Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dettagliare un approccio collaudato per la preparazione di campioni di nanoparticelle plasmoniche e per l'esecuzione di spettroscopia a singola particella su di essi con microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC).
Abstract
La microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) è un potente strumento di imaging che è più comunemente impiegato per l'imaging di oggetti in Microscala utilizzando la luce a raggio visibile. Lo scopo di questo protocollo è quello di dettagliare un metodo collaudato per la preparazione di campioni plasmonici di nanoparticelle e l'esecuzione di spettroscopia a singola particella su di essi con la microscopia DIC. Per eseguire esperimenti di spettroscopia ripetibile è necessario seguire con attenzione diversi passaggi importanti. In primo luogo, i punti di interesse possono essere incisi nel substrato del campione, che aiuta a localizzare la superficie del campione e a tracciare la regione di interesse durante gli esperimenti. Successivamente, il substrato deve essere adeguatamente pulito di detriti e contaminanti che possono altrimenti ostacolare o oscurare l'esame del campione. Una volta preparato correttamente il campione, il percorso ottico del microscopio deve essere allineato, utilizzando l'illuminazione Kohler. Con un microscopio DIC standard Nomarski, può essere necessaria la rotazione del campione, in particolare quando le nanoparticelle plasmoniche presentano proprietà ottiche dipendenti dall'orientamento. Poiché la microscopia DIC ha due campi di polarizzazione ortogonale intrinseci, il modello di contrasto DIC dipendente dalla lunghezza d'onda rivela l'orientamento delle nanoparticelle plasmoniche a forma di asta. Infine, l'acquisizione dei dati e l'analisi dei dati devono essere accuratamente eseguite. È comune rappresentare i dati della spettroscopia basata su DIC come valore di contrasto, ma è anche possibile presentarlo come dati di intensità. In questa dimostrazione di DIC per la spettroscopia a singola particella, il focus è sulle nanoparticelle d'oro sferiche e a forma di asta.
Introduction
A partire dagli anni ottanta, la microscopia a contrasto differenziale (DIC) è stata ampiamente vista come un importante metodo di imaging riservato agli oggetti in Microscala all'interno delle scienze biologiche. Tuttavia, durante il suo sviluppo negli anni cinquanta e sessanta, era inteso come una tecnica per la scienza dei materiali1. Con i recenti progressi nelle scienze dei materiali legati alle nanoparticelle plasmoniche, si è tenuto un maggiore interesse per la caratterizzazione dei materiali con microscopia ottica.
Molte tecniche ottiche sono certamente disponibili per la caratterizzazione dei nanomateriali (ad esempio, campo scuro, campo chiaro, luce polarizzata, fluorescenza, ecc.). Campo oscuro è ampiamente popolare nella ricerca di nanoparticelle, ma si basa esclusivamente sulla raccolta di dispersione e fornisce informazioni limitate su campioni complessi2. La fluorescenza può essere utile, ma solo con campioni che si illuminalizzano o che possono essere adeguatamente macchiati. La microscopia DIC ha diversi tratti che lo rendono uno strumento prezioso per l'analisi delle nanoparticelle. I vantaggi più frequentemente dichiarati di DIC rispetto ad altri metodi e per quanto riguarda le nanoparticelle plasmoniche sono: nessuna colorazione del campione richiesta, nessun effetto alone, profondità di campo superficiale e alta risoluzione laterale3. DIC ha ulteriori punti di forza che sono preziosi per la ricerca di nanoparticelle plasmoniche. Prima di tutto, sono presenti due campi di polarizzazione intrinseci e ortogonali, che possono essere misurati simultaneamente per scopi di spettroscopia2. In secondo luogo, il segnale depolarizzato delle nanoparticelle non viene catturato nell'immagine finale2, che può essere una causa di grave preoccupazione nelle misurazioni della spettroscopia di campo scuro.
Lo scopo di questo articolo è quello di fornire una chiara metodologia per l'utilizzo della luce trasmessa Nomarski DIC microscopia per eseguire la spettroscopia sulle nanoparticelle plasmoniche. Anche se DIC è una tecnica potente che può essere applicata a materiali altamente diversificati, è anche una tecnica che richiede grande abilità e comprensione per operare correttamente durante l'imaging di nanoparticelle. La microscopia di Nomarski DIC basata sulla trasmissione ha un percorso luminoso complesso1 che verrà esaminato solo brevemente qui. Il treno ottico di DIC viene visualizzato in Figura 1. La luce viene trasmessa attraverso il microscopio prima di essere passata attraverso un polarizzatore e un prisma Nomarski che divide il fascio prima di essere concentrato dal condensatore sul piano del campione. Dopo aver attraversato l'obiettivo, la luce incontra una trave-combinando Prisma Nomarski e un analizzatore prima di uscire al rivelatore. I due polarizzatori e i prismi Nomarski sono fondamentali per la formazione dell'immagine DIC e sono responsabili della produzione dei due campi di polarizzazione ortogonale di DIC1. Per il lettore interessato a conoscere meglio i principi di lavoro e il percorso ottico dei microscopi DIC Nomarski, o le differenze tra Nomarski DIC e altri stili di DIC, si prega di fare riferimento ad altri conti ben scritti su questi argomenti1, 4 , 5 il , 6 il , 7. il
È altrettanto importante comprendere la natura di base delle nanoparticelle plasmoniche prima di tentare di eseguire la spettroscopia su di essi, che si tratti di Nomarski DIC, campo scuro o qualsiasi altra tecnica di microscopia. Nel campo della plasmonica, le nanoparticelle sono definite come particolati con dimensioni sulla scala di 10-100 Nm8,9. Le nanoparticelle possono assumere molte forme (ad esempio sfere, aste, stelle, manubri, ecc.), e la maggior parte delle loro proprietà importanti derivano da interazioni con la luce nella gamma infrarossa-visibile-vicino infrarosso dello spettro elettromagnetico. Il termine "plasmonico" non è limitato alle nanoparticelle10; Tuttavia, quando si discute di nanoparticelle, viene utilizzato in riferimento alla risonanza plasmonica superficiale localizzata (LSPR). LSPR è un fenomeno in cui gli elettroni di conduzione in una nanoparticelle oscillano a causa di un'interazione Coulombica con radiazioni elettromagnetiche di una banda di frequenza molto specifica e relativamente ristretta8. A queste stesse frequenze, le nanoparticelle plasmoniche mostrano un aumento dell'assorbimento e della dispersione della luce, rendendole osservabili con la microscopia ottica. In molti casi, è preferibile osservare le nanoparticelle mentre si posizionano filtri passa-banda prima del condensatore2, per migliorare il contrasto dell'imaging e per eliminare la luce che non riesce a indurre l'effetto LSPR. L'utilizzo dei filtri consente inoltre di eseguire esperimenti di spettroscopia a singola particella.
