Udfører spektroskopi på Plasmonic nanopartikler med transmission-baseret Nomarski-type differential interferens kontrast mikroskopi

Summary

Formålet med denne protokol er at gøre detaljeret rede for en dokumenteret tilgang til fremstilling af plasmidiske nanopartikler og for at udføre enkelt partikel spektroskopi på dem med differentiale interferens kontrast (DIC) mikroskopi.

Abstract

Differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi er et kraftfuldt billedbehandlings værktøj, der er mest almindeligt anvendt til billedbehandlings mikroskop objekter ved hjælp af synligt lys. Formålet med denne protokol er at gøre detaljeret rede for en gennemprøvet metode til fremstilling af plasmidiske nanopartikler og udføre enkelt partikel spektroskopi på dem med DIC-mikroskopi. Flere vigtige trin skal følges nøje for at udføre gentagelig spektroskopi eksperimenter. For det første kan landmærker ætses ind i prøve substratet, som hjælper med at lokalisere prøveoverfladen og i at spore området af interesse under eksperimenter. Dernæst skal substratet renses ordentligt for snavs og kontaminanter, som på anden måde kan hæmme eller sløre undersøgelsen af prøven. Når en prøve er korrekt forberedt, skal den optiske vej af mikroskopet justeres ved hjælp af Kohler belysning. Med en standard Nomarski stil DIC mikroskop, kan rotation af prøven være nødvendig, især når de plasmonic nanopartikler udviser orienterings afhængige optiske egenskaber. Fordi DIC mikroskopi har to iboende ortogononale polariserings felter, afslører bølge-afhængig DIC kontrast mønster orienteringen af stang formede plasmaale nanopartikler. Endelig skal dataindsamling og dataanalyser udføres omhyggeligt. Det er almindeligt at repræsentere DIC-baserede spektroskopi-data som en kontrast værdi, men det er også muligt at præsentere den som intensitets data. I denne demonstration af DIC for enkelt partikel spektroskopi, er fokus på sfæriske og stang formede guld nanopartikler.

Introduction

Siden 1980 ' erne er differentialinterferens kontrast (DIC) mikroskopi i vid udstrækning blevet betragtet som en vigtig billedbehandlings metode, der er forbeholdt mikroskaleringsobjekter inden for de biologiske videnskaber. Men i løbet af sin udvikling i 1950 ' erne og 1960 ' erne, var det tænkt som en teknik for materialevidenskab¹. Med de seneste fremskridt i de materielle videnskaber i forbindelse med plasmonic nanopartikler, en øget interesse i karakterisering af materialer med optisk mikroskopi har fundet sted.

Mange optiske teknikker er helt sikkert til rådighed for nanomateriale karakterisering (f. eks mørke felt, brightfield, polariseret lys, fluorescens, etc.). Mørkt felt er meget populært i nanopartikel forskning, men det er udelukkende baseret på indsamling af scatter og giver begrænset information om komplekse prøver². Fluorescens kan være nyttig, men kun med prøver, der luminesce eller som kan være korrekt farves. DIC mikroskopi har flere træk, der gør det til et værdifuldt værktøj til analyse af nanopartikler. De hyppigst anførte fordele ved DIC i forhold til andre metoder og med hensyn til plasmonic nanopartikler er: ingen prøve farvning kræves, ingen Halo effekter, overfladisk dybdeskarphed, og høj lateral opløsning³. DIC har yderligere styrker, der er værdifulde for plasmonic nanopartikel forskning. Først og fremmest er to iboende og ortogononale polariserings felter til stede, og de kan måles samtidigt til spektroskopi formål². For det andet, det depolariserede signal af nanopartikler er ikke fanget i det endelige billede², som kan give anledning til alvorlig bekymring i mørke felt spektroskopi målinger.

Formålet med denne artikel er at give en klar metodologi for anvendelse af transmitteret-lys Nomarski DIC mikroskopi til at udføre spektroskopi på plasmoniske nanopartikler. Selvom DIC er en kraftfuld teknik, der kan anvendes på meget forskellige materialer, er det også en teknik, der kræver stor dygtighed og forståelse for at betjene det ordentligt, når Imaging nanopartikler. Transmissions baseret Nomarski DIC-mikroskopi har en kompleks lyskurve¹ , som kun vil blive gennemgået kortvarigt. Det optiske tog af DIC vises i figur 1. Lys overføres gennem mikroskopet ved først at passere gennem en polarisator og en stråle-opdeling Nomarski prisme, før de bliver fokuseret af kondensatoren på prøve planet. Efter at have passeret målet, møder lyset en stråle-kombinering Nomarski prisme og en analysator, før du afslutter til detektoren. De to polarisatorer og Nomarski-prismer er afgørende for dannelsen af DIC-billedet og er ansvarlige for at producere di's to ortogonale polariserings felter¹. For læseren interesseret i at vide mere om de arbejder principper og optiske sti Nomarski DIC mikroskoper, eller forskellene mellem Nomarski DIC og andre stilarter af DIC, henvises til andre velskrevne konti om disse emner^{1, 4} af ^{, 5} ) i ^{, 6} af ^{, 7}. der er

Det er lige så vigtigt at forstå den grundlæggende karakter af plasmonic nanopartikler, før du forsøger at udføre spektroskopi på dem, hvad enten det er med Nomarski DIC, mørkt felt, eller enhver anden mikroskopi teknik. På området for plasmonics defineres nanopartikler som partikler med dimensioner på skalaen 10-100 nm^8,9. Nanopartikler kan antage mange former (f. eks. kugler, stænger, stjerner, dumbbells, etc.), og de fleste af deres vigtige egenskaber opstår som følge af interaktioner med lys i den ultraviolette-synlige-nær infrarød rækkevidde af det elektromagnetiske spektrum. Udtrykket "plasmonic" er ikke begrænset til nanopartikler¹⁰; men når man diskuterer nanopartikler, anvendes det som reference til lokaliseret overflade Plasmon resonans (LSPR). LSPR er et fænomen, hvor lednings elektroner i en nanopartikel svinger på grund af en Coulombic interaktion med elektromagnetisk stråling af et meget specifikt og relativt smal frekvensbånd⁸. Ved disse samme frekvenser udviser plasmonic nanopartikler øget absorption og spredning af lys, hvilket gør dem observerbare med optisk mikroskopi. I mange tilfælde foretrækkes det at observere nanopartiklerne, mens du placerer båndpas filtre før kondensatoren², for at forbedre billedbehandlings kontrast og for at eliminere lys, der ikke inducerer lspr-effekten. Brug af filtre gør det også muligt at udføre enkelt partikel spektroskopi eksperimenter.

LSPR-relaterede optiske adfærd er meget afhængig af størrelsen og formen af nanopartiklerne, og det kan undersøges med mange optiske mikroskopi teknikker. Men for at dechifrere orientering information af plasmonic nanopartikler med en Anisotropisk (dvs., ikke-sfærisk) form, er det nødvendigt at udnytte polarisering af lys felt. Ved forsigtigt at rotere polariserings feltet eller prøve substratet i små intervaller er det muligt at overvåge de orienterings afhængige spektroskopiske egenskaber for de enkelte nanopartikler. Rotation og polarisering kan også hjælpe med at afgøre, om en spektral funktion skyldes en dipolær eller højere ordre svingning af nanoparti Rens overfladeelektroner. I tilfælde af isotropiske (dvs. sfæriske) nanopartikler forbliver spektral profilen dog i det væsentlige uændret, når prøven drejes under polariseret lys.

Når de ses gennem et DIC-mikroskop (figur 2), har nanopartikler en luftig disk med et skygge støbt hvidt og sort udseende mod en grå baggrund. Sfæriske nanopartikler vil bevare dette udseende under rotation og med skiftende af båndpas filtre; men partiklerne vil gradvist forsvinde fra visningen, da filterets centrale bølgelængde bliver yderligere adskilt fra sfærens eneste dipolære LSPR bølgelængde¹¹. Udseendet af nanoroder kan ændre ganske dramatisk, da de er roteret². Nanorods har to LSPR-bånd med dipolær opførsel, hvis placering er baseret på nanorods ' fysiske dimensioner. Når længdeaksen af en nanorod er orienteret parallelt med en af de DIC polariserings felter, vil den luftige skive vises alle hvide eller alle sorte, hvis de ses med et båndpas filter forbundet med denne LSPR bølgelængde. Efter rotation af prøven 90 °, vil det tage på den modsatte farve. Alternativt, da den tværgående akse af en nanorod er vinkelret på længdeaksen, vil stangen tage på den modsatte farve, når du skifter mellem filtre, der matcher LSPR bølgelængder for de to akser. På andre retninger og filterindstillinger, vil nanoroder fremstå mere som kugler, præsenterer en række skygge-støbt luftige skive mønstre. For nanoroder med en tværakse < 25 nm kan det være svært at detektere signal ved den pågældende lspr-bølgelængde ved hjælp af DIC-mikroskopi.

For at udføre enkelt partikel spektroskopi er det vigtigt at bruge de korrekte optiske komponenter og at justere dem korrekt. Der skal anvendes et objektiv, der kan bruges til DIC-mikroskopi. For enkelt partikel eksperimenter er 80x eller 100x olie mål ideelle. Nomarski DIC prismer normalt kommer i tre varianter: standard, høj kontrast, og høj opløsning. Den ideelle type afhænger i høj grad af formålet med eksperimentet og størrelsen af nanopartiklerne. Standard prismer er fint til mange eksperimenter; men når man arbejder med mindre nanopartikler (< 50 nm), kan høje kontrast prismer være gavnlig, da partikel kontrasten aftager, efterhånden som partiklerne falder i størrelse¹¹. Justering af DIC kontrast opnås enten ved at rotere en polarisator eller ved at oversætte en af de DIC prismer, afhængigt af mikroskopet mærke eller model⁶.

Efter indstilling Kohler belysning og polarisator indstillinger, er det vigtigt at ikke justere disse indstillinger, mens indsamling spektroskopi data. Desuden skal et konstant gennemsnitligt baggrunds signal holdes på alle tidspunkter under dataindsamlingen, selv når der skiftes mellem filtre og vinkel indstillinger. Den faktiske ideelle baggrund værdi afhænger af det dynamiske område af det videnskabelige kamera, men generelt bør baggrunden være i intervallet 15% – 40% af den maksimale detekteringsniveau af kameraet. Dette reducerer sandsynligheden for mætning af kamerasensoren, samtidig med at den optimale partikel kontrast aktiveres. Til indsamling af spektroskopi data, er det nødvendigt at arbejde med et videnskabeligt kamera, der fanger billeder i sort og hvid, i modsætning til et farvekamera.

Prøveforberedelse er et andet kritisk aspekt af Imaging plasmonic nanopartikler. Det er bydende nødvendigt, at operatørerne af DIC-mikroskopi har en forståelse af prøvens optiske egenskaber og af prøvens substrat. "Pre-renset" mikroskop glas er ikke tilstrækkeligt forberedt til billedbehandlings nanopartikler, og det skal rengøres grundigt før prøven aflejres for at sikre uhindret observation af prøven. Mange rense protokoller for mikroskop-slides er tidligere dokumenteret¹², men det er ikke et skridt, der normalt rapporteres i eksperimentelle undersøgelser.

Endelig, dataanalyse metoder er den endelige komponent til enkelt partikel spektroskopi. Den maksimale og mindste intensitet for hver nanopartikel skal måles, samt den lokale baggrunds gennemsnit. Partiklerne af interesse bør placeres i områder uden baggrunds affald, substrat defekter eller ujævn belysning. En metode til bestemmelse af spektral profilen af en nanopartikel er ved at beregne partikel kontrast ved hver bølgelængde ved hjælp af ligningen under^11,13,14,15:

Alternativt kan en enkelt partikls spektrum opdeles i dets individuelle maksimale og minimale signalkomponenter, som repræsenterer DIC to polariserings felter, hvorved de to samtidigt indsamlede Direct-afhængige spektre vises. gennem de to ligninger:

Protocol

1. forberedelse af prøver med standard glas mikroskopi

1. Forbered glas mikroskop-slides til prøve aflejring.
   Bemærk: under visse omstændigheder kan det være mere hensigtsmæssigt at opbevare glasset i ultrarent vand i stedet for ethanol. Men, opbevaring i vand eller luft gør glasset hydrofobe over tid.
   1. For de bedste resultater, købe glas eller kvarts mikroskop slides og dække glas.
   2. Brug en opstregningen pen til at anbringe et lavt og kort skrabemærke på midten af hver glas dækseddel.
   3. Rengør alle mikroskop glas, selv om det er købt "pre-rengjort", at fjerne glasskafter, støv, pulver, organiske rester, og andre kontaminanter, der påvirker billedkvalitet eller prøve deposition.
      Bemærk: denne rengøringsmetode nedenfor fungerer godt for de typer af prøver, der er beskrevet her, og undgår brugen af barske kemikalier. Harsher kemikalier kan ætser glasset og kræver mere omhu i håndtering og bortskaffelse.
      1. Anbring mikroskopet glas på opbevarings stativer og derefter ind i et bæger eller i en farvnings krukke. Der må ikke anbringes mikroskop glas i bunden af bægerglas og andet laboratorieglas uden brug af racen, fordi hvert stykke og overflade af mikroskopet skal være fuldt eksponeret for rengøringsmidler.
      2. Hæld ~ 1 mL flydende rengøringsmiddel (tabel med materialer) i beholderen og fyld beholderen med vand. Sonikatat i 30 min.
         Bemærk: når renseprocessen begynder, skal du kun håndtere glasset, mens du bærer handsker, for at undgå at efterlade fingeraftryk rester på glasset.
      3. Hæld væskeindholdet i rense beholderen i en vask. Skyl beholderen flere gange med ultrarent vand for at fjerne al udseende af vaskemiddel. Fyld beholderen med ultrarent vand. Sonikatat beholderen med mikroskop glas til en anden 30 min.
      4. Gentag det forrige trin mindst en gang mere. Udfør yderligere runder af sonikering i vand, indtil det er indlysende, at alle spor af vaskemidlet er blevet fjernet.
      5. Hæld indholdet af rense beholderen ud. Skyl beholderen med ultrarent vand. Fyld beholderen med ethanol. Sonicate mikroskop glas i 30 min.
      6. Hæld indholdet af rense beholderen i en affaldsbeholder. Fyld med ethanol. Dæk beholderen for at forhindre tab af ethanol ved fordampning. Opbevar mikroskop glasset i denne beholder indtil tidspunktet for forsøget. Slides forbliver rene og brugbare, så længe de forbliver nedsænket i ethanol inde i en dækket beholder.
2. Fremstilling af nanopartikler opløsning
   1. Brug en mikropipette til at fjerne en 100 μL alikvot 0,05 mg/mL guld nanopartikel opløsning fra den oprindelige opbevaringsbeholder og skubbe opløsningen ud i et 1,5 mL centrifugeglas.
   2. Prøven centrifugeres i 10 minutter ved 6.000 x g.
   3. Supernatanten fjernes med en mikropipette for at fjerne overskydende overfladeaktivt stof.
   4. Ved hjælp af en mikropipette anbringes 100 μl ultrarent vand i centrifugeglasset.
      Bemærk: Hvis ikke alle supernatanten kan fjernes ved første forsøg, gentages Centrifugerings-og ophængs trinene.
   5. Hvirvstik prøven kortvarigt for at opslæbe pellet. Sonicate umiddelbart bagefter i 20 min til fuldt resuspension og bryde op nanopartikel aggregater.
      Bemærk: Hvis prøven ikke anvendes med det samme, skal den soniceres igen i 20 minutter, før den deponeres på mikroskop glas.
3. Prøve aflejring
   1. Fjern de rensede dæksedler og mikroskop-slides fra opbevaringsbeholderne. Pust tørt glasset med tryk kvælstof eller argon.
   2. Ved hjælp af en mikropipette, drop-Cast 6 μL nanopartikel opløsning fra trin 1.2.5 på Cover sedlen. For at sprede dråben jævnt, forsigtigt placere en anden, større stykke mikroskop glas på toppen af forsiden slip, såsom en anden Cover seddel eller et mikroskop slide. Undgå at få luftbobler fanget mellem de to stykker glas.
      1. Vend prøve substratet om, og forsegl kanterne på Cover sedlen med en smal linje af neglelak for at forhindre fordampning af medium opløsningen.
      2. Alternativt, for at afbilde prøven "tørre", lad opløsningen stå i 5 – 15 min på Cover sedlen, før du fjerner det uønskede stykke glas. Blæs forsigtigt dæksedlen tørt med tryk kvælstof eller argon.
   3. Hvis det er muligt, billede prøver umiddelbart efter tilberedning. Hvis dette ikke er muligt, opbevares prøverne i en dækket beholder, såsom en Petri skål indtil billeddannelse.

2. DIC-afbildning

1. Juster objektiv og kondensator.
   1. Når prøven er placeret på mikroskop, skal du finde brændplanet med prøven på den. Først skal du finde og fokusere på det ridse mærke, der blev oprettet tidligere. Så Finjuster fokus indtil nanopartikler kommer i udsigt.
   2. For at bestemme den nøjagtige placering af kondensatoren, udnytte Kohler belysning metode. ⁵ Kohler belysning ved høj forstørrelse (80x, 100x) er lettere opnås ved først at indstille Kohler belysning ved en lavere forstørrelse, såsom 20x.
      Bemærk: normalt er det ikke nødvendigt at justere Kohler-belysningen under afbildning af en enkelt prøve. Men, det er god praksis at kontrollere, at Kohler belysning er korrekt indstillet, når du skifter til et nyt mikroskop slide.
2. Optimer kontrastindstillinger.
   1. Vælg et område af interesse i eksemplet til billedbehandling. Centrer området i kameraets synsfelt, og Juster fokus efter behov.
      1. Hvis mikroskopet har de Senarmont design, start med polarisator indstillet tæt på maksimal baggrund udryddelse og gradvist Rotere polarisator mod faldende baggrund udryddelse. Baggrunds intensiteten vil gradvist stige.
      2. Hvis mikroskopet ikke har et de Senarmont-design, skal du starte med det optiske tog, der er indstillet til maksimal baggrunds udslettelse. I dette tilfælde, gradvist justere objektiv prisme position mod faldende baggrund udryddelse.
         Bemærk: den ideelle indstilling opnås, når nanopartiklerne når deres største intensitets forskel (dvs. kontrast) fra den gennemsnitligt lokale baggrundsværdi. For plasmonic nanopartikler opnås optimal kontrast normalt med en relativ mørk baggrund, og dermed ved indstillinger nær maksimal baggrunds udslettelse.
3. Billede af prøven.
   1. Sluk for rumbelysning for at forhindre, at forstyrrende belysning interagerer med processen.
   2. Mens du ser nanopartiklerne med et videnskabeligt billed kamera, skal du bestemme det optimale baggrundsniveau. Brug en 10 nm fuld bredde på halv maksimum (FWHM) båndpas filter med sin centrale bølgelængde Co-placeret med den vigtigste lspr bølgelængde, se regionen af interesse. Juster lampe intensiteten eller eksponeringstid, indtil baggrundsniveauet ligger i intervallet 15% – 40% af kameraets maksimale kapacitetsniveau, og ingen genstande inden for interesseområdet udviser signal intensiteter, der overstiger 90% af kameraets maksimale intensitetsniveau.
      Bemærk: målet med trin 2.3.2 er at forhindre, at sensoren mættede, når der skiftes mellem filtrene. Det ideelle baggrundsniveau vil variere mellem prøver og kameraer. Når dette trin er færdigt, kan eksponeringstid justeres, men ikke lampens intensitet.
   3. Billede prøven med en serie af båndpas filtre, der hver har en FWHM på 10 nm, og at som en helhed muliggør billeddiagnostik på tværs af hele bølgelængde vifte af interesse. Sørg for, at baggrunds intensiteten forbliver konsistent fra billede til billede (inden for ~ 5% af hinanden) ved at justere eksponeringstiden. Når du har skiftet filtre, skal du igen fokusere på prøven før billedoptagelse.
   4. Gem billederne som ukomprimerede TIFF-filer og/eller i softwarens oprindelige filformat for at bevare alle oplysninger.
4. Drej prøven.
   1. Efter indsamling af billeder af prøven på dens oprindelige position, kan prøven nu drejes og afbildes ved yderligere retninger i lyset vej. Udfør rotation med jævne mellemrum (f. eks. 10 ° eller 15 °) på enten et 180 ° eller et 360 ° område.
      Bemærk: rotation kræver et Roterbart prøve stadie.
   2. Som i afsnit 2.1-2.3 skal du justere kameraets indstillinger for at give et konsistent baggrundsniveau fra billede til billede.
      Bemærk: der bør ikke foretages justering af Kohler-belysningen.

3. data analyse ved hjælp af ImageJ

Bemærk: følgende beregninger kan udføres i en række forskellige softwarepakker, og nogle gange i det oprindelige program, der bruges til at indsamle billederne. ImageJ er en frit tilgængelig software fra National Institutes of Health (NIH).

1. Beregn partikel kontrast eller-intensitet.
   1. Åbn billedet med ImageJ.
   2. Vælg rektangel værktøjet, og tegn et rektangel omkring det vigtigste område af interesse.
   3. På værktøjslinjen skal du vælge billede, derefter Zoomog derefter til valg. Billedvinduet zoomes ind på det valgte område.
   4. På værktøjslinjen skal du vælge billede, derefter Justerog derefter lysstyrke/kontrast. Der vises et nyt vindue. Hvis du vil aktivere en bedre visning af eksempelområdet, skal du justere de fire indstillinger: minimum, maksimum, lysstyrke og kontrast. Disse justeringer ændrer ikke de videnskabelige data, de giver blot mulighed for bedre synlighed af stikprøve området.
      Bemærk: trin 3.1.3 og 3.1.4 kan udføres flere gange og i omvendt rækkefølge.
   5. Brug rektangelværktøjet igen, og tegn en kasse omkring den første nanopartikel, der skal måles. Boksen bør kun være lidt større end nanopartiklen luftige skive.
   6. På værktøjslinjen skal du vælge Analysérog derefter måle. Der vises et nyt vindue, som rapporterer minimum-, maksimum-og middel intensiteter for de pixel, der er placeret i den markerede boks.
   7. Træk den boks, der bruges til at måle nanopartiklen til et område umiddelbart ved siden af partiklen, hvor baggrunds kontrasten er relativt jævn, og ingen partikler eller kontaminanter er til stede. Bevar boksens oprindelige størrelse.
   8. Brug måleværktøjet til at bestemme middel intensiteten for baggrundsområdet.
   9. Mål de resterende partikler og et tilstødende baggrundsområde for hver.
   10. Gentag processen for hver partikel i alle billederne i serien.
   11. Eksporter dataene til et regneark for at beregne kontrasten eller intensiteten af hver partikel på tværs af alle bølgelængder og vinkler.
   12. Beregn hver partikel kontrast ved hjælp af følgende ligning^13,14,15:
       
       Bemærk: ved brug af denne ligning skal partikel kontrasten altid være > 0.
   13. Beregn partiklens baggrunds justerede maksimumværdi ved at dividere den målte maksimale partikel intensitet med baggrunds middelværdien:
       
   14. På samme måde beregnes den baggrunds justerede minimumsværdi ved at dividere den målte minimums partikel intensitet med baggrundsværdien:
       
       Bemærk: som beregnet, bør maksimum have en værdi større end én, mens minimum vil være mindre end én. Det er acceptabelt at trække hver værdi med "1", så den gennemsnitlige baggrund er stort set nul, det maksimale repræsenteres som en positiv værdi, og minimumsværdien tildeles en negativ værdi¹⁶. Sidstnævnte fremgangsmåde gør det muligt for analytikeren separat at overveje, hvad der sker langs hver af de polariserings felter, hvilket er nyttigt, når man studerer anisotropiske partikler.
   15. Hvis du vil afbilde spektral profilen ved en given nanopartikel position, skal du lægge data sammen med bølgelængden langs x-aksen og kontrasten eller intensiteten langs y-aksen.
   16. Hvis du vil afbilde rotations profilen ved en given bølgelængde, skal du lægge rotationsvinklen langs x-aksen og kontrasten eller intensiteten langs y-aksen.

Representative Results

Når man arbejder med prøver, der er store nok til at blive set med det blotte øje, er det normalt ikke nødvendigt at placere landemærker på glas substratet. Når der arbejdes med nanomaterialer, eller når der kræves rotation af prøven, kan landemærker dog give en nem metode til at finde, skelne mellem og spore retningen af prøven. Selv om mere sofistikerede teknikker kan udnyttes til at forlade vartegn på glas substrater¹⁷, skrabe glasset med en opstregningen pen er en økonomisk og enkel metode, der virker i mange situationer. Det er vigtigt at undgå at undersøge de stikprøve områder, der umiddelbart støder op til disse landemærker, da ridser skaber en kompleks baggrund med potentialet for at påvirke data (figur 3). Men ved spidserne af ridser, "Spider webs" ofte strækker sig udad fra bunden. Disse linjer er ganske værdifulde som vartegn, men igen, nanopartikler bør undgås, hvis de overlapper med disse defekter.

For at opnå optimal billeddannelse med DIC mikroskopi, er det af vital betydning at bestemme den rette brændplanet. Objekter, der er lidt ude af fokus, vil fremstå uskarpe, have slørede kanter og have formindsket kontrast. Figur 4 viser guld nanopartikler, der er ude af fokus i varierende grad. Nanopartikler i nederste højre hjørne er i fokus, mens nanopartikler bliver længere ude af fokus, når de nærmer sig det øverste venstre hjørne af dette billede. Da DIC har en overfladisk dybdeskarphed, er det ikke ualmindeligt, at nogle nanopartikler er i fokus, mens andre er ude af fokus, når de afbilder dem på et glas underlag. Som et resultat, er det afgørende for konsekvent at fokusere på de samme nøjagtige partikler, når du foretager justeringer af mikroskopet under et eksperiment.

Figur 5 er et eksempel på effekten af at justere polarisator indstillingerne, mens billeddannelse guld nanokugler. Fem nanopartikler er i fokus, mens man er lidt ude af fokus. Et 540 nm-båndpas filter med 10 nm FWHM var også i den optiske kurve. I denne serie af billeder blev baggrunds lysstyrken justeret med ImageJ efter billed erhvervelse for at gøre de fem partikler mere synlige i baggrunden. Når Polarisatoren er indstillet til 0 ° i et de Senarmont-designet Nomarski DIC-mikroskop, er den ortogonale for analysatoren (figur 5a). Ved 0 ° forekommer partiklerne for det meste hvide med en mørk stribe, der løber hen over deres midtersektion. Dette er tegn på tvær polarisering for nanosfære prøver. Når Polarisatoren drejes til forskellige vinkler (figur 5b-E), ser partiklerne ud til at kaste mørke skygger mod sydvest. De sorte og hvide komponenter til signalet opstår som et resultat af DIC to polariserings felter og give oplysninger om orienteringen af plasmonic nanopartikler, når du arbejder med båndpas filtre. Efterhånden som Polarisatoren drejes mod højere vinkler, forbliver skygge mønsteret ens. Men partikel kontrast værdierne ændres dramatisk. Dette demonstreres bedst ved at måle kontrast værdierne for de enkelte partikler ved hjælp af ovenstående ligning. Partiklen fremhævet med den sorte boks har kontrastværdier på 0,65 (krydsede polarisatorer), 0,84 (polarizer skift på 5 °), 1,10 (10 °), 0,44 (20 °) og 0,23 (45 °). Derfor er den optimale billedbehandlings indstilling for denne prøve med et polarisator skift på 10 °. Plasmonic nanopartikler kræver ofte en polarisator indstilling i intervallet 5 ° – 15 °, og mindre intervaller end disse bør normalt anvendes til at identificere den ideelle indstilling. For yderligere oplysninger om billeddannelse og analyse af sfæriske guld nanopartikler henvises læserne til det tidligere arbejde af Sun et al.¹¹.

Anisotropic-formede nanopartikler producerer mønstre af højere kompleksitet end nanokugler. Guld nanoroder blev lagret (figur 6) ved deres langsgående lspr bølgelængde, 650 nm. I den oprindelige billede (figur 6a), fem lyse nanoroder og flere lysdæmper partikler er synlige. I stedet for at have en skygge-Cast udseende, tre af stængerne har overvejende sort luftige diske, mens to er for det meste hvide. Polarisatoren blev indstillet til 10 ° til venstre for den krydsede polariserings indstilling. I figur 6bblev der anvendt krydsede polarisering; kun tre af partiklerne vises som fuldt hvide, luftige skiver. De andre er forsvundet eller synes at være lidt ude af fokus. Med polarisator indstillet til 10 ° til højre for krydsede polarisering (figur 6c), er mønstrene nu vendt om, hvad der blev observeret i figur 6a. Polarisator blev næste vendt til 45 ° højre for krydsede polarisering (figur 6D), den maksimale indstilling, for at påvise, at partikler bevarer deres farver på denne indstilling, men kontrasten er faldet betydeligt. I de resterende figur paneler, blev samlingen af nanoroder gradvist drejet en fuld 90 ° med uret, mens polarisator blev sat til 10 ° til højre for krydsede polarisering. Mønsteret ændres gradvist for hver nanorod, og efter en fuld 90 ° rotation, har partiklerne vendt deres farver fra den oprindelige indstilling. Kort sagt, hvis en af akserne i en plasmonic nanorod er linet op med en af de to polariserings felter, og hvis nanorod er indpakket på denne akse ' LSPR bølgelængde, vil nanorod synes at være for det meste hvide eller for det meste sort, afhængigt af hvilket polariserings felt det er aligne d med (figur 6a, C)². Hvis nanopartiklen drejes en fuld 90 ° (figur 6h), vil den nu være linet op med det modsatte polariserings felt og indtage den modsatte farve. Hvis i stedet nanopartiklen blev roteret kun 45 ° (figur 6F), så vil det være i en position, hvor partiklen vil udstille sin største skygge-Cast udseende, der viser slående lighed med, hvad der er observeret med plasmonic nanosfærer. Som et resultat af denne optiske adfærd, plasmonic nanopartikler med en Anisotropisk form ofte ser fladt i stedet for at have den tredimensionelle skygge-støbt udseende af nanokugler. Resultatet af denne forskel i optisk adfærd er, at det kan udnyttes med henblik på at skelne mellem plasmonic nanopartikler, der er sfærisk og anisotrope i form, som det tidligere er blevet diskuteret i flere undersøgelser^{2, 3,6,7,11,13,16}.

Endelig, figur 7 viser repræsentative enkelt partikel spektroskopi data, som kontrast af en guld nanosfære (figur 7a)¹¹, intensitet af en enkelt guld nanorod med sin langsgående akse orienteret parallelt med en af polariseringen felter (figur 7b)⁶og intensitets profilen for en enkelt guld nanorod ved dens lspr bølgelængde og under rotation af scenen (figur 7c)⁶. Begge præsentationsmåder afslører bredden og placeringen af LSPR-effekten. For plasmoniske nanopartikler med en Anisotropisk form afslører intensitets-og rotations dataene direktionaliteten af effekten og dermed orienteringen af partiklen på prøve substratet, som tidligere er blevet påvist gennem korrelative undersøgelser af sådanne partikler ved hjælp af DIC og transmission elektronmikroskopi^2,16,18.

Figur 1: lyskurve i overført-lys Nomarski-baseret dic-mikroskopi. Efter at have forladt lyskilden (S), lys passerer gennem en polarisator (P), en Beam-Shearing Nomarski prisme (NP), kondensatoren (C), brændplanet (FP), målet (O), en stråle-kombinerer Nomarski prisme (NP), analysatoren (A), og endelig detektoren (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: eksempler på plasmonic nanopartikler, der er indpakket ved deres LSPR-bølgelængder med 10 nm-båndpas filtre ved hjælp af et dic-mikroskop. Begge billeder samles ved 100x. (A) sølv nanokugler med 40 nm diameter indlagret ved 480 nm med et båndpas filter med 10 nm FWHM. B) stang lignende guld nanopartikler, der er indlagret ved 700 nm ved hjælp af et båndpas filter med 10 nm FWHM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: billede af en ridse lavet i en glas Cover seddel med en opstregningen pen. Nær slutningen af den faktiske indrykning, en række smalle og lavvandede "Spider web" linjer filial ud fra bunden selv, hvilket resulterer i et mønster, der kan udnyttes som en billeddannelse milepæl. Dette billede blev indsamlet ved hjælp af 100x forstørrelse og bredbånd hvidt lys. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: guld nanokugler med bredbånds hvidt lys ved 100x. Partikler i nederste højre er i fokus, men partikler glider længere væk fra brændplanet mod det øverste venstre hjørne. Objekt i midten af billedet er snavs. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: guld nanokugler indpakket under en række forskellige polarisator indstillinger ved en bølgelængde på 540 nm og en forstørrelse på 100x. Baggrunds lysstyrken blev justeret efter billeddannelse med ImageJ for at gøre partiklerne mere synlige. Polarizer indstilling af (a) 0 ° (polarizer ortogononal til analysator), (B) 5 °, (C) 10 ° (den bedste kontrast i denne serie af billeder), (D) 20 ° og (E) 45 °. Målt kontrast af partikel i sort boks er (a) 0,65, (B) 0,84, (c) 1,10, (D) 0,44 og (E) 0,23. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: eksempel på billedbehandlings anisotropiske plasmoniske nanopartikler: guld nanoroder ved deres langsgående lspr bølgelængde på 650 nm og en forstørrelse på 100x. Partikler af hovedinteresse er vedlagt i gule boks. Polarizer indstillinger er: (a) venstre 10 °, (b) 0 °, (c) højre 10 °, (D) højre 45 °. Med polarisator indstillet til højre 10 °, blev scenen drejet med uret med (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 ° og (H) 90 °. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: repræsentative resultater af enkelt partikel spektroskopi-data. (A) guld nanosfære spektroskopi vist i form af DIC Contrast. Hvert datapunkt repræsenterer et gennemsnit på 20 nanokugler for hver partikeldiameter, og dataopsamling baseret på 10 nm FWHM båndpas filtre. (B) en enkelt guld nanorod vises som dic intensitet data, ved hjælp af to forskellige polarisator indstillinger (2 ° på hver side af krydsede polarisering). C) dic-intensitets data for en enkelt guld nanorod ved lspr-bølgelængden på 680 nm, mens den blev drejet 180 °, og Polarisatoren blev holdt ved 2 ° fra den krydsede polariserings position. Figur 7A er tilpasset med tilladelse fra Sun et al., analytisk kemi. 81 (22), 9203-9208 (2009) og figur 7B, C fra Stender et al., analytisk kemi. 84 (12), 5210-5215 (2012). Copyright American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Ved afbildning med DIC-mikroskopi er det vigtigt at optimere de optiske komponenter, før data indsamles. Selv mindre justeringer af polarisator i midten af et eksperiment kan resultere i betydelige påvirkninger af de endelige data⁶. Desuden, forskellige materialer kræver forskellige polarisator indstillinger. Selv om store trin størrelser blev udnyttet her til at demonstrere effekten af polariserings vinklen, er det i et faktisk eksperiment bydende nødvendigt at optimere polarisator indstillingen inden for 1 ° – 2 ° af den optimale kontrast indstilling. Polarisator indstillingen skal også registreres til fremtidig brug. Det anbefales også altid at arbejde på samme side af den krydsede polarisator (0 °) punkt. Skift frem og tilbage giver ikke nogen fordele, men det kan føre til forvirring, på grund af en vending i skyggen mønster.

Næste i vigtighed, er det afgørende at overvåge baggrunds intensiteten, når de planlægger at udføre spektroskopi. Dette opnås bedst ved at justere kameraets eksponeringstid eller ved at føje neutrale tætheds filtre til lyskurven. Justering af åbninger eller lampe intensiteter kan påvirke Kohler-belysningen og ændre kontrast værdierne. Baggrunden skal være relativt selv på tværs af prøven, således at udvælgelsen af et baggrundsområde ikke ændrer kontrasten beregning. Prøveeksemplarer, der ikke støder op til en ren baggrunds plads, bør undgås. Desuden kan baggrunds intensiteten ikke i første omgang sættes for højt eller for lavt. Hvis baggrunds intensiteten er sat for højt, er der en øget risiko for, at nogle signaler vil overskride det maksimale område af kameraet, hvilket gør det umuligt at beregne kontrasten i disse regioner. Hvis baggrunds intensiteten er indstillet for lavt, vil det være yderst vanskeligt at opnå god kontrast mellem den mørke komponent af DIC-signalet og baggrunds signalet. Forståelse af typiske eller forventede opførsel af en prøve kan hjælpe med at vælge den rette baggrunds intensitet.

At finde den rette brændplan er også afgørende. En af Nomarski DIC fordele er, at det har en overfladisk dybdeskarphed. Men dette gør det mere udfordrende at fokusere på tynde prøver, såsom nanopartikler. Med tykkere prøver, er udfordringen at finde den faktiske brændplanet af største interesse. Mange brændplaner kan være interessante og har nanopartikler om dem, så det er vigtigt at afgøre tidligt på nanopartikler af største interesse.

I tilfælde af nanopartikler er det vigtigt for mikroskopet at erkende, at de ser en luftig skive eller "punkt sprednings funktion" af objektet². Generelt er den luftige skive nyttig til at afgøre, om en plasmonic nanopartikel har en form, der er isotropisk eller Anisotropisk, men nanopartiklen billedbehandling er i virkeligheden langt mere kompleks end hvad der diskuteres her. Komplekse nanopartikler aggregater kan undertiden ligne isotropiske partikler, og som et resultat, elektronmikroskopi metoder er derefter nødvendigt at karakterisere nanopartikel mønstre^{2,16,18, 19}. til image plasmonic nanopartikler med et dic mikroskop, er det afgørende at bruge filtreret billeddannelse og til at afbilde partiklerne på en af deres stærkt absorberende plasmonic bølgelængder⁶. Imaging på en forkert bølgelængde eller uden filtre kan resultere i erobringen af skygge-Cast mønstre, der er svære at dechifrere.

Når billeddiagnostiske nanopartikler sammen med objekter, der er større end diffraktion grænse for lys, er det vigtigt at huske, at mikroskopets mål "ser" en forholdsvis flad brændvidde. En almindelig misforståelse af DIC er, at det gør det muligt at se et objekt i faktiske 3D Relief. Dette er forårsaget af skygge-støbt mønster, som faktisk gør mange objekter synes at være tredimensionale. Men for at indsamle vertikale oplysninger om flere fokale planer, ville det være nødvendigt at hæve eller sænke scenen og indsamle en sekvens af billeder. Dette kan være meget vanskeligt at udføre og at fortolke, især for tykkere prøver, såsom celler. Således har mikroskopet brug for en dyb forståelse af alle materialer, der er involveret, når de udfører sådanne eksperimenter og skal registrere positionerne af de enkelte brændemaskiner, der blev udnyttet.

Endelig er dataanalyse trinnet så kritisk som dataindsamling. Ved måling af prøvens kontrast-eller intensitetsværdier skal der tages hensyn til flere faktorer. Typisk er analytikeren primært interesseret i minimum-og maksimumværdierne for partiklerne af interesse. Når forholdet mellem kontrast og støj for prøven er tilstrækkeligt højt, og hvis baggrundsområdet er rent og jævnt belyst, kan der tegnes en simpel geometrisk form rundt om prøve regionen uden bekymring for signal, der indføres med kontaminanter. Hvis baggrunden er ren og jævnt belyst, kan der desuden foretages en baggrunds måling i et hvilket som helst område umiddelbart ved siden af prøven. Men hvis der er forurenende stoffer, eller hvis baggrunden er ujævn, så analytikeren skal foretage en kritisk gennemgang af prøvens omegn, og analytikeren skal vurdere, om det er endda muligt at foretage en fornuftig baggrunds måling. Det er også afgørende at måleprøve-og baggrunds områderne med samme størrelse og formet værktøj for at undgå, at der indføres bias i beregningen. Generelt har mindre måleområder en lavere sandsynlighed for at detektere outliers (f. eks. kontaminanter, dårlige pixels osv.), men større prøvetagnings områder giver ofte en mere pålidelig måling af baggrundsmiddelværdien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm