Summary
Vi beskriver en metode for behandling av lunges og matchet perifert blod fra kronisk HIV-smittede personer på antiretroviral behandling for å vurdere lunge HIV-reservoarer. Disse metodene resulterer i oppkjøpet av svært rene CD4 T-celler og alveolære makrofager som senere kan brukes til immunfenotyping og HIV DNA/RNA-quantifications ved ultrasensitive polymerase kjedere reaksjon.
Abstract
Bronkoskopi er en medisinsk prosedyre der normal saltvann injiseres inn i lungene via en bronkoskop og deretter sug påføres, fjerne lunges tømming (BAL) væske. BAL-væsken er rik på celler og kan dermed gi et "øyeblikksbilde" av lunge immun miljøet. CD4 T-celler er den best preget HIV-reservoarene, mens det er sterke bevis som tyder på at vev makrofager, inkludert alveolære makrofager (AMs), også tjene som viral reservoarer. Men mye er fortsatt ukjent om rollen som AMs i sammenheng med HIV reservoar etablering og vedlikehold. Derfor, utvikle en protokoll for behandling av BAL væske for å få celler som kan brukes i virological og immunologiske analyser for å karakterisere og evaluere cellen populasjoner og delsett innen lunge er relevant for å forstå rollen til lungene som HIV Reservoarer. Heri, beskriver vi en slik protokoll, ansette standard teknikker som enkle sentrifugering og flyt flowcytometri. CD4 T-cellene og AMs kan deretter brukes til senere bruk, inkludert immunfenotyping og HIV-DNA og RNA-kvantifisering.
Introduction
En av de viktigste utfordringene mot en kur mot HIV-smitte er tilstedeværelsen av den latente HIV reservoaret som forårsaker en rebound av plasma viremia etter avbrudd av antiretroviral behandling (art)1,2. Mens HIV reservoaret under langsiktige ART er godt dokumentert i flere vev avdelinger, inkludert sekundære lymfoide organer, gut-assosiert lymfoide vev (GALT), og sentralnervesystemet (CNS), lungene har blitt oversett som et område av studien siden pre-ART era3. Men lungene spiller en sentral rolle i patogenesen av HIV. Faktisk var lungesymptomer blant de første indikatorene på AIDS-relaterte opportunistiske infeksjoner4. Selv i den moderne ART æra, personer med HIV er en større risiko for å utvikle både smittsomme og noninfectious lungesykdommer enn personer uten HIV. For eksempel, personer med HIV-smitte har forhøyet risiko for invasiv streptokokk pneumoniae infeksjon, samt kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)5,6. Videre er Coinfection av tuberkulose (TB) og HIV en betydelig folkehelse utfordring i enkelte regioner av verden, spesielt, Afrika sør for Sahara, som HIV-smittede individer er 16 til 27 ganger større sannsynlighet for å ha TB enn personer uten HIV7. Selv om noen forklaringer på denne mottakelighet for lungeinfeksjon og kronisk sykdom har blitt foreslått8,9,10, den presise cellulære mekanismer som individer med undertrykt HIV plasma viral belastning forbli i høyere risiko for lunge komplikasjoner har ikke blitt fullstendig belyst. Viktigere er HIV en veldig sterk risikofaktor for lungeinfeksjon og kronisk sykdom, uavhengig av røyke status6.
Analyse av immun miljøet i lungene er derfor avgjørende for å forstå sin rolle i helse og sykdom. Selv om ikke-invasiv, indusert sputum prøver tendens til å inneholde store mengder av epitelceller og rusk med sjeldne lunge-lymfocytter og ingen AMs, begrense sin rolle til bestemte applikasjoner. Omvendt kan store biopsier av vev ikke oppnås i fravær av mistanke om sykdom på grunn av assosiert risiko for betydelig blødning og pneumotoraks (kollaps av lungene). Videre, flertallet av lunge immunceller er hovedsakelig plassert på slimhinne nivå der lungene er kontinuerlig stimulert av antigener under pusting. For dette formål, bronkoskopi å få BAL Fluid har fordelen av å gi relativt sikker tilgang til lymfocytter og AMs (se figur 1). Makrofager utgjør den største andelen av celler innen BAL-væske, etterfulgt av lymfocytter11. Det er derfor nyttig å etablere en metode der BAL-væsken kan behandles for bruk i etterfølgende programmer, for eksempel immunfenotyping, cellekultur, transcriptomics eller andre programmer. Protokollen for behandling av BAL-væsken som er skissert her, er tilpasset fra generelle prosedyrer som tidligere er beskrevet og optimalisert for de ulike nedstrøms analysene som brukes. Denne metodikken gjør det mulig for isolering av både lunge lymfoide og myelogen slimhinne immunceller for deres phenotypical og funksjonell karakterisering, samt en vurdering av HIV-reservoaret i voksne som lever med HIV.