Il comportamento ottico correlato a LSPR dipende fortemente dalle dimensioni e dalla forma delle nanoparticelle e può essere studiato con molte tecniche di microscopia ottica. Tuttavia, al fine di decifrare le informazioni di orientamento delle nanoparticelle plasmoniche con una forma anisotropa (cioè non sferica), è necessario utilizzare la polarizzazione del campo luminoso. Ruotando con cautela il campo di polarizzazione o il substrato campione a piccoli incrementi, è possibile monitorare le proprietà spettroscopiche dipendenti dall'orientamento delle singole nanoparticelle. La rotazione e la polarizzazione possono anche aiutare a determinare se una funzione spettrale è dovuta ad un'oscillazione dipolare o superiore dell'ordine degli elettroni superficiali delle nanoparticelle. Tuttavia, nel caso delle nanoparticelle isotrope (cioè sferiche), il profilo spettrale rimane sostanzialmente invariato al momento della rotazione del campione sotto luce polarizzata.
Quando viene visualizzato attraverso un microscopio DIC (Figura 2), le nanoparticelle hanno un disco arioso con un aspetto bianco e nero in ombra su uno sfondo grigio. Le nanoparticelle sferiche manterranno questo aspetto in rotazione e con il cambio di filtri passa-banda; Tuttavia, le particelle svaniranno gradualmente dalla vista poiché la lunghezza d'onda centrale del filtro diventa ulteriormente separata dall'unica lunghezza d'onda dipolare LSPR della sfera11. La comparsa di nanorodi può cambiare abbastanza drammaticamente come sono ruotati2. I nanorodi hanno due bande LSPR con comportamento dipolare, la cui posizione si basa sulle dimensioni fisiche dei nanorodi. Quando l'asse longitudinale di un aggregato nanorod è orientato parallelamente a uno dei campi di polarizzazione DIC, il disco arioso apparirà tutto bianco o tutto nero se visualizzato con un filtro passa-banda associato a quella lunghezza d'onda LSPR. Dopo aver ruotate il campione 90 °, si avrà il colore opposto. In alternativa, poiché l'asse trasversale di un nanorodo è perpendicolare all'asse longitudinale, l'asta assumerà il colore opposto quando si passa da un filtro che corrisponde alle lunghezze d'onda LSPR per i due assi. In altri orientamenti e impostazioni del filtro, i nanorodi appariranno più come sfere, presentando una varietà di modelli di dischi ariosi in fusione di ombre. Per i nanorodi con un asse trasversale < 25 Nm, può essere difficile rilevare il segnale a quella lunghezza d'onda di LSPR utilizzando la microscopia DIC.
Per eseguire la spettroscopia a singola particella, è importante utilizzare i componenti ottici corretti e allinearli correttamente. Deve essere utilizzato un obiettivo in grado di microscopia DIC. Per esperimenti di particelle singole, gli obiettivi di 80x o 100x Oil sono ideali. I prismi di Nomarski DIC sono normalmente disponibili in tre varietà: standard, ad alto contrasto e ad alta risoluzione. Il tipo ideale dipende fortemente dallo scopo dell'esperimento e dalle dimensioni delle nanoparticelle. I prismi standard vanno bene per molti esperimenti; ma quando si lavora con nanoparticelle più piccole (< 50 Nm), i prismi ad alto contrasto possono essere utili, poiché il contrasto delle particelle diminuisce con la diminuzione delle particelle nella dimensione11. Regolando il contrasto DIC si ottiene ruotando un polarizzatore o traducendo uno dei prismi DIC, a seconda della marca del microscopio o del modello6.
Dopo aver impostato l'illuminazione Kohler e le impostazioni del polarizzatore, è fondamentale non regolare queste impostazioni durante la raccolta dei dati della spettroscopia. Inoltre, un segnale di fondo medio costante deve essere mantenuto in ogni momento durante la raccolta dei dati, anche quando si passa tra i filtri e le impostazioni angolari. L'effettivo valore di sfondo ideale dipende dalla gamma dinamica della fotocamera scientifica, ma in generale, lo sfondo dovrebbe essere nell'intervallo di 15% – 40% del livello di rilevamento massimo della fotocamera. Ciò riduce la probabilità di saturare il sensore della fotocamera, consentendo al contempo un contrasto ottimale delle particelle. Per la raccolta dei dati della spettroscopia, è necessario lavorare con una fotocamera scientifica che cattura le immagini in bianco e nero, a differenza di una fotocamera a colori.
La preparazione dei campioni è un altro aspetto critico dell'imaging delle nanoparticelle plasmoniche. È imperativo che gli operatori della microscopia DIC abbiano una comprensione delle proprietà ottiche del campione e del substrato del campione. Il vetro per microscopio "pre-pulito" non è sufficientemente preparato per l'imaging delle nanoparticelle e deve essere adeguatamente ripulito prima della deposizione del campione per garantire un'osservazione senza ostacoli del campione. Molti protocolli di pulizia per le diapositive del microscopio sono stati documentati in precedenza12, ma non è un passo che viene normalmente riportato negli studi sperimentali.
Infine, i metodi di analisi dei dati sono il componente finale della spettroscopia a singola particella. Devono essere misurate le intensità massime e minime per ogni nanoparticelle, nonché la media locale di base. Le particelle di interesse devono trovarsi in aree senza detriti di fondo, difetti del substrato o illuminazione irregolare. Un metodo per determinare il profilo spettrale di un nanoparticelle è calcolando il contrasto delle particelle ad ogni lunghezza d'onda, usando l'equazione sotto11,13,14,15:
In alternativa, lo spettro di una singola particella può essere suddiviso nei suoi singoli componenti di segnale massimo e minimo, che rappresentano i due campi di polarizzazione di DIC, mostrando così i due spettri direttivamente dipendenti raccolti simultaneamente, attraverso le due equazioni:
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Protocol
1. preparazione del campione con vetrini di microscopia in vetro standard
- Preparare vetrini per microscopio in vetro per la deposizione del campione.
Nota: in alcune circostanze, può essere più appropriato conservare il vetro in acqua ultrapura invece di etanolo. Tuttavia, la conservazione in acqua o aria rende il vetro idrofobico nel tempo.- Per risultati ottimali, acquistare vetrini per microscopio in vetro o quarzo e vetro di copertura.
- Utilizzando una penna tracciatura, posizionare un segno di graffio poco profondo e breve sul centro di ogni busta di copertura di vetro.
- Pulire tutto il vetro del microscopio, anche se viene acquistato "pre-pulito", per rimuovere frammenti di vetro, polvere, polvere, residui organici e qualsiasi altro contaminanti che influenzano la qualità dell'immagine o la deposizione del campione.
Nota: questo metodo di pulizia di seguito funziona bene per i tipi di campioni qui descritti ed evita l'uso di prodotti chimici aggressivi. I prodotti chimici harsher possono etch il vetro e richiedono maggiore cura nella manipolazione e nello smaltimento.- Mettere il vetro del microscopio sui rack di stoccaggio e poi in un bicchiere, o in un vaso di colorazione. Non collocare il vetro del microscopio sul fondo di bicchieri e altri vetreria di laboratorio senza svinatura, perché ogni pezzo e superficie del vetro del microscopio deve essere completamente esposto agli agenti di pulizia.
- Versare ~ 1 mL di detergente liquido (tabella dei materiali) nel contenitore e dall'alto il contenitore con acqua. Sonicare per 30 min.
Nota: una volta che il processo di pulizia inizia, maneggiare il vetro solo indossando i guanti, per evitare di lasciare residui di impronte digitali sul vetro. - Versare il contenuto liquido del contenitore di pulizia in un lavello. Sciacquare il recipiente più volte con acqua ultrapura per rimuovere ogni aspetto del detergente. Riempire il contenitore con acqua ultrapura. Sonicare il contenitore con il vetro del microscopio per altri 30 min.
- Ripetere il passaggio precedente almeno una volta di più. Eseguire ulteriori turni di sonicazione in acqua fino a quando è ovvio che tutte le tracce del detergente sono stati rimossi.
- Versare il contenuto del contenitore di pulizia. Sciacquare il contenitore con acqua ultrapura. Riempire il contenitore con etanolo. Vetro per microscopio sonicato per 30 min.
- Versare il contenuto del contenitore di pulizia in un contenitore di rifiuti. Riempire con etanolo. Coprire il contenitore per evitare la perdita di etanolo attraverso l'evaporazione. Conservare il vetro del microscopio in questo contenitore fino al momento dell'esperimento. Le diapositive restano pulite e utilizzabili finché rimangono sommerse in etanolo all'interno di un contenitore coperto.
-
Preparazione della soluzione di nanoparticelle
- Utilizzando una micropipetta, rimuovere un'aliquota di 100 μL di soluzione di nanoparticelle d'oro di 0,05 mg/mL dal suo contenitore di stoccaggio originale ed espellere la soluzione in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare il campione per 10 minuti a 6.000 x g.
- Rimuovere il supernatante con una micropipetta, al fine di rimuovere il tensioattivo in eccesso.
- Utilizzando una micropipetta, inserire 100 μL di acqua ultrapura nel tubo della centrifuga.
Nota: se non tutto il supernatante può essere rimosso al primo tentativo, ripetere le fasi di centrifugazione e risospensione. - Agitare brevemente il campione per risospendere il pellet. Sonicare immediatamente dopo 20 minuti per risospendere completamente e rompere gli aggregati di nanoparticelle.
Nota: se il campione non viene utilizzato immediatamente, deve essere sonicato nuovamente per 20 minuti prima della soluzione di deposito sul vetro del microscopio.
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Deposizione di campioni
- Rimuovere i fogli di copertura puliti e le diapositive del microscopio dai loro contenitori di stoccaggio. Asciugare il vetro con azoto pressurizzato o argon.
- Utilizzando una micropipetta, rilasciare 6 μL di soluzione di nanoparticelle dal punto 1.2.5 sulla busta di copertura. Per stendere la gocciolina in modo uniforme, posizionare con cura un secondo pezzo di vetro del microscopio più grande sulla parte superiore dello slip di copertura, come un secondo Slip di copertura o uno scivolo per microscopio. Evitare di ottenere bolle d'aria intrappolate tra i due pezzi di vetro.
- Capovolgere il substrato del campione e sigillare i bordi dello slip di copertura con una linea stretta di smalto per evitare l'evaporazione della soluzione media.
- In alternativa, per l'immagine del campione "asciutto", lasciare riposare la soluzione per 5 – 15 minuti sul coperchio, prima di rimuovere il pezzo di vetro indesiderato. Soffiare delicatamente il coperchio scivolare asciutto con azoto pressurizzato o argon.
- Se possibile, campioni di immagine subito dopo la preparazione. Se ciò non è possibile, conservare i campioni in un contenitore coperto, come una capsula di Petri fino all'imaging.
2. Imaging DIC
- Allineare obiettivo e condensatore.
- Dopo aver posizionato il campione sul microscopio, trovare il piano focale con il campione su di esso. Prima individuare e concentrarsi sul marchio Scratch creato in precedenza. Quindi sintonizzare la messa a fuoco fino a quando le nanoparticelle entrano in vista.
- Per determinare il posizionamento accurato del condensatore, utilizzare il metodo di illuminazione Kohler. 5 l'illuminazione Kohler ad alto ingrandimento (80x, 100x) si ottiene più facilmente impostando prima l'illuminazione Kohler a un ingrandimento inferiore, ad esempio 20x.
Nota: in genere, l'illuminazione Kohler non deve essere regolata nuovamente durante l'imaging di un singolo campione. Tuttavia, è buona norma verificare che l'illuminazione Kohler sia impostata correttamente quando si passa a un nuovo vetrino per microscopio.
- Ottimizza le impostazioni di contrasto.
- Selezionare un'area di interesse all'interno del campione per l'imaging. Centrare la regione nel campo visivo della telecamera e regolare la messa a fuoco se necessario.
- Se il microscopio ha il design de Senarmont, iniziare con il polarizzatore impostato vicino alla massima estinzione dello sfondo e ruotare gradualmente il polarizzatore verso la diminuzione dello sfondo estinzione. L'intensità di sfondo aumenterà gradualmente.
- Se il microscopio non ha un design de Senarmont, iniziare con il treno ottico impostato al massimo sfondo estinzione. In questo caso, regolare gradualmente la posizione del prisma obiettivo verso la diminuzione dello sfondo estinzione.
Nota: l'impostazione ideale si ottiene quando le nanoparticelle raggiungono la loro più grande differenza di intensità (cioè il contrasto) dal valore di sfondo locale medio. Per le nanoparticelle plasmoniche, il contrasto ottimale è normalmente raggiunto con uno sfondo relativamente scuro, quindi a impostazioni vicino all'estinzione massima dello sfondo.
- Selezionare un'area di interesse all'interno del campione per l'imaging. Centrare la regione nel campo visivo della telecamera e regolare la messa a fuoco se necessario.
- Immagine del campione.
- Disattiva l'illuminazione dell'ambiente per evitare che l'illuminazione diffusa interagisca con il processo.
- Durante la visualizzazione delle nanoparticelle con una telecamera di imaging scientifica, determinare il livello di sfondo ottimale. Utilizzando un filtro passa-banda di 10 Nm a larghezza intera a metà massimo (FWHM) con la sua lunghezza d'onda centrale co-posizionata con la lunghezza di onda principale LSPR, visualizzare la regione di interesse. Regolare l'intensità della lampada o il tempo di esposizione fino a quando il livello di sfondo è compreso tra il 15% e il 40% del livello di capacità massima della fotocamera e nessun oggetto all'interno della regione interessata Mostra intensità del segnale che superano il 90% del livello di intensità massima della fotocamera.
Nota: l'obiettivo del passo 2.3.2 è quello di evitare di saturare il sensore quando si passa da un filtro all'altro. Il livello di sfondo ideale varierà tra campioni e fotocamere. Una volta completato questo passaggio, il tempo di esposizione può essere regolato ma non l'intensità della lampada. - Immagine del campione con una serie di filtri passa-banda che ognuno ha un FWHM di 10 Nm e che nel suo complesso consentono l'imaging attraverso l'intera gamma di lunghezze d'onda di interesse. Assicurarsi che l'intensità di sfondo rimanga coerente dall'immagine all'immagine (entro ~ 5% l'uno dall'altro) regolando il tempo di esposizione. Dopo aver commutato i filtri, rifocalizzare il campione prima dell'acquisizione dell'immagine.
- Salvare le immagini come file TIFF non compressi e/o nel formato di file nativo del software, al fine di preservare tutte le informazioni.
- Ruotare il campione.
- Dopo aver raccolto le immagini del campione nella sua posizione originale, il campione può ora essere ruotato e immaturato in orientamenti aggiuntivi nel percorso di luce. Eseguire la rotazione a intervalli regolari (ad esempio, 10 ° o 15 °) su un intervallo di 180 ° o 360 °.
Nota: la rotazione richiede una fase di campionamento ruotabile. - Come nelle sezioni 2.1-2.3, regolare le impostazioni della fotocamera per fornire un livello di sfondo coerente da un'immagine all'immagine.
Nota: non è necessario effettuare alcuna regolazione all'illuminazione Kohler.
- Dopo aver raccolto le immagini del campione nella sua posizione originale, il campione può ora essere ruotato e immaturato in orientamenti aggiuntivi nel percorso di luce. Eseguire la rotazione a intervalli regolari (ad esempio, 10 ° o 15 °) su un intervallo di 180 ° o 360 °.
3. analisi dei dati tramite ImageJ
Nota: i seguenti calcoli possono essere eseguiti in una varietà di pacchetti software, e talvolta nel programma nativo utilizzato per raccogliere le immagini. ImageJ è un software liberamente disponibile presso il National Institutes of Health (NIH).
- Calcola il contrasto o l'intensità delle particelle.
- Aprire l'immagine con ImageJ.
- Selezionate lo strumento rettangolo e disegnate un rettangolo attorno all'area principale di interesse.
- Nella barra degli strumenti, selezionare immagine, quindi Zoom, quindi alla selezione. La finestra di imaging ingrandisce l'area selezionata.
- Nella barra degli strumenti, selezionare immagine, quindi regolare, quindi luminosità/contrasto. Viene visualizzata una nuova finestra. Per consentire una migliore visualizzazione dell'area di esempio, regolate le quattro impostazioni: minimo, massimo, luminosità e contrasto. Queste regolazioni non alterano i dati scientifici, ma consentono solo una migliore visibilità dell'area campione.
Nota: i passaggi 3.1.3 e 3.1.4 possono essere eseguiti più volte e in ordine inverso. - Usando di nuovo lo strumento rettangolo, disegna una casella attorno al primo nanoparticelle da misurare. La scatola dovrebbe essere solo leggermente più grande del disco arioso delle nanoparticelle.
- Nella barra degli strumenti, selezionare analizza, quindi misura. Viene visualizzata una nuova finestra che riporta le intensità minima, massima e media per i pixel posizionati all'interno della casella selezionata.
- Trascinare la casella utilizzata per misurare le nanoparticelle in un'area immediatamente adiacente alla particella, dove il contrasto di sfondo è relativamente uniforme e non sono presenti particelle o contaminanti. Conservare le dimensioni originali della scatola.
- Utilizzare lo strumento misura per determinare l'intensità media per l'area di sfondo.
- Misurare le particelle rimanenti e un'area di sfondo adiacente per ciascuno.
- Ripeti il processo per ogni particella in tutte le immagini della serie.
- Esporta i dati in un foglio di calcolo per calcolare il contrasto o l'intensità di ogni particella, attraverso tutte le lunghezze d'onda e gli angoli.
- Calcola il contrasto di ogni particella, usando la seguente equazione13,14,15:
Nota: usando questa equazione, il contrasto delle particelle dovrebbe sempre essere > 0. - Calcola il valore massimo regolato dallo sfondo della particella dividendo l'intensità massima misurata della particella in base alla media:
- Allo stesso modo, calcolare il valore minimo regolato in background dividendo l'intensità minima misurata delle particelle per lo sfondo significa:
Nota: come calcolato, il massimo dovrebbe avere un valore maggiore di uno, mentre il minimo sarà inferiore a uno. È accettabile sottrarre ogni valore di "1", in modo che lo sfondo medio è essenzialmente zero, il massimo è rappresentato come un valore positivo e al valore minimo viene assegnato un valore negativo16. Quest'ultimo approccio consente all'analista di considerare separatamente ciò che si verifica lungo ciascuno dei campi di polarizzazione, che è utile quando si studiano particelle anisotropi. - Per rappresentare graficamente il profilo spettrale in una determinata posizione di nanoparticelle, tracciare i dati con la lunghezza d'onda lungo l'asse x e il contrasto o l'intensità lungo l'asse y.
- Per tracciare graficamente il profilo rotazionale ad una determinata lunghezza d'onda, tracciare l'angolo di rotazione lungo l'asse x e il contrasto o l'intensità lungo l'asse y.
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Representative Results
Quando si lavora con campioni che sono abbastanza grandi da essere osservati ad occhio nudo, non è normalmente necessario collocare punti di contatto sul substrato di vetro. Tuttavia, quando si lavora con nanomateriali o quando è richiesta la rotazione del campione, i punti di interesse possono fornire un metodo semplice per localizzare, distinguere e tracciare l'orientamento del campione. Anche se le tecniche più sofisticate possono essere utilizzate per lasciare punti di interesse sui substrati di vetro17, graffiare il vetro con una penna di incisione è un metodo economico e semplice che funziona in molte situazioni. È importante evitare di esaminare le regioni di esempio immediatamente adiacenti a questi punti di riferimento, dal momento che i graffi creano uno sfondo complesso con il potenziale di influire sui dati (Figura 3). Tuttavia, alle punte dei graffi, "ragnatele" spesso si estendono verso l'esterno dal graffio. Queste linee sono abbastanza preziose come punti di interesse, ma ancora una volta, le nanoparticelle dovrebbero essere evitate se si sovrappongono a questi difetti.
Al fine di ottenere un'immagine ottimale con la microscopia DIC, è di vitale importanza determinare il piano focale corretto. Gli oggetti che sono leggermente fuori fuoco appariranno sfocati, hanno bordi sfocato e hanno un contrasto ridotto. Figura 4 Mostra nanoparticelle d'oro che sono fuori fuoco a vari gradi. Le nanoparticelle nell'angolo in basso a destra sono a fuoco, mentre le nanoparticelle diventano più lontane dalla messa a fuoco mentre si avvicinano all'angolo in alto a sinistra di questa immagine. Poiché DIC ha una profondità di campo bassa, non è raro che alcune nanoparticelle siano a fuoco mentre altre sono fuori fuoco quando le si immaginano su un substrato di vetro. Di conseguenza, è fondamentale concentrarsi costantemente sulle stesse particelle esatte quando si effettua regolazioni al microscopio durante un esperimento.
La Figura 5 fornisce un esempio dell'effetto della regolazione delle impostazioni del polarizzatore durante l'imaging delle nanosfere dorate. Cinque nanoparticelle sono a fuoco, mentre una è leggermente fuori fuoco. Un filtro passa banda 540 Nm con FWHM a 10 Nm era anche nel percorso ottico. In questa serie di immagini, la luminosità dello sfondo è stata regolata con ImageJ dopo l'acquisizione di immagini al fine di rendere le cinque particelle più evidenti sullo sfondo. Quando il polarizzatore è impostato a 0 ° in un microscopio di de Senarmont progettato Nomarski DIC, è ortogonale all'analizzatore (Figura 5a). A 0 °, le particelle appaiono per lo più bianche, con una striscia scura che attraversa la loro sezione intermedia. Questo è indicativo di cross-polarizzazione per campioni di nanosfera. Quando il polarizzatore viene ruotato in diverse angolazioni (Figura 5b-E), le particelle sembrano lanciare ombre scure verso sud-ovest. I componenti in bianco e nero al segnale sorgono come risultato dei due campi di polarizzazione di DIC e forniscono informazioni sull'orientamento delle nanoparticelle plasmoniche quando si lavora con i filtri passa-banda. Poiché il polarizzatore viene ruotato verso angoli più alti, il motivo dell'ombra rimane simile. Tuttavia, i valori di contrasto delle particelle cambiano drasticamente. Questo è meglio dimostrato misurando i valori di contrasto per le singole particelle, utilizzando l'equazione di cui sopra. La particella evidenziata con la scatola nera ha valori di contrasto di 0,65 (polarizzatori incrociati), 0,84 (spostamento polarizzatore di 5 °), 1,10 (10 °), 0,44 (20 °) e 0,23 (45 °). Pertanto, per questo esempio, l'impostazione di imaging ottimale è con uno spostamento polarizzatore di 10 °. Le nanoparticelle plasmoniche spesso richiedono un settaggio polarizzatore nell'intervallo di 5 ° – 15 °, e incrementi più piccoli di questi dovrebbero normalmente essere utilizzati per identificare l'impostazione ideale. Per ulteriori informazioni sull'imaging e l'analisi delle nanoparticelle sferiche d'oro, i lettori sono riferiti al precedente lavoro di Sun et al.11.
Le nanoparticelle a forma anisotropica producono modelli di maggiore complessità rispetto alle nanosfere. I nanorodi dorati sono stati iminvecchiati (Figura 6) alla loro lunghezza d'onda longitudinale LSPR, 650 nm. Nell'immagine iniziale (Figura 6a), sono evidenti cinque nanorodi luminosi e diverse particelle dimmer. Invece di avere un aspetto shadow-cast, tre delle canne hanno predominatamente nero dischi ariosi mentre due sono per lo più bianco. Il polarizzatore è stato impostato a 10 ° a sinistra dell'impostazione di polarizzazione incrociata. Nella Figura 6bè stata utilizzata la polarizzazione incrociata; appaiono solo tre delle particelle, come dischi ariosi completamente bianchi. Gli altri sono scomparsi o sembrano essere leggermente fuori fuoco. Con il polarizzatore impostato a 10 ° a destra della polarizzazione incrociata (Figura 6C), i modelli sono ora invertiti di quanto osservato nella Figura 6a. Il polarizzatore era poi rivolto a 45 ° a destra della polarizzazione incrociata (Figura 6D), l'impostazione massima, per dimostrare che le particelle mantengono i loro colori in questa impostazione, ma il contrasto è diminuito significativamente. Nei restanti pannelli di figura, la raccolta di nanorodi è stata ruotata in modo incrementale di 90 ° in senso orario mentre il polarizzatore è stato impostato a 10 ° a destra della polarizzazione incrociata. Il modello cambia gradualmente per ogni nanorodo, e dopo una rotazione completa di 90 °, le particelle hanno invertito i loro colori dall'impostazione iniziale. In breve, se uno degli assi di un nanorodo plasmonico è allineato con uno dei due campi di polarizzazione, e se il aggregato nanorod è immaturato a tale asse ' lunghezza d'onda LSPR, il aggregato nanorod apparirà per lo più bianco o per lo più nero, a seconda di quale campo di polarizzazione è allineare d con (Figura 6a, C)2. Se la nanoparticelle viene ruotata di un 90 ° pieno (Figura 6h), ora sarà allineato con il campo di polarizzazione opposto e assumere il colore opposto. Se invece il nanoparticelle è stato ruotato solo 45 ° (Figura 6F), allora sarà in una posizione in cui la particella esporrà il suo più grande aspetto ombra-cast, mostrando somiglianza sorprendente a ciò che è osservato con le nanosfere plasmoniche. Come risultato di questo comportamento ottico, le nanoparticelle plasmoniche con una forma anisotropa spesso sembrano piatte invece di avere l'aspetto tridimensionale delle nanosfere. Il risultato di questa differenza nel comportamento ottico è che può essere sfruttato al fine di distinguere tra nanoparticelle plasmoniche che sono di forma sferica e anisotropa, come è stato precedentemente discusso in più studi di ricerca2, 3,6,7,11,13,16.
Infine, Figura 7 Mostra i dati rappresentativi della spettroscopia a singola particella, come contrasto di una nanosfera d'oro (Figura 7a)11, intensità di un singolo nanorodo d'oro con il suo asse longitudinale orientato parallelo a una delle polarizzazioni campi (Figura 7b)6, e profilo di intensità di un singolo nanorodo d'oro alla sua lunghezza d'onda LSPR e durante la rotazione dello stage (Figura 7C)6. Entrambi i metodi di presentazione rivelano la larghezza e la posizione dell'effetto LSPR. Per le nanoparticelle plasmoniche con una forma anisotropa, i dati di intensità e rotazione rivelano la direzionalità dell'effetto, e quindi l'orientamento della particella sul substrato del campione, che è stato precedentemente dimostrato attraverso studi correlativi su tali particelle usando la microscopia elettronica dic e di trasmissione2,16,18.
Figura 1: il percorso luminoso in microscopia dic basata su Nomarski a luce trasmessa. Dopo aver lasciato la sorgente luminosa (S), la luce passa attraverso un polarizzatore (P), un prisma Nomarski (NP), il condensatore (C), il piano focale (FP), l'obiettivo (O), un fascio che unisce il prisma Nomarski (NP), l'analizzatore (A) e infine il rivelatore (D). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: esempi di nanoparticelle plasmoniche iminvecchiate a lunghezze d'onda LSPR con filtri passa-banda da 10 Nm, utilizzando un microscopio dic. Entrambe le immagini sono raccolte a 100x. A) nanosfere d'argento con diametro di 40 Nm, con un livello di 480 Nm con un filtro passa-banda di 10 nm FWHM. B) nanoparticelle d'oro simili a canne imbiancate a 700 nm utilizzando un filtro passa-banda a 10 nm FWHM. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: immagine di un graffio fatto in una copertina di vetro scivolare con una penna di tracciatura. Verso la fine del rientro effettivo, una serie di linee strette e poco profonde "Spider Web" si diramano dal graffio stesso, risultando in un modello che può essere utilizzato come punto di riferimento per l'imaging. Questa immagine è stata raccolta con ingrandimento 100x e luce bianca a banda larga. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: nanosfere d'oro imbiancate con luce bianca a banda larga a 100x. Le particelle in basso a destra sono a fuoco, ma le particelle si allontanano dal piano focale verso l'angolo superiore sinistro. Oggetto al centro dell'immagine è detriti. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5: nanosfere d'oro immagine sotto una serie di diverse impostazioni polarizzatore ad una lunghezza d'onda di 540 nm e un ingrandimento di 100x. La luminosità dello sfondo è stata regolata dopo l'imaging con ImageJ per rendere le particelle più evidenti. Impostazione polarizzatore di (a) 0 ° (polarizzatore ortogonale all'analizzatore), (B) 5 °, (C) 10 ° (il miglior contrasto di questa serie di immagini), (D) 20 °, e (e) 45 °. Il contrasto misurato della particella in scatola nera è (a) 0,65, (B) 0,84, (C) 1,10, (D) 0,44 ed (e) 0,23. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6: esempio di imaging di nanoparticelle plasmoniche anisotropi: nanorodi dorati alla lunghezza d'onda LSPR longitudinale di 650 nm e un ingrandimento di 100x. Le particelle di interesse principale sono racchiuse in scatola gialla. Le impostazioni del polarizzatore sono: (A) sinistra 10 °, (B) 0 °, (C) destra 10 °, (D) destra 45 °. Con il polarizzatore impostato a destra 10 °, lo stage è stato ruotato in senso orario di (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 °, e (H) 90 °. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 7: risultati rappresentativi dei dati della spettroscopia a singola particella. (A) spettroscopia di nanosfera dorata visualizzata in termini di contrasto dic. Ogni punto dati rappresenta una media di 20 nanosfere per ogni diametro di particella e l'acquisizione dei dati si basa sui filtri a banda passante da 10 nm FWHM. (B) un singolo nanorodo d'oro visualizzato come dati di intensità dic, utilizzando due diverse impostazioni polarizzatore (2 ° su entrambi i lati della polarizzazione incrociata). C) dati di intensità dic per un singolo nanorodo d'oro alla lunghezza d'onda LSPR di 680 Nm, mentre è stato ruotato di 180 ° e il polarizzatore si è tenuto a 2 ° dalla posizione di polarizzazione incrociata. La figura 7A è adattata con il permesso di Sun et al., chimica analitica. 81 (22), 9203-9208 (2009), e figura 7B, C di Stender et al., chimica analitica. 84 (12), 5210-5215 (2012). Copyright American Chemical Society. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Quando si imaging con la microscopia DIC, è fondamentale ottimizzare i componenti ottici prima di raccogliere i dati. Anche piccole regolazioni al polarizzatore nel mezzo di un esperimento possono comportare impatti significativi sui dati finali6. Inoltre, diversi materiali richiedono diverse impostazioni polarizzatore. Anche se le grandi dimensioni dei gradini sono state utilizzate qui per dimostrare l'effetto dell'angolo di polarizzazione, in un esperimento reale, è imperativo ottimizzare l'impostazione del polarizzatore entro 1 °-2 ° dell'impostazione di contrasto ottimale. L'impostazione del polarizzatore deve essere registrata anche per riferimento futuro. Si raccomanda inoltre di lavorare sempre sullo stesso lato del punto polarizzatore incrociato (0 °). Il passaggio avanti e indietro non fornisce alcun vantaggio, ma può portare a confusione, a causa di un'inversione nel modello di ombra.
Successivamente, è fondamentale monitorare l'intensità di sfondo quando si pianifica di eseguire la spettroscopia. Questo è meglio realizzato regolando il tempo di esposizione della fotocamera, o aggiungendo filtri di densità neutra al percorso di luce. La regolazione di aperture o intensità della lampada può influire sull'illuminazione Kohler e alterare i valori di contrasto. Lo sfondo deve essere relativamente anche attraverso l'esempio, in modo che la selezione di un'area di sfondo non alteri il calcolo del contrasto. I campioni di campioni che non sono adiacenti a uno spazio di sfondo pulito devono essere evitati. Inoltre, l'intensità di fondo non può essere inizialmente impostata troppo alta o troppo bassa. Se l'intensità di sfondo è troppo alta, c'è un rischio maggiore che alcuni segnali superino la portata massima della telecamera, rendendo impossibile il calcolo del contrasto in quelle regioni. Se l'intensità di sfondo è impostata troppo bassa, sarà estremamente difficile ottenere un buon contrasto tra la componente scura del segnale DIC e il segnale di fondo. Comprendere il comportamento tipico o previsto di un campione può aiutare a selezionare l'intensità di sfondo corretta.
Trovare il giusto piano focale è anche essenziale. Uno dei vantaggi di Nomarski DIC è che ha una profondità di campo poco profonda. Tuttavia, questo rende più impegnativo concentrarsi su campioni sottili, come le nanoparticelle. Con campioni più spessi, la sfida è trovare il piano focale effettivo di maggiore interesse. Molti piani focali possono essere interessanti e avere nanoparticelle su di loro, quindi è importante determinare presto le nanoparticelle di maggiore interesse.
Nel caso delle nanoparticelle, è importante che il microscopista riconosca che sta visualizzando un disco arioso o "funzione di diffusione del punto" dell'oggetto2. In generale, il disco arioso è utile per determinare se un nanoparticelle plasmonico ha una forma isotropica o anisotropa, ma l'imaging delle nanoparticelle è in realtà molto più complesso di quello che viene discusso in questo articolo. Aggregazioni di nanoparticelle complesse a volte possono assomigliare a particelle isotropiche, e di conseguenza, i metodi di microscopia elettronica sono quindi necessari per caratterizzare i modelli di nanoparticelle2,16,18, 19. per l'immagine di nanoparticelle plasmoniche con un microscopio dic, è fondamentale utilizzare immagini filtrate e per l'immagine delle particelle in una delle loro lunghezze d'onda plasmoniche altamente assorbenti6. L'imaging a una lunghezza d'onda non corretta o senza filtri può comportare la cattura di modelli di fusione Shadow che sono difficili da decifrare.
Quando si immaginano nanoparticelle insieme a oggetti più grandi del limite di diffrazione della luce, è importante ricordare che l'obiettivo del microscopio "vede" un piano focale relativamente piatto. Un equivoco comune di DIC è che consente la visualizzazione di un oggetto in rilievo 3D reale. Ciò è causato dal patterning shadow-cast, che fa sì che molti oggetti sembrano essere tridimensionali. Tuttavia, per raccogliere informazioni verticali su più piani focali, sarebbe necessario alzare o abbassare lo stage e raccogliere una sequenza di immagini. Questo può essere molto difficile da eseguire e da interpretare, soprattutto per i campioni più spessi, come le cellule. Così, il microscopista ha bisogno di una profonda comprensione di tutti i materiali coinvolti durante l'esecuzione di tali esperimenti e deve registrare le posizioni dei singoli piani focali che sono stati utilizzati.
Infine, il passaggio di analisi dei dati è critico come la raccolta dei dati. Quando si misurano i valori di contrasto o intensità del campione, si devono tenere presenti diversi fattori. In genere, l'analista è principalmente interessato ai valori minimo e massimo per la particella di interesse. Quando il rapporto contrasto/rumore per il campione è sufficientemente elevato e se l'area di sfondo è pulita e uniformemente illuminata, è possibile disegnare una semplice forma geometrica intorno alla regione del campione senza preoccuparsi del segnale introdotto dai contaminanti. Inoltre, se lo sfondo è pulito e uniformemente illuminato, una misura di sfondo può essere fatta in qualsiasi area immediatamente adiacente al campione. Tuttavia, se ci sono contaminanti o se lo sfondo è irregolare, l'analista deve fare una revisione critica dei dintorni del campione, e l'analista deve valutare se è anche possibile effettuare una misura di fondo ragionevole. È inoltre fondamentale misurare le aree campione e sfondo con lo stesso strumento di dimensioni e forma, al fine di evitare l'introduzione di pregiudizi nel calcolo. In generale, le aree di misura di dimensioni ridotte hanno una probabilità inferiore di rilevare i valori anomali (ad esempio, contaminanti, pixel danneggiati, ecc.), ma le aree di campionamento più grandi spesso forniscono una misurazione più affidabile del valore medio dello sfondo.
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Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
Dr. Anthony S. Stender desidera riconoscere il supporto tecnico attraverso il nanoscale e Quantum fenomeni Institute (NQPI) presso l'Università di Ohio. Questo articolo è stato reso possibile attraverso il finanziamento di Start-up fornito al Dr. Stender dall'Ohio University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Contrad 70 | Decon Labs, Inc. | 1002 | For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers |
| Ethanol | Fisher Scientific | A962-4 | For cleaning and storing microscope glass |
| Glass microscope cover slips | Ted Pella | 260148 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26007 | |
| Gold nanorods | Nanopartz | DIAM-SPR-25-650 | |
| Gold nanospheres (80 nm) | Sigma Aldrich | 742023-25ML | |
| ImageJ | NIH | N/A | Free Software availabe for data analysis from NIJ |
| Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | N/A | |
| Nitrogen gas | Airgas | N/A | |
| ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera | Hamamatsu | 77054098 | |
| Scribing pen | Amazon | N/A | Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version. |
| Ultrapure water | 18 megaohm |
References
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