Het uitvoeren van de spectroscopie op Plasmonic nanodeeltjes met transmissie-gebaseerde Nomarski-type differentiële interferentie contrast microscopie

Summary

Het doel van dit protocol is om een bewezen aanpak voor de bereiding van plasmonic nanodeeltjes monsters en voor het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie op hen met differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie detail.

Abstract

Differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie is een krachtige imaging tool die het meest gebruikt wordt voor Imaging micro Scale objecten met behulp van zichtbare-bereik licht. Het doel van dit protocol is om een beproefde methode voor de voorbereiding van plasmonic nanodeeltjes monsters en het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie op hen met DIC microscopie detail. Een aantal belangrijke stappen moeten zorgvuldig worden gevolgd om herhaalbare spectroscopie experimenten uit te voeren. Ten eerste kunnen oriëntatiepunten worden geëtst in het monster substraat, die helpt bij het lokaliseren van het monster oppervlak en in het bijhouden van de regio van belang tijdens experimenten. Vervolgens moet het substraat goed worden gereinigd van puin en verontreinigingen die anderszins kan belemmeren of obscure onderzoek van het monster. Zodra een monster goed is voorbereid, moet het optische pad van de Microscoop worden uitgelijnd, met behulp van Kohler verlichting. Met een standaard Nomarski stijl DIC Microscoop, rotatie van het monster kan nodig zijn, met name wanneer de plasmonic nanodeeltjes vertonen oriëntatie-afhankelijke optische eigenschappen. Omdat DIC microscopie heeft twee inherente orthogonale polarisatie velden, de golflengte-afhankelijke DIC contrast patroon onthult de oriëntatie van Rod-vormige plasmonic nanodeeltjes. Tot slot moeten de data-acquisitie en gegevensanalyses zorgvuldig worden uitgevoerd. Het is gebruikelijk om op DIC gebaseerde spectroscopie gegevens te vertegenwoordigen als een contrastwaarde, maar het is ook mogelijk om het als intensiteits gegevens te presenteren. In deze demonstratie van DIC voor enkele deeltjes spectroscopie, de focus ligt op sferische en Rod-vormige goud nanodeeltjes.

Introduction

Sinds de jaren tachtig is differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie grotendeels gezien als een belangrijke imaging methode voor micro Scale objecten binnen de biologische wetenschappen. Nochtans, tijdens zijn ontwikkeling in de jaren ' 50 en de jaren ' 60, was het bedoeld als techniek voor materialen wetenschap¹. Met de recente vooruitgang in de materiële wetenschappen met betrekking tot plasmonic nanodeeltjes, heeft een verhoogde rente in de karakterisering van materialen met optische microscopie plaatsgevonden.

Vele optische technieken zijn zeker beschikbaar voor nanomateriaal karakterisering (b.v., donker gebied, helderveld, gepolariseerd licht, fluorescentie, enz.). Dark Field is zeer populair in nanodeeltjes onderzoek, maar het berust uitsluitend op de verzameling van Scatter en biedt beperkte informatie over complexe monsters². De fluorescentie kan nuttig zijn, maar slechts met steekproeven dat luminescentie of dat kan behoorlijk worden bevlekt. DIC microscopie heeft verschillende eigenschappen die het een waardevol instrument maken voor de analyse van nanodeeltjes. De meest voorkomende voordelen van DIC in vergelijking met andere methoden en met betrekking tot plasmonic nanodeeltjes zijn: geen monster kleuring vereist, geen halo effecten, ondiepe scherptediepte, en hoge zijdelingse resolutie³. DIC heeft extra sterke punten die waardevol zijn voor plasmonic nanodeeltjes onderzoek. Allereerst, twee inherente en orthogonale polarisatie velden aanwezig zijn, en ze kunnen gelijktijdig worden gemeten voor de spectroscopie doeleinden². Ten tweede wordt het gepolariseerde signaal van nanodeeltjes niet vastgelegd in het uiteindelijke beeld², wat een oorzaak kan zijn van ernstige bezorgdheid in de donkere veld spectroscopie metingen.

Het doel van dit artikel is het verstrekken van een duidelijke methodologie voor het gebruik van overdraagbare licht Nomarski DIC microscopie uit te voeren spectroscopie op plasmonic nanodeeltjes. Hoewel DIC is een krachtige techniek die kan worden toegepast op zeer diverse materialen, het is ook een techniek die vereist grote vaardigheid en begrip om goed te werken wanneer beeldvorming nanodeeltjes. Transmission-based Nomarski DIC microscopie heeft een complex licht pad¹ dat hier slechts kort zal worden herzien. De optische trein van DIC wordt weergegeven in Figuur 1. Het licht wordt overgebracht door de Microscoop door eerst te worden overgegaan door een polarisator en een straal-verdelend Nomarski prisma alvorens wordt geconcentreerd door de condensator op het steekproef vliegtuig. Na het passeren van de doelstelling, het licht ontmoetingen een Beam-combineren Nomarski prisma en een analysator voor het verlaten van de detector. De twee polarisatoren en Nomarski prisma's zijn cruciaal voor de vorming van de DIC beeld en zijn verantwoordelijk voor de productie van DIC de twee orthogonale polarisatie velden¹. Voor de lezer geïnteresseerd in meer weten over de werkingsprincipes en optische pad van Nomarski DIC microscopen, of de verschillen tussen Nomarski DIC en andere stijlen van DIC, verwijzen wij u naar andere goed geschreven accounts over deze onderwerpen^{1, 4 , 5 , 6 , 7}.

Het is even belangrijk om de fundamentele aard van plasmonic nanodeeltjes te begrijpen alvorens te proberen de spectroscopie uit te voeren op hen, of het nu met Nomarski DIC, Dark Field, of een andere microscopie techniek. Op het gebied van plasmonics worden nanodeeltjes gedefinieerd als deeltjes met afmetingen op de schaal van 10-100 nm^8,9. Nanodeeltjes kunnen nemen op vele vormen (bijvoorbeeld bollen, staven, sterren, halters, enz.), en de meeste van hun belangrijke eigenschappen ontstaan door interacties met licht in de ultraviolet-zichtbare-near Infrarood bereik van het elektromagnetische spectrum. De term "plasmonic" is niet beperkt tot nanodeeltjes¹⁰; echter, bij de bespreking van nanodeeltjes, wordt het gebruikt in verwijzing naar gelokaliseerde oppervlakte Plasmon resonantie (LSPR). LSPR is een fenomeen waarbij de geleiding elektronen in een nanodeeltjes schommelen als gevolg van een Coulomb interactie met elektromagnetische straling van een zeer specifieke en relatief smalle frequentieband⁸. Bij deze zelfde frequenties, plasmonic nanodeeltjes vertonen verhoogde absorptie en verstrooiing van licht, waardoor ze waarneembaar met optische microscopie. In veel gevallen, is het de voorkeur aan de nanodeeltjes observeren tijdens het plaatsen van band filters voor de condensor², om het beeldcontrast te verbeteren en om het licht te elimineren dat niet aan de LSPR effect te induceren. Het gebruik van filters maakt het ook mogelijk om enkele deeltjes spectroscopie experimenten uit te voeren.

LSPR optische gedrag is sterk afhankelijk van de grootte en de vorm van de nanodeeltjes, en het kan worden onderzocht met veel optische microscopie technieken. Echter, om oriëntatie informatie van plasmonic nanodeeltjes te ontcijferen met een anisotropische (dwz, niet-sferische) vorm, is het noodzakelijk om gebruik te maken van polarisatie van het lichtveld. Door het polarisatie veld of het monster substraat bij kleine stappen zorgvuldig te roteren, is het mogelijk om de oriëntatie afhankelijke spectroscopie eigenschappen van afzonderlijke nanodeeltjes te monitoren. Rotatie en polarisatie kan ook helpen bij het bepalen of een spectrale functie is te wijten aan een dipolaire of hogere orde trilling van het oppervlak van de nanodeeltjes elektronen. Echter, in het geval van isotrope (dat wil zeggen, sferische) nanodeeltjes, het spectrale profiel blijft in wezen ongewijzigd bij het roteren van het monster onder gepolariseerd licht.

Wanneer ze worden bekeken door een DIC Microscoop (Figuur 2), hebben nanodeeltjes een luchtige schijf met een schaduw-gegoten wit-en-zwart uiterlijk tegen een grijze achtergrond. Sferische nanodeeltjes zullen deze verschijning onder rotatie en met het veranderen van band filters behouden; Nochtans, zullen de deeltjes geleidelijk aan van mening langzaam verdwijnen aangezien de centrale golflengte van het filter verder van de enige dipolaire LSPR golflengte¹¹van de bol wordt gescheiden. De verschijning van nanorods kan vrij dramatisch veranderen aangezien zij²worden gedraaid. Nanorods hebben twee LSPR banden met dipolaire gedrag, waarvan de locatie gebaseerd is op de fysieke afmetingen van de nanorods. Wanneer de longitudinale as van een nano staafje is gericht parallel aan een van de DIC polarisatie velden, zal de luchtige schijf verschijnen alle witte of alle zwarte als bekeken met een bandfilter geassocieerd met die LSPR golflengte. Na het roteren van de steekproef 90 °, zal het op de tegenovergestelde kleur. Als alternatief, aangezien de transversale as van een nano staafje loodrecht op de longitudinale as is, zal de staaf de tegenovergestelde kleur nemen wanneer het schakelen tussen filters die de LSPR golflengten voor de twee assen aanpassen. Bij andere oriëntaties en filter montages, zal nanorods meer als bollen verschijnen, die een verscheidenheid van schaduw-gegoten luchtige schijf patronen voorstellen. Voor nanorods met een transversale as < 25 nm, kan het moeilijk zijn om signaal op die LSPR golflengte te detecteren met behulp van DIC microscopie.

Voor het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie, is het belangrijk om de juiste optische componenten te gebruiken en om ze goed af te stemmen. Er moet een doelstelling voor DIC microscopie worden gebruikt. Voor enkelvoudige deeltjes experimenten, 80x of 100x olie doelstellingen zijn ideaal. Nomarski DIC prisma's komen gewoonlijk in drie variëteiten: standaard, hoog contrast, en hoge resolutie. Het ideale type hangt sterk af van het doel van het experiment en de grootte van de nanodeeltjes. Standaard prisma's zijn prima voor vele experimenten; maar wanneer het werken met kleinere nanodeeltjes (< 50 nm), kunnen de hoog contrast prisma's voordelig zijn, aangezien het deeltjes contrast vermindert aangezien de deeltjes in grootte¹¹verminderen. Het aanpassen van de DIC contrast wordt bereikt, hetzij door het roteren van een polarisator of door het vertalen van een van de DIC prisma's, afhankelijk van de Microscoop merk of model⁶.

Na het instellen van Kohler verlichting en de polarisator instellingen, is het van cruciaal belang om deze instellingen niet opnieuw aan te passen, terwijl het verzamelen van spectroscopie gegevens. Bovendien moet tijdens het verzamelen van gegevens altijd een constant gemiddeld achtergrond signaal worden bijgehouden, ook bij het schakelen tussen filters en hoek instellingen. De werkelijke ideale achtergrondwaarde is afhankelijk van het dynamisch bereik van de wetenschappelijke camera, maar in het algemeen moet de achtergrond in het bereik van 15%-40% van de maximale detectie niveau van de camera. Dit vermindert de kans op verzadiging van de camera sensor terwijl het optimale particle contrast mogelijk maakt. Voor het verzamelen van de spectroscopie gegevens, is het noodzakelijk om te werken met een wetenschappelijke camera die beelden in zwart-wit, in tegenstelling tot een kleurencamera vangt.

Sample voorbereiding is een ander kritisch aspect van de beeldvorming plasmonic nanodeeltjes. Het is noodzakelijk dat de exploitanten van DIC microscopie inzicht hebben in de optische eigenschappen van het monster en het substraat van het monster. "Pre-gereinigd" Microscoop glas is niet voldoende voorbereid voorbeeld vorming nanodeeltjes, en het moet goed worden opnieuw gereinigd voordat monster depositie om onbelemmerde waarneming van het monster te waarborgen. Veel reinigings protocollen voor Microscoop dia's zijn eerder gedocumenteerd¹², maar het is niet een stap die normaalgesproken wordt gerapporteerd in experimentele studies.

Ten slotte, data-analysemethoden zijn de laatste component van enkele deeltjes spectroscopie. De maximum-en minimum intensiteiten voor elke nano partikel moeten worden gemeten, evenals het lokale achtergrond gemiddelde. De deeltjes van belang zouden in gebieden met geen achtergrond puin, substraat tekorten, of ongelijke verlichting moeten worden gevestigd. Een methode voor het bepalen van het spectrale Profiel van een nano partikel is door het berekenen van particle contrast bij elke golflengte, met behulp van de vergelijking onder^11,13,14,15:

Als alternatief kan het spectrum van een enkel deeltje worden gesplitst in zijn individuele maximum-en minimum signaal componenten, die de twee polarisatie velden van DIC vertegenwoordigen, waardoor de twee gelijktijdig verzamelde directioneel afhankelijke spectra worden weergegeven, door de twee vergelijkingen:

Protocol

1. Monstervoorbereiding met standaard glas microscopie dia's

1. Bereid glazen Microscoop dia's voor monster depositie.
   Nota: in sommige omstandigheden, kan het meer aangewezen zijn om het glas in ultrapuur water in plaats van ethylalcohol op te slaan. Echter, het opslaan in water of lucht maakt het glas hydrofobe in de tijd.
   1. Voor de beste resultaten, de aankoop glas of Quartz Microscoop dia's en cover glas.
   2. Met behulp van een pen, plaats een ondiep en korte Scratch merk op het centrum van elke glazen Afdekstrook.
   3. Reinig alle Microscoop glas, zelfs als het is gekocht "pre-gereinigd", om glasscherven, stof, poeder, organisch residu, en alle andere verontreinigingen die invloed hebben op de beeldkwaliteit of monster depositie te verwijderen.
      Opmerking: deze reinigingsmethode hieronder werkt goed voor de soorten monsters hier beschreven en vermijdt het gebruik van agressieve chemicaliën. Ruwere chemicaliën kunnen etsen het glas en vereisen meer zorg in behandeling en verwijdering.
      1. Plaats Microscoop glas op opslag rekken en vervolgens in een beker, of in een kleuring jar. Plaats geen Microscoop glas op de bodem van bekers en andere Lab glaswerk zonder rekken, omdat elk stuk en oppervlak van Microscoop glas moet volledig worden blootgesteld aan de reinigingsmiddelen.
      2. Giet ~ 1 mL vloeibaar detergens (lijst van materialen) in de container en bovenkant van de container met water. Bewerk voor 30 min.
         Opmerking: zodra het reinigingsproces begint, alleen omgaan met het glas tijdens het dragen van handschoenen, om te voorkomen dat het verlaten van vingerafdruk residu op het glas.
      3. Giet de vloeibare inhoud van de reinigings container in een gootsteen. Spoel de container meerdere malen met ultrapuur water om alle verschijning van wasmiddel te verwijderen. Vul de container met ultrapuur water. Bewerk de container met Microscoop glas voor nog eens 30 min.
      4. Herhaal de vorige stap ten minste eens te meer. Voer extra rondes van sonication in water totdat het duidelijk is dat alle sporen van het wasmiddel zijn verwijderd.
      5. Giet de inhoud van de reinigings container. Spoel de container met ultrapuur water. Vul de container met ethanol. Bewerk Microscoop glas voor 30 min.
      6. Giet de inhoud van de reinigings container in een afvalcontainer. Vullen met ethanol. Bedek de container om verlies van ethanol te voorkomen door verdamping. Bewaar de Microscoop glas in deze container tot de tijd van experiment. De dia's blijven schoon en bruikbaar zolang ze in ethanol in een overdekte container ondergedompeld blijven.
2. Voorbereiding van de nano partikel oplossing
   1. Verwijder met behulp van een micro pipette een 100 µ L-hoeveelheid van 0,05 mg/mL Gold nano partikel oplossing uit de oorspronkelijke opslag container en haal de oplossing in een 1,5 mL centrifugebuis.
   2. Centrifugeer het monster voor 10 min bij 6.000 x g.
   3. Verwijder de bovendrijvende met een micropipet, om overtollige oppervlakteactieve stof te verwijderen.
   4. Met behulp van een micro pipette, plaats 100 µ L van ultrapuur water in de centrifugebuis.
      Opmerking: als niet alle van de bovendrijvende kan worden verwijderd op de eerste poging, herhaal de centrifugeren en herschorsing stappen.
   5. Draai het monster kort om de pellet opnieuw op te schorten. Bewerk onmiddellijk daarna voor 20 min om volledig te hersuspenderen en breken nanodeeltjes aggregaten.
      Nota: als de steekproef niet onmiddellijk wordt gebruikt, zou het sonicated opnieuw voor 20 min moeten zijn alvorens oplossing op Microscoop glas te deponeren.
3. Steekproef afzetting
   1. Verwijder de gereinigde cover slips en Microscoop dia's uit hun opslag containers. Föhn het glas met onder druk staande stikstof of argon.
   2. Met behulp van een micropipet, druppel-gegoten 6 µ L van nano partikel oplossing van stap 1.2.5 op de cover slip. Om verspreid de druppel gelijkmatig, zorgvuldig plaats een tweede, groter stuk Microscoop glas op de top van de cover slip, zoals een tweede cover slip of een Microscoop dia. Vermijd het krijgen van luchtbellen opgesloten tussen de twee stukjes glas.
      1. Draai het monster substraat over, en sluit de randen van de cover slip met een smalle lijn van nagellak om verdamping van de middellange oplossing te voorkomen.
      2. Als alternatief, om het beeld van de steekproef "droge", laat de oplossing te staan voor 5 – 15 min op de cover slip, voordat u het ongewenste stuk glas. Blaas de cover slip droog met onder druk gezette stikstof of argon.
   3. Indien mogelijk, beeld monsters onmiddellijk na de voorbereiding. Als dat niet mogelijk is, bewaar monsters in een overdekte container, zoals een Petri schaaltje tot Imaging.

2. DIC beeldvorming

1. Doelstelling en condensator uitlijnen.
   1. Na het plaatsen van het monster op de Microscoop, vind het focal plane met het monster op. Eerst lokaliseren en focussen op de Scratch merk eerder gemaakt. Dan fine-tunen van de focus tot nanodeeltjes in beeld komen.
   2. Voor het bepalen van de nauwkeurige plaatsing van de condensor, gebruik maken van de Kohler verlichting methode. ⁵ Kohler verlichting bij hoge vergroting (80x, 100x) is gemakkelijker bereikt door eerst het instellen van de Kohler verlichting op een lagere vergroting, zoals 20x.
      Opmerking: normaal, Kohler verlichting hoeft niet opnieuw te worden aangepast tijdens de beeldvorming van een enkel monster. Echter, het is een goede gewoonte om te verifiëren dat Kohler verlichting goed is ingesteld bij het overschakelen naar een nieuwe Microscoop dia.
2. Optimaliseer de contrast instellingen.
   1. Selecteer een regio met interesse in het voorbeeld voor Imaging. Centreer de regio in het gezichtsveld van de camera en pas de focus zo nodig aan.
      1. Als de Microscoop heeft de de Senarmont ontwerp, beginnen met de polarisator in de buurt van maximale achtergrond uitsterven en geleidelijk draaien de polarisator naar afnemende achtergrond uitsterven. De achtergrond intensiteit zal geleidelijk toenemen.
      2. Als de Microscoop niet over een de Senarmont ontwerp, beginnen met de optische trein ingesteld op maximale achtergrond uitsterven. In dit geval, geleidelijk aan te passen de objectieve prisma positie naar afnemende achtergrond uitsterven.
         Opmerking: de ideale instelling wordt bereikt wanneer de nanodeeltjes hun grootste intensiteit verschil (dat wil zeggen, contrast) te bereiken van de gemiddelde lokale achtergrondwaarde. Voor plasmonic nanodeeltjes wordt het optimale contrast normaal bereikt met een relatief donkere achtergrond, dus bij instellingen in de buurt van maximale uitsterven op de achtergrond.
3. Afbeelding van het monster.
   1. Schakelkamer verlichting om te voorkomen dat zwerf verlichting van de interactie met het proces.
   2. Tijdens het bekijken van de nanodeeltjes met een wetenschappelijke Imaging camera, bepalen de optimale achtergrondniveau. Met behulp van een 10 nm volle breedte bij half maximum (FWHM) Bandfilter met zijn centrale golflengte co-gelegen met de belangrijkste LSPR golflengte, Bekijk de regio van belang. Pas de intensiteit van de lamp of de belichtingstijd totdat de achtergrondniveau is in het bereik van 15%-40% van de maximale capaciteit van de camera niveau en geen objecten in de regio van belang vertonen signaal intensiteiten die hoger zijn dan 90% van het maximale niveau van de camera.
      Opmerking: het doel van stap 2.3.2 is om te voorkomen dat verzadiging van de sensor bij het schakelen tussen filters. Het ideale achtergrondniveau zal variëren tussen samples en camera's. Zodra deze stap is voltooid, kan de belichtingstijd worden aangepast, maar niet de lamp intensiteit.
   3. Afbeelding van het monster met een reeks van band filters die elk een FWHM van 10 nm heeft en dat als geheel in staat beeldvorming over de gehele golflengte bereik van belang. Zorg ervoor dat de achtergrond intensiteit consistent blijft van afbeelding tot afbeelding (binnen ~ 5% van elkaar) door de belichtingstijd aan te passen. Na het schakelen van filters, re-focus het monster voordat beeld vast te leggen.
   4. Sla de afbeeldingen op als niet-gecomprimeerde TIFF-bestanden en/of in de oorspronkelijke bestandsindeling van de software om alle informatie te bewaren.
4. Draai het monster.
   1. Na het verzamelen van beelden van het monster op zijn oorspronkelijke positie, het monster kan nu worden gedraaid en afgebeeld op extra oriëntaties in het licht pad. Voer op gezette tijden rotatie uit (bijv. 10 ° of 15 °) over een bereik van 180 ° of 360 °.
      Opmerking: rotatie vereist een draaibare sample fase.
   2. Zoals in de punten 2.1-2.3, camera-instellingen aan te passen aan een consistente achtergrondniveau van beeld naar beeld te bieden.
      Opmerking: geen aanpassing aan Kohler verlichting moet worden gemaakt.

3. data-analyse met behulp van ImageJ

Nota: de volgende berekeningen kunnen in een verscheidenheid van softwarepakketten worden uitgevoerd, en soms in het inheemse programma dat wordt gebruikt om de beelden te verzamelen. ImageJ is een vrij beschikbare software van de nationale instituten van gezondheid (NIH).

1. Bereken particle contrast of intensiteit.
   1. Open de afbeelding met ImageJ.
   2. Selecteer de rechthoek gereedschap en teken een rechthoek rond de belangrijkste regio van belang.
   3. Op de werkbalk, selecteer afbeelding, dan Zoom, vervolgens naar selectie. Het Imaging venster zal inzoomen op het geselecteerde gebied.
   4. Op de werkbalk, selecteert u afbeelding, vervolgens aanpassen, dan helderheid/contrast. Er verschijnt een nieuw venster. Om een betere weergave van het steekproef gebied mogelijk te maken, past u de vier instellingen aan: minimum, maximum, helderheid en contrast. Deze aanpassingen doen geen afbreuk aan de wetenschappelijke gegevens, maar maken een betere zichtbaarheid van de steekproef regio mogelijk.
      Opmerking: stappen 3.1.3 en 3.1.4 kunnen meerdere keren en in omgekeerde volgorde worden uitgevoerd.
   5. Met behulp van de rechthoek opnieuw, teken een doos rond de eerste nanodeeltjes te meten. De doos moet alleen iets groter dan luchtige schijf van de nano partikel.
   6. Selecteer analyserenen vervolgens metenop de werkbalk. Er wordt een nieuw venster weergegeven waarin de minimum-, maximum-en gemiddelde intensiteit wordt gerapporteerd voor de pixels die zich binnen het geselecteerde vak bevinden.
   7. Sleep de doos gebruikt om de nanodeeltjes te meten aan een gebied direct naast het deeltje, waar de achtergrond contrast is relatief gelijkmatig en geen deeltjes of contaminanten aanwezig zijn. Behoud de oorspronkelijke grootte van het vak.
   8. Gebruik het gereedschap Meetlat om de gemiddelde intensiteit voor het achtergrond gebied te bepalen.
   9. Meet de resterende deeltjes en een aangrenzende achtergrond gebied voor elk.
   10. Herhaal het proces voor elk deeltje in alle beelden in de serie.
   11. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet om het contrast of de intensiteit van elk deeltje te berekenen, over alle golflengten en hoeken.
   12. Bereken het contrast van elk deeltje met behulp van de volgende vergelijking^13,14,15:
       
       Opmerking: het gebruik van deze vergelijking, particle contrast moet altijd worden > 0.
   13. Bereken de door de achtergrond gecorrigeerde maximumwaarde van het deeltje door de gemeten maximale deeltjes intensiteit door de achtergrond te delen:
       
   14. Evenzo, bereken de achtergrond-gecorrigeerde minimumwaarde door het delen van de gemeten minimale deeltjes intensiteit door de achtergrond betekent:
       
       Nota: zoals berekend, zou het maximum een waarde moeten hebben groter dan één, terwijl het minimum minder dan één zal zijn. Het is aanvaardbaar om elke waarde door "1" af te trekken, zodat de gemiddelde achtergrond in wezen nul is, wordt het maximum vertegenwoordigd als positieve waarde, en de minimumwaarde wordt toegewezen een negatieve waarde¹⁶. Deze laatste benadering kan de analist om afzonderlijk te overwegen wat er gebeurt langs elk van de polarisatie velden, die nuttig is bij het bestuderen van anisotropische deeltjes.
   15. Om het spectrale profiel op een bepaalde positie van nanodeeltjes te plaatsen, worden gegevens met de golflengte langs de x-as en het contrast of de intensiteit langs de y-as getekend.
   16. Als u het rotatie profiel bij een bepaalde golflengte wilt fotograferen, moet u de rotatie hoek langs de x-as en het contrast of de intensiteit langs de y-as plotten.

Representative Results

Bij het werken met monsters die groot genoeg zijn om gezien te worden met het blote oog, het plaatsen van oriëntatiepunten op het glassubstraat is normaalgesproken niet nodig. Echter, bij het werken met nanomaterialen of wanneer rotatie van het monster is vereist, kunnen de oriëntatiepunten een eenvoudige methode voor het lokaliseren, onderscheiden en bijhouden van de oriëntatie van het monster. Hoewel meer verfijnde technieken kunnen worden gebruikt voor het verlaten van oriëntatiepunten op glas substraten¹⁷, krabben het glas met een Schrijfstift is een economische en eenvoudige methode die werkt in veel situaties. Het is belangrijk om te voorkomen dat de steekproefgebieden die direct grenzen aan deze oriëntatiepunten worden onderzocht, aangezien Scratch Marks een complexe achtergrond vormen met het potentieel van de impact van gegevens (Figuur 3). Echter, op de uiteinden van de Scratch merken, "Spider webs" vaak uit te breiden naar buiten van de Scratch. Deze lijnen zijn zeer waardevol als oriëntatiepunten, maar nogmaals, nanodeeltjes moeten worden vermeden als ze overlappen met deze gebreken.

Om een optimale beeldvorming met DIC microscopie te bereiken, is het van vitaal belang om de juiste focal plane te bepalen. Objecten die iets onscherp zijn, worden vaag weergegeven, hebben wazige randen en hebben het contrast verminderd. Figuur 4 toont goud nanodeeltjes die onscherp zijn in verschillende gradaties. Nanodeeltjes in de rechter benedenhoek zijn in focus, terwijl nanodeeltjes worden verder onscherp als ze de aanpak van de linkerbovenhoek van dit beeld. Omdat DIC heeft een ondiepe scherptediepte, is het niet ongewoon voor sommige nanodeeltjes in focus, terwijl anderen zijn onscherp bij de beeldvorming ze op een glassubstraat. Als gevolg daarvan is het van cruciaal belang om consequent te richten op exact dezelfde deeltjes bij het maken van aanpassingen aan de Microscoop tijdens een experiment.

Figuur 5 geeft een voorbeeld van het effect van het aanpassen van de polarisator instellingen, terwijl Imaging Gold nanospheres. Vijf nanodeeltjes zijn in focus, terwijl een is iets onscherp. Een 540 nm Bandfilter met 10 nm FWHM was ook in de optische pad. In deze reeks van beelden, werd de achtergrond helderheid aangepast met ImageJ na beeldaanwinst om de vijf deeltjes tegen de achtergrond duidelijker te maken. Wanneer de polarisator is ingesteld op 0 ° in een de Senarmont ontworpen Nomarski DIC Microscoop, is het loodrecht op de Analyzer (figuur 5a). Op 0 °, de deeltjes lijken meestal wit, met een donkere streep loopt over hun mid-sectie. Dit is een indicatie van cross-polarisatie voor nanosphere monsters. Wanneer de polarisator wordt gedraaid om verschillende hoeken (Figuur 5b-E), de deeltjes lijken te zijn gieten donkere schaduwen naar het zuidwesten. De zwarte en witte componenten aan het signaal ontstaan als gevolg van de twee polarisatie velden van DIC en geven informatie over de oriëntatie van plasmonic nanodeeltjes bij het werken met band filters. Als de polarisator is gedraaid naar hogere hoeken, de schaduw patroon blijft vergelijkbaar. Echter, de deeltjes contrastwaarden drastisch veranderen. Dit wordt het best aangetoond door het meten van de contrastwaarden voor de afzonderlijke deeltjes, met behulp van de vergelijking hierboven vermeld. Het deeltje dat met de zwarte doos wordt benadrukt heeft contrastwaarden van 0,65 (gekruiste polarisatoren), 0,84 (polarisator verschuiving van 5 °), 1,10 (10 °), 0,44 (20 °), en 0,23 (45 °). Daarom, voor dit monster, de optimale beeldvorming instelling is met een polarisator verschuiving van 10 °. Plasmonic nanodeeltjes vereisen vaak een polarisator instelling in het bereik van 5 °-15 °, en kleinere stappen dan deze moeten normaal worden gebruikt om de ideale setting te identificeren. Voor meer informatie over de beeldvorming en analyse van sferische goud nanodeeltjes, lezers worden verwezen naar de eerdere werk van Sun et al.¹¹.

Anisotropische nanodeeltjes produceren patronen van hogere complexiteit dan nanospheres. Goud nanorods werden afgebeeld (Figuur 6) op hun longitudinale LSPR golflengte, 650 nm. In het eerste beeld (Figuur 6a) zijn vijf heldere nanorods en meerdere dimmer deeltjes zichtbaar. In plaats van een schaduw-cast verschijning, drie van de staven hebben overwegend zwart luchtige schijven, terwijl twee zijn meestal wit. De polarisator werd vastgesteld op 10 ° aan de linkerkant van de gekruiste polarisatie-instelling. In Figuur 6b, gekruiste polarisatie werd gebruikt; slechts drie van de deeltjes verschijnen, als volledig witte luchtige schijven. De anderen zijn verdwenen of lijken iets onscherp te zijn. Met de polarisator ingesteld op 10 ° aan het recht van gekruiste polarisatie (figuur 6C), zijn de patronen nu omgekeerd van wat werd waargenomen in Figuur 6a. De polarisator werd vervolgens gedraaid om 45 ° recht van gekruiste polarisatie (figuur 6d), de maximale instelling, om aan te tonen dat deeltjes hun kleuren behouden bij deze instelling, maar het contrast is aanzienlijk gedaald. In de resterende figuur panelen, de collectie van nanorods werd stapsgewijs gedraaid een volledige 90 ° rechtsom, terwijl de polarisator werd vastgesteld op 10 ° aan het recht van gekruiste polarisatie. Het patroon verandert geleidelijk voor elke nano staafje, en na een volledige rotatie van 90 °, hebben de deeltjes hun kleuren van de aanvankelijke het plaatsen omgekeerd. In het kort, als een van de assen van een plasmonic nano staafje is opgesteld met een van de twee polarisatie velden, en als de nano staafje is afgebeeld op die as ' LSPR golflengte, zal de nano staafje lijken te zijn meestal wit of meestal zwart, afhankelijk van welke polarisatie veld is uitgelijnd d met (Figuur 6a, C)². Als de nano partikel is gedraaid een volledige 90 ° (figuur 3H), zal het nu worden opgesteld met de tegenovergestelde polarisatie veld en nemen op de tegenovergestelde kleur. Als in plaats daarvan de nano partikel werd gedraaid slechts 45 ° (figuur 6F), dan zal het in een positie waar het deeltje zal zijn grootste schaduw-cast verschijning vertonen, met opvallende gelijkenis met wat wordt waargenomen met de plasmonic nanospheres. Als gevolg van dit optische gedrag, plasmonic nanodeeltjes met een anisotropische vorm vaak plat kijken in plaats van het hebben van de driedimensionale schaduw-cast verschijning van nanospheres. Het resultaat van dit verschil in optisch gedrag is dat het kan worden benut om onderscheid te maken tussen plasmonic nanodeeltjes die sferische en anisotropische in vorm, zoals eerder is besproken in meerdere onderzoek studies^{2, 3,6,7,11,13,16}.

Tot slot, Figuur 7 toont representatieve enkele deeltjes spectroscopie gegevens, als contrast van een gouden Nanosphere (figuur 7A)¹¹, intensiteit van een enkele gouden nano staafje met zijn longitudinale as georiënteerd parallel aan een van de polarisatie velden (figuur 7b)⁶, en het profiel van de intensiteit van een enkel goud nano staafje op de LSPR golflengte en tijdens de rotatie van het podium (figuur 7C)⁶. Beide wijze van presentatie onthult de breedte en de locatie van de LSPR effect. Voor plasmonic nanodeeltjes met een anisotropische vorm, de intensiteit en rotatie gegevens onthullen de directionaliteit van het effect, en dus de oriëntatie van het deeltje op het monster substraat, die eerder is bewezen door middel van correlatieve studies over dergelijke deeltjes met behulp van DIC en transmissie elektronenmicroscopie^2,16,18.

Figuur 1: het licht pad in overdraagbare licht Nomarski-gebaseerde dic microscopie. Na het verlaten van de lichtbron (S), licht gaat door een polarisator (P), een Beam-scheren Nomarski prisma (NP), de condensator (C), het focal plane (FP), de doelstelling (O), een bundel-combinatie van Nomarski prisma (NP), de Analyzer (A), en ten slotte de detector (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: voorbeelden van plasmonic nanodeeltjes afgebeeld op hun LSPR golflengten met 10 nm band filters, met behulp van een dic Microscoop. Beide beelden worden verzameld op 100x. (A) zilver nanospheres met 40 nm diameter afgebeeld op 480 nm met een bandfilter met 10 nm FWHM. (B) Rod-achtige goud nanodeeltjes afgebeeld op 700 nm met behulp van een bandfilter met 10 nm FWHM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: afbeelding van een kras gemaakt in een glazen Afdekstrook met een Schrijfstift. In de buurt van het einde van de feitelijke inspringing, een reeks van smalle en ondiepe "Spider Web" lijnen tak uit van de Scratch zelf, wat resulteert in een patroon dat kan worden gebruikt als een Imaging oriëntatiepunt. Deze afbeelding is verzameld met behulp van 100x vergroting en breedband wit licht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: goud nanospheres afgebeeld met breedband wit licht op 100x. De deeltjes in het lagere recht zijn in nadruk maar de deeltjes drijven verder van het focale vliegtuig naar de hogere linkerhoek. Object in het midden van het beeld is puin. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: goud nanospheres afgebeeld onder een reeks van verschillende polarisator instellingen op een golflengte van 540 nm en een vergroting van 100x. De helderheid van de achtergrond werd aangepast post-Imaging met ImageJ om deeltjes duidelijker te maken. Polarisatie-instelling van (a) 0 ° (polarisator loodrecht op Analyzer), (B) 5 °, (C) 10 ° (het beste contrast van deze reeks beelden), (D) 20 °, en (E) 45 °. Het gemeten contrast van deeltje in zwarte doos is (a) 0,65, (B) 0,84, (C) 1,10, (D) 0,44, en (E) 0,23. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: voorbeeld van beeldvorming anisotropische plasmonic nanodeeltjes: goud nanorods op hun longitudinale LSPR golflengte van 650 nm en een vergroting van 100x. De deeltjes van belangrijkste rente zijn ingesloten in gele doos. Polarisator instellingen zijn: (a) links 10 °, (B) 0 °, (C) rechts 10 °, (D) rechts 45 °. Met de polarisator die aan recht 10 ° wordt geplaatst, werd het stadium gedraaid rechtsom door (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 °, en (H) 90 °. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: representatieve resultaten van enkelvoudige deeltjes spectroscopie gegevens. (A) goud nanosphere spectroscopie weergegeven in termen van dic contrast. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een gemiddelde van 20 nanospheres voor elke deeltjesdiameter, en de gegevens vangst baseerde zich op 10nm FWHM band filters. (B) een enkel goud nano staafje weergegeven als dic intensiteit gegevens, met behulp van twee verschillende polarisator instellingen (2 ° aan beide zijden van de gekruiste polarisatie). (C) dic intensiteit gegevens voor een enkele gouden nano staafje op de LSPR golflengte van 680 nm, terwijl het werd gedraaid 180 ° en de polarisator werd gehouden op 2 ° uit de gekruiste polarisatie positie. Figuur 7A is aangepast met toestemming van Sun et al., analytische chemie. 81 (22), 9203-9208 (2009), en figuur 7B, C van stender et al., analytische chemie. 84 (12), 5210-5215 (2012). Auteursrecht Amerikaanse chemische maatschappij. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Wanneer Imaging met DIC microscopie, is het essentieel om de optische componenten te optimaliseren voordat het verzamelen van gegevens. Zelfs kleine aanpassingen aan de polarisator in het midden van een experiment kan leiden tot significante effecten op de definitieve gegevens⁶. Bovendien, verschillende materialen vereisen verschillende polarisator instellingen. Hoewel grote stap maten werden hier gebruikt om het effect van de polarisatie hoek aan te tonen, in een effectief experiment, is het noodzakelijk om de polarisator instelling te optimaliseren binnen 1 °-2 ° van de optimale contrast instelling. De polarisator instelling moet ook worden opgenomen voor toekomstige referentie. Het is ook aanbevolen om altijd te werken aan dezelfde kant van de gekruiste polarisator (0 °) punt. Schakelen heen en weer biedt geen voordelen, maar het kan leiden tot verwarring, als gevolg van een omkering in de schaduw patroon.

Daarna in belang, is het essentieel om de achtergrond intensiteit te controleren wanneer het van plan zijn om spectroscopie uit te voeren. Dit wordt het best bereikt door het aanpassen van de camera belichtingstijd, of door het toevoegen van neutrale dichtheid filters om het licht pad. Aanpassing van openingen of lamp intensiteiten kan invloed hebben op de Kohler verlichting en Alter contrastwaarden. De achtergrond moet relatief zelfs over het monster, zodat de selectie van een achtergrond regio niet verandert de contrast berekening. Monster specimens die niet grenzen aan een schone achtergrond ruimte moet worden vermeden. Bovendien kan de achtergrond intensiteit niet in eerste instantie te hoog of te laag worden ingesteld. Als de achtergrond intensiteit te hoog is ingesteld, is er een verhoogd risico dat sommige signalen zal het maximale bereik van de camera te overschrijden, waardoor het onmogelijk is om het contrast te berekenen in deze regio's. Als de achtergrond intensiteit te laag is ingesteld, zal het uiterst moeilijk zijn om een goed contrast te bereiken tussen de donkere component van het DIC-signaal en het achtergrond signaal. Inzicht in de typische of verwachte gedrag van een monster kan helpen bij het selecteren van de juiste achtergrond intensiteit.

Het vinden van de juiste focal plane is ook van essentieel belang. Een van de voordelen van Nomarski DIC is dat het een ondiepe scherptediepte heeft. Echter, dit maakt het meer uitdagend om zich te concentreren op dunne monsters, zoals nanodeeltjes. Met dikkere monsters, de uitdaging is in het vinden van de werkelijke focal plane van het grootste belang. Veel focale vliegtuigen kan interessant zijn en hebben nanodeeltjes op hen, dus het is belangrijk om te bepalen vroeg op de nanodeeltjes van het grootste belang.

In het geval van nanodeeltjes, is het belangrijk voor de microscopist te erkennen dat ze een luchtige schijf of "pointspread functie" van het object²te bekijken. In het algemeen, de luchtige schijf is nuttig bij het bepalen of een plasmonic nano partikel heeft een vorm die is isotrope of anisotropische, maar nanodeeltjes beeldvorming is in feite veel complexer dan wat hier wordt besproken. Complexe nanodeeltjes aggregaten kunnen soms lijken op isotrope deeltjes, en als gevolg daarvan, elektronenmicroscopie methoden zijn dan nodig om de nanodeeltjes patronen te karakteriseren^{2,16,18, 19}. om beeld plasmonic nanodeeltjes met een dic Microscoop, is het cruciaal om gefilterde beeldvorming te gebruiken en om het imago van de deeltjes op een van hun zeer absorberende plasmonic golflengten⁶. Beeldvorming op een onjuiste golflengte of zonder filters kan leiden tot het vangen van schaduw-cast patronen die moeilijk te ontcijferen.

Bij de beeldvorming nanodeeltjes naast objecten die groter zijn dan de diffractie grens van licht, is het belangrijk om te onthouden dat de Microscoop doelstelling "ziet" een relatief vlakke focal plane. Een veel voorkomende misvatting van DIC is dat het mogelijk maakt het bekijken van een object in de werkelijke 3D-reliëf. Dit wordt veroorzaakt door de schaduw-cast patroon, die inderdaad maakt veel objecten lijken te zijn driedimensionale. Echter, om verticale informatie te verzamelen over meerdere focale vlakken, zou het nodig zijn om het podium te verhogen of te verlagen en een opeenvolging van beelden te verzamelen. Dit kan zeer moeilijk uit te voeren en te interpreteren, met name voor dikkere monsters, zoals cellen. Zo heeft de microscopist behoefte aan een diep begrip van alle materialen die betrokken zijn bij het uitvoeren van dergelijke experimenten en moet de posities van de individuele focale vliegtuigen die werden gebruikt record.

Ten slotte is de data-analyse stap zo kritisch als het verzamelen van gegevens. Bij het meten van het contrast of de intensiteit waarden van het monster, moeten verschillende factoren in gedachten worden gehouden. Typisch, is de analist hoofdzakelijk geinteresseerd in de minimum en maximumwaarden voor het deeltje van belang. Wanneer het contrast met de ruisverhouding voor het monster voldoende hoog is, en als het achtergrond gebied schoon en gelijkmatig verlicht is, dan kan een eenvoudige geometrische vorm rond het steekproef gebied worden getrokken zonder dat het signaal door contaminanten wordt ingevoerd. Bovendien, als de achtergrond is schoon en gelijkmatig verlicht, een achtergrond meting kan worden gemaakt in elk gebied direct naast het monster. Echter, als er verontreinigingen of als de achtergrond ongelijk is, dan is de analist moet een kritisch overzicht van de omgeving van het monster te maken, en de analist moet beoordelen of het zelfs mogelijk is om een redelijke achtergrond meting te maken. Het is ook essentieel om de steekproef en de achtergrond gebieden met het zelfde-gerangschikte en gevormde hulpmiddel te meten om de introductie van bias in de berekening te vermijden. In het algemeen, kleinere meet gebieden hebben een lagere kans op het opsporen van uitlopers (bijv. contaminanten, slechte pixels, enz.), maar grotere bemonsterings gebieden bieden vaak een meer betrouwbare meting van de gemiddelde waarde van de achtergrond.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm