Summary
Vi beskriver en metod för bearbetning av bronkoalveolär pumpning vätska och matchade perifert blod från kroniskt hiv-infekterade individer på antiretroviral behandling för att bedöma pulmonell hiv-reservoarer. Dessa metoder resulterar i förvärvet av mycket rena CD4 T-celler och alveolära makrofager som senare kan användas för immunfenotypning och hiv DNA/RNA kvantifieringar genom ultraljud polymeras kedjereaktion.
Abstract
Bronkoskopi är ett medicinskt ingrepp där normal saltlösning injiceras i lungorna via ett bronkoskop och sedan sug appliceras, ta bort bronkoalveolär pumpning (bal) vätska. BAL vätskan är rik på celler och kan därmed ge en "ögonblicksbild" av lung immun miljön. CD4 T-celler är de bästa kännetecknas HIV-reservoarer, medan det finns starka belägg som tyder på att vävnad makrofager, inklusive alveolära makrofager (AMs), också fungera som virala reservoarer. Mycket är dock fortfarande okänt om AMs roll i samband med etablering och underhåll av HIV-reservoaren. Därför, utveckla ett protokoll för bearbetning av BAL vätska för att få celler som kan användas i virologiska och immunologiska analyser för att karakterisera och utvärdera cellpopulationer och undergrupper inom lungan är relevant för att förstå rollen av lungorna som HIV Reservoarer. Häri beskriver vi ett sådant protokoll och använder standardtekniker som enkel centrifugering och flödescytometri. CD4 T-celler och AMS kan sedan användas för efterföljande tillämpningar, inklusive immunfenotypning och hiv-DNA och RNA-kvantifiering.
Introduction
En av de mest betydande utmaningarna inför ett botemedel mot hiv-infektion är närvaron av latent hiv-reservoar som orsakar en rebound av plasma viremia efter avbrottet i antiretroviral terapi (art)1,2. Medan HIV-reservoaren under långsiktig konst är väl dokumenterad i flera vävnad fack, inklusive sekundära lymfoida organ, Gut-associerade lymfoida vävnad (GALT), och det centralanervsystemet (CNS), lungorna har förbisetts som ett område i studien sedan pre-ART era3. Men, lungorna spelar en central roll i patogenesen av HIV. I själva verket, lungsymtom var bland de första indikatorerna på AIDS-relaterade opportunistiska infektioner4. Även i den moderna tidsåldern är personer med HIV en större risk att utveckla både smittsamma och icke-infektiösa lungsjukdomar än personer utan HIV. Till exempel, personer med hiv-infektion är en förhöjd risk för invasiv streptokock pneumoniae infektion, samt kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol)5,6. Dessutom är samtidig infektion med tuberkulos (TB) och HIV en betydande folkhälso utmaning i vissa regioner i världen, särskilt Afrika söder om Sahara, eftersom HIV-infekterade individer är 16 till 27 gånger mer benägna att ha tuberkulos än personer utan HIV7. Även om vissa förklaringar till denna känslighet för lunginfektion och kronisk sjukdom har föreslagits8,9,10, den exakta cellulära mekanismer som individer med undertryckt hiv plasma virusbelastningen är fortsatt högre risk för pulmonella komplikationer har inte helt klarlagts. Viktigt, HIV är en mycket stark riskfaktor för lunginfektion och kronisk sjukdom, oberoende av rökning status6.
Analys av immun miljön i lungan är därför avgörande för att förstå dess roll i hälsa och sjukdom. Även noninvasiv, inducerad sputum prover tenderar att innehålla stora mängder epitelceller och skräp med sällsynta pulmonell lymfocyter och inga AMs, begränsa deras roll till specifika tillämpningar. Omvänt kan stora biopsier av vävnad inte erhållas i avsaknad av misstänkt sjukdom på grund av tillhörande risker för betydande blödning och pneumothorax (kollaps av lungan). Dessutom är majoriteten av pulmonella immunceller huvudsakligen ligger på slemhinnor nivå där lungorna kontinuerligt stimuleras av antigener under andning. För detta ändamål har bronkoskopi för att få BAL vätska fördelen av att ge relativt säker tillgång till lymfocyter och AMs (se figur 1). Makrofager utgör den största andelen av celler inom BAL Fluid, följt av lymfocyter11. Det är därför lämpligt att fastställa en metod genom vilken BAL Fluid kan bearbetas för användning i efterföljande tillämpningar, såsom immunophenotypning, cellkultur, transkriptomik eller andra tillämpningar. Protokollet för bearbetning av BAL Fluid som beskrivs här är anpassad från allmänna procedurer som tidigare beskrivits och optimerats för de olika nedströmsanalyser som används. Denna metod möjliggör isolering av både pulmonell lymfoida och myeloida slemhinnor immunceller för deras fenotypisk och funktionell karakterisering, samt en bedömning av HIV-reservoaren hos vuxna som lever med HIV.
För att upprätta detta protokoll använde vi följande kriterier för att rekrytera studiedeltagare15. För deltagare att vara berättigad att delta i denna studie, de var tvungna att vara HIV-infekterade personer som uppfyllde följande kriterier: (1) om konst i minst 3 år; (2) undertryckt virusmängd (VL) i minst 3 år; (3) antal CD4 T-celler på ≥ 200/mm3; (4) villiga att genomgå forskning spirometri och bronkoskopi. Patienter med följande kriterier exkluderades från studien: (1) kontraindikation (s) mot bronkoskopi; (2) hög blödningsrisk: koagulopati eller på warfarin eller klopidogrel terapi; (3) trombocytopeni (lågt antal blodplättar); (4) aktiv lunginfektion eller annan akut Pulmonisk process; (5) gravid/försöker bli gravid.
Protocol
Detta forskningsprotokoll upprättades direkt på grund av de principer som ingår i Helsingforsdeklarationen och fick godkännande från de institutionella gransknings nämnderna vid McGill University Health Centre (RI-MUHC, #15-031), Université du Québec à Montréal (UQAM, #602) och Centre de Recherche du Centre Hospitalier de L'université de Montréal (CR-CHUM, #15-180).
1. bronalveolärt lavage
Anmärkning: Detta avsnitt beskriver bronkoskopi som utförs av en licensierad respirologist med hjälp av en respiratorisk terapeut16,17.
- Förbered de delar av apparaten som behövs för förfarandet, inklusive en bronkrinskop och saltlösning. Administrera bedövning spray på bak i patientens hals. Undvik överdriven användning av topikal anestesi när det är möjligt. Applicera hjärt leder till bröstet för att övervaka hjärtfrekvens och rytm och en syre sond till första finger i en hand för att övervaka syremättnaden. Sätt näskanyl i näsborrarna för att ge extra syre.
- Placera patienten, helst i ryggläge. Administrera sedering enligt följande: midazolam 0,01-0,04 mg/kg och fentanyl 50-100 μg (för att underlätta patientens komfort och minimera hosta reflex) intravenöst, i närvaro av en respirologist eller anestetist.
- Advance den flexibla bronkiskop tills det är inklämd i önskad subsegmental bronchus. Ingjuta saltlösning (50-60 mL i taget) med sprutan och applicera sedan mild sug (50-80 mmHg). Pumpning vätskan kommer att samlas i sprutan och sedan överföras till en uppsamlingsbehållare.
- Upprepa spolningen till totalt 200-300 mL sköljning. Samla minst 100 mL BAL vätska om möjligt.
- Placera BAL vätskan på isen.
2. isolering av BAL celler
Anmärkning: Följande förfarande skall utföras under sterila förhållanden i ett biologiskt säkerhetsskåp, klass II (BSL2) eller högre.
-
Håll BAL proverna på is tills de bearbetas.
- Vortex BAL i det ursprungliga samlingsröret och överför den till ett 50 mL-rör med hjälp av en serologisk pipett. Om BAL vätskan verkar mycket grumlig eller förorenad av trådformiga vävnad, filtrera vätskan genom ett 70 μm nylonnät filter till en ny 50 mL tub.
- Centrifugera vid 200 x g i 10 min vid 4 ° c. Överför supernatanten till ett nytt 50 mL-rör. Bryt försiktigt upp pelleten med pipettspetsen och Omsuspendera den i 1 mL RPMI 1640-medium.
- Överför 1 mL av supernatanten till var och en av 10X 1,5 mL mikrocentrifugrör och resterande supernatanten till 15 mL-rör, 10 mL i vardera. Förvara alla supernatanten rör vid-80 ° c.
-
Bearbeta BAL cells pelleten.
- Omsuspendera pelleten i 10 mL RPMI 1640 för varje 25 mL av det ursprungliga provet. Centrifugera vid 200 x g i 10 min vid 4 ° c. Överför supernatanten till ett nytt 15 mL-rör (kassera efter att det finns tillräckligt med celler i pelleten).
- Omsuspendera pelleten i 1 mL RPMI 1640 + 10% foster bovint serum (FBS) och räkna med trypan Blue och en hemocytometer.
Anmärkning: Om BAL vätskan inte separeras genom att cellerna följs före sortering, gå vidare till avsnitt 4.
3. anslutning av BAL celler (tillval)
Anmärkning: Detta alternativa protokoll kan utföras före eller i stället för cell sortering. Följande procedur skall utföras under sterila förhållanden i ett BSL2 skåp (eller högre).
- Överför önskat antal BAL celler för sortering till ett nytt 15 mL-rör och gör upp rätt volym för 1,5 x 106 makrofager/ml. Platta 2 mL celler per brunn i 6-brunn plattor och inkubera i 2 h vid 37 ° c med 5% CO2, för att ge tid för följsamhet.
- Efter inkubering ska du försiktigt aspirera mediet som innehåller nonadherent-celler och överföra det till ett 15 mL-rör. Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur (RT). Avlägsna supernatanten och Omsuspendera vid 1 x 107 celler/ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 2% FBS och överför suspensionen till en 5 ml rundbottnad polystyren tub. Denna lymfocytfraktion är nu redo att färga för cell sortering.
- Till de kvarvarande anhängare cellerna i plattan, tillsätt 1 mL per brunn av cell-disassociations lösning (se tabellen av material) och inkubera i minst 15 min vid 37 ° c med 5% Co2, tills cellerna separat lätt från plattan med en pipett spets.
- Varsamt men grundligt skrapa de sittande cellerna från brunnen ytan med hjälp av en pipett spets, och använda 1 mL vätska i brunnen för att hjälpa till med avlossning. Överför cellerna till en ny 15 mL tub. Tvätta brunnarna med 1 mL PBS och tillsätt detta i samma tub. Gör upp innehållet i röret till 5 mL med PBS.
- Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid RT. avlägsna supernatanten, Omsuspendera vid 1 x 107 celler/ml PBS + 2% FBS och överför suspensionen till en 5 ml rundbottnad polystyren tub. Denna myeloida fraktion är nu redo att färga för cell sortering.
4. isolering av perifera mononukleära blodceller
Anmärkning: Följande procedur skall utföras under sterila förhållanden i ett BSL2 skåp (eller högre).
- På samma dag av bronkoskopi (i allmänhet direkt före BAL samlingen), få sex rör av venöst blod från en givare i etylendiamintetraättiksyra (EDTA) rör (ca 10 mL per tub).
- Separera blodet genom att Centrifugera blod rören vid 300 x g i 15 min vid RT. överför plasma till 1,5 ml-mikrocentrifugrör i 1 ml-aliquoter och förvara den vid-80 ° c.
-
Utför densitet gradient separation.
- Tillsätt 2 mL RPMI 1640 till varje blod rör och blanda väl med hjälp av en serologisk pipett.
- Överför till 3x 50 mL-rör och gör upp volymen i varje tub till 25 mL med RPMI 1640.
- Bered en annan omgång 3x 50 mL-rör, vardera innehållande 20 mL lymfocytsepareringsmedium (LSM) (se tabell över material) vid RT. sakta och försiktigt lager 25 ml av utspädd blod ovanpå lsm för vart och ett av de tre rören, håller röret på en 45 ° vinkel .
- Centrifugera vid 600 x g i 25 minuter vid RT med låg acceleration och ingen retardation (broms av).
-
Utför en tvättning av perifera mononukleära blodceller (PBMCs).
- Överför lagret av celler vid gränssnittet för de två vätske faserna i röret till ett 50 mL-rör med hjälp av en serologisk pipett. om det finns mer än 30 mL volym, dela den i två rör. Gör upp volymen i varje tub till 50 mL med PBS.
- Centrifugera vid 700 x g i 5 minuter vid RT och ta bort så mycket supernatanten som möjligt.
- Omsuspendera pelleten och gör upp volymen till 25 mL med PBS. Centrifugera vid 350 x g i 10 minuter vid RT och ta bort så mycket supernatanten som möjligt.
- Upprepa tvättsteget som beskrivs i steg 4.4.3.
- Omsuspendera pelleten i 5 mL PBS + 2% FBS och räkna cellerna.
5. sortering av hela BAL celler och PBMCs
Anmärkning: Följande förfarande skall utföras under sterila förhållanden i en BSL2 (eller högre).
- Förbered sorteringsbufferten med PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (pH 7,4). Bered 5 mL rundbottnad polystyrenrör med 1 mL FBS för insamling av sorterade cell undergrupper.
-
Utför färgning.
- Bered 3x 5 mL rundbottnade polystyrenrör, vardera för BAL (hela celler eller lymfocyt-och myeloida fraktioner efter följsamhet) och PBMCs (se avsnitt 4). För varje delmängd, Förbered en tub med celler för att sortera och två rör av 5 x 105 celler att använda för ofärgade och bärkraft fläck kompensation kontroller.
- Centrifugera vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c. Ta bort supernatanterna, Omsuspendera cellerna för kontroller i 100 μL PBS och förvara dem vid 4 ° c tills kompensations kontrollerna kan förberedas enligt beskrivningen i steg 5.2.6.
- Bered en 1:20 spädning av FC-receptorns (FcR) blockerande reagens i PBS + 5% FBS (se tabellen med material-för att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar mot FCR-uttrycksceller). Omsuspendera cellerna för att sortera dem på 1 x 107 celler i 250 μl av FCR-blockerande blandning. Inkubera dem i 1 h vid 4 ° c.
- Efter inkubering, Tillsätt lämplig antikropps cocktail (se tabell 1) till cellerna och inkubera i 1 h vid 4 ° c i mörker.
- Efter 1 h färgning, tillsätt 1 mL PBS till cellerna och centrifugera vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c. Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellerna i sorteringsbufferten för att ha 1 x 107 celler i 250 μl. filtrera cellerna genom ett 70 μm-filter om det behövs.
- Förbered kompensationskontroller.
- Tillsätt tre droppar vardera av anti-Mouse ig, κ, och negativ kontroll kompensation pärlor (se tabellen av material) per 1 ml PBS i ett microcentrifug rör och överföra 100 μl till varje 5 ml rundbottnad polystyren rör som skall användas för kompensation. Förbered ett rör för varje fluorokrom som finns i cocktail som ska användas.
- Tillsätt 1 μL av varje antikropp i cocktailen till ett annat rör som innehåller pärlor. Tillsätt 1 μL viabilitet till ett av rören med 5 x 105 celler som avsatts i steg 5.2.1. Inkubera i 20 minuter vid 4 ° c i mörker.
- Tillsätt 1 mL PBS till varje tub och centrifugera vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c. Avlägsna supernatanten och Omsuspendera pelleten i 250 μL PBS. Förvaras vid 4 ° c i mörker tills det behövs.
- Sortera cellerna med fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) i samlingsrör som bereds med 1 mL FBS och snurra försiktigt för att belägga sidorna av rören med serum.
- Sortera BAL celler vid lågt tryck. Grind celler först för att utesluta buller och inkludera levande, CD45+ celler, och inom denna population Gate ut Doublet celler (se figur 3). Inom den större myeloida befolkningen sortera CD206 och CD169 dubbla positiva celler som AMs; inom den mindre lymfocytpopulationen isolerar CD3+ celler och sorterar både CD4 och CD8 ensamstående positiva populationer (se figur 3; gating strategi som beskrivs i avsnittet representativa resultat).
- Vid sortering PBMCs, Gate celler först för att utesluta buller och inkludera levande, CD45+ celler, och inom denna population Gate ut Doublet celler. Nästa, Gate på CD3 celler och inom CD3- populationen, Gate först på CD14 och sortera enda positiva monocyter, och sedan inom CD3+ befolkningen Gate på CD4 och CD8 och sortera både enstaka positiva populationer (gating strategi som beskrivs i Representativa resultat sektionen.
6. immunophenotypning av AMs och PBMCs
Anmärkning: Följande procedur skall utföras under sterila förhållanden i ett BSL2 skåp (eller högre).
- Tillsätt upp till 1 000 000 vardera av AMs och PBMCs till två separata 5 mL rundbottnade polystyrenrör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c och avlägsna supernatanten.
- Utföra FcR-blockering för att förbättra specificiteten hos antikropps färgning. För detta, Omsuspendera cellerna i 100 μL PBS + 2% FBS och tillsätt 1,4 μL FcR blockerande reagens. Inkubera i 20 minuter vid 4 oC.
-
Utför extracellulär färgning.
- Efter inkubering med FcR-block, tillsätt önskad extracellulär antikropps cocktail, Vortexblanda rören och inkubera i 1 h vid 4 ° c i mörker.
- Tvätta 2x genom att tillsätta 500 μL PBS och centrifugering vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c.
-
Förbered för fixering och permeabilisering (se tabellen av material för specifika reagenser som används).
- Förbered depolarisering lösning med 1 del depolarisering buffert och 3 delar spädningsvätska buffert. Omsuspendera pelleten i 1 mL permeabiliseringslösning och inkubera i 40 min vid 4 ° c i mörker.
- Förbered tvättlösning med 1 del tvättbuffert och 4 delar H2O. Tillsätt 2 ml tvättlösning till de permeabiliserade cellerna och centrifugera vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c. Ta bort supernatanten.
-
Utföra intracellulär färgning.
- Omsuspendera cellerna i 100 μL 1x tvättlösning, tillsätt önskade intracellulära antikroppar, Vortexblanda rören och inkubera i minst 1 h vid 4 ° c i mörker.
- Tillsätt 2 mL tvättlösning och centrifugera vid 350 x g i 5 minuter vid RT. ta bort supernatanten och Omsuspendera pelleten i 200 μl PBS. Förvara cellerna vid 4 ° c i mörker tills de behövs.
7. återstoden av BAL cellerna
Anmärkning: Följande procedur skall utföras under sterila förhållanden i ett BSL2 skåp (eller högre).
- Cell nummer tillåter, kryopreserve levande celler från BAL cell pelleten (från steg 2.2.2).
- Förbered frys mediet som innehåller 90% FBS + 10% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 min vid 4 ° c. Avlägsna supernatanten och Omsuspendera i 1,5 mL frys medium i en kryogen injektionsflaska. Överför de kryogena flaskorna till en frys behållare med kontrollerad hastighet (se material tabellen) och placera dem vid-80 ° c. Överför cellerna till flytande kväve för långtidslagring när temperaturen är nådd.
-
Bevara BAL cellerna som torra pellets.
- Överför de återstående cellerna till ett 1,5 mL microcentrifugerör. Centrifugera i en Counter-Top centrifug vid 6 000 x g i 1 min. ta bort så mycket supernatanten som möjligt utan att störa pelleten. Förvara pelleten vid-80 ° c.
8. HIV-DNA och RNA-kvantifiering
Anmärkning: Följande procedur skall utföras under sterila förhållanden i ett BSL2 skåp (eller högre).
- Total HIV-DNA-kvantifiering
- För att undvika hämning av polymeraskedjereaktion (PCR) med BAL lysat skräp, Använd en DNA-extraktion Kit (se tabellen av material) för att extrahera DNA från ett urval av bal celler enligt tillverkarens anvisningar. Använd 15 μL av detta DNA kombinerat med en Mastermix i det förförstärknings steg som beskrivs nedan (steg 8.1.3).
- Förbered standardkurva utspädningar.
- Som ovan, Använd en DNA-extraktion kit för att extrahera DNA från en pellet av 2 x 106 ACH-2 celler (se tabellen av material).
- Efter eluering av DNA, utföra seriella 10-faldig utspädningar av ACH-2 DNA för att generera sex utspädningar, allt från 3 x 105 celler till 3 celler per 15 μl.
- Utför ett preamplifieringssteg.
- I ett separat rum, Förbered Mastermixen för n + 2-prover bestående av 1x polymeras-buffert, 3 mm mgcl2, 300 μm dntps och 2,5 U av Taq DNA-polymeras (se tabell över material) och 300 Nm för var och en av de fyra primerarna (se steg 8.1.3.2). Utför alla åtgärder i tre exemplar brunnar.
- Använd primers hCD3OUT5 ', hCD3OUT3 ', ULF1 och UR1 för att generera förstärkt DNA från både humant CD3 och HIV (se sekvenserna i tabell 2). Observera att båda generna är förförstärkade i samma tub. Blanda försiktigt och snurra ner röret för att säkerställa fullständig blandning.
- Fördela 35 μL Master Mix per brunn i en 96-brunn PCR-platta och tillsätt 15 μL standard-eller prov-DNA. Den totala reaktions volymen är 50 μL.
- Utför preamplifiering (denaturering vid 95 ° c i 8 min, följt av 12 cykler på 95 ° c i 1 min, 55 ° c för 40 s, 72 ° c i 1 min, och förlängning vid 72 ° c i 15 min).
- Utför realtids PCR.
- För att kvantifiera CD3 och HIV DNA, förbereda två Master blandningar som innehåller 1x PCR-reaktion Master Mix (se tabellen av material), 1 250 nm lämpliga primers, och 100 nm sond. Använd primers HCD3IN5 ' och HCD3IN3 ' och sond CD3 FamZen att kvantifiera humant CD3 i en reaktion, och primers UR2 och LambdaT och sond UHIV FamZen att kvantifiera HIV-DNA i en annan reaktion (se sekvenser i tabell 2). Fördela 13,6 μL av varje blandning i qPCR-anpassade rör.
- Späd ger PCR-produkten till 1:10 i sterilt vatten, DNase, RNase och proteas Free. Tillsätt 6,4 μL av varje utspätt prov till 13,6 μL qPCR-blandning i qPCR-anpassade rör för en total reaktions volym på 20 μL.
- Utför realtids PCR med följande program: denaturering vid 95 ° c i 4 min och 40 cykler av 95 ° c för 3 s och 60 ° c för 10 s med enstaka förvärv.
- Extrapolerar antalet HIV-kopior och antal cell ekvivalenter i varje reaktionsrör från standard kurvorna. Beräkna antalet HIV-DNA-kopior/106 celler.
- HIV-RNA-kvantifiering
- Extrahera RNA från ett prov av BAL celler, med hjälp av en RNA extraktion Kit (se tabellen av material) enligt tillverkarens anvisningar. Använd 17 μL av detta RNA i det omvända transkription-och preamplifieringssteget som beskrivs nedan (steg 8.2.4).
- LTR-gag RNA syntetiseras in vitro och exakt kvantifierad används som standard; Det är spetsade till friska givare RNA-extrakt för GUSB normalisering. Bered sex seriella 10-faldigt spädningar av denna standard, motsvarande 3 x 105 celler till tre kopior av LTR-gag RNA i 17 μl.
- Fördela 17 μL av varje standard spädning och varje prov i en PCR-platta 96-well och behandla proverna med DNase (se material tabellen) i 10 min vid 25 ° c för att avlägsna förorenat GENOMISKT DNA. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 2 μL 25 mM EDTA och inkubera proverna i 10 min vid 65 ° c.
- Utför omvänd Transkription (RT) och ger PCR.
- Utför det här steget med ett enstegs RT-PCR-Kit (se material tabellen) enligt tillverkarens anvisningar. Använd primers gusb framåt 1, gusb omvänd 1, UR1, och ULF1 att generera förstärks cDNA från både mänskliga gusb som Housekeeping Gene och LTR-gag hiv RNA (se sekvenser i tabell 2). Den GUSB värden kommer att användas för att normalisera HIV-värden.
- Fördela 31 μL Master Mix per brunn i samma PCR-platta 96-well som innehåller de DNase-behandlade standarderna och proverna och blanda väl. Den totala reaktions volymen är 50 μL.
- Kör plattan i 16 cykler enligt tillverkarens anvisningar, med en glödgningstemperatur på 55 ° c.
- Utför realtids PCR.
- Förbered två Master blandningar som innehåller 1x PCR-reaktion Master Mix (som ovan i steg 8.1.4.1), 1250 nM lämpliga primers, och 100 nM sond. Använd primers GUSB framåt 2, GUSB omvänd 2, och sond GUSB-HEX att kvantifiera GUSB cDNA i en reaktion; Använd primers UR2, LambdaT och PROBE UHIV FamZen för att kvantifiera HIV cDNA i en annan reaktion (se sekvenserna i tabell 2).
- Fördela 13,6 μL av varje Mastermix i qPCR-anpassade rör. Späd RT ger PCR-produkterna 1:10 i sterilt vatten, DNase, RNase och proteas Free, och tillsätt 6,4 μl av varje utspätt prov eller standard till lämplig PCR-blandning. Den totala reaktions volymen är 20 μL.
- Utför realtids PCR med följande program: denaturering vid 95 ° c i 4 min och 40 cykler av 95 ° c för 3 s och 60 ° c för 10 s med enda förvärv (Välj den gröna kanalen för FamZen och gult för HEX).
Representative Results
I de flesta icke-rökare, BAL vätska tas emot i en steril behållare och är en något grumlig gul-orange-färgad vätska. Vätskan kan vara Pinker i färg om givaren genomgick endobronkial biopsier under bronkoskopi och viss blödning inträffade. Vätskan kan vara mörkare i färgen om givaren är en rökare. Efter centrifugering kommer BAL supernatanten att vara nästan klar och aningen orange, medan cellpelleten kan variera i färg från benvit till mycket mörkbrun, beroende på provets tillstånd och om givaren är rökare eller inte.
Vid räkning av hela bal provet kan olika celltyper visualiseras, inklusive större, runda makrofager runt 17 μm i diameter och mindre runda lymfocyter runt 7,3 μm i diameter18,19 (se figur 2). Makrofager förstoras hos rökare med cirka 40%18. Skillnaden mellan celltyperna gör det möjligt att räkna makrofager och lymfocyter separat. Det kan också finnas en del skräp synlig på fältet, särskilt i prover från rökare. Makrofager är den vanligast förekommande Celltypen i BAL, som står för cirka 85% av cellerna i icke-rökare20, och de är berikade hos rökare så de kan tyckas nästan exklusivt.
BAL cellerna har en tendens att aggregera, så de måste blandas väl under alla manipulationer. Pelleten kan verka mörk även efter flera tvättsteg. Om trådformiga rester syns i fraktionen efter färgning för cell sortering, passera cellerna genom ett 70 μm filter innan du kör dem genom cell Sorteraren.
Sortering av BAL celler måste göras med ett lågt tryck för att säkerställa dropp storlekar tillräckligt stora för att rymma makrofager. Cellerna är först gated att inkludera alla CD45+21 celler, och sedan baserat på lönsamhet för att säkerställa att alla döda celler är undantagna (se figur 3). Singlet celler väljs sedan och inom detta, två populationer är gated baserat på storlek och morfologi, nämligen större myeloida celler och mindre lymfocyter (se figur 3). Inom de större cellerna är celler gated på CD20622,23 och CD16922 och de dubbel-positiva cellerna sorteras som AMS, medan inom de mindre cellerna, CD3+ celler väljs och gated på CD4 och CD8; CD4 enstaka positiva och CD8 enstaka positiva celler sorteras (se figur 3). De markörer som används valdes baserat på tidigare beskrivna fenotyper av AMS, såsom mannos receptor CD206, finns på fagocyterande celler23, och sialoadhesin receptorn CD16922.
Vid sortering av PBMCs, celler är först gated på framåt och sida scatter som bör visa en homogen lymfocyt population, som alla är tagna, exklusive buller nära noll-axeln (data som inte visas). Befolkningen är gated på lönsamhet och CD45, och levande CD45+ celler används. Denna population är sedan gated på CD3; för att isolera monocyter, CD3- populationen är därefter gated på CD14 och alla enskilda positiva celler sorteras. För att isolera lymfocyter undergrupper, CD3+ cellerna är gated på CD4 och CD8 och både enstaka positiva och cellpopulationer sorteras.
Figur 1 : Protokoll översikt. En schematisk visar arbetsflödet för protokollet, inklusive potentiella nedströmsanvändningar av de genererade proverna. PBMC = mononukleära blodceller; BAL = bronalveolärt lavage; LSM = lymfocytseparering medium. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mikroskop fältvy av hela bal Fluid. Mikroskopbilder från (a) en nonrökare och (B) en rökare med synliga lymfocyter (L), makrofager (M), och röda blodkroppar (RBC). Förstoring är 1000X (10X okulär och 100x lins med oljeimmersion). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativ gating strategi för cell sorteringen av hela bal celler. Gating strategi som används för att sortera alveolära makrofager (AM), CD4, och CD8 T celler från hela BAL cell prover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Antikropp | Fluorokromkonjugerat | Klon | Volym per test (μL) |
| BAL och PBMC | Live/Dead | APC-H7 | - | 1 |
| CD45 | PE-Cy7 | HI30 | 5 | |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 2 | |
| CD4 | PE-Cy5 | RPA-T4 | 4 | |
| CD8 | BV605 | SK1 | 3 | |
| BAL endast | CD206 | Pe | 19,2 | 10 |
| CD169 | BB515 | 7-239 | 5 | |
| Endast PBMC | CD14 | BV786 | M5E2 | 5 |
Tabell 1: flödes panel för sortering av hela BAL celler och isolerade PBMCs.
| Mål | Steg | Namn på primer | Primer sekvens | |||
| HIV totalt DNA eller HIV LTR-gag RNA | Pre-Amplification PCR | UR1 | 5 '-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3 ' | |||
| ULF1 | 5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3 ' | |||||
| Real tids PCR | UR2 | 5 '-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3 ' | ||||
| LambdaT | 5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3 " | |||||
| UHIV FamZen: | 5 '-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3 ' | |||||
| CD3 DNA | Pre-Amplification PCR | HCD3 out 5 ' | 5 '-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3 ' | |||
| HCD3 out 3 ' | 5 '-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3 " | |||||
| Real tids PCR | HCD3 i 5 ' | 5 '-GGC TAT KATT TCT TCT TCA AGG T-3 ' | ||||
| HCD 3 i 3 ' | 5 '-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3 ' | |||||
| CD3 FamZen: | 5 '-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3 ' | |||||
| GUSB RNA | Pre-Amplification PCR | GUSB framåt 1: | 5 '-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3 " | |||
| GUSB omvänd 1: | 5 '-GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3 ' | |||||
| Real tids PCR | GUSB framåt 2: | 5 '-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3 | ||||
| GUSB omvänd 2: | 5 '-CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3 ' | |||||
| GUSB-HEX: | 5 '-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 ' | |||||
Tabell 2: primer-och sond sekvenser för HIV-DNA och RNA-kvantifiering.
Discussion
Häri beskrev vi en metod för bearbetning av BAL Fluid för att få CD4 T-celler och AMs, tillsammans matchade PBMCs, som kan studeras för att undersöka HIV-reservoaren i lungorna. Vi rapporterade nyligen om HIV-DNA-kvantifiering i CD4 T-celler från matchade perifert blod och BAL prover, och vår grupp visade att HIV är 13 gånger vanligare i pulmonella CD4 T-celler än i de från perifera blod15. Emellertid, nivåerna av HIV-DNA i AMs är givare beroende och så, hittills, det har inte varit ett konsekvent samband mellan HIV-DNA-nivåer i lymfocyterna jämfört med makrofager15. Tillgången till dessa primära makrofage cell undergrupper, dock kommer att vara ett viktigt verktyg för att ifrågasätta denna fråga och få en bättre förståelse av virusbelastningen i lungan i samband med HIV-reservoaren.
I pre-ART eran och i flera andra studier som utnyttjar BAL Fluid, deltagarna genomgick bronkoskopi för att diagnostisera en misstänkt patologi eller få en mikrobiologisk diagnos för respiratoriska symtom3. Vi kunde dock rekrytera deltagare utan aktiva lungsymtom eller patologier och alla deltagare undertecknade ett etiskt samtyckesformulär15. Vi kunde rekrytera deltagare från vårt Center som deltog i andra studier, såsom en spirometri screening studie för obstruktiv lungsjukdom24, samt de som genomgår andra forskningsmetoder, såsom leukaferes och Koloskopi. Tidigare forskning bland människor som lever med HIV visade att altruism är en nyckelfaktor som motiverar deltagande i forskningsstudier25. Liksom med många mänskliga exemplar, noterade vi en hel del person-till-person variation. Det fanns inget sätt att "förutsäga" från vilka deltagare vi skulle få BAL med bra kontra dålig cell avkastning. Till skillnad från perifert blod, som ger ganska konsekvent antal lymfocyter, cellnumren i BAL Fluid är mycket varierande. Injicera en större volym av normal saltlösning i lungorna (med hopp om att få en större avkastning av BAL vätska) är inte alltid möjligt eftersom större volymer av normal saltlösning ofta förknippas med mer hosta och en högre risk för feber postbronkoskopi. Vi märkte att använda en mindre (snarare än större) diameter bronkoskop aktiverat respirologist att nå djupare in i luftrören och få vätska som innehåller större mängder av celler. En konsekvent slutsats var att tobaksrökning hade mycket större proportioner av AMs än lymfocyter inom deras BAL vätska, vilket förväntas som AMs uppslukar skräp och partiklar. Dessutom konstaterade vi att BAL vätska från rökare innehöll skräp som kan blockera den utrustning som används, såsom PCR-maskiner och flödescytometrar. Liknande problem kan observeras i områden med hög förorening eller individer som oftare exponeras för dålig luftkvalitet.
När det gäller deras roll i upprättandet av HIV-reservoarer och virus beständighet, renheten av CD4 T-celler och AMs är en viktig faktor. Av denna anledning valde vi att använda Fluorescence-aktiverad cell sortering (FACS) för att få mycket ren cellpopulationer. Det är också möjligt att den insamlade BAL vätskan kan vara förorenad med blod eftersom vissa mindre blödningar förväntas under en bronkoskopi; närvaron av naiva B-celler skulle indikera detta, och celler kan tvättas i en röd blodcell lysis buffert för att kringgå detta problem. En annan utmaning med att studera BAL Fluid handlar om att kvantifiera inflammatoriska markörer och cytokiner, vilket är viktigt för förståelsen av HIV-beständighet26. Eftersom den instillade saltlösning späda BAL vätskan, nivåer av inflammatoriska mediatorer och cytokiner kan vara svåra att mäta. Även om en faktor för korrigering av urea har föreslagits för att redovisa utspädning, finns det relativt lite litteratur som beskriver dess användning27,28.
AMs är mycket autofluorescent, vilket utgör ett problem under cell sortering och flödescytometri fenotypisk analys. I synnerhet, effekten är mer uttalad hos rökare vars AMs kan vara helt svart i färg, signifikant påverkar deras autofluorescence. När upphetsad av en vanlig blå 488 nm Laser, är am autofluorescence på sin topp vid ungefär 540 nm, som överlappar fluorescenspektrat av vanliga konjugat såsom FITC och PE29,30. Det är värt att notera att två separata lasrar kan användas för att excitera FITC och PE (t. ex., PE av den gula/gröna och FITC av den blå 488 laser). För att övervinna den inneboende autofluorescence med FITC, använde vi obefläckade AMs att bestämma autofluorescence bakgrund. Dessutom kan användningen av fluorescensminus en (FMO) kontroller vara mycket användbar för att bekämpa dessa tekniska problem. Större pärlor (t. ex. 7,5 μm) kan användas, som är närmare i storlek för att kompensera makrofagpopulationer, jämfört med mindre pärlor (t. ex. 3,0 μm), som kan användas för att kompensera lymfocytpopulationer. En ännu lämpligare metod skulle vara att använda en liten del av cellerna som Single-fläck kontroller, med hjälp av en känd, mycket uttrycks markör på undergruppen, såsom HLA-DR eller CD45, konjugerat till var och en av de önskade fluorochromes, vilket skulle möjliggöra en mycket mer exakt kompensation än vad som kan uppnås med pärlor. När det gäller rökare prover, denna taktik är särskilt användbart eftersom makrofager är mycket större och mer autofluorescent. Dessutom kan hela BAL provet, från förberedelsesteget, odlas på en tallrik före sortering enligt beskrivningen i avsnitt 3 i protokollet, så att populationerna kan skiljas genom följsamhet. På detta sätt kan de anhängare makrofager isoleras från andra nonadherent celler såsom lymfocyter. Ersättningen är mycket mindre utmanande om lymfocyt-och AM-populationerna separeras i stället för att undersökas tillsammans. men förlitar sig på efterlevnad kommer att resultera i en förlust av makrofager, vilket är en viktig faktor när cell nummer redan begränsande. Också, en följsamhet steg kan resultera i oönskad aktivering av anhängare monocyter, som kan påverka nedströms resultat som genereras med hjälp av dessa celler. Värdet av att effektivt sortera celler i renare populationer måste vägas mot begränsningen att ha färre sådana celler för efterföljande experiment.
Andra modeller, främst murina modeller, har använts för att studera makrofagimmunologiska egenskaper och biologi. Även om dessa modeller är mycket användbara och ger stor insikt i en celltyp som är svår att manipulera, har de begränsningar. Många av cellens ytmarkörer varierar mellan möss och människor så att immunophenotypen av mänskliga AMs inte är helt klarlagd. Detta modellsystem kräver dock sammanslagning av flera möss för analyser på grund av de låga cell nummer som finns tillgängliga från varje djur. Dessutom utesluter nödvändigheten att poolproverna överväganden om genetisk predisposition och kön. Nyligen har det visats att sex spelar en roll i smittsamheten av makrofager av HIV-1 på grund av det skilda uttrycket av begränsningen faktorn SAMHD-131. Nonhuman primater (NHP) representerar den närmaste modellen för människor och underlättade studiet av Simian immunbristvirus (SIV) infektion och dess effekt på immunförsvaret, ge insikt i rollen av vävnad bosatta makrofager jämfört med monocyte-härledda makrofager. I rhesusmakaker har det också visats att lungmakrofagisolat från BAL Harbor är ett replikat-kompetent virus. en viral utväxt assay (VOA) användes för att analysera beteendet hos SIV i vävnad bosatta celler32. Ett sådant konstaterande är av betydande forsknings värde men måste fortfarande valideras på människor innan det kan tillämpas, och de höga kostnaderna för att använda NHPs utesluter användning av stora prov populationer. Dessutom, mänsklig AMs vilja bli nyttig för många annan ansökan sådan som in vitro viral/mikrobiell infektion analyser och i studier av annan patogener sådan som tuberkulos/HIV coinfection.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna sina finansiärer: den kanadensiska institut för hälsoforskning (CIHR) (Grant #153082 till CC, MAJ, NC); Réseau sida et sjukdomar infectieuses du fonds de Recherche du Québec-santé (FRQ-S) som beviljade finansiering till CC och maj och McGill University medicinska fakulteten som beviljade finansiering till CC. Denna studie stöddes också delvis den kanadensiska Institute of Health Research (CIHR)-finansierade kanadensiska HIV Cure Enterprise (CanCURE) team Grant HB2-164064 till MAJ, CC och NC. MAJ innehar CIHR Canada forsknings ordförande Tier 2 i Immunovirology och CC och NC hålla en FRQ-S Junior 1 och Junior 2 Research lön Award, respektive. ET innehar en RI-MUHC student Ship MSc Award.
Dessutom skulle författarna vilja erkänna Josée Girouard och all klinisk personal som deltar i samordningen och erhålla proverna, liksom respiratoriska terapeuter; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette och Marie-Hélène Lacombe vid RI-MUHC Immunophenotyping-plattformen; och Dr. Marianna Orlova för tillhandahållande av mikroskopi bilder. Viktigast av allt, författarna vill tacka de många volontärer utan vilka denna forskning inte skulle vara möjligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
| ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
| BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
| BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
| Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
| Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
| CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
| CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
| CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
| CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
| CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
| dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
| EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
| FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
| FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
| FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
| HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
| HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
| Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1 °C/min, the optimal rate for cell preservation |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
| PBS 1x | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
| PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
| PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2x concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
| QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
| Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
| RPMI 1640 1x | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
| Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
| Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10x PCR buffer, magnesium chloride |
| Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |
References
- Chun, T. W., Fauci, A. S. Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).
- Finzi, D., et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy. Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).
- Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection. Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).
- Center for Disease Control and Prevention. A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California. Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).
- Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus. Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).
- Kunisaki, K. M. Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease? Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).
- World Health Organization. WHO | Tuberculosis and HIV. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).
- Jambo, K. C., et al. Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function. Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).
- Yeligar, S. M., et al. Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ. AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).
- Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages. AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).
- Holt, P. G., et al. Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure. Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).
- Brenchley, J. M., et al. High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage. Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).
- Mwandumba, H. C., et al. Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection. The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).
- Gordon, S. B., et al. Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses. Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).
- Costiniuk, C. T., et al. HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy. AIDS. 32, 2279-2289 (2018).
- American Thoracic Society. American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).
- King, T. E. Jr Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).
- Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls. European Respiratory Journal. 50, (2017).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50, 243-248 (1985).
- Heron, M., et al. Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung. Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).
- Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Yu, Y. R. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).
- Geiser, M. Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).
- Costiniuk, C. T., et al. Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study. HIV Medicine. , (2019).
- Balfour, L., et al. Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173). AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).
- Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir. Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).
- Rennard, S. I., et al. Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution. Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).
- Twigg, H. L., et al. Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects. The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).
- Duan, M., et al. Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease. The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).
- Garn, H. Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).
- Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Avalos, C. R., et al. Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).
