נתון, מתווה נתונים עם אורך הגל לאורך ציר ה-x והניגודיות או האינטנסיביות לאורך ציר ה-y.
16. כדי ליצור גרף של פרופיל הסיבוב באורך גל נתון, התווה את זווית הסיבוב לאורך ציר ה-x והניגודיות או העוצמה לאורך ציר ה-y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר עובדים עם דגימות גדולות מספיק כדי להיראות עם עין בלתי, הצבת ציוני דרך על מצע זכוכית לא נדרש בדרך כלל. עם זאת, כאשר עובדים עם ננו או כאשר הסיבוב של המדגם נדרש, ציוני דרך יכולים לספק שיטה קלה לאיתור, הבחנה, ומעקב אחר כיוון המדגם. למרות טכניקות מתוחכמות יותר יכול להיות מנוצל לעזוב ציוני דרך על זכוכית מצעים¹⁷, שורט את הזכוכית עם עט סקריבינג היא שיטה חסכונית ופשוטה שפועלת במצבים רבים. חשוב להימנע מבדיקת אזורים לדוגמה הסמוכים באופן מיידי לציוני דרך אלה, שכן סימני הגירוד יוצרים רקע מורכב עם הפוטנציאל להשפיע על הנתונים (איור 3). עם זאת, בקצות סימני שריטות, "קורי עכביש" לעתים קרובות להאריך החוצה מההתחלה. קווים אלה הם בעלי ערך רב כמו ציוני דרך, אבל שוב, חלקיקים יש להימנע אם הם חופפים עם פגמים אלה.

על מנת להשיג דימות אופטימלי עם מיקרוסקופ DIC, יש חשיבות רבה לקביעת מישור המוקד המתאים. אובייקטים הנמצאים מעט מחוץ לפוקוס יופיעו מטושטשים, בעלי קצוות מטושטשים והצטמצמה לעומת זאת. איור 4 מציג חלקיקים זהב כי הם מחוץ לפוקוס במעלות שונות. ננו חלקיקים בפינה הימנית התחתונה נמצאים בפוקוס, בעוד חלקיקים להיות רחוק יותר ממוקד כאשר הם ניגשים לפינה השמאלית העליונה של התמונה הזו. מכיוון DIC יש עומק שדה רדוד, זה לא נדיר עבור חלקיקים מסוימים להיות בפוקוס בעוד אחרים הם מחוץ לפוקוס בעת הדמיה להם על מצע זכוכית. כתוצאה מכך, זה קריטי להתמקד בעקביות באותם חלקיקים בדיוק בעת ביצוע התאמות למיקרוסקופ במהלך ניסוי.

איור 5 מספק דוגמה של ההשפעה של התאמת הגדרות מקטזר בזמן הדמיה ננו כדורי זהב. חמישה חלקיקים נמצאים בפוקוס, בעוד אחד הוא קצת מחוץ לפוקוס. A 540 ננומטר מסנן bandpass עם 10 ננומטר FWHM היה גם בנתיב האופטי. בסדרה זו של תמונות, בהירות הרקע הותאמה עם ImageJ לאחר רכישת התמונה כדי להפוך את חמשת החלקיקים ברורה יותר נגד הרקע. כאשר מקטצר מוגדר 0 ° ב דה Senarmont עיצב Nomarski מיקרוסקופ DIC, זה אורתוגונאליות למנתח (איור 5A). בשעה 0 °, החלקיקים מופיעים בעיקר לבנים, עם פס כהה הפועל לאורך החלק האמצע שלהם. זה מעיד על צלב-פולריזציה. לדגימות ננו-ספירה כאשר המיקטזר מסובב לזוויות שונות (איור 5B-E), החלקיקים נראים כשהם מיציקת צללים כהים לכיוון דרום-מערב. הרכיבים השחורים והלבנים לאות מופיעים כתוצאה משני השדות הפולריזציה של DIC ומספקים מידע על כיוון חלקיקי הפלמונית בעבודה עם מסנני בנדנה. כמו מקטצר מסובבת לכיוון זוויות גבוהות, דפוס הצל נשאר דומה. עם זאת, ערכי ניגודיות החלקיקים משתנים באופן דרמטי. הדבר מומלץ ביותר על-ידי מדידת ערכי הניגודיות עבור החלקיקים הבודדים, תוך שימוש במשוואה המסופקת לעיל. החלקיק המסומן בתיבה השחורה כולל ערכי ניגודיות של 0.65 (מקטכי מוצלבות), 0.84 (מעבר מקטצר של 5 °), 1.10 (10 °), 0.44 (20 °), ו-0.23 (45 °). לכן, עבור דוגמה זו, הגדרת ההדמיה האופטימלית היא עם שינוי מקטצר של 10 °. חלקיקים פלמונית דורשים לעתים קרובות הגדרה מקטונית בטווח של 5 ° – 15 °, ובמרווחים קטנים יותר מאלה צריך לשמש בדרך כלל כדי לזהות את ההגדרה האידיאלית. לקבלת מידע נוסף על הדמיה וניתוח של חלקיקי זהב כדורית, הקוראים מתייחסים לעבודה הקודמת על ידי Sun et al.¹¹.

אנאיזוטרופי בצורת חלקיקים לייצר דפוסים של מורכבות גבוהה יותר מאשר ננו כדורים. Nanorods זהב היו בתמונה (איור 6) באורך הגל LSPR האורכי שלהם, 650 nm. בתמונה הראשונית (איור 6A), חמישה nanorods בהירים ומספר חלקיקי עמעם גלויים. במקום להיות מראה הטלת צל, שלושה מוטות יש בעיקר דיסקים שחור אוורירי בעוד שניים הם לבנים ברובם. הקטצר הוגדר ב -10 ° משמאל להגדרה הפולריזציה. באיור 6Bנעשה שימוש בקיטוב הנחצה; רק שלושה מהחלקיקים מופיעים, כדיסקים מאווררים לבנים לגמרי. האחרים נעלמו או שנראה שהם קצת לא מרוכזים. עם הקיטוב שנקבע ב -10 ° מימין לקיטוב הנחצה (איור 6C), הדפוסים הפוכים כעת של מה שנצפה באיור 6c. המיקטזר הגיע לאחר מכן ל 45 ° ימינה של פולריזציה מוצלב (איור 6D), ההגדרה המקסימלית, כדי להדגים שהחלקיקים שומרים על הצבעים שלהם בהגדרה זו, אך הניגודיות נדחתה באופן משמעותי. בלוחות התרשים הנותרים, האוסף של nanorods היה מסובב הצטבר מלא 90 ° כיוון השעון בעוד המקטזר הוגדר 10 ° לימין של קיטוב חצה. התבנית משתנה בהדרגה עבור כל nanorod, ולאחר סיבוב מלא של 90 °, החלקיקים התחלפו הצבעים שלהם מההגדרה הראשונית. בקצרה, אם אחד הצירים של nanorod הפלסטיק הוא בשורה עם אחד משני שדות פולריזציה, ואם nanorod הוא התמונה בציר זה ' LSPR אורך הגל, nanorod יופיע להיות לבן בעיקר או שחור בעיקר, בהתאם לשדה הקיטוב זה תנינים d עם (איור 6a, ג)². אם ננו-חלקיק מסובבת מלא 90 ° (איור 6H), זה יהיה כעת בשורה עם השדה הפולריזציה הפוך לקחת על הצבע הנגדי. אם במקום הננו-חלקיק סובב רק 45 ° (איור 6F), אז זה יהיה במצב שבו החלקיקים יציג את המראה הגדול ביותר של הצל שלה, מראה דמיון בולט מה שנצפה עם הננו כדורים הפלמונית. כתוצאה מכך התנהגות אופטית זו, חלקיקים פלמונית עם צורה אניסוטרופי לעתים קרובות נראה שטוח במקום שיש המראה התלת מימדי הצל-משחק של ננו כדורים. התוצאה של הבדל זה התנהגות אופטית היא כי ניתן לנצל אותו כדי להבדיל בין חלקיקים פלמונית כי הם כדוריים ו אניסוטרופי בצורה, כפי שכבר דנו בעבר במחקרים מרובים²^,. ^שלוש^,^שש^,^שבע^,¹¹^,¹³^,¹⁶

בסופו של דבר, איור 7 מציג הנציג היחיד ספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים, כניגוד של ננוספירה זהב (איור 7a)¹¹, העוצמה של nanorod זהב יחיד עם ציר האורך שלו מונחה במקביל לאחד הקיטוב שדות (איור 7B)⁶, ועוצמה פרופיל של nanorod זהב יחיד באורך הגל lspr שלה במהלך סיבוב של השלב (איור 7b)⁶. אחת משיטות המצגת חושפת את הרוחב והמיקום של אפקט LSPR. עבור חלקיקים פלמונית עם צורה אנאיזוטרופי, העוצמה ונתוני הסיבוב חושפים את הכיווניות של האפקט, ומכאן, את כיוון החלקיק על מצע המדגם, אשר הוכח בעבר באמצעות לימודי הקשר על חלקיקים כאלה בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני מסוג DIC ושידור²^,¹⁶^,¹⁸.

איור 1: הנתיב האור במיקרוסקופיה DIC המבוססת על האור נוארסקי. לאחר שעזב את מקור האור (S), האור עובר דרך מקטצר (P), מנסרה הקורה Nomarski (NP), העבה (C), מטוס המוקד (FP), המטרה (O), קרן שילוב מנסרה Nomarski (NP), מנתח (א), ולבסוף גלאי (ד) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמאות של חלקיקי פלמונית הנמצאים באורכי גל של LSPR עם 10 מסנני מעבר ננומטר, בעזרת מיקרוסקופ DIC. שתי התמונות נאספים ב-100x. (A) כסף nanospheres עם 40 בקוטר ננומטר עם התמונה ב 480 ננומטר עם מסנן bandpass עם 10 ננומטר FWHM. (ב) מוט-כמו חלקיקי זהב בתמונה ב 700 ננומטר באמצעות מסנן bandpass עם 10 ננומטר FWHM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונה של שריטה עשה להחליק מכסה זכוכית עם עט סקריבינג. לקראת סוף הכניסה בפועל, סדרה של שורות "קורי העכביש" הצר והרדוד החוצה מן השריטה עצמה, וכתוצאה מכך דפוס שניתן לשימוש בו כנקודת ציון להדמיה. תמונה זו נאספה באמצעות הגדלה 100x ואור לבן בפס רחב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ננו כדורי זהב התמונה עם אור לבן בפס רחב ב 100x. חלקיקים בפינה הימנית התחתונה הם בפוקוס אבל החלקיקים להיסחף הרחק מהמטוס המוקד לכיוון הפינה השמאלית העליונה. האובייקט באמצע התמונה הוא פסולת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ננו כדורי זהב התמונה תחת סדרה של הגדרות מקטצר שונים באורך הגל של 540 ננומטר והגדלה של 100x. בהירות הרקע הותאמה לאחר הדמיה עם ImageJ כדי להפוך את החלקיקים לגלויים יותר. הגדרת הקיטוב של (א) 0 ° (מקטפולייזר למנתח), (ב) 5 °, (ג) 10 ° (הניגודיות הטובה ביותר של סדרה זו של תמונות), (ד) 20 °, ו (ה) 45 °. הניגודיות הנמדדת של חלקיק בקופסה השחורה היא (A) 0.65, (ב) 0.84, (ג) 1.10, (ד) 0.44, ו-(ה) 0.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דוגמה להדמיה אנאיזוטרופי חלקיקים פלמונית: nanorods זהב על אורך הגל LSPR האורך שלהם של 650 ננומטר והגדלה של 100x. חלקיקי עניין עיקריים מוקפים בקופסה צהובה. הגדרות מקטייזר הן: (א) שמאל 10 °, (ב) 0 °, (ג) ימינה 10 °, (ד) ימינה 45 °. עם הקיטוב שנקבע ימינה 10 °, השלב היה סובב בכיוון השעון על ידי (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 °, ו (H) 90 °. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: התוצאות הייצוגיות של נתוני ספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים. (א) ספקטרוסקופיית ננו זהב המוצג במונחים של ניגודיות DIC. כל נקודת נתונים מייצגת ממוצע של 20 ננוספירות עבור כל קוטר של חלקיק, ולכידת נתונים התבססה על מסנני bandpass FWHM של 10nm. (ב) nanorod זהב יחיד הוצג כנתוני עוצמה DIC, באמצעות שתי הגדרות מקטונות שונים (2 ° משני צדדיו של קיטוב מוצלב). (ג) העוצמה הDIC נתונים עבור nanorod זהב יחיד באורך הגל lspr של 680 ננומטר, בעוד זה היה מסובב 180 ° ואת מקטצר התקיים ב 2 ° על העמדה קיטוב חצה. איור 7A מותאם באישור Sun ואח '., כימיה אנליטית. 81 (22), 9203-9208 (2009), ואיור 7B, C מתוך סטנדר ואח ', כימיה אנליטית. 84 (12), 5210-5215 (2012). האגודה האמריקנית לכימיה בזכויות יוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעת הדמיה עם מיקרוסקופ DIC, חיוני למטב את הרכיבים האופטיים לפני איסוף הנתונים. אפילו התאמות מינורי מקטצר באמצע הניסוי יכול לגרום להשפעות משמעותיות על הנתונים הסופיים⁶. יתר על כן, חומרים שונים דורשים הגדרות מקטייזר שונים. למרות שגודלי השלבים הגדולים היו מנוצלים כאן כדי להדגים את ההשפעה של זווית הקיטוב, בניסוי ממשי, זה הכרחי למטב את הגדרת הקיטוב בתוך 1 ° – 2 ° של הגדרת ניגודיות אופטימלית. הגדרת מקטצר צריך גם להיות מוקלט לעיון עתידי. כמו כן, מומלץ לעבוד תמיד באותו צד של נקודת הקיטוב (0 °) מוצלב. החלפת הלוך ושוב אינה מספקת יתרונות, אך היא עלולה לגרום לבלבול, עקב היפוך בתבנית הצל.

לאחר מכן, חשוב לעקוב אחר עוצמת הרקע כאשר מתכננים לבצע ספקטרוסקופיה. הדבר מתבצע בדרך הטובה ביותר על-ידי התאמת זמן חשיפת המצלמה, או על-ידי הוספת מסנני דחיסות נייטרליים לנתיב האור. התאמת פתחים או עוצמות המנורה יכולות להשפיע על התאורה של קולר ולשנות ערכי ניגודיות. הרקע צריך להיות יחסית גם לאורך המדגם, כך שהבחירה באזור הרקע אינה משנה את חישוב הניגודיות. יש להימנע מדגימות דוגמאות שאינן סמוכות לשטח רקע נקי. כמו-כן, אין אפשרות להגדיר בתחילה את עוצמת הרקע כגבוהה מדי או נמוכה מדי. אם עוצמת הרקע מוגדרת כגבוהה מדי, יש סיכון מוגבר לכך שאותות מסוימים יחרגו מהטווח המירבי של המצלמה, ובכך לא ניתן לחשב את הניגודיות באזורים אלה. אם עוצמת הרקע מוגדרת כנמוכה מדי, יהיה קשה מאוד להשיג ניגוד טוב בין הרכיב הכהה של האות DIC לבין אות הרקע. הבנת ההתנהגות האופיינית או הצפויה של מדגם יכולה לסייע בבחירת עוצמת הרקע המתאימה.

גם מציאת מטוס המוקד המתאים היא חיונית. אחד היתרונות של Nomarski DIC הוא שיש לו עומק שדה רדוד. עם זאת, זה עושה את זה יותר מאתגר להתמקד בדגימות דקות, כגון ננו חלקיקים. עם דגימות עבות יותר, האתגר הוא למצוא את מישור המיקוד בפועל של האינטרס הגדול ביותר. מטוסי מוקד רבים עשויים להיות מעניינים ויש להם חלקיקים על אותם, כך חשוב לקבוע מוקדם על חלקיקים של האינטרס הגדול ביותר.

במקרה של חלקיקי חלקיקים, חשוב מmicroscopist להכיר כי הם מציגים דיסק אוורירי או "נקודת התפשטות הנקודה" של האובייקט². באופן כללי, הדיסק האוורירי שימושי כדי לקבוע אם ננו-חלקיק פלמונית יש צורה איזוטרופי או אניסוטרופי, אבל הדמיה ננו-חלקיק היא למעשה הרבה יותר מורכבת ממה שנדון כאן. אגרגטים ננו-חלקיק מורכבים יכולים לעיתים להידמות לחלקיקים איזוטרופיים, וכתוצאה מכך, השיטות המיקרוסקופיה של האלקטרון הינן נחוצות כדי לאפיין את הדפוסים הננו-חלקיק²^,¹⁶^,¹⁸^, ¹⁹. כדי לדמות חלקיקי חלקיקים עם מיקרוסקופ DIC, חיוני להשתמש בהדמיה מסוננת ולדמות את החלקיקים באחד מאורכי הגל הפלמונית הגבוהה שלהם. הדמיה באורך גל לא תקין או ללא מסננים יכול לגרום לכידת של דפוסי הטלת צל קשה לפענח.

כאשר הדמיה חלקיקים לצד אובייקטים גדולים יותר מאשר גבול עקיפה של אור, חשוב לזכור כי מטרת המיקרוסקופ "רואה" מטוס מוקד שטוח יחסית. טעות נפוצה ב-DIC היא שהיא מאפשרת צפייה באובייקט בהקלה בפועל בתלת-ממד. הדבר נגרם על-ידי הפרנינג שהטיל הצל, שאכן גורם לעצמים רבים להיראות תלת-ממדיים. עם זאת, כדי לאסוף מידע אנכי על מטוסי מיקוד מרובים, יהיה צורך להעלות או להנמיך את הבמה ולאסוף רצף של תמונות. הדבר עשוי להיות קשה מאוד לביצוע ולפענוח, במיוחד עבור דגימות עבות יותר, כגון תאים. לפיכך, המיקרוסקוסט זקוק להבנה עמוקה של כל החומרים המעורבים בעת ביצוע ניסויים אלה וחייב לתעד את עמדות מטוסי המוקד הבודדים שנוצלו.

לבסוף, שלב ניתוח הנתונים קריטי כאיסוף נתונים. בעת מדידת ערכי הניגודיות או האינטנסיביות של המדגם, יש לזכור מספר גורמים. בדרך כלל, האנליסט מתעניין בעיקר בערכי המינימום והמקסימום עבור חלקיק הריבית. כאשר יחס הניגוד לרעש של המדגם גבוה במידה מספקת, ואם אזור הרקע נקי ומואר באופן שווה, ניתן לצייר צורה גיאומטרית פשוטה סביב האזור לדוגמה ללא חשש לאות שהוצג על-ידי מזהמים. יתרה מזאת, אם הרקע נקי ומואר באופן שווה, ניתן לבצע מדידת רקע בכל אזור הצמוד למדגם. עם זאת, אם יש מזהמים או אם הרקע אינו אחיד, האנליסט חייב לבצע סקירה קריטית של סביבות המדגם, והאנליסט צריך להעריך אם ניתן אפילו לבצע מדידת רקע סבירה. הוא גם קריטי למדוד את אזורי המדגם והרקע עם כלי זהה בגודל ובצורת, כדי למנוע את המבוא של הטיה לתוך החישוב. באופן כללי, אזורים קטנים יותר בגודל מדידה יש סבירות נמוכה יותר של גילוי מיירס (למשל, מזהמים, פיקסלים פגומים, וכו ') אבל אזורי דגימה גדולים יותר לעתים קרובות לספק מדידה אמינה יותר של ערך ממוצע של הרקע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. לסופר אין מה לגלות

Acknowledgments

ד ר אנתוני ס. סטנדר מבקש להכיר בתמיכה הטכנית באמצעות המכון לתופעות ננו והקוונטים (NQPI) באוניברסיטת אוהיו. מאמר זה התאפשר באמצעות סטארט-up מימון סיפק ד ר סטנדר על ידי אוניברסיטת אוהיו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. Advanced Light Microscopy. 2, Elsevier. 146-197 (1989).
Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response. ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).
Stender, A. S., et al. Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy. Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).
Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope. Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).
Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , Wiley. 1-20 (2012).
Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy. Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).
Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).
Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).
Mulvaney, P. Not All That's Gold Does Glitter. MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).
Maier, S. A. Plasmonics: Fundamentals and Applications. , Springer US. (2007).
Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells. Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).
Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).
Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles. Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).
Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 2: Light and Color. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , Wiley. 21-33 (2012).
Wayne, R. Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light. Light and Video Microscopy (Second Edition). , Academic Press. 43-78 (2014).
Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries. The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).
Hu, M., et al. Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance. Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).
Choo, P., et al. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).
Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries. Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).

Chemistry

מבצע ספקטרוסקופיית על חלקיקי פלמונית עם מיקרוסקופ ניגוד מבוסס שידור מסוג Nomarski הפרעות דיפרנציאליות

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.