For å etablere denne protokollen, brukte vi følgende kriterier for å rekruttere studiedeltakere15. For deltakerne å være kvalifisert til å delta i denne studien, måtte de være HIV-smittede individer som møtte følgende kriterier: (1) på ART i minst 3 år; (2) undertrykt viral Load (VL) i minst 3 år; (3) CD4 T celle tall ≥ 200/mm3; (4) villig til å gjennomgå forskning Spirometri og bronkoskopi. Pasienter med følgende kriterier ble ekskludert fra studien: (1) kontraindikasjon (e) til bronkoskopi; (2) høy blødningsrisiko: koagulopati eller på warfarin eller klopidogrel terapi; (3) trombocytopeni (lav blodplater); (4) aktiv lungeinfeksjon eller annen akutt pulmonic prosess; (5) gravid/prøver å bli gravid.
Protocol
Denne forskningen protokollen ble etablert direkte basert på prinsippene i erklæringen av Helsingfors og mottatt godkjenning fra institusjonelle Review Boards av McGill University Health Centre (RI-MUHC, #15-031), Université du Québec à Montréal (UQAM, #602) og Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CR-CHUM, #15-180).
1. lunges-tømming
Merk: Denne delen beskriver bronkoskopi som utføres av en lisensiert respirologist med assistanse fra en respirasjons terapeut16,17.
- Forbered bitene av apparater som trengs for prosedyren, inkludert en bronkoskop og saltvann. Administrere bedøvelse spray på baksiden av pasientens hals. Unngå overdreven bruk av aktuell anestesi når det er mulig. Påfør CARDIAC fører til brystet for å overvåke hjertefrekvens og rytme og en oksygen sonde til den første finger av en hånd for å overvåke oksygenmetning. Sett nese kanyle inn i neseborene for å gi ekstra oksygen.
- Plasser pasienten, fortrinnsvis i liggende posisjon. Administrer sedasjon som følger: midazolam 0.01-0.04 mg/kg og fentanyl 50-100 μg (for å lette pasientens komfort og minimere hoste refleks) intravenøst, i nærvær av en respirologist eller anesthetist.
- Advance den fleksible bronkoskop til den er klemt fast i ønsket subsegmental bronkie. Innpode saltvann (50-60 mL om gangen) med sprøyten, og deretter bruke skånsom sug (50-80 mmHg). Tømming væsken vil samle i sprøyten og deretter bli overført til en oppsamlingsbeholder.
- Gjenta flush til totalt 200-300 mL av tømming. Samle minst 100 mL av BAL-væsken hvis mulig.
- Plasser BAL væsken på isen.
2. isolering av BAL celler
Merk: Følgende prosedyre må utføres under sterile forhold i et biologisk sikkerhetskabinett, klasse II (BSL2) eller høyere.
-
Hold BAL prøver på isen til de er behandlet.
- Vortex BAL i den opprinnelige samlingen røret og overføre den til en 50 mL rør ved hjelp av en serologisk pipette. Hvis BAL væsken vises svært grumsete eller forurenset av trådformede vev, Filtrer væsken gjennom en 70 μm nylon mesh filter inn i en ny 50 mL tube.
- Sentrifuger på 200 x g i 10 min ved 4 ° c. Overfør supernatanten til et nytt 50 mL rør. Bryt forsiktig opp pellet med en pipette spissen og resuspend den i 1 mL RPMI 1640 medium.
- Overfør 1 mL av supernatanten til hver av 10x 1,5 mL mikrosentrifugen rør og de resterende supernatanten til 15 mL rør, 10 mL i hver. Oppbevar alle supernatanten rør ved-80 ° c.
-
Prosess for BAL celle pellet.
- Resuspend pellet i 10 mL RPMI 1640 for hver 25 mL av den opprinnelige prøven. Sentrifuger på 200 x g i 10 min ved 4 ° c. Overfør supernatanten til et nytt 15 mL rør (kast etter at det er nok celler i pellet).
- Resuspend pellet i 1 mL av RPMI 1640 + 10% fosterets storfe serum (FBS) og telle med trypan blå og en hemocytometer.
Merk: Hvis BAL-væsken ikke er atskilt ved å overholde cellene før sortering, går du videre til del 4.
3. overholdelse av BAL celler (valgfritt)
Merk: Denne alternative protokollen kan utføres før eller i stedet for celle sortering. Følgende prosedyre må utføres under sterile forhold i et BSL2 kabinett (eller høyere).
- Overfør det ønskede antall BAL-celler for sortering til en ny 15 mL rør og utgjør riktig volum for 1,5 x 106 makrofager/ml. Plate 2 mL celler per brønn i 6-brønn plater og ruge for 2 timer ved 37 ° c med 5% CO2, for å gi tid til overholdelse.
- Etter inkubasjons, nøye aspirer mediene som inneholder nonadherent celler og overføre den til en 15 mL tube. Sentrifuger ved 300 x g i 10 min ved romtemperatur (RT). Fjern supernatanten og resuspend ved 1 x 107 celler/ml i fosfat-bufret saltvann (PBS) + 2% FBS og overføre suspensjonen til en 5 ml rund bunn polystyren tube. Denne brøkdelen av lymfocytter er nå klar til å farge for celle sortering.
- Til de resterende tilhenger celler i platen, tilsett 1 mL per brønn av celle-oppheve Aktivitetstilknytning løsning (se tabellen av materialer) og ruge i minst 15 min ved 37 ° c med 5% co2, inntil cellene skille lett fra platen med en pipette spissen.
- Forsiktig, men grