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Immunology and Infection

अल्वेलर मैक्रोफेज और सीडी 4+ टी-सेल इम्यूनोफेनोटाइपिंग और एचआईवी जलाशय आकलन के लिए ब्रोंकोएलवेलर लावेज द्रव और मिलान रक्त का प्रसंस्करण

Published: June 23, 2019 doi: 10.3791/59427
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 2, 5, 5,6, 1, 1,3,4, 2,3,6
1Research Institute McGill University Health Centre, 2Department of Biological Sciences, Université de Québec à Montréal, 3Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 4Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, McGill University, 5Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, 6Département de microbiologie, infectiologie et immunologie, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

हम ब्रोंकोएल्वेलर लैवेज तरल पदार्थ के प्रसंस्करण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और फुफ्फुसीय एचआईवी जलाशयों का आकलन करने के लिए एंटीरेट्रोवायरल थेरेपी पर लंबे समय से एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों से परिधीय रक्त का मिलान करते हैं। इन विधियों के परिणामस्वरूप अत्यधिक शुद्ध सीडी 4 टी कोशिकाओं और कूपिका मैक्रोफेज का अधिग्रहण होता है जिसका उपयोग बाद में अतिसंवेदी पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा इम्यूनोफेनोटाइपिंग और एचआईवी डीएनए/आरएनए परिमाणीकरण के लिए किया जा सकता है।

Abstract

ब्रोंकोस्कोपी एक चिकित्सा प्रक्रिया है जिसके द्वारा सामान्य लवण को ब्रोंकोस्कोप के माध्यम से फेफड़ों में इंजेक्ट किया जाता है और फिर चूषण लागू किया जाता है, ब्रोंकोएल्वेलर लेवेज (बाल) तरल पदार्थ को हटा दिया जाता है। बाल तरल पदार्थ कोशिकाओं में समृद्ध है और इस प्रकार फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा वातावरण का एक 'स्नैपशॉट' प्रदान कर सकता है। सीडी 4 टी कोशिकाओं का सबसे अच्छा विशेषता एचआईवी जलाशयों हैं, जबकि वहाँ मजबूत सबूत के लिए सुझाव है कि ऊतक मैक्रोफेज, कूपिका मैक्रोफेज (एम्स) सहित, भी वायरल जलाशयों के रूप में सेवा है. तथापि, एचआईवी जलाशय स्थापना और अनुरक्षण के संदर्भ में एम्स की भूमिका के बारे में अभी भी बहुत कुछ पता नहीं है। इसलिए, बाल तरल पदार्थ प्रसंस्करण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए कोशिकाओं है कि virological और इम्यूनोलॉजिकल assays में इस्तेमाल किया जा सकता है की विशेषता और फेफड़ों के भीतर सेल आबादी और सबसेट का मूल्यांकन एचआईवी के रूप में फेफड़ों की भूमिका को समझने के लिए प्रासंगिक है प्राप्त करने के लिए जलाशयों. इसमें, हम इस तरह के एक प्रोटोकॉल का वर्णन, इस तरह के सरल centrifugation और प्रवाह साइटोमेट्री के रूप में मानक तकनीकों को रोजगार. CD4 टी कोशिकाओं और एम्स तो बाद में अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इम्यूनोफेनोटाइपिंग और एचआईवी डीएनए और आरएनए परिमाणीकरण सहित.

Introduction

एचआईवी संक्रमण के इलाज के सामने सबसे महत्वपूर्ण चुनौतियों में से एक गुप्त एचआईवी जलाशय की उपस्थिति है जो एंटीरेट्रोवायरल थेरेपी (एआरटी)1,2के व्यवधान के बाद प्लाज्मा viremia के एक पलटाव का कारण बनता है . जबकि लंबी अवधि के एआरटी के दौरान एचआईवी जलाशय अच्छी तरह से कई ऊतक डिब्बों में प्रलेखित है, माध्यमिक लसीकाभ अंगों सहित, आंत से जुड़े लसीकाभ ऊतक (GALT), और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), फेफड़ों के अध्ययन के एक क्षेत्र के रूप में अनदेखी की गई है पूर्व एआरटी युग3के बाद से | हालांकि, फेफड़े एचआईवी के रोगजनन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। वास्तव में, फुफ्फुसीय लक्षण एड्स से संबंधित अवसरवादी संक्रमण4के पहले संकेतकों में से एक थे. यहां तक कि आधुनिक एआरटी युग में, एचआईवी से ग्रस्त व्यक्तियों को एचआईवी के बिना व्यक्तियों की तुलना में संक्रामक और गैर संक्रामक फुफ्फुसीय रोगों दोनों के विकास का अधिक खतरा होता है। उदाहरण के लिए, एचआईवी संक्रमण वाले व्यक्तियों को आक्रामक स्ट्रेप्टोकोकल निमोनिया संक्रमण के साथ-साथ क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी)5,6 के लिए ऊंचा जोखिम होताहै। इसके अलावा, तपेदिक (टीबी) और एचआईवी का सह संक्रमण दुनिया के कुछ क्षेत्रों में एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य चुनौती है, विशेष रूप से, उप-सहारा अफ्रीका, क्योंकि एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों में एचआईवी7के बिना व्यक्तियों की तुलना में टीबी होने की संभावना 16 से 27 गुना अधिक है। हालांकि फुफ्फुसीय संक्रमण और पुरानी बीमारी के लिए इस संवेदनशीलता के लिए कुछ स्पष्टीकरण प्रस्तावित किया गया है8,9,10, सटीक सेलुलर तंत्र जिसके द्वारा दबा एचआईवी के साथ व्यक्तियों फुफ्फुसीय जटिलताओं के लिए प्लाज्मा वायरल लोड उच्च जोखिम पर रहता है, पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। महत्वपूर्ण बात, एचआईवी फुफ्फुसीय संक्रमण और पुरानी बीमारी के लिए एक बहुत मजबूत जोखिम कारक है, धूम्रपान की स्थिति से स्वतंत्र6.

इसलिए, स्वास्थ्य और बीमारी में इसकी भूमिका को समझने के लिए फेफड़ों के प्रतिरक्षा वातावरण का विश्लेषण महत्वपूर्ण है। हालांकि noninvasive, प्रेरित थूक नमूने दुर्लभ फुफ्फुसीय लिम्फोसाइटों और कोई एम्स के साथ उपकला कोशिकाओं और मलबे की बड़ी मात्रा में होते हैं, विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उनकी भूमिका को सीमित. इसके विपरीत, महत्वपूर्ण रक्तस्राव और न्यूमोथोरैक्स (फेफड़ों के पतन) के संबद्ध जोखिमों के कारण संदिग्ध बीमारी के अभाव में ऊतक की बड़ी बायोप्सी प्राप्त नहीं की जा सकती है। इसके अलावा, फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बहुमत मुख्य रूप से mucosal स्तर पर स्थित हैं जहां फेफड़ों लगातार सांस लेने के दौरान प्रतिजनों द्वारा प्रेरित कर रहे हैं. कि अंत करने के लिए, ब्रोंकोस्कोपी बाल तरल पदार्थ प्राप्त करने के लिए लिम्फोसाइटों और एम्स के लिए अपेक्षाकृत सुरक्षित पहुँच प्रदान करने का लाभ है (चित्र 1देखें)। मैक्रोफेज बाल तरल पदार्थ के भीतर कोशिकाओं का सबसे बड़ा अनुपात का गठन, लिम्फोसाइटों11के बाद . इसलिए, यह एक विधि है जिसके द्वारा बाल तरल पदार्थ बाद के अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए संसाधित किया जा सकता है स्थापित करने के लिए उपयोगी है, जैसे इम्यूनोफेनोटाइपिंग, सेल संस्कृति, transcriptomics, या किसी भी आगे अनुप्रयोगों. यहाँ उल्लिखित बाल तरल पदार्थ प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल पहले वर्णित सामान्य प्रक्रियाओं से अनुकूलित है और विभिन्न बहाव परख कार्यरत के लिए अनुकूलित. इस पद्धति दोनों फुफ्फुसीय लिम्फोइड और माइलॉयड mucosal प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उनके phenotypical और कार्यात्मक लक्षण के लिए अलगाव के लिए अनुमति देता है, साथ ही एचआईवी के साथ रहने वाले वयस्कों में एचआईवी जलाशय का एक आकलन.

इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने के लिए, हमने अध्ययन प्रतिभागियों की भर्ती के लिए निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग किया15. प्रतिभागियों को इस अध्ययन में भाग लेने के लिए पात्र होने के लिए, वे एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों, जो निम्नलिखित मानदंडों को पूरा किया जाना था: (1) कम से कम 3 साल के लिए एआरटी पर; (2) दबा वायरल लोड (वीएल) कम से कम 3 साल के लिए; (3) सीडी 4 टी सेल गिनती $200/ (4) अनुसंधान स्पाइरोमेट्री और ब्रोंकोस्कोपी से गुजरना करने के लिए तैयार। निम्नलिखित मानदंडों वाले मरीजों को अध्ययन से बाहर रखा गया था: (1) ब्रोन्कोस्कोपी के लिए मतभेद (ओं); (2) उच्च रक्तस्राव जोखिम: स्कंदन चिकित्सा या warfarin या clopidogrel चिकित्सा पर; (3) थ्रोम्बोसाइटोपेनिया (कम प्लेटलेट्स); (4) सक्रिय फुफ्फुसीय संक्रमण या किसी अन्य तीव्र स्पंदनात्मक प्रक्रिया; (5) गर्भवती/

Protocol

इस अनुसंधान प्रोटोकॉल सीधे हेलसिंकी की घोषणा में शामिल सिद्धांतों के आधार पर स्थापित किया गया था और McGill विश्वविद्यालय स्वास्थ्य केंद्र के संस्थागत समीक्षा बोर्डों से अनुमोदन प्राप्त (आरआई-MUHC, #15-031), Universit] du Qubec ] मोंटरेल (UQAM, #602) और केंद्र डे Recherche du Centre Hospitalier de l'Universit] de Montral (CR-CHUM, #15-180).

1. ब्रोंकोल्वेलर लावेज

नोट: यह खंड ब्रोंकोस्कोपी का वर्णन करता है जैसा कि एक लाइसेंस प्राप्त श्वसन विज्ञानी द्वारा श्वसन चिकित्सक16,17की सहायता से किया जाता है .

  1. प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपकरण के टुकड़े तैयार करें, जिसमें ब्रोंकोस्कोप और नमकीन शामिल हैं। रोगी के गले के पीछे एनेस्थेटिक स्प्रे को प्रशासित करें। जब संभव हो तो सामयिक संज्ञाहरण के अत्यधिक उपयोग से बचें। हृदय की ओर जाता है छाती के लिए लागू करें ताकि दिल की दर और लय और एक हाथ की पहली उंगली करने के लिए एक ऑक्सीजन जांच की निगरानी करने के लिए ऑक्सीजन संतृप्ति की निगरानी के लिए. पूरक ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए नाक के कैनुला को नाक में डालें।
  2. रोगी को स्थिति, अधिमानतः सुपाच्य स्थिति में। प्रशासन सेडेशन इस प्रकार है: midazolam 0.01-0.04 mg/kg और fentanyl 50-100 डिग्री (रोगी आराम की सुविधा और खांसी पलटा कम से कम करने के लिए) नसों में, एक श्वसन विज्ञानी या एनेस्थेटिस्ट की उपस्थिति में.
  3. लचीला ब्रोंकोस्कोप अग्रिम जब तक यह वांछित उपखंडीय ब्रोंकस में wedged है. सिरिंज के साथ नमकीन (50-60 एमएल) को उत्तेजित करें, और फिर कोमल चूषण (50-80 mmHg) लागू करें। lavage तरल पदार्थ सिरिंज में इकट्ठा होगा और फिर एक संग्रह कंटेनर में स्थानांतरित किया जाएगा.
  4. lavage के 200-300 एमएल की कुल करने के लिए फ्लश दोहराएँ. यदि संभव हो तो बाल तरल पदार्थ के कम से कम 100 एमएल ले लीजिए।
  5. बर्फ पर BAL तरल पदार्थ रखें.

2. बाल कोशिकाओं का अलगाव

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट, वर्ग द्वितीय (BSL2) या उच्चतर में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए।

  1. बर्फ पर BAL नमूने रखें जब तक वे संसाधित कर रहे हैं.
    1. मूल संग्रह ट्यूब में बाल भंवर और एक serological pipette का उपयोग कर एक 50 एमएल ट्यूब के लिए यह हस्तांतरण. यदि BAL द्रव बहुत अशांत या फिलामेंटस ऊतक द्वारा दूषित दिखाई देता है, एक 70 m नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से एक नया 50 एमएल ट्यूब में तरल पदार्थ फिल्टर.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। एक नया 50 एमएल ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण. धीरे से एक पिपेट टिप के साथ गोली को तोड़ने और RPMI 1640 मध्यम के 1 एमएल में इसे फिर से निलंबित.
    3. 10x 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए सुपरनेंट के 1 एमएल और शेष सुपरनेंट को 15 एमएल ट्यूबों, प्रत्येक में 10 एमएल स्थानांतरित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर सभी supernatant ट्यूबों स्टोर।
  2. बाल कोशिका गोली की प्रक्रिया.
    1. मूल नमूने के हर 25 एमएल के लिए RPMI 1640 के 10 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। एक नया 15 एमएल ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण (यह सुनिश्चित करने के बाद वहाँ गोली में पर्याप्त कोशिकाओं रहे हैं छोड़).
    2. RPMI 1640 + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 1 एमएल में गोली resuspend और trypan नीले और एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर गिनती.
      नोट: यदि BAL तरल पदार्थ सॉर्ट करने से पहले कोशिकाओं के पालन से अलग नहीं है, तो अनुभाग 4 पर आगे बढ़ें।

3. BAL Cells का पालन (वैकल्पिक)

नोट: यह वैकल्पिक प्रोटोकॉल कक्ष सॉर्टिंग से पहले या उसके बजाय किया जा सकता है. निम्नलिखित प्रक्रिया एक BSL2 कैबिनेट (या उच्च) में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

  1. एक नई 15 एमएल ट्यूब को छँटाई के लिए BAL कोशिकाओं की वांछित संख्या स्थानांतरण और 1.5 x 106 मैक्रोफेज/एमएल के लिए सही मात्रा बनाने के लिए। 6-वेल प्लेटमें प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की प्लेट 2 एमएल और 5 % सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट, पालन के लिए समय की अनुमति देने के लिए।
  2. ऊष्मायन के बाद, ध्यान से गैर adherent कोशिकाओं वाले मीडिया aspirate और यह एक 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट निकालें और फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) में 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल पर पुन: स्नैच करें और निलंबन को 5 एमएल गोल-नीचे वाली पॉलीस्टाइरीन ट्यूब पर स्थानांतरित करें। इस लिम्फोसाइट अंश अब सेल छँटाई के लिए दाग के लिए तैयार है.
  3. प्लेट में शेष अनुलग्न कोशिकाओं के लिए, सेल-डिसासासोशन समाधान के प्रति 1 एमएल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें ) और कम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2के साथ इनक्यूबेट करें, जब तक कि कोशिकाएं प्लेट से आसानी से एक पिपेट टिप के साथ अलग न हो जाएं।
  4. धीरे लेकिन अच्छी तरह से एक पिपेट टिप का उपयोग कर सतह से अनुयायी कोशिकाओं परिमार्जन, और टुकड़ी के साथ सहायता करने के लिए अच्छी तरह से में तरल के 1 एमएल का उपयोग करें। कोशिकाओं को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 1 एमएल पीबीएस से कुएँ धोलें और इसे एक ही नली में डालें। पीबीएस के साथ 5 एमएल तक ट्यूब की सामग्री बनाएं।
  5. RT. RT. पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेंट निकालें, 1 x 107 cells/mL PBS + 2% FBS पर पुन: खोलें, और निलंबन को 5 एमएल गोल-नीचे पॉलीस्टाइरीन ट्यूब पर स्थानांतरित करें। इस माइलॉयड अंश अब सेल छँटाई के लिए दाग के लिए तैयार है.

4. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक BSL2 कैबिनेट (या उच्च) में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

  1. ब्रोंकोस्कोपी के एक ही दिन (आम तौर पर सीधे बाल संग्रह से पहले), ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) ट्यूबों (लगभग 10 एमएल प्रति ट्यूब) में एक दाता से शिरापरक रक्त के छह ट्यूब प्राप्त करते हैं।
  2. आरटी में 15 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर रक्त ट्यूबों को केंद्रित करके रक्त को अलग करें। प्लाज्मा को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल ऐलिकोट में स्थानांतरित करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. घनत्व ढाल जुदाई प्रदर्शन.
    1. प्रत्येक रक्त ट्यूब के लिए RPMI 1640 के 2 एमएल जोड़ें और एक serological pipette का उपयोग कर अच्छी तरह से मिश्रण.
    2. 3x 50 एमएल ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और RPMI 1640 के साथ 25 एमएल करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में मात्रा बनाते हैं।
    3. 3x 50 एमएल ट्यूबों का एक और बैच तैयार करें, जिसमें 20 एमएल लिम्फोसाइट जुदाई माध्यम (एलएसएम) (सामग्री की तालिकादेखें) RT पर धीरे-धीरे और धीरे-धीरे तीन ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए एलएसएम के शीर्ष पर पतला रक्त की 25 एमएल परत, ट्यूब को 45 डिग्री कोण पर पकड़े हुए हैं। .
    4. कम त्वरण और कोई मंदी (ब्रेक बंद) के साथ आरटी पर 25 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) की धुलाई करें।
    1. ट्यूब में दो तरल चरणों के इंटरफेस पर कोशिकाओं की परत एक सीरम संबंधी पिपेट का उपयोग कर एक 50 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण; यदि 30 एमएल से अधिक आयतन है, तो इसे दो नलों में विभाजित करें। पीबीएस के साथ 50 एमएल करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में मात्रा बनाओ.
    2. आरटी में 5 मिनट के लिए 700 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और जितना संभव हो उतना सुपरनेंट हटा दें।
    3. गोली resuspend और पीबीएस के साथ 25 एमएल करने के लिए मात्रा बनाते हैं. आरटी में 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और जितना संभव हो उतना सुपरनेंट हटा दें।
    4. चरण 4.4.3 में वर्णित धोने चरण को दोहराएँ.
    5. पीबीएस के 5 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें + 2% FBS और कोशिकाओं की गिनती.

5. पूरे बाल कोशिकाओं और PBMCs छंटनी

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक BSL2 (या उच्च) में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

  1. PBS युक्त छँटाई बफर तैयार + 5% FBS + 25 m HEPES (पीएच 7.4). हल किए गए सेल सबसेट के संग्रह के लिए एफबीएस के 1 एमएल के साथ 5 एमएल गोल-नीचे पॉलीस्टाइरीन ट्यूब तैयार करें।
  2. धुंधला प्रदर्शन करें।
    1. 3x 5 एमएल गोल नीचे polystyrene ट्यूब तैयार, बाल के लिए प्रत्येक (पूरी कोशिकाओं या लिम्फोसाइट और पालन के बाद माइलॉयड भिन्न) और PBMCs (अनुभाग 4 देखें). प्रत्येक सबसेट के लिए, सॉर्ट करने के लिए कोशिकाओं के साथ एक ट्यूब और 5 x 105 कोशिकाओं के दो ट्यूबों unstained और व्यवहार्यता दाग मुआवजा नियंत्रण के लिए उपयोग करने के लिए तैयार करते हैं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। supernatants निकालें, पीबीएस के 100 डिग्री एल में नियंत्रण के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक मुआवजा नियंत्रण चरण 5.2.6 में वर्णित के रूप में तैयार किया जा सकता है।
    3. पीबीएस में एफ सी रिसेप्टर (FcR) अवरुद्ध अभिकर्मक की एक 1:20 कमजोर पड़ने तैयार + 5% FBS (सामग्री की तालिकादेखें - FcR पर FcR-expressing कोशिकाओं को एंटीबॉडी के nonspecific बंधन को रोकने के लिए). FCR अवरुद्ध मिश्रण के 250 डिग्री एल में 1 x 107 कोशिकाओं पर उन्हें सॉर्ट करने के लिए कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 h के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं में उपयुक्त एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें (तालिका 1देखें) और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 1 ज धुंधला करने के बाद, कोशिकाओं में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रण जोड़ें। सुपरनेंट निकालें और बफ़र सॉर्ट करने में कक्षों को पुन: निलंबित करें जिसमें 250 0L में 1 x 107 कक्ष हैं. यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं को 70 डिग्री मी फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें.
    6. मुआवजा नियंत्रण तैयार करें।
      1. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस के प्रति 1 एमएल प्रति एंटी-माउस आईजी, जेड, और नकारात्मक नियंत्रण मुआवजा मोती (सामग्री की तालिकादेखें) में से प्रत्येक को तीन बूँदें जोड़ें और मुआवजे के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्रत्येक 5 एमएल गोल-नीचे वाली पॉलीस्टाइरीन ट्यूब को 100 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरित करें। उपयोग किए जाने वाले कॉकटेल में मौजूद प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के लिए एक ट्यूब तैयार करें।
      2. मोती युक्त एक अलग ट्यूब के लिए कॉकटेल में प्रत्येक एंटीबॉडी के 1 डिग्री एल जोड़ें. 5 x 105 कोशिकाओं के एक ट्यूब में व्यवहार्यता दाग के 1 $L जोड़ें चरण 5.2.1 में अलग सेट. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      3. प्रत्येक ट्यूब में पीबीएस का 1 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रण। सुपरनेंट निकालें और पीबीएस के 250 डिग्री एल में गोली को फिर से निलंबित करें। जब तक आवश्यक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा कोशिकाओं को FBS के 1 एमएल के साथ तैयार संग्रह ट्यूबों में सॉर्ट करें और सीरम के साथ ट्यूबों के पक्षों को कोट करने के लिए धीरे-धीरे घूमता है।
      1. कम दबाव पर BAL कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें। गेट कोशिकाओं को पहले शोर को बाहर करने और लाइव शामिल करने के लिए, CD45+ कोशिकाओं, और इस जनसंख्या के भीतर डबलेट कोशिकाओं बाहर (चित्र 3देखें)। बड़े माइलॉयड जनसंख्या के भीतर AMs के रूप में CD206 और CD169 डबल सकारात्मक कोशिकाओं को सॉर्ट; छोटे लिम्फोसाइट जनसंख्या के भीतर CD3 + कोशिकाओंको अलग और दोनों CD4 और CD8 एकल सकारात्मक आबादी सॉर्ट (देखें चित्र 3; गेटिंग रणनीति प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तृत).
      2. PBMCs सॉर्ट करते समय, गेट सेल पहले शोर को बाहर करने और लाइव शामिल करने के लिए, CD45+ कोशिकाओं, और इस जनसंख्या के भीतर डबलेट कोशिकाओं बाहर गेट. अगले, CD3 कोशिकाओं पर गेट और CD3 के भीतर- जनसंख्या, CD14 पर पहले गेट और सॉर्ट एकल-सकारात्मक monocytes, और फिर CD3 के भीतर+ CD4 और CD8 पर जनसंख्या गेट और दोनों एकल सकारात्मक आबादी सॉर्ट (गटिंग रणनीति में विस्तृत प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग.

6. एम्स और पीबीएम की इम्यूनोफेनोटाइपिंग

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक BSL2 कैबिनेट (या उच्च) में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

  1. दो अलग-अलग 5 एमएल गोल-नीचे polystyrene ट्यूबों के लिए एम्स और PBMCs के प्रत्येक 1 लाख तक जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें।
  2. एंटीबॉडी धुंधला की विशिष्टता में सुधार करने के लिए FcR अवरुद्ध प्रदर्शन. इसके लिए, पीबीएस के 100 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें + 2% एफबीएस और FCR अवरुद्ध अभिकर्मक के 1.4 $L जोड़ें। 4 oC पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट
  3. बाह्य अभिरंजन करें।
    1. FcR ब्लॉक के साथ ऊष्मायन के बाद, वांछित extracellular एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ने के लिए, ट्यूब भंवर, और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट.
    2. पीबीएस के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़कर 2x धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगिंग करें।
  4. निर्धारण और permebilization के लिए तैयार (विशिष्ट अभिकर्मकों का इस्तेमाल किया के लिए सामग्री की तालिका देखें).
    1. 1 भाग permeabilization बफर और 3 भागों diluent बफर के साथ permeabilization समाधान तैयार करें। 1 एमएल permeabilization समाधान में गोली को पुन: निलंबित करें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. 1 भाग धोने बफर और 4 भागों एच2ओ का उपयोग कर धोने समाधान तैयार करें, permebilized कोशिकाओं के लिए 2 एमएल धोने समाधान जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x g पर अपकेंद्रित्र। सुपरनेंट निकालें.
  5. इंट्रासेलुलर धुंधला प्रदर्शन.
    1. 1x धोने समाधान के 100 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, वांछित इंट्रासेल्यूलर एंटीबॉडी जोड़ें, ट्यूब ोंयलों को भ्रमित करें, और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर 2 एमएल वॉश घोल और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सुपरनेंट निकालें और पीबीएस के 200 डिग्री एल में गोली को फिर से शुरू करें। कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर जब तक की जरूरत है.

7. BAL सेल का रीमरी

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक BSL2 कैबिनेट (या उच्च) में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

  1. सेल संख्या की अनुमति, CRYopreserve बाल सेल गोली से जीवित कोशिकाओं (चरण 2.2.2 से).
    1. 90% FBS + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) युक्त फ्रीज मीडिया तैयार करें।
    2. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें और एक क्रायोजेनिक शीशी में फ्रीज मीडिया के 1.5 एमएल में resuspend. क्रायोजेनिक शीशियों को नियंत्रित दर हिमांक कंटेनर में स्थानांतरित करें (सामग्री की सारणीदेखें) और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। तापमान तक पहुँच जाता है एक बार लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित।
  2. सूखे छर्रों के रूप में बाल कोशिकाओं को संरक्षित करें।
    1. शेष कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 1 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर एक काउंटर-टॉप सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज को गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सुपरनेट निकालें। -80 डिग्री सेल्सियस पर गोली स्टोर करें।

8. एचआईवी डीएनए और आरएनए क्वांटाफिकेशन

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक BSL2 कैबिनेट (या उच्च) में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

  1. कुल एचआईवी डीएनए परिमाणीकरण
    1. BAL lysate मलबे के साथ polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के निषेध से बचने के लिए, एक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार बाल कोशिकाओं के एक नमूने से डीएनए निकालने के लिए। नीचे वर्णित preamplification चरण में एक मास्टर मिश्रण के साथ संयुक्त इस डीएनए के 15 डिग्री एल का प्रयोग करें (चरण 8.1.3).
    2. मानक वक्र कमजोर पड़ने तैयार करें।
      1. जैसा कि ऊपर, 2 x 106 ACH-2 कोशिकाओं की एक गोली से डीएनए निकालने के लिए एक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
      2. डीएनए के elution के बाद, ACH-2 डीएनए के धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन करने के लिए छह कमजोर पड़ने उत्पन्न करने के लिए, से लेकर 3 x 105 कोशिकाओं को 3 कोशिकाओं प्रति 15 $L.
    3. एक preamplification कदम प्रदर्शन.
      1. एक अलग कमरे में, n के लिए मास्टर मिश्रण तैयार + 2 नमूने 1x polymerase बफर, 3 mM MgCl2, 300 $M dNTPs, और 2.5 Tक डीएनए polymerase के यू (सामग्री की मेजदेखें) और चार प्राइमर में से प्रत्येक के 300 एनएम (देखें चरण 8.1.3.2). त्रिफला कुओं में सभी उपाय करें।
      2. मानव CD3 और एचआईवी दोनों से प्रवर्धित डीएनए उत्पन्न करने के लिए प्राइमर्स hCD3OUT5', hCD3OUT3', ULF1, और UR1 का उपयोग करें (तालिका 2में अनुक्रम देखें)। ध्यान दें कि दोनों जीन एक ही ट्यूब में preamplified हैं. धीरे मिक्स और पूरा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब नीचे स्पिन.
      3. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण के 35 डिग्री एल वितरित करें और मानक या नमूना डीएनए के 15 डिग्री एल जोड़ें। कुल अभिक्रिया आयतन 50 उउL है।
      4. preamplification (8 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर denaturation, 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 12 चक्र के बाद, 40 s के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 15 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाना) प्रदर्शन करें।
    4. वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
      1. CD3 और एचआईवी डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 1x पीसीआर प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण युक्त दो मास्टर घोला जा सकता है तैयार (सामग्री की मेजदेखें), 1,250 एनएम उपयुक्त प्राइमर्स, और 100 एनएम जांच. प्राइमर HCD3IN5' और HCD3IN3' और सीडी 3 Famzen जांच एक प्रतिक्रिया में मानव CD3 मात्रा में करने के लिए, और प्राइमर UR2 और LambdaT और जांच UHIV Famzen एक और प्रतिक्रिया में एचआईवी डीएनए मात्रा निर्धारित करने के लिए (तालिका 2में दृश्यों देखें). ुपीसीआर-अनुकूलित नलों में प्रत्येक मिश्रण का 13.6 डिग्री सेल्सियस वितरित करें।
      2. बाँझ पानी, DNase, RNase, और प्रोटीज़ मुक्त में 1:10 पर preamplification पीसीआर उत्पाद को पतला। 20 डिग्री सेल्सियस की कुल अभिक्रिया आयतन के लिए ुपीसीआर मिश्रण के 13ण्6 डिग्री सेल्सियस मिश्रण में प्रत्येक पतला नमूने का 6ण्4 र्ल जोड़ें।
      3. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग कर वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन: 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 3 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और एकल अधिग्रहण के साथ 10 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण।
      4. मानक वक्रों से प्रत्येक प्रतिक्रिया नली में एचआईवी प्रतियों और संख्या सेल समकक्षों की संख्या को अतिरिक्त करें। एचआईवी डीएनए प्रतियां की संख्या की गणना /
  2. एचआईवी आरएनए परिमाणीकरण
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, BAL कोशिकाओं के एक नमूने से आरएनए निकालें, आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें)। इस आरएनए के 17 डिग्री सेल्सियस का उपयोग रिवर्स प्रतिलेखन और नीचे वर्णित preamplification चरण में (चरण 8.2.4)।
    2. LTR-gag आरएनए इन विट्रो में संश्लेषित और ठीक मात्रा निर्धारित मानक के रूप में प्रयोग किया जाता है; यह GUSB सामान्यीकरण के लिए स्वस्थ दाता आरएनए निकालने में नुकीला है. इस मानक के छह धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने तैयार करें, जो 3 x 105 कोशिकाओं के अनुरूप 17 डिग्री एल में एलटीआर-गैग आरएनए की तीन प्रतियों के लिए संगत है।
    3. प्रत्येक मानक कमजोर पड़ने के 17 डिग्री सेल्सियस और एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में प्रत्येक नमूना वितरित करें और डीएनएसे के साथ नमूनों का इलाज करें (सामग्री की तालिकादेखें ) 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए संदूषक जीनोमिक डीएनए को हटाने के लिए। 25 एमएम EDTA के 2 डिग्री एल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो और 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने इनक्यूबेट।
    4. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) और preamplification पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
      1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक-चरण RT-PCR किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके यह चरण निष्पादित करें. प्राइमर GUSB आगे का प्रयोग करें 1, GUSB रिवर्स 1, UR1, और ULF1 दोनों मानव GUSB से प्रवर्धित CDNA गृह व्यवस्था जीन और LTR-gag एचआईवी आरएनए के रूप में उत्पन्न करने के लिए (तालिका 2में दृश्यों देखें). जीयूएसबी मूल्यों का उपयोग एचआईवी मूल्यों को सामान्य करने के लिए किया जाएगा।
      2. एक ही 96-वेल PCR प्लेट में प्रति अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण के 31 $L वितरित DNase इलाज मानकों और नमूनों युक्त और अच्छी तरह से मिश्रण. कुल अभिक्रिया आयतन 50 उउL है।
      3. 55 डिग्री सेल्सियस के एक अनीलन तापमान के साथ, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 16 चक्र के लिए प्लेट चलाएँ।
    5. वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
      1. 1x पीसीआर प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण (चरण 8.1.4.1) में ऊपर के रूप में युक्त दो मास्टर घोला जा सकता है तैयार, 1250 एनएम उपयुक्त प्राइमर, और 100 एनएम जांच. प्राइमर जीयूएसबी फॉरवर्ड 2, जीयूएसबी रिवर्स 2, और एक प्रतिक्रिया में GUSB cDNA की मात्रा निर्धारित करने के लिए GUSB-HEX की जांच करें; एक और प्रतिक्रिया में एचआईवी cDNA मात्रा निर्धारित करने के लिए प्राइमर्स UR2, LambdaT, और जांच UHIV Famzen का उपयोग करें (तालिका 2में दृश्यों देखें)।
      2. ुपीसीआर-अनुकूलित नलों में प्रत्येक मास्टर मिश्रण का 13.6 डिग्री सेल्सियस वितरित करें। बाँझ पानी में आरटी preamplification PCR उत्पादों 1:10, DNase, RNase, और प्रोटीज़ मुक्त पतला, और उचित पीसीआर मिश्रण करने के लिए प्रत्येक पतला नमूना या मानक के 6.4 $L जोड़ें। कुल अभिक्रिया आयतन 20 उउL है।
      3. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग कर वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन: 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 3 एस और 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए एक अधिग्रहण के साथ 10 एस के लिए विकृतीकरण (Famzen और हेक्स के लिए पीले रंग के लिए हरे चैनल का चयन करें)।

Representative Results

सबसे nonsmokers में, बाल तरल पदार्थ एक बाँझ कंटेनर में प्राप्त किया जाता है और एक थोड़ा अशांत पीले नारंगी रंग का तरल है। यदि दाता ब्रोंकोस्कोपी के दौरान एंडोब्रोन्कियल बायोप्सी करता है और कुछ रक्तस्राव हुआ तो तरल पदार्थ रंग में गुलाबी हो सकता है। तरल पदार्थ रंग में गहरा हो सकता है अगर दाता एक धूम्रपान करने वाला है. centrifugation के बाद, बाल supernatant लगभग स्पष्ट और थोड़ा नारंगी हो जाएगा, जबकि सेल गोली बंद सफेद से बहुत गहरे भूरे रंग के रंग में रेंज कर सकते हैं, नमूना की स्थिति पर निर्भर करता है और क्या दाता एक धूम्रपान करने वाला था या नहीं.

पूरे BAL नमूने की गणना करते समय, विभिन्न सेल प्रकारों की कल्पना की जा सकती है, जिसमें व्यास में 17 डिग्री मीटर के आस-पास बड़ा, गोल मैक्रोफेज और व्यास 18में 7ण्3 उ लगभग छोटे गोल लिम्फोसाइट शामिल हैं (चित्र 2देखें)। धूम्रपान करने वालों में मैक्रोफेज का लगभग 40%18हो जाता है . सेल प्रकार के बीच अंतर मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों अलग से गिनती के लिए अनुमति देता है. वहाँ भी कुछ मलबे क्षेत्र में दिखाई, विशेष रूप से धूम्रपान करने वालों से नमूने में हो सकता है. Macrophages बाल में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार हैं, nonsmokers20में कोशिकाओं के लगभग 85% के लिए लेखांकन , और वे धूम्रपान करने वालों में समृद्ध कर रहे हैं ताकि वे लगभग अनन्य लग सकता है.

बाल कोशिकाओं को एकीकृत करने की प्रवृत्ति है, तो वे सभी जोड़तोड़ के दौरान अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए. गोली कई धोने चरणों के बाद भी अंधेरे दिखाई दे सकता है. यदि कोशिका छँटाई के लिए धुंधला करने के बाद अंश में फिलामेंटस मलबा स्पष्ट है, तो कोशिका ओंकार को कोशिका सॉर्टर के माध्यम से चलाने से पहले कोशिकाओं को 70 डिग्री मीटर फिल्टर से गुजारें।

मैक्रोफेज को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बड़ी छोटी बूंद आकार सुनिश्चित करने के लिए बाल कोशिकाओं की छँटाई कम दबाव पर की जानी चाहिए। कोशिकाओं को पहले सभी CD45+21 कोशिकाओं को शामिल करने के लिए गेट किया जाता है, और फिर सभी मृत कोशिकाओं को बाहर रखा गया है यह सुनिश्चित करने के लिए व्यवहार्यता पर आधारित (चित्र 3देखें)। एकल कोशिकाओं तो चुना जाता है और इस के भीतर, दो आबादी आकार और आकृति विज्ञान के आधार पर gated रहे हैं, अर्थात् बड़ा माइलॉयड कोशिकाओं और छोटे लिम्फोसाइटों (चित्र 3देखें). बड़े कक्षों के भीतर, कोशिकाओं CD20622,23 और CD16922 और डबल सकारात्मक कोशिकाओं AMs के रूप में हल कर रहे हैं पर gated रहे हैं, जबकि छोटे कोशिकाओं के भीतर, CD3+ कोशिकाओं को चुना और CD4 और CD8 पर gated हैं; CD4 एकल-धनात्मक और CD8 एकल-धनात्मक कक्ष सॉर्ट किए जाते हैं (चित्र 3देखें). इस्तेमाल किया मार्करों AMs के पहले वर्णित phenotypes के आधार पर चुना गया था, इस तरह के mannose रिसेप्टर CD206 के रूप में, phagocytic कोशिकाओं पर पाया23, और sialoadhesin रिसेप्टर CD16922.

PBMCs सॉर्ट करते समय, कक्षों को पहले आगे और साइड स्कैटर पर गेट किया जाता है जो एक सजातीय लिम्फोसाइट जनसंख्या दिखाना चाहिए, जिनमें से सभी लिया जाता है, शून्य-अक्ष के करीब शोर को छोड़कर (डेटा नहीं दिखाया गया). जनसंख्या व्यवहार्यता और CD45 पर gated है, और जीना CD45+ कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है. यह आबादी तो CD3 पर gated है; monocytes को अलग करने के लिए, CD3- जनसंख्या CD14 पर बाद में gated है और सभी एकल सकारात्मक कोशिकाओं को हल कर रहे हैं. लिम्फोसाइट सबसेट को अलग करने के लिए, CD3+ कक्ष CD4 और CD8 पर गेट किए जाते हैं और एकल सकारात्मक और कक्ष जनसंख्या दोनों सॉर्ट किए जाते हैं.

Figure 1
चित्र 1 : प्रोटोकॉल सिंहावलोकन. जनरेट किए गए नमूनों के संभावित डाउनस्ट्रीम उपयोगों सहित प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध. PBMC - परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं; बाल ] ब्रोंकोल्वेलर लावेज; LSM - लिम्फोसाइट जुदाई माध्यम. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : पूरे बाल तरल पदार्थ के माइक्रोस्कोप क्षेत्र दृश्य। (ए) एक नॉनस्मोकर और (बी) से माइक्रोस्कोप छवियों दृश्य लिम्फोसाइटों (एल), मैक्रोफेज (एम), और लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के साथ एक धूम्रपान करने वाला. आवर्धन 1,000x (10x नेत्र और तेल विसर्जन के साथ 100x लेंस) है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : प्रतिनिधि पूरे बाल कोशिकाओं की सेल छँटाई के लिए रणनीति gating. गैटिंग रणनीति पूरे बाल सेल नमूनों से कूपिका मैक्रोफेज (एएम), सीडी 4, और सीडी 8 टी कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना एंटीबॉडी फ्लोरोक्रोम क्लोन प्रति परीक्षण वॉल्यूम ($L)
बीएएन और पीबीएमसी लाइव/मृत एपीसी-एच 7 - 1
CD45 पीई-Cy7 HI30 5
सीडी 3 एलेक्सा700 UCHT1 २
सीडी 4 पीई-साइ5 आरपीए-टी 4 4
सीडी 8 बीवी 605 एसके1 3
केवल BAL CD206 पीई 19.2 10
CD169 BB515 7-239 5
केवल पीबीएमसी CD14 बीवी786 एम 5ई2 5

तालिका 1: पूरे BAL कोशिकाओं और अलग PBMCs की छँटाई के लिए फ्लो पैनल.

लक्ष्य चरण प्राइमर नाम प्राइमर अनुक्रम
एचआईवी कुल डीएनए या एचआईवी एलटीआर-गैग आरएनए पूर्व amplification पीसीआर UR1 5'-सीसीए टीसीटी सीटीसी टीसीसी टीटीसी टैग सी-3'
यूएलएफ1 5'-एटीजी सीसीए CGT AAG CGA एसी टीसीटी जीजीजी टीसीटी सीटीसी टीजीटी टीजी टी जी टी जी जी -3'
वास्तविक समय पीसीआर यूआर 2 5'-CTG AGG GAT CTC टैग टीटीए सीसी-3'
लैम्बडाT 5'-एटीजी सीसीए CGT AAG CGA AAC T-3'
यूएचवी फैमजेन: 5'-56-FAM/CA CTC AAG G/JEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3'
CD3 डीएनए पूर्व amplification पीसीआर HCD3 बाहर 5' 5'-ACT GAC ATG GAA कैग जीजी एजी-3'
HCD3 बाहर 3' 5'-सीसीए जीसीटी सीटीजी एजी टैग GGA ACA TAT-3'
वास्तविक समय पीसीआर 5' में HCD3 5'-जीजीसी टैट कैट टीसीटी टीसीए एजी टी-3'
HCD 3 में 3' 5'-सीसीसीटी टीटीसी एजीसी कैट TTA AGT A-3'
CD3 फैमजेन: 5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/JEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3'
जीयूएसबी आरएनए पूर्व amplification पीसीआर जीयूएसबी फॉरवर्ड 1: 5'-एसीसी टैग AAT CTG GCT अधिनियम A-3'
जीयूएसबी रिवर्स 1: 5'- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3'
वास्तविक समय पीसीआर जीयूएसबी फॉरवर्ड 2: 5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3'
जीयूएसबी रिवर्स 2: 5'- सीसीटी टीजीटी सीटीजी सीटीजी कैट एजी एजी ए-3'
जीयूएसबी-हेक्स: 5'-/5HEX/TCGCTCACA/जेन/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'

तालिका 2: एचआईवी डीएनए और आरएनए परिमाणीकरण के लिए प्राइमर और जांच दृश्यों।

Discussion

इसमें हमने बाल तरल पदार्थ को संसाधित करने के लिए CD4 T cells और AMs प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन किया, साथ ही मिलान PBMCs, जो फेफड़ों के भीतर एचआईवी जलाशय की जांच करने के लिए अध्ययन किया जा सकता है. हमने हाल ही में मिलान परिधीय रक्त और बाल नमूनों से सीडी 4 टी कोशिकाओं में एचआईवी डीएनए परिमाणीकरण पर रिपोर्ट की है, और हमारे समूह ने दिखा दिया है कि एचआईवी परिधीय रक्त15से उन लोगों की तुलना में फुफ्फुसीय CD4 टी कोशिकाओं में 13 गुना अधिक प्रचुर मात्रा में है। हालांकि, एम्स में एचआईवी डीएनए के स्तर दाता पर निर्भर हैं और इसलिए, इस प्रकार अब तक, मैक्रोफेज15की तुलना में लिम्फोसाइटों में एचआईवी डीएनए के स्तर के बीच एक सुसंगत संबंध नहीं रहा है। इन प्राथमिक मैक्रोफेज सेल सबसेट तक पहुंच, हालांकि, इस सवाल से पूछताछ करने और एचआईवी जलाशय के संदर्भ में फेफड़ों में वायरल लोड की बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा।

पूर्व एआरटी युग में और कई अन्य अध्ययनों में बाल तरल पदार्थ का उपयोग, प्रतिभागियों को एक संदिग्ध विकृति का निदान या श्वसन लक्षणों के लिए एक सूक्ष्मजीवी निदान प्राप्त करने के क्रम में ब्रोंकोस्कोपी लिया3. हालांकि, हम किसी भी सक्रिय फुफ्फुसीय लक्षण या रोगों के बिना प्रतिभागियों की भर्ती करने में सक्षम थे और सभी प्रतिभागियों ने एक नैतिक सहमति फार्म15पर हस्ताक्षर किए। हम अपने केंद्र से प्रतिभागियों की भर्ती करने में सक्षम थे जो अन्य अध्ययनों में भाग ले रहे थे, जैसे कि ऑब्सट्रक्टिव फेफड़ों की बीमारी के लिए एक स्पाइरोमेट्री स्क्रीनिंग अध्ययन24, साथ ही साथ अन्य अनुसंधान प्रक्रियाओं के दौर से गुजर रहे लोगों के रूप में, जैसे ल्यूकाफेरेसिस और Colonoscopy. एचआईवी के साथ रहने वाले लोगों के बीच पिछले शोध से पता चला है कि परोपकारिता अनुसंधान अध्ययनों में भागीदारी को प्रेरित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारकहै 25. कई मानव नमूनों के साथ की तरह, हम व्यक्ति से व्यक्ति परिवर्तनशीलता का एक बड़ा सौदा नोट किया. वहाँ कोई रास्ता नहीं था "पूर्वकथन" जिसमें से प्रतिभागियों हम अच्छा बनाम गरीब सेल पैदावार के साथ बाल प्राप्त होगा. परिधीय रक्त के विपरीत, जो लिम्फोसाइटों की काफी सुसंगत संख्या पैदावार, बाल तरल पदार्थ में सेल संख्या बहुत चर रहे हैं. फेफड़ों में सामान्य नमकीन की एक बड़ी मात्रा इंजेक्शन (बाल तरल पदार्थ की एक बड़ी वापसी प्राप्त करने की उम्मीद के साथ) हमेशा संभव नहीं है के रूप में सामान्य नमकीन की बड़ी मात्रा अक्सर अधिक खाँसी और बुखार postbronchoscopy के एक उच्च जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं. हमने देखा कि एक छोटे का उपयोग कर (बड़े से बजाय) व्यास ब्रोंकोस्कोप श्वसन विज्ञानी ब्रोंची में गहरी तक पहुँचने और कोशिकाओं की अधिक मात्रा से युक्त तरल पदार्थ प्राप्त करने के लिए सक्षम. एक सुसंगत निष्कर्ष यह था कि तंबाकू धूम्रपान करने वालों को उनके बाल तरल पदार्थ के भीतर लिम्फोसाइटों की तुलना में एम्स का बहुत बड़ा अनुपात था, जो एम्स मलबे और कण पदार्थ को निगल के रूप में की उम्मीद है. इसके अलावा, हमने देखा कि धूम्रपान करने वालों से बाल तरल पदार्थ मलबे जो पीसीआर मशीनों और प्रवाह cytometers के रूप में इस्तेमाल किया उपकरणों को ब्लॉक कर सकते हैं निहित. इसी तरह के मुद्दों को उच्च प्रदूषण के क्षेत्रों में देखा जा सकता है या खराब हवा की गुणवत्ता के लिए अधिक बार उजागर व्यक्तियों.

एचआईवी जलाशयों और वायरल दृढ़ता की स्थापना में उनकी भूमिका के संबंध में, सीडी 4 टी कोशिकाओं और एम्स की शुद्धता एक महत्वपूर्ण विचार है. इस कारण से, हम अत्यधिक शुद्ध सेल आबादी प्राप्त करने के लिए फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करने का विकल्प चुना। यह भी संभव है कि एकत्र किए गए बाल तरल पदार्थ रक्त से दूषित हो सकता है क्योंकि ब्रोंकोस्कोपी के दौरान कुछ मामूली रक्तस्राव की संभावना होती है; भोले बी कोशिकाओं की उपस्थिति इस संकेत होता है, और कोशिकाओं को एक लाल रक्त कोशिका lysis बफर में धोया जा सकता है इस समस्या को दरकिनार. बाल तरल पदार्थ का अध्ययन के साथ एक और चुनौती भड़काऊ मार्करों और साइटोकिन्स, जो एचआईवी हठ26को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं की मात्रा निर्धारित करने से संबंधित है. के रूप में पैदा नमकीन बाल तरल पदार्थ पतला, भड़काऊ मध्यस्थों और साइटोकिन्स के स्तर को मापने के लिए मुश्किल हो सकता है. यद्यपि यूरिया सुधार कारक को कमजोर करने का प्रस्ताव किया गया है , फिर भी इसके उपयोग का वर्णन करने वाले अपेक्षाकृत कम साहित्यहैं.

एम्स अत्यधिक स्वप्रवाही होते हैं, जो सेल छँटाई और प्रवाह साइटोमेट्री फेनोटाइपिक विश्लेषण के दौरान एक समस्या बन जाता है। विशेष रूप से, प्रभाव धूम्रपान करने वालों जिसका एम्स पूरी तरह से रंग में काला हो सकता है में अधिक स्पष्ट है, काफी उनके autofluorence को प्रभावित. जब एक मानक नीले 488 एनएम लेजर से उत्साहित, AM autofluorscence लगभग 540 एनएम पर अपने चरम पर है, जो आमतौर पर इस्तेमाल किया conzugates के फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप ऐसे FITC और पीई29,30. यह ध्यान देने योग्य बात है कि दो अलग लेज़रों FITC और पीई उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लायक है (उदाहरण के लिए, पीले / FITC के साथ निहित autofluorence पर काबू पाने के लिए, हम unstained AMs का इस्तेमाल किया autofluorence पृष्ठभूमि निर्धारित करने के लिए. इसके अलावा, इन तकनीकी मुद्दों का मुकाबला करने के लिए एक (FMO) नियंत्रण शून्य से फ्लोरोसेंट का उपयोग बहुत उपयोगी हो सकता है। बड़े मोती (उदाहरण के लिए, 7.5 डिग्री) का उपयोग किया जा सकता है, जो मैक्रोफेज आबादी को मुआवजा देने के लिए आकार में करीब हैं, छोटे मोती की तुलना में (उदाहरण के लिए, 3.0 डिग्री), जो लिम्फोसाइट आबादी को मुआवजा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक और भी अधिक उपयुक्त दृष्टिकोण एकल दाग नियंत्रण के रूप में कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश का उपयोग करने के लिए किया जाएगा, एक ज्ञात का उपयोग कर, उच्च व्यक्त मार्कर सबसेट पर, जैसे HLA-DR या CD45, वांछित fluorochromes में से प्रत्येक के लिए संयुग्मी, जो एक बहुत अधिक के लिए अनुमति होगी मोती के साथ प्राप्त किया जा सकता है की तुलना में सटीक मुआवजा. धूम्रपान करने वालों के नमूने के मामले में, इस रणनीति के रूप में मैक्रोफेज बहुत बड़ा है और अधिक autofluorescent विशेष रूप से उपयोगी है. इसके अलावा, तैयारी कदम से, पूरे BAL नमूना प्रोटोकॉल के खंड 3 में वर्णित के रूप में छँटाई से पहले एक थाली में सुसंस्कृत किया जा सकता है, पालन द्वारा आबादी के एक जुदाई की अनुमति देने के लिए. इस तरह, अनुयायी मैक्रोफेज को लिम्फोसाइटों जैसे अन्य गैर-संलग्न कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है। मुआवजा अभी तक कम चुनौतीपूर्ण है अगर लिम्फोसाइट और AM आबादी को एक साथ जांच के बजाय अलग कर रहे हैं; हालांकि, पालन पर निर्भर मैक्रोफेज का नुकसान होगा, जो एक महत्वपूर्ण विचार है जब सेल संख्या पहले से ही सीमित कर रहे हैं. इसके अलावा, एक पालन चरण adherent monocytes, जो इन कोशिकाओं का उपयोग कर उत्पन्न downstream परिणामों को प्रभावित कर सकता है की अवांछित सक्रियण में परिणाम हो सकता है. शुद्ध आबादी में कोशिकाओं छँटाई के मूल्य बाद के प्रयोगों के लिए कम ऐसी कोशिकाओं होने के प्रतिबंध के खिलाफ तौला जाना चाहिए.

अन्य मॉडल, सबसे विशेष रूप से murine मॉडल, मैक्रोफेज इम्यूनोलॉजिकल विशेषताओं और जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। जबकि इन मॉडलों अत्यंत उपयोगी होते हैं और एक सेल प्रकार है कि हेरफेर करने के लिए मुश्किल है में महान अंतर्दृष्टि की अनुमति है, वे सीमाएं हैं. सेल सतह मार्करों के कई चूहों और मनुष्यों के बीच भिन्न इस तरह है कि मानव एम्स के इम्यूनोफेनोटाइप पूरी तरह से समझ में नहीं आता है. हालांकि, इस मॉडल प्रणाली प्रत्येक जानवर से उपलब्ध कम सेल संख्या के कारण परख के लिए कई चूहों के पूलिंग की आवश्यकता है. इसके अलावा, नमूनों को पूल करने की आवश्यकता आनुवंशिक गड़बड़ी और सेक्स के विचारों को रोकती है। हाल ही में, यह दिखाया गया है कि सेक्स प्रतिबंध कारक SAMHD-131की असमान अभिव्यक्ति के कारण एचआईवी-1 द्वारा मैक्रोफेज की संक्रमितता में एक भूमिका निभाता है। गैर-मानव प्राइमेट (एनएचपी) मनुष्यों के निकटतम मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं और सिमियन इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस (एसआईवी) संक्रमण और प्रतिरक्षा प्रणाली पर इसके प्रभाव के अध्ययन में मदद करते हैं, जो ऊतक-निवासी मैक्रोफेज की भूमिका में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं एकाणुक व्युत्पन्न मैक्रोफेज। रीसस मैकैक में, यह भी दिखाया गया है कि फेफड़ों के मैक्रोफेज बाल बंदरगाह से एक प्रतिकृति-सक्षम वायरस बंदरगाह; एक वायरल वृद्धि परख (वीओए) ऊतक निवासी कोशिकाओं32में SIV के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस तरह के एक खोज महत्वपूर्ण अनुसंधान मूल्य का है, लेकिन अभी भी मनुष्यों में मान्य किया जाना चाहिए इससे पहले कि इसे लागू किया जा सकता है, और NHPs का उपयोग करने की उच्च लागत बड़े नमूना आबादी के उपयोग precludes. इसके अतिरिक्त, मानव एम्स कई अन्य अनुप्रयोगों जैसे विट्रो वायरल/माइक्रोबायल संक्रमण परख और क्षय रोग/एचआईवी सहसंक्रमण जैसे अन्य रोगजनकों के अध्ययनों के लिए उपयोगी होगा।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को अपने funders स्वीकार करना चाहते हैं: कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR) (सीसी, MAJ, नेकां के लिए #153082 अनुदान); आरज़ौ सिडा एट बीमारियों infectieuses du Fonds de recherche du Qubec-Sant] (FRQ-S) जो सीसी और MAJ और McGill विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय के लिए धन प्रदान की है जो सीसी के लिए धन प्रदान की. इस अध्ययन में भी भाग में समर्थित किया गया था कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (CIHR) - वित्त पोषित कनाडा एचआईवी इलाज उद्यम (CanCURE) टीम अनुदान HB2 - 164064 MAJ, सीसी और नेकां के लिए. MAJ इम्यूनोवायरोलॉजी और सीसी में सीआईएचआर कनाडा रिसर्च चेयर टियर 2 रखती है और नेकां क्रमशः एक FRQ-एस जूनियर 1 और जूनियर 2 अनुसंधान वेतन पुरस्कार पकड़ते हैं। ईटी एक आरआई-MUHC छात्र संघ पुरस्कार रखती है.

इसके अलावा, लेखकों को समन्वय और नमूने प्राप्त करने में शामिल सभी नैदानिक स्टाफ जोस Girouard स्वीकार करना चाहते हैं, साथ ही श्वसन चिकित्सक; आरआई-MUHC इम्यूनोफेनोटाइपिंग मंच पर एकातेरिना Iourtchenko, H[l]ne Pag]-Veillette, और Marie-H[l]ne Lacombe; और माइक्रोस्कोपी फोटो के प्रावधान के लिए डॉ. सबसे महत्वपूर्ण बात, लेखकों के लिए कई स्वयंसेवकों जिसके बिना इस अनुसंधान संभव नहीं होगा शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22363548 Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting
ACH-2 Cells NIH 349 HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4
BD FACSAria BD Biosciences N/A Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)
BD LSRFortessa X-20 BD Biosciences N/A  Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)
Bronchoscope Olympus BF-1TH190  EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm
Cell Disassociation Solution Sigma C5914  Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.
CD169  BB515 BD Biosciences 565353 Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry
CD14  BV786 BD Biosciences 563698 Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry
CD206  PE BD Biosciences 555954 Mannose receptor antibody used for flow cytometry
CD3  Alexa700 BD Biosciences 557943 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD4  PE-Cy5 BD Biosciences 555348 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD45  PE Cy-7 BD Biosciences 557748 Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry
CD8  BV605 BD Biosciences 564116 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CompBead Plus BD 560497 Anti-mouse  Ig, κ  and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry
DNase I Invitrogen 18068015 Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA
dNTP Set 100 mM Invitrogen  10297-018 Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418  Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells
EDTA Invitrogen AM9912 Used to stop Dnase I enzyme activity
FBS Wisent Bioproducts 080-150 Premium fetal bovine serum to supplement media
FcR Blocking Reagent, Human Miltenyi 130-059-901 Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies
FlowJo v10 FlowJo LLC N/A Flow cytometry analysis software used for all analyses
HLA-DR  BV650 BD Biosciences 564231 MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry
HyClone HEPES solution Fisher Scientific SH3023701 Buffer providing maintenance of physiological pH 
Live/Dead  APC-H7 Invitrogen L34975 Viability marker used for flow cytometry
Lymphocyte Separation Medium (LSM) Wisent Bioproducts 350-000-CL Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001 Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1 °C/min, the optimal rate for cell preservation
OneComp eBeads Invitrogen 01-1111-41 Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples
PBS 1x Wisent Bioproducts 311-010-CL Phosphate buffered saline for cell washing and staining
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene Axygen PCR-0104-C 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene
PerfeCTa qPCR ToughMix Quantabio 95112 2x concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates 
QiaAmp DNA Mini Kit Qiagen 51304 Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers
Rotor-Gene Q Qiagen 9001550 Real-time PCR cycler
RPMI 1640 1x Wisent Bioproducts 350-000-CL Cell culture media
Sterile Water Wisent Bioproducts 809-115-CL DNase, RNase & protease free
Superscript™ III One-Step RT-PCR System  Invitrogen 12574018 RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate
Taq DNA Polymerase  Invitrogen 18038-042 Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10x PCR buffer, magnesium chloride
Transcription Factor Buffer Set BD Biosciences 562725 Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer
Trypan Blue Sigma T8154 Viability dye to count cells using haemacytometer 

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References

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Retraction अंक 148 Bronchoalveolar lavage (BAL) एल्वेओलर मैक्रोफेज इम्यूनोफेनोटाइपिंग सीडी 4 टी कोशिकाओं एचआईवी आरएनए एचआईवी जलाशय माइलॉयड कोशिकाओं एंटीरेट्रोवायरल थेरेपी (एआरटी) एल्वीओलर मैक्रोफेज (एम्स)
अल्वेलर मैक्रोफेज और सीडी 4<sup>+</sup> टी-सेल इम्यूनोफेनोटाइपिंग और एचआईवी जलाशय आकलन के लिए ब्रोंकोएलवेलर लावेज द्रव और मिलान रक्त का प्रसंस्करण
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