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Chemistry

संचरण आधारित Nomarski-प्रकार विभेदक हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट Microscopy के साथ Plasmonic नैनोकणों पर प्रदर्शन स्पेक्ट्रोस्कोपी

Published: June 5, 2019 doi: 10.3791/59411
Automatic Translation
1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Ohio University

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य plasmonic नैनोकणों के नमूनों की तैयारी के लिए और विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी के साथ उन पर एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन के लिए विस्तार करने के लिए एक सिद्ध दृष्टिकोण है ।

Abstract

विभेदक व्यतिकरण कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली इमेजिंग उपकरण है जो सबसे अधिक इमेजिंग माइक्रोस्केल वस्तुओं के लिए दृश्यमान-रेंज प्रकाश का उपयोग करते हुए नियोजित है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य plasmonic नैनोकणों नमूनों की तैयारी और डीआईसी microscopy के साथ उन पर एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन के लिए एक सिद्ध विधि विस्तार करने के लिए है. Repeatable स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों प्रदर्शन करने के क्रम में कई महत्वपूर्ण कदम सावधानी से पीछा किया जाना चाहिए. सबसे पहले, स्थलों नमूना सब्सट्रेट, जो नमूना सतह का पता लगाने में और प्रयोगों के दौरान ब्याज के क्षेत्र पर नज़र रखने में एड्स में etched किया जा सकता है । अगले, सब्सट्रेट ठीक से मलबे और अंयथा बाधा या नमूने की जांच अस्पष्ट कर सकते है कि contaminants की साफ किया जाना चाहिए । एक बार एक नमूना ठीक से तैयार है, सूक्ष्मदर्शी के ऑप्टिकल पथ गठबंधन होना चाहिए, Kohler रोशनी का उपयोग । एक मानक Nomarski शैली डीआईसी माइक्रोस्कोप के साथ, नमूने के रोटेशन के लिए आवश्यक हो सकता है, विशेष रूप से जब plasmonic नैनोकणों अभिविन्यास-निर्भर ऑप्टिकल गुण प्रदर्शित. क्योंकि dic माइक्रोस्कोपी दो अंतर्निहित लांबिक ध्रुवीकरण क्षेत्रों है, तरंग दैर्ध्य-निर्भर डीआईसी कंट्रास्ट पैटर्न रॉड के आकार का plasmonic नैनोकणों के उंमुखीकरण से पता चलता है । अंत में, डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण सावधानी से किया जाना चाहिए । यह एक विपरीत मूल्य के रूप में डीआईसी आधारित स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा का प्रतिनिधित्व करने के लिए आम है, लेकिन यह भी तीव्रता डेटा के रूप में पेश करने के लिए संभव है. एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए डीआईसी के इस प्रदर्शन में, ध्यान गोलाकार और रॉड के आकार का सोने नैनोकणों पर है ।

Introduction

1980 के दशक के बाद से, विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी काफी हद तक एक महत्वपूर्ण इमेजिंग विधि जैविक विज्ञान के भीतर माइक्रोस्कोपी वस्तुओं के लिए आरक्षित के रूप में देखा गया है । हालांकि, 1950 और 1960 के दशक में अपने विकास के दौरान, यह सामग्री विज्ञान1के लिए एक तकनीक के रूप में करना था । सामग्री plasmonic नैनोकणों, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ सामग्री के लक्षण वर्णन में वृद्धि हुई रुचि विज्ञान में हाल ही में प्रगति के साथ जगह ले ली है ।

कई ऑप्टिकल तकनीकों नैनोमटेरियल लक्षण वर्णन (उदा., डार्क फील्ड, ब्राइटफील्ड, ध्रुवित प्रकाश, प्रतिदीप्ति, आदि) के लिए निश्चित रूप से उपलब्ध हैं । डार्क फील्ड नैनोकणों अनुसंधान में व्यापक रूप से लोकप्रिय है, लेकिन यह तितर बितर के संग्रह पर पूरी तरह निर्भर करता है और जटिल नमूनों के बारे में सीमित जानकारी उपलब्ध कराता है2। प्रतिदीप्ति उपयोगी हो सकता है, लेकिन केवल नमूने के साथ कि luminesce या कि ठीक से दाग जा सकता है. DIC माइक्रोस्कोपी कई लक्षण है कि यह नैनोकणों के विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान उपकरण बना दिया है । अंय तरीकों की तुलना में और में डीआईसी के सबसे अक्सर कहा लाभ plasmonic नैनोकणों के संबंध में कर रहे हैं: कोई नमूना धुंधला आवश्यक, कोई प्रभामंडल प्रभाव, क्षेत्र के उथले गहराई, और उच्च पार्श्व संकल्प3। DIC अतिरिक्त ताकत है कि plasmonic नैनोकणों अनुसंधान के लिए मूल्यवान हैं । सबसे पहले, दो अंतर्निहित और लांबिक ध्रुवीकरण क्षेत्रों मौजूद हैं, और वे स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोजनों2के लिए एक साथ मापा जा सकता है । दूसरे, नैनोकणों के depolarized संकेत अंतिम2छवि है, जो अंधेरे क्षेत्र स्पेक्ट्रोस्कोपी मापन में गंभीर चिंता का कारण हो सकता है में कब्जा नहीं किया है ।

इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए संचारित प्रकाश Nomarski डीआईसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए plasmonic नैनोकणों पर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन के लिए एक स्पष्ट पद्धति प्रदान करने के लिए है । हालांकि डीआईसी एक शक्तिशाली तकनीक है कि अत्यधिक विविध सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है, यह भी एक तकनीक है कि महान कौशल और समझ की आवश्यकता है इसे ठीक से संचालित जब इमेजिंग नैनोकणों । संचरण आधारित nomarski डीआईसी माइक्रोस्कोपी एक जटिल प्रकाश पथ1 कि केवल संक्षेप में यहां की समीक्षा की जाएगी है । डीआईसी की ऑप्टिकल ट्रेन चित्रा 1में प्रदर्शित की जाती है । प्रकाश माइक्रोस्कोप के माध्यम से पहली बार एक polarizer और एक बीम बंटवारे Nomarski चश्मे के माध्यम से पारित कर दिया जा रहा से पहले नमूना विमान पर संघनित्र द्वारा ध्यान केंद्रित किया जा रहा द्वारा फैलता है । इस उद्देश्य के माध्यम से पारित करने के बाद, प्रकाश एक बीम-संमिश्रण Nomarski चश्मे और डिटेक्टर के लिए बाहर निकलने से पहले एक विश्लेषक मुठभेड़ों । दो polarizers और nomarski प्रिज्म डीआईसी छवि के गठन के लिए महत्वपूर्ण है और है डीआईसी दो लांबिक ध्रुवीकरण क्षेत्रों1उत्पादन के लिए जिंमेदार हैं । काम सिद्धांतों और Nomarski डीआईसी microscopes, या Nomarski डीआईसी और डीआईसी के अंय शैलियों के बीच मतभेद के ऑप्टिकल पथ के बारे में अधिक जानने में रुचि पाठक के लिए, कृपया अंय अच्छी तरह से इन विषयों1पर लिखा खातों को देखें, 4 । , 5 । , 6 । , ७।

यह भी उन पर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए प्रयास करने से पहले plasmonic नैनोकणों की बुनियादी प्रकृति को समझने के लिए, चाहे वह nomarski डीआईसी, डार्क फील्ड, या किसी अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ होना महत्वपूर्ण है । Plasmonics के क्षेत्र में, नैनोकणों 10-100 एनएम8,9के पैमाने पर आयामों के साथ particulates के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । Nanoparticles कई आकार (जैसे, क्षेत्रों, छड़, तारे, dumbbells, आदि) पर ले जा सकते हैं, और उनके महत्वपूर्ण गुणों के अधिकांश पराबैंगनी-दृश्य-के पास अवरक्त चुंबकीय स्पेक्ट्रम की रेंज में प्रकाश के साथ बातचीत से उत्पंन होते हैं । शब्द "plasmonic" नैनोकणों10तक ही सीमित नहीं है; हालांकि, जब नैनोकणों पर चर्चा, यह स्थानीयकृत सतह plasmon अनुनाद (LSPR) के संदर्भ में प्रयोग किया जाता है । LSPR एक घटना है, जिसमें एक नैनोकणों में चालन इलेक्ट्रॉनों एक उच्च विशिष्ट और अपेक्षाकृत संकीर्ण आवृत्ति बैंड8के विद्युत चुम्बकीय विकिरण के साथ एक कूलॉम्बिक बातचीत के कारण दोलन । इन एक ही आवृत्तियों पर, plasmonic नैनोकणों का प्रदर्शन बढ़ अवशोषण और प्रकाश के बिखरने, उन्हें ऑप्टिकल microscopy के साथ नमूनायोग्य बनाने. कई मामलों में, यह नैनोकणों का निरीक्षण करने के लिए पसंद किया जाता है, जबकि संघनित्र2से पहले bandpass फिल्टर रखने, इमेजिंग कंट्रास्ट में सुधार करने के लिए और प्रकाश है कि LSPR प्रभाव पैदा करने में विफल रहता है को खत्म करने के लिए । फिल्टर का उपयोग भी यह संभव एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए बनाता है ।

LSPR-संबंधित ऑप्टिकल व्यवहार नैनोकणों के आकार और आकार पर अत्यधिक निर्भर है, और यह कई ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ जांच की जा सकती है । तथापि, एक विषमदैशिक (यानी, गैर गोलाकार) आकार के साथ plasmonic नैनोकणों के अभिविन्यास जानकारी को समझने के लिए, यह प्रकाश क्षेत्र के ध्रुवीकरण का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । ध्यान से ध्रुवीकरण क्षेत्र या छोटे वेतन वृद्धि पर नमूना सब्सट्रेट घूर्णन करके, यह व्यक्तिगत नैनोकणों के अभिविन्यास-निर्भर स्पेक्ट्रोस्कोपिक गुणों पर नजर रखने के लिए संभव है. रोटेशन और ध्रुवीकरण भी एक वर्णक्रमीय सुविधा नैनोकणों की सतह इलेक्ट्रॉनों के एक द्विध्रुवीय या उच्च क्रम दोलन के कारण है कि क्या निर्धारित करने में सहायता कर सकते हैं । हालांकि, समदैशिक (यानी, गोलाकार) नैनोकणों के मामले में, वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल polarized प्रकाश के तहत नमूना घूर्णन पर अनिवार्य रूप से अपरिवर्तित रहता है ।

जब एक डीआईसी माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा (चित्रा 2), नैनोकणों एक छाया के साथ एक हवादार डिस्क-कास्ट सफेद और काले एक ग्रे पृष्ठभूमि के खिलाफ उपस्थिति है । गोलाकार नैनोकणों रोटेशन के तहत इस उपस्थिति को बनाए रखने और bandpass फिल्टर के बदलने के साथ होगा; हालांकि, कणों को धीरे से देखने से फीका के रूप में है फिल्टर केंद्रीय तरंगदैर्ध्य आगे हो जाता है क्षेत्र ही dipolar LSPR तरंगदैर्ध्य11से अलग हो जाता है । Nanorods की उपस्थिति काफी नाटकीय रूप से बदल सकते है के रूप में वे2घुमाया । Nanorods दो LSPR बैंड dipolar व्यवहार के साथ है, जो के स्थान nanorods के भौतिक आयामों पर आधारित हैं । जब एक nanorod के अनुदैर्ध्य अक्ष डीआईसी ध्रुवीकरण क्षेत्रों में से एक के समानांतर उंमुख है, हवादार डिस्क सभी सफेद या सभी काले दिखाई अगर एक bandpass कि LSPR तरंगदैर्ध्य के साथ जुड़े फिल्टर के साथ देखा जाएगा । नमूना घूर्णन के बाद ९० °, यह विपरीत रंग पर ले जाएगा । वैकल्पिक रूप से, के बाद से एक nanorod के अनुप्रस्थ अक्ष अनुदैर्ध्य धुरी के लिए सीधा है, रॉड विपरीत रंग पर ले जब फिल्टर है कि दो अक्षों के लिए LSPR तरंग दैर्ध्य मैच के बीच स्विचन जाएगा । अंय झुकाव और फ़िल्टर सेटिंग्स में, nanorods अधिक क्षेत्रों की तरह दिखाई देगा, छाया की एक किस्म-कास्ट हवादार डिस्क पैटर्न पेश । एक अनुप्रस्थ अक्ष < 25 एनएम के साथ nanorods के लिए, यह है कि LSPR तरंग दैर्ध्य पर डीआईसी microscopy का उपयोग कर संकेत का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है ।

एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए, यह सही ऑप्टिकल घटकों का उपयोग करने के लिए और उन्हें ठीक से संरेखित करने के लिए महत्वपूर्ण है । डीआईसी माइक्रोस्कोपी में सक्षम एक उद्देश्य का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । एकल कण प्रयोगों के लिए, 80x या 100x तेल उद्देश्य आदर्श होते हैं । Nomarski डीआईसी प्रिज्म आमतौर पर तीन किस्मों में आते हैं: मानक, उच्च विपरीत, और उच्च संकल्प । आदर्श प्रकार अत्यधिक प्रयोग के उद्देश्य और नैनोकणों के आकार पर निर्भर करता है । मानक प्रिज्म कई प्रयोगों के लिए ठीक कर रहे हैं; लेकिन जब छोटे नैनोकणों (< ५० एनएम) के साथ काम कर रहे हैं, उच्च विपरीत प्रिज्म फायदेमंद हो सकता है, क्योंकि कण के विपरीत कम हो जाता है के रूप में कणों के आकार में कमी11। डीआईसी इसके विपरीत समायोजन या तो एक polarizer घूर्णन द्वारा या डीआईसी prisms में से एक का अनुवाद करके हासिल की है, खुर्दबीन ब्रांड या6मॉडल पर निर्भर करता है ।

Kohler रोशनी और polarizer सेटिंग्स स्थापित करने के बाद, यह स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा इकट्ठा करते समय इन सेटिंग्स सुधारने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है. इसके अलावा, एक निरंतर औसत पृष्ठभूमि संकेत डेटा संग्रह के दौरान हर समय बनाए रखा जाना चाहिए, यहां तक कि जब फिल्टर और कोण सेटिंग्स के बीच स्विचन. वास्तविक आदर्श पृष्ठभूमि मूल्य वैज्ञानिक कैमरे के गतिशील रेंज पर निर्भर करता है, लेकिन सामान्य रूप में, पृष्ठभूमि 15% की सीमा में होना चाहिए – कैमरे का अधिकतम पता लगाने के स्तर का 40%. यह कैमरा सेंसर saturating की संभावना कम कर देता है, जबकि इष्टतम कण विपरीत सक्षम करने से । स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा इकट्ठा करने के लिए, यह एक रंग कैमरा करने के लिए विरोध के रूप में, काले और सफेद में छवियों को कब्जा है कि एक वैज्ञानिक कैमरे के साथ काम करने के लिए आवश्यक है ।

नमूना तैयार इमेजिंग plasmonic नैनोकणों का एक और महत्वपूर्ण पहलू है । यह आवश्यक है कि डीआईसी माइक्रोस्कोपी के ऑपरेटरों नमूना है और नमूना सब्सट्रेट के ऑप्टिकल गुणों की एक समझ है । "पूर्व साफ" खुर्दबीन ग्लास इमेजिंग नैनोकणों के लिए पर्याप्त रूप से तैयार नहीं है, और यह नमूना के अबाधित अवलोकन को सुनिश्चित करने के लिए नमूना बयान से पहले ठीक से फिर से साफ किया जाना चाहिए. खुर्दबीन स्लाइड के लिए कई सफाई प्रोटोकॉल पहले12प्रलेखित किया गया है, लेकिन यह एक कदम है कि आम तौर पर प्रयोगात्मक अध्ययन में रिपोर्ट नहीं है ।

अंत में, डेटा विश्लेषण विधियों एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए अंतिम घटक हैं । प्रत्येक नैनोकणों के लिए अधिकतम और न्यूनतम तीव्रता मापा जाना चाहिए, साथ ही स्थानीय पृष्ठभूमि औसत. ब्याज के कणों कोई पृष्ठभूमि मलबे, सब्सट्रेट दोषों, या असमान रोशनी के साथ क्षेत्रों में स्थित होना चाहिए । एक नैनोकणों के वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल का निर्धारण करने के लिए एक विधि प्रत्येक तरंग दैर्ध्य पर कण विपरीत की गणना,11,13,14,15से नीचे समीकरण का उपयोग कर रहा है:

Equation

वैकल्पिक रूप से, एक एकल कण स्पेक्ट्रम अपने व्यक्तिगत अधिकतम और ंयूनतम संकेत घटकों में विभाजित किया जा सकता है, जो है डीआईसी दो ध्रुवीकरण क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिससे दो एक साथ प्रदर्शित-directionally निर्भर स्पेक्ट्रा एकत्र, दो समीकरणों के माध्यम से:

Equation

Equation

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Protocol

1. मानक ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड के साथ नमूना तैयारी

  1. नमूना बयान के लिए ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें ।
    नोट: कुछ परिस्थितियों में, यह अधिक उपयुक्त हो सकता है के लिए इथेनॉल के बजाय ultrapure पानी में कांच का भंडारण । हालांकि, पानी या हवा में भंडारण समय के साथ ग्लास जलविरागी बनाता है ।
    1. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, खरीद ग्लास या क्वार्ट्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड और कवर ग्लास ।
    2. एक लेखन कलम का प्रयोग, एक गिलास कवर पर्ची के केंद्र पर एक उथले और छोटे खरोंच निशान जगह है ।
    3. सभी खुर्दबीन ग्लास साफ, भले ही यह खरीदा है "पूर्व साफ", ग्लास shards, धूल, पाउडर, कार्बनिक अवशेषों को हटाने के लिए, और किसी भी अन्य contaminants कि इमेजिंग गुणवत्ता या नमूना बयान को प्रभावित.
      नोट: नीचे यह सफाई विधि के नमूनों के प्रकार के लिए अच्छी तरह से काम करता है यहां वर्णित है और कठोर रसायनों के उपयोग से बचा जाता है । कठोर रसायन कांच खोदना और हैंडलिंग और निपटान में और अधिक देखभाल की आवश्यकता कर सकते हैं ।
      1. प्लेस माइक्रोस्कोप भंडारण रैक पर गिलास और फिर एक बीकर में, या एक धुंधला जार में । Beakers के तल पर माइक्रोस्कोप ग्लास जगह नहीं है और बिना चालाकी के अंय प्रयोगशाला कांच के बर्तनों, क्योंकि प्रत्येक टुकड़ा और खुर्दबीन कांच की सतह पूरी तरह से सफाई एजेंटों को उजागर किया जाना चाहिए ।
      2. कंटेनर में तरल डिटर्जेंट (सामग्री की मेज) के ~ 1 मिलीलीटर डालो और पानी के साथ कंटेनर से ऊपर । 30 मिनट के लिए sonicate ।
        नोट: एक बार सफाई की प्रक्रिया शुरू होती है, केवल गिलास को संभाल जबकि दस्ताने पहने हुए, कांच पर फिंगरप्रिंट अवशेषों छोड़ने से बचने के लिए ।
      3. एक सिंक में सफाई कंटेनर के तरल सामग्री बाहर डालो । कुल्ला कंटेनर ultrapure पानी के साथ कई बार डिटर्जेंट की सभी उपस्थिति को दूर करने के लिए । अल्ट्राप्योर पानी के साथ कंटेनर फिर से भरना । एक और 30 मिनट के लिए माइक्रोस्कोप ग्लास के साथ कंटेनर sonicate ।
      4. पिछले चरण को एक बार फिर से दोहराएं । पानी में sonication के अतिरिक्त राउंड प्रदर्शन जब तक यह स्पष्ट है कि डिटर्जेंट के सभी निशान हटा दिया गया है ।
      5. बाहर सफाई कंटेनर की सामग्री डालो । पराशुद्ध जल से पात्र को कुल्ला कर लें । इथेनॉल के साथ कंटेनर फिर से भरना । सोकेट माइक्रोस्कोप ग्लास 30 मिनट के लिए ।
      6. एक अपशिष्ट कंटेनर में सफाई कंटेनर की सामग्री बाहर डालो । इथेनॉल के साथ फिर से भरना । वाष्पीकरण के माध्यम से इथेनॉल की हानि को रोकने के कंटेनर को कवर । इस कंटेनर में माइक्रोस्कोप ग्लास प्रयोग के समय तक स्टोर । स्लाइड स्वच्छ और प्रयोग करने योग्य के रूप में लंबे समय के रूप में वे एक कवर कंटेनर के अंदर इथेनॉल में डूबे रहते हैं ।
  2. नैनोकणों समाधान की तैयारी
    1. एक micropipette का उपयोग करना, अपने मूल भंडारण कंटेनर से ०.०५ मिलीग्राम/एमएल सोने नैनोकणों समाधान के एक १०० μL aliquot निकालें और एक १.५ मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में समाधान बाहर फैंकना ।
    2. ६,००० x gपर 10 मिनट के लिए सेंसेंटज नमूने
    3. एक micropipette के साथ supernatant निकालें, क्रम में अतिरिक्त surfactant हटाने के लिए ।
    4. एक micropipette का उपयोग करना, अपकेंद्रित्र ट्यूब में ultrapure पानी की १०० μL जगह है ।
      नोट: यदि supernatant के सभी पहले प्रयास पर हटाया जा सकता है नहीं है, और फिर से लागू करने के लिए अपकेंद्रण पुन: निलंबन कदम ।
    5. संक्षेप में पेलेट को पुन: निलंबित करने के लिए नमूना भंवर । तुरंत बाद sonicate 20 मिनट के लिए पूरी तरह से निलंबित और नैनोकणों समुच्चय को तोड़ने के लिए ।
      नोट: नमूना तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो यह माइक्रोस्कोप ग्लास पर समाधान जमा करने से पहले 20 मिनट के लिए फिर से sonicated किया जाना चाहिए ।
  3. प्रतिदर्श निक्षेपण
    1. अपने भंडारण कंटेनरों से साफ कवर स्लिप और माइक्रोस्कोप स्लाइड निकालें । झटका सूखी गिलास दबाव नाइट्रोजन या argon के साथ ।
    2. एक micropipette का उपयोग करना, ड्रॉप से नैनोकणों समाधान के 6 μL कदम 1.2.5 से कवर स्लिप पर । छोटी बूंद समान रूप से बाहर फैलाने के लिए, ध्यान से एक दूसरा, कवर स्लिप के शीर्ष पर माइक्रोस्कोप ग्लास का बड़ा टुकड़ा, जैसे एक दूसरे कवर स्लिप या एक खुर्दबीन स्लाइड के रूप में जगह है । शीशे के दो टुकड़ों के बीच फंसे हुए हवा के बुलबुले निकलने से बचें ।
      1. नमूना सब्सट्रेट मुड़ें, और मध्यम समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के क्रम में नेल पॉलिश की एक संकीर्ण रेखा के साथ कवर स्लिप के किनारों को सील ।
      2. वैकल्पिक रूप से, नमूना छवि के लिए "सूखी", समाधान 5 के लिए खड़े करने की अनुमति-15 मिनट कवर पर्ची पर, कांच के अवांछित टुकड़ा हटाने से पहले । दबाव नाइट्रोजन या argon के साथ धीरे कवर पर्ची सूखी झटका ।
    3. यदि संभव हो तो, तुरंत तैयारी के बाद छवि नमूने । यदि ऐसा संभव नहीं है, तो नमूने को किसी ढके हुए कंटेनर में संग्रहीत करें, जैसे कि पेट्री डिश को इमेजिंग तक ।

2. DIC इमेजिंग

  1. उद्देश्य और संघनित्र संरेखित करें ।
    1. माइक्रोस्कोप पर नमूना रखने के बाद, उस पर नमूने के साथ फोकल विमान लगता है । पहले स्थिति जानें और पहले बनाए गए स्क्रैच मार्क पर फोकस करें । तो ठीक धुन ध्यान जब तक नैनोकणों को देखने में आते हैं ।
    2. कंडेनसर की सही प्लेसमेंट का निर्धारण करने के लिए, Kohler रोशनी विधि का उपयोग. 5 kohler रोशनी उच्च आवर्धन (80x, 100x) में अधिक आसानी से पहली बार इस तरह 20x के रूप में एक कम इज़ाफ़ा पर Kohler रोशनी की स्थापना के द्वारा प्राप्त की है ।
      नोट: आम तौर पर, Kohler रोशनी फिर से एक नमूना के इमेजिंग के दौरान समायोजित करने की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, यह अच्छा अभ्यास करने के लिए सत्यापित करें कि Kohler रोशनी ठीक से सेट है जब एक नए माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए स्विचन है ।
  2. कंट्रास्ट सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ करें ।
    1. इमेजिंग के लिए नमूने के भीतर ब्याज के एक क्षेत्र का चयन करें । दृश्य के कैमरे के क्षेत्र में क्षेत्र केंद्र और आवश्यकतानुसार फ़ोकस समायोजित करें ।
      1. माइक्रोस्कोप de Senarmont डिजाइन किया है, तो polarizer अधिकतम पृष्ठभूमि विलुप्त होने के पास सेट के साथ शुरू और धीरे-धीरे पृष्ठभूमि विलुप्त होने की ओर polarizer घुमाएगी । बैकग्राउंड की तीव्रता धीरे से बढ़ती जाएगी ।
      2. यदि माइक्रोस्कोप एक de Senarmont डिजाइन नहीं है, ऑप्टिकल अधिकतम पृष्ठभूमि विलुप्त होने पर सेट ट्रेन के साथ शुरू करते हैं । इस मामले में, क्रमशः कम पृष्ठभूमि विलुप्त होने की ओर उद्देश्य चश्मे की स्थिति को समायोजित ।
        नोट: आदर्श सेटिंग हासिल की है जब नैनोकणों उनकी सबसे बड़ी तीव्रता अंतर तक पहुंचने (यानी, इसके विपरीत) औसत से स्थानीय पृष्ठभूमि मूल्य । Plasmonic नैनोकणों के लिए, इष्टतम कन्ट्रास्ट सामान्य रूप से एक अपेक्षाकृत अंधेरे पृष्ठभूमि के साथ प्राप्त किया है, इस प्रकार अधिकतम पृष्ठभूमि विलुप्त होने के पास सेटिंग्स पर.
  3. नमूना छवि ।
    1. प्रक्रिया के साथ बातचीत से आवारा रोशनी को रोकने के लिए कमरे में प्रकाश बंद करें ।
    2. जबकि एक वैज्ञानिक इमेजिंग कैमरा के साथ नैनोकणों को देखने, इष्टतम पृष्ठभूमि स्तर निर्धारित करते हैं । मुख्य LSPR तरंगदैर्ध्य के साथ स्थित अपने केंद्रीय तरंगदैर्घ्य के साथ आधा अधिकतम (FWHM) bandpass फिल्टर पर एक 10 एनएम पूर्ण चौड़ाई का उपयोग करना, ब्याज के क्षेत्र को देखते हैं । दीपक तीव्रता या जोखिम समय समायोजित जब तक पृष्ठभूमि स्तर 15% की श्रेणी में है-कैमरे की अधिकतम क्षमता स्तर का 40% और ब्याज के क्षेत्र के भीतर कोई वस्तु नहीं संकेत तीव्रता है कि कैमरे की अधिकतम तीव्रता स्तर के ९०% से अधिक है ।
      नोट: 2.3.2 कदम का लक्ष्य सेंसर saturating जब फिल्टर के बीच स्विचन को रोकने के लिए है. आदर्श पृष्ठभूमि स्तर के नमूनों और कैमरों के बीच भिंन हो जाएगा । एक बार इस कदम पूरा हो गया है, जोखिम समय समायोजित किया जा सकता है, लेकिन नहीं दीपक तीव्रता ।
    3. छवि bandpass फिल्टर की एक श्रृंखला है कि प्रत्येक 10 एनएम के एक FWHM है और के रूप में है कि एक पूरे ब्याज की तरंग दैर्ध्य रेंज भर में इमेजिंग सक्षम के साथ नमूना । सुनिश्चित करें कि पृष्ठभूमि तीव्रता छवि को छवि से संगत रहता है (के भीतर ~ एक दूसरे के 5%) जोखिम समय का समायोजन करके । फिल्टर स्विचन के बाद, छवि पर कब्जा करने से पहले नमूना फिर से ध्यान केंद्रित.
    4. सभी सूचनाओं को रक्षित करने के लिए छवियों को असंपीड़ित TIFF फ़ाइलों और/या सॉफ़्टवेयर के मूल फ़ाइल स्वरूप में सहेजें ।
  4. नमूना घुमाएं ।
    1. अपनी मूल स्थिति में नमूने के चित्र एकत्रित करने के बाद, नमूना अब घुमाया जा सकता है और प्रकाश पथ में अतिरिक्त झुकाव पर imaged । या तो १८० ° या ३६० ° श्रेणी में नियमित अंतरालों (उदा., 10 ° या 15 °) पर रोटेशन निष्पादित करें ।
      नोट: रोटेशन एक rotatable नमूना चरण की आवश्यकता है ।
    2. के रूप में धारा 2.1-2.3, कैमरा सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए छवि से छवि को एक सुसंगत पृष्ठभूमि स्तर प्रदान करते हैं ।
      नोट: कोलर रोशनी के लिए कोई समायोजन किया जाना चाहिए ।

3. डेटा ImageJ का उपयोग विश्लेषण

नोट: निंनलिखित गणना सॉफ्टवेयर संकुल की एक किस्म में किया जा सकता है, और मूल रूप से छवियों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया कार्यक्रम में कभी । ImageJ स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) से एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर है ।

  1. कण विपरीत या तीव्रता की गणना ।
    1. ImageJ के साथ छवि खोलें ।
    2. आयत उपकरण का चयन करें और ब्याज के मुख्य क्षेत्र के चारों ओर एक आयत आकर्षित ।
    3. उपकरण पट् टी पर, छविका चयन करें, फिर ज़ूमकरें, फिर चयन करें। इमेजिंग विंडो चयनित क्षेत्र पर ज़ूम इन करेगी ।
    4. उपकरण पट्टी पर, छविका चयन करें, फिर समायोजित, फिर चमक/कंट्रास्ट। एक नई विंडो प्रकट होती है । नमूना क्षेत्र के बेहतर देखने को सक्षम करने के लिए, चार सेटिंग्स समायोजित करें: ंयूनतम, अधिकतम, चमक, और कंट्रास्ट । इन समायोजन वैज्ञानिक डेटा में परिवर्तन नहीं करते हैं, वे केवल नमूना क्षेत्र की बेहतर दृश्यता सक्षम.
      नोट: 3.1.3 चरण और 3.1.4 कई बार और उल्टे क्रम में किया जा सकता है ।
    5. आयत उपकरण का उपयोग फिर से, मापा जा करने के लिए पहले नैनोकणों के आसपास एक बॉक्स आकर्षित । बॉक्स सिर्फ नैनोकणों की हवादार डिस्क से थोड़ा बड़ा होना चाहिए ।
    6. टूल बार पर, विश्लेषणकरें, फिर मापेंचुनें । एक नई विंडो प्रकट होती है जो चयनित बॉक्स के अंदर स्थित पिक्सेल के लिए ंयूनतम, अधिकतम, और माध्य तीव्रता बताती है ।
    7. एक क्षेत्र के लिए नैनोकणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया बॉक्स खींचें तुरंत कण है, जहां पृष्ठभूमि के विपरीत अपेक्षाकृत भी है और कोई कण या contaminants मौजूद हैं के बगल में । बॉक्स के मूल आकार को बनाए रखें ।
    8. पृष्ठभूमि क्षेत्र के लिए माध्य तीव्रता निर्धारित करने के लिए माप उपकरण का उपयोग करें ।
    9. शेष कणों और प्रत्येक के लिए एक आसन्न पृष्ठभूमि क्षेत्र को मापने ।
    10. श्रृंखला में सभी छवियों में प्रत्येक कण के लिए प्रक्रिया को दोहराएं ।
    11. सभी तरंगदैर्ध्य और कोणों के पार, प्रत्येक कण के विपरीत या तीव्रता की गणना करने के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा निर्यात करें ।
    12. निंन समीकरण13,14,15का उपयोग करते हुए, प्रत्येक कण के कंट्रास्ट की गणना करें:
      Equation
      नोट: इस समीकरण का उपयोग करते हुए, कण कंट्रास्ट हमेशा 0 > होना चाहिए ।
    13. गणना कण की पृष्ठभूमि-समायोजित अधिकतम मान मापा अधिकतम कण तीव्रता पृष्ठभूमि द्वारा विभाजित करके मतलब है:
      Equation
    14. इसी तरह, पृष्ठभूमि-समायोजित ंयूनतम मूल्य की गणना द्वारा मापा ंयूनतम कण की तीव्रता पृष्ठभूमि का मतलब है:
      Equation
      नोट: परिकलित के रूप में, अधिकतम में एक से अधिक मान होना चाहिए, जबकि ंयूनतम एक से कम होगा । प्रत्येक मान को "1" से घटाना स्वीकार्य है, ताकि औसत पृष्ठभूमि अनिवार्य रूप से शूंय हो, अधिकतम को धनात्मक मान के रूप में दर्शाया जाता है, और ंयूनतम मान को ऋणात्मक मान16असाइन किया जाता है । इस उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण अलग से क्या ध्रुवीकरण क्षेत्रों, जो उपयोगी है जब विषमदैशिक कणों का अध्ययन में से प्रत्येक के साथ होने वाली है पर विचार करने के लिए विश्लेषक की अनुमति देता है ।
    15. किसी दिए गए नैनोकणों की स्थिति पर वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल को ग्राफ़ करने के लिए, x-अक्ष के साथ तरंगदैर्घ्य और y-अक्ष के साथ कंट्रास्ट या तीव्रता के साथ डेटा प्लॉट करें ।
    16. किसी दिए गए तरंगदैर्घ्य पर घूर्णी परिच्छेदिका को ग्राफ करने के लिए, ग-अक्ष के अनुदिश घूर्णन कोण को तथा इसके विपरीत या तीव्रता को ल्-अक्ष के अनुदिश प्लॉट करें ।

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Representative Results

जब नमूनों के साथ काम कर रहे है कि काफी बड़ी नग्न आंखों से देखा जा सकता है, गिलास सब्सट्रेट पर स्थलों रखने के सामांय रूप से आवश्यक नहीं है । हालांकि, जब nanomaterials के साथ काम या जब नमूने के रोटेशन की आवश्यकता है, स्थलों का पता लगाने के लिए एक आसान तरीका प्रदान कर सकते हैं, भेद, और नमूने के अभिविन्यास ट्रैकिंग. हालांकि अधिक परिष्कृत तकनीकों ग्लास पर स्थलों छोड़ने के लिए उपयोग किया जा सकता17substrates, एक लेखन कलम के साथ गिलास scratching एक किफायती और सरल तरीका है कि कई स्थितियों में काम करता है । यह नमूना क्षेत्रों है कि तुरंत इन स्थलों के निकट है की जांच से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से खरोंच निशान प्रभाव डेटा की क्षमता के साथ एक जटिल पृष्ठभूमि बनाने (चित्रा 3) । हालांकि, खरोंच के निशान के सुझावों पर, "मकड़ी के जाले" अक्सर खरोंच से जावक का विस्तार । इन पंक्तियों स्थलों के रूप में काफी मूल्यवान हैं, लेकिन फिर से, नैनोकणों अगर वे इन दोषों के साथ ओवरलैप से बचा जाना चाहिए ।

आदेश में डीआईसी microscopy के साथ इष्टतम इमेजिंग प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण महत्व के लिए उचित फोकल विमान का निर्धारण है । वस्तुओं है कि थोड़ा ध्यान से बाहर है फजी दिखाई देगा, किनारों धुंधला है, और इसके विपरीत कम है । 4 चित्रा सोने नैनोकणों कि ध्यान से बाहर है डिग्री बदलती करने के लिए प्रदर्शित करता है । नीचे दाएं कोने में नैनोकणों ध्यान में हैं, जबकि नैनोकणों दूर ध्यान से बाहर के रूप में वे इस छवि के ऊपरी बाएं कोने दृष्टिकोण हो । क्योंकि डीआईसी क्षेत्र के एक उथले गहराई है, यह असामांय कुछ नैनोकणों के लिए ध्यान में नहीं है, जबकि दूसरों को ध्यान से बाहर है जब उंहें एक गिलास सब्सट्रेट पर इमेजिंग हैं । नतीजतन, यह लगातार एक ही सटीक कणों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है जब एक प्रयोग के दौरान माइक्रोस्कोप करने के लिए समायोजन कर रही है ।

चित्रा 5 polarizer सेटिंग्स का समायोजन के प्रभाव का एक उदाहरण प्रदान करता है, जबकि इमेजिंग गोल्ड nanospheres । पांच नैनोकणों ध्यान में हैं, जबकि एक थोड़ा ध्यान से बाहर है । ऑप्टिकल पाथ में 10 एनएम एफडब्ल्यूएम के साथ ५४० एनएम बैंडपास फिल्टर भी था । छवियों की इस श्रृंखला में, पृष्ठभूमि चमक ImageJ छवि अधिग्रहण के बाद के साथ समायोजित करने के लिए पांच कणों पृष्ठभूमि के खिलाफ और अधिक स्पष्ट करने के लिए किया गया था । जब polarizer एक de senarmont डिजाइन nomarski डीआईसी माइक्रोस्कोप में 0 डिग्री पर सेट है, यह विश्लेषक को लांबिक है (चित्रा 5a) । 0 ° पर, कणों ज्यादातर सफेद दिखाई देते हैं, एक काले उनके मध्य अनुभाग में चल धारी के साथ । यह नैनोस्फीयर नमूनों के लिए क्रॉस-ध्रुवीकरण का संकेत है । जब polarizer अलग कोण (चित्रा 5B-ई) के लिए घुमाया जाता है, कणों के लिए दक्षिण पश्चिम की ओर अंधेरा छाया ढलाई होना दिखाई देते हैं । संकेत करने के लिए काले और सफेद घटकों है डीआईसी दो ध्रुवीकरण क्षेत्रों का एक परिणाम के रूप में उठता है और plasmonic नैनोकणों के अभिविन्यास के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं जब bandpass फिल्टर के साथ काम. के रूप में polarizer उच्च कोण की ओर घुमाया जाता है, छाया पैटर्न इसी तरह रहता है । हालांकि, कण विपरीत मूल्यों नाटकीय रूप से बदल जाते हैं । यह सबसे अच्छा अलग कणों के लिए विपरीत मूल्यों को मापने के द्वारा, ऊपर दिए गए समीकरण का उपयोग करके प्रदर्शन किया है । ब्लैक बॉक्स के साथ प्रकाश डाला कण के विपरीत मूल्यों ०.६५ (पार polarizers), ०.८४ (5 ° की polarizers पारी), १.१० (10 °), ०.४४ (20 °), और ०.२३ (४५ °) है । इसलिए, इस नमूने के लिए, इष्टतम इमेजिंग सेटिंग एक polarizer shift की 10 ° के साथ है । Plasmonic नैनोकणों अक्सर इन सामान्य रूप से आदर्श सेटिंग की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए की तुलना में 5 ° – 15 डिग्री, और छोटे वेतन वृद्धि की श्रेणी में एक polarizer सेटिंग की आवश्यकता है. इमेजिंग और गोलाकार सोने नैनोकणों के विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठकों सूर्य एट अल11से पहले काम करने के लिए भेजा जाता है ।

असमदैशिक आकार का नैनोकणों नैनोगोलों की तुलना में उच्च जटिलता के पैटर्न का उत्पादन करते हैं । सोने के नैनोछड़ को उनके अनुदैर्ध्य LSPR तरंग दैर्ध्य, ६५० एनएम पर imaged (चित्रा 6) थे । प्रारंभिक छवि में (चित्र 6a), पाँच चमकीले नैनोऑड्स और कई dimmer कण स्पष्ट हैं । इसके बजाय एक छाया कलाकारों उपस्थिति होने के, छड़ के तीन predominately काले हवादार डिस्क है, जबकि दो ज्यादातर सफेद होते हैं । Polarizer पार ध्रुवीकरण की स्थापना के बाईं ओर 10 डिग्री पर सेट किया गया था । आरेख 6Bमें, क्रॉसित ध्रुवीकरण का उपयोग किया गया; कणों के केवल तीन दिखाई देते हैं, पूरी तरह से सफेद हवादार डिस्क के रूप में । दूसरों को गायब कर दिया है या थोड़ा ध्यान से बाहर दिखाई देते हैं । Polarizer पार ध्रुवीकरण के अधिकार को 10 डिग्री पर सेट के साथ (चित्रा 6c), पैटर्न अब क्या चित्र 6aमें मनाया गया था के उलट रहे हैं । Polarizer अगले पार ध्रुवीकरण के ४५ ° सही करने के लिए बदल गया था (चित्रा 6D), अधिकतम सेटिंग, प्रदर्शित करने के लिए कि कणों को इस सेटिंग में अपने रंग बनाए रखने, लेकिन इसके विपरीत काफी गिरावट आई है । शेष चित्रा पैनलों में, nanorods का संग्रह संवर्द्धित रूप से एक पूर्ण ९० ° दक्षिणावर्त घुमाया गया था, जबकि polarizer पार ध्रुवीकरण के अधिकार के लिए 10 डिग्री पर स्थापित किया गया था । पैटर्न प्रत्येक nanorod के लिए धीरे से बदलता है, और एक पूर्ण ९० ° रोटेशन के बाद, कणों प्रारंभिक सेटिंग से उनके रंग उलट है । संक्षेप में, यदि एक plasmonic nanorod की अक्षों में से एक दो ध्रुवीकरण क्षेत्रों में से एक के साथ लाइन में खड़ा है, और अगर nanorod है कि ' धुरी LSPR तरंगदैर्ध्य, nanorod में imaged दिखाई देगा ज्यादातर सफेद या ज्यादातर काले, पर निर्भर करता है जो ध्रुवीकरण क्षेत्र यह aligne है d के साथ (चित्र 6a, C)2। यदि nanoparticle एक पूर्ण ९० ° (चित्रा 6H) घुमाया गया है, यह अब विपरीत ध्रुवीकरण क्षेत्र के साथ लाइन में खड़ा हो जाएगा और विपरीत रंग पर ले । अगर इसके बजाय nanoparticle केवल ४५ ° (चित्रा 6F) घुमाया गया था, तो यह एक स्थिति में होगा जहां कण अपनी सबसे बड़ी छाया-डाली उपस्थिति प्रदर्शन करेंगे, क्या plasmonic नैनोगोलों के साथ मनाया जाता है हड़ताली समानता दिखा । इस ऑप्टिकल व्यवहार का एक परिणाम के रूप में, एक विषमदैशिक आकार के साथ plasmonic नैनोकणों अक्सर nanospheres के तीन आयामी छाया कलाकारों उपस्थिति होने के बजाय फ्लैट देखो । ऑप्टिकल व्यवहार में इस अंतर का परिणाम यह है कि यह गोलाकार और विषमदैशिक आकार में कर रहे हैं कि plasmonic नैनोकणों के बीच भेद करने के लिए शोषण किया जा सकता है, के रूप में पहले से कई शोध अध्ययनों में चर्चा की गई है2, 3,6,7,11,13,16।

अंत में, चित्रा 7 प्रदर्शित करता है प्रतिनिधि एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा, के विपरीत के रूप में एक सोने nanosphere (चित्रा 7a)11, इसकी तीव्रता के साथ एक सोने nanorod अपनी अनुदैर्ध्य धुरी उंमुख एक ध्रुवीकरण के लिए समानांतर (चित्र7B)6तथा इसके एलएसपीआर तरंगदैर्घ्य पर एक स्वर्ण नैनोरोड की तीव्रता प्रोफाइल तथा चरण के घूर्णन के दौरान (चित्र 7b)6। प्रस्तुति की या तो विधि LSPR प्रभाव की चौड़ाई और स्थान का पता चलता है । एक विषमदैशिक आकार के साथ plasmonic नैनोकणों के लिए, तीव्रता और रोटेशन डेटा प्रभाव की दिशात्मकता प्रकट, और इसलिए, नमूना सब्सट्रेट पर कण के अभिविन्यास, जो पहले सहसंबंधी अध्ययन के माध्यम से सिद्ध किया गया है पर ऐसे कण डीआईसी और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग2,16,18।

Figure 1
चित्रा 1: संचारित प्रकाश Nomarski आधारित डीआईसी microscopy में प्रकाश पथ. प्रकाश स्रोत (ओं) को छोड़ने के बाद, प्रकाश एक polarizer (पी), एक बीम बाल काटना Nomarski चश्मे (एनपी), संघनित्र (सी), फोकल तल (FP), उद्देश्य (ओ), एक बीम-के संयोजन Nomarski चश्मे (NP), विश्लेषक (एक), और अंत में डिटेक्टर (डी) के माध्यम से गुजरता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: plasmonic नैनोकणों के उदाहरण उनके LSPR तरंग दैर्ध्य पर 10 एनएम bandpass फिल्टर के साथ imaged, एक डीआईसी माइक्रोस्कोप का उपयोग । दोनों छवियों 100x पर एकत्र कर रहे हैं । (क) ४० एनएम व्यास वाले सिल्वर नैनोक्षेत्रों में 10 एनएम एफडब्ल्यूएम वाले बैंडपास फिल्टर के साथ ४८० एनएम पर imaged है । (ख) रॉड की तरह सोने नैनोकणों 10 एनएम FWHM के साथ एक bandpass फिल्टर का उपयोग कर ७०० एनएम पर imaged । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक घसीटन कलम के साथ एक गिलास कवर पर्ची में किए गए एक खरोंच की छवि । वास्तविक इंडेंटेशन के अंत के पास, संकीर्ण और उथले "मकड़ी वेब" लाइनों की एक श्रृंखला खरोंच से ही बाहर शाखा, एक पैटर्न है कि एक इमेजिंग मील का पत्थर के रूप में उपयोग किया जा सकता है में जिसके परिणामस्वरूप । यह छवि 100x आवर्धन और ब्रॉडबैंड सफेद प्रकाश का उपयोग कर एकत्र किया गया था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: गोल्ड nanospheres 100x पर ब्रॉडबैंड सफेद रोशनी के साथ imaged । निचले सही में कणों ध्यान में हैं, लेकिन कणों के ऊपरी बाएं कोने की ओर फोकल विमान से दूर बहाव । छवि के बीच में वस्तु मलबा है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सोने nanospheres ५४० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य और 100x की आवर्धन पर विभिंन polarizer सेटिंग्स की एक श्रृंखला के तहत imaged । पृष्ठभूमि चमक ImageJ के साथ पोस्ट इमेजिंग के लिए और अधिक स्पष्ट कणों बनाने के लिए समायोजित किया गया था । Polarizer की सेटिंग (A) 0 ° (polarizer लांबिक करने के लिए विश्लेषक), (ख) 5 °, (C) 10 ° (छवियों की इस श्रृंखला का सबसे अच्छा कंट्रास्ट), (D) 20 °, और (E) ४५ ° । कण के ब्लैक बॉक्स में मापा कंट्रास्ट (A) ०.६५, (B) ०.८४, (C) १.१०, (D) ०.४४, और (E) ०.२३ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: इमेजिंग एनिसोट्रॉपिक प्लामोनिक नैनोकणों के उदाहरण: गोल्ड नैनोरॉड्स उनके अनुदैर्ध्य LSPR तरंग दैर्ध्य ६५० एनएम और 100x की आवर्धन पर । मुख्य ब्याज के कण पीले बॉक्स में संलग्न हैं । Polarizer सेटिंग्स हैं: (क) बाएँ 10 °, (B) 0 °, (C) दाएँ 10 °, (D) दाएँ ४५ °. के साथ polarizer सही करने के लिए सेट 10 °, चरण दक्षिणावर्त घुमाया गया था द्वारा (ई) 20 °, (F) ४५ °, (G) ७० °, और (H) ९० ° । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा के प्रतिनिधि परिणाम. (क) डीआईसी कंट्रास्ट के संदर्भ में गोल्ड नैनोस्फेयर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शित की गई । प्रत्येक डेटा बिंदु प्रत्येक कण व्यास के लिए 20 नैनोक्षेत्रों की एक औसत का प्रतिनिधित्व करता है, और डेटा पर कब्जा 10nm FWHM bandpass फिल्टर पर भरोसा. (ख) एक भी सोना nanorod डीआईसी तीव्रता डेटा के रूप में प्रदर्शित, दो अलग polarizer सेटिंग्स (पार ध्रुवीकरण के दोनों तरफ 2 डिग्री) का उपयोग कर । (ग) ६८० एनएम के एलएसपीआर तरंगदैर्ध्य पर एक स्वर्ण नैनोरोड के लिए डीआईसी तीव्रता डेटा, जबकि यह १८० ° घुमाया गया और पोलेरिज़र को क्रॉस किए गए ध्रुवीकरण की स्थिति से 2 ° पर रखा गया । चित्रा 7A सूर्य एट अल, विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञानसे अनुमति के साथ अनुकूलित है । ८१ (22), 9203-9208 (२००९), और चित्रा 7B, सी से Stender एट अल., विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान। ८४ (12), 5210-5215 (२०१२) । कॉपीराइट अमेरिकन केमिकल सोसायटी । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

जब डीआईसी माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग, यह डेटा एकत्र करने से पहले ऑप्टिकल घटकों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां तक कि एक प्रयोग के बीच में polarizer करने के लिए मामूली समायोजन अंतिम डेटा6करने के लिए महत्वपूर्ण प्रभावों में परिणाम कर सकते हैं । इसके अलावा, विभिन्न सामग्रियों अलग polarizer सेटिंग्स की आवश्यकता है । हालांकि बड़े कदम आकार यहां का उपयोग किया गया ध्रुवीकरण कोण के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, एक वास्तविक प्रयोग में, यह 1 के भीतर polarizer सेटिंग ऑप्टिमाइज़ करने के लिए आवश्यक है ° – 2 इष्टतम विपरीत सेटिंग के ° । Polarizer सेटिंग भी भविष्य में संदर्भ के लिए दर्ज किया जाना चाहिए । यह भी हमेशा पार polarizer (0 °) बिंदु के एक ही पक्ष पर काम करने के लिए सिफारिश की है । वापस और पीछे स्विचन कोई लाभ प्रदान नहीं करता है, लेकिन यह भ्रम की ओर ले जा सकते हैं, छाया पैटर्न में एक उलट के कारण.

महत्व में अगले, यह जब स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन करने की योजना बना पृष्ठभूमि तीव्रता की निगरानी करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह सबसे अच्छा कैमरा जोखिम समय का समायोजन करके, या प्रकाश पथ के लिए तटस्थ घनत्व फिल्टर जोड़कर पूरा किया है । पंचर या लैंप तीव्रता कोलर रोशनी को प्रभावित कर सकते है और इसके विपरीत मूल्यों में परिवर्तन समायोजित । पृष्ठभूमि भी नमूना भर में अपेक्षाकृत होने की जरूरत है, ताकि एक पृष्ठभूमि क्षेत्र का चयन विपरीत गणना में परिवर्तन नहीं करता है । नमूना नमूने जो एक स्वच्छ पृष्ठभूमि स्थान के निकट नहीं हैं, उनसे बचा जाना चाहिए । इसके अलावा, पृष्ठभूमि तीव्रता शुरू में बहुत अधिक या बहुत कम सेट नहीं किया जा सकता है । यदि पृष्ठभूमि तीव्रता बहुत अधिक सेट है, वहां एक बढ़ा जोखिम है कि कुछ संकेतों कैमरे की अधिकतम सीमा से अधिक हो जाएगा, यह असंभव उन क्षेत्रों में इसके विपरीत की गणना करने के लिए बना । पृष्ठभूमि तीव्रता बहुत कम सेट है, तो यह डीआईसी संकेत और पृष्ठभूमि संकेत के अंधेरे घटक के बीच अच्छा विपरीत प्राप्त करने के लिए बेहद मुश्किल हो जाएगा । एक नमूना के ठेठ या उंमीद व्यवहार को समझना उचित पृष्ठभूमि तीव्रता के चयन में सहायता कर सकते हैं ।

उचित फोकल प्लेन ढूंढना भी जरूरी है । Nomarski है डीआईसी लाभ में से एक यह है कि यह क्षेत्र के एक उथले गहराई है । हालांकि, यह इसे और अधिक चुनौतीपूर्ण नैनोकणों जैसे पतले नमूनों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए बनाता है । मोटा नमूनों के साथ, चुनौती सबसे बड़ा ब्याज की वास्तविक फोकल विमान खोजने में है । कई फोकल विमानों दिलचस्प हो सकता है और उन पर नैनोकणों है, तो यह सबसे बड़ी ब्याज की नैनोकणों पर जल्दी निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

नैनोकणों के मामले में, यह microscopist के लिए महत्वपूर्ण है पहचान है कि वे एक हवादार डिस्क या वस्तु2के "बिंदु प्रसार समारोह" देख रहे हैं । सामान्य तौर पर, हवादार डिस्क का निर्धारण करने में उपयोगी है कि क्या एक plasmonic नैनोकणों एक आकार है कि समदैशिक या anisotropic है, लेकिन नैनोकणों इमेजिंग वास्तव में क्या यहाँ चर्चा की तुलना में बहुत अधिक जटिल है. जटिल नैनोकणों समुच्चय कभी-कभार आइसोट्रोपिक कणों के समान हो सकता है, और परिणामस्वरूप, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि तो नैनोकणों पैटर्न की विशेषता के लिए आवश्यक हैं2,16,18, 19. एक डीआईसी माइक्रोस्कोप के साथ छवि plasmonic नैनोकणों के लिए, यह फ़िल्टर्ड इमेजिंग का उपयोग करने के लिए और उनके उच्च अवशोषित plasmonic तरंग दैर्ध्य में से एक पर कणों छवि के लिए महत्वपूर्ण है6. एक अनुचित तरंगदैर्ध्य या फिल्टर के बिना पर इमेजिंग छाया-कास्ट पैटर्न है कि समझने के लिए मुश्किल है की कैद में परिणाम कर सकते हैं ।

जब इमेजिंग नैनोकणों की वस्तुओं के साथ प्रकाश की विवर्तन सीमा से बड़ी होती हैं, तो यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि सूक्ष्मदर्शी का उद्देश्य "एक अपेक्षाकृत सपाट फोकल प्लेन" देखता है । डीआईसी के एक आम गलतफहमी है कि यह वास्तविक 3 डी राहत में एक वस्तु के देखने में सक्षम बनाता है । यह छाया-कास्ट patterning के कारण होता है, जो वास्तव में बनाता है कई वस्तुओं के लिए तीन आयामी होना दिखाई देते हैं । हालांकि, एकाधिक फोकल विमानों पर ऊर्ध्वाधर जानकारी इकट्ठा करने के लिए, यह मंच को बढ़ाने या कम और छवियों का एक दृश्य इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हो जाएगा । यह बहुत प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है और व्याख्या करने के लिए, विशेष रूप से मोटा नमूनों के लिए, इस तरह के कोशिकाओं के रूप में. इस प्रकार, microscopist सभी शामिल सामग्री की गहरी समझ की जरूरत है जब इस तरह के प्रयोगों प्रदर्शन और व्यक्तिगत फोकल विमानों कि उपयोग किया गया की स्थिति रिकॉर्ड करना चाहिए ।

अंतत:, डेटा विश्लेषण चरण डेटा संग्रह के रूप में महत्वपूर्ण है । जब नमूने के विपरीत या तीव्रता मूल्यों को मापने, कई कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए । आमतौर पर, विश्लेषक मुख्य रूप से ब्याज के कण के लिए ंयूनतम और अधिकतम मूल्यों में दिलचस्पी है । जब नमूने के लिए शोर अनुपात के विपरीत पर्याप्त उच्च है, और पृष्ठभूमि क्षेत्र साफ है और समान रूप से प्रबुद्ध है, तो एक सरल ज्यामितीय आकार संकेत की चिंता के बिना नमूना क्षेत्र के चारों ओर खींचा जा सकता है contaminants द्वारा शुरू की जा रही है । इसके अलावा, अगर पृष्ठभूमि साफ है और समान रूप से प्रबुद्ध, एक पृष्ठभूमि माप किसी भी क्षेत्र में बनाया जा सकता है तुरंत नमूना के निकट । हालांकि, अगर वहां contaminants है या यदि पृष्ठभूमि असमान है, तो विश्लेषक है नमूना माहौल का एक महत्वपूर्ण समीक्षा करना चाहिए, और विश्लेषक का आकलन है कि क्या यह भी एक उचित पृष्ठभूमि माप करना संभव है की जरूरत है । यह भी एक ही आकार और आकार उपकरण के साथ नमूना और पृष्ठभूमि क्षेत्रों को मापने के क्रम में करने के लिए गणना में पूर्वाग्रह की शुरूआत से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । सामांय में, छोटे आकार के माप क्षेत्रों outliers का पता लगाने की एक कम संभावना है (जैसे, contaminants, बुरा पिक्सल, आदि) लेकिन बड़ा नमूना क्षेत्रों अक्सर पृष्ठभूमि मतलब मूल्य का एक और अधिक विश्वसनीय माप प्रदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

डॉ एंथोनी एस Stender ओहियो विश्वविद्यालय में Nanoscale और क्वांटम घटनाएं संस्थान (NQPI) के माध्यम से तकनीकी सहायता स्वीकार करना चाहता है । इस अनुच्छेद के माध्यम से संभव किया गया था शुरू करने के लिए प्रदान की फंडिंग डॉ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Contrad 70 Decon Labs, Inc. 1002 For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol Fisher Scientific A962-4 For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips Ted Pella 260148
Glass microscope slides Ted Pella 26007
Gold nanorods Nanopartz DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm) Sigma Aldrich 742023-25ML
ImageJ NIH N/A Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish Electron Microscopy Sciences 72180
Nikon Ti-E microscope Nikon N/A
Nitrogen gas Airgas N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera Hamamatsu 77054098
Scribing pen Amazon N/A Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water 18 megaohm

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References

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रसायन विज्ञान मुद्दा १४८ स्थानीयकृत सतह plasmon अनुनाद एकल कण स्पेक्ट्रोस्कोपी ध्रुवीकरण डीआईसी तरंग दैर्ध्य nanoscale Nomarski
संचरण आधारित Nomarski-प्रकार विभेदक हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट Microscopy के साथ Plasmonic नैनोकणों पर प्रदर्शन स्पेक्ट्रोस्कोपी
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Stender, A. S. Performing… More

Stender, A. S. Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59411, doi:10.3791/59411 (2019).

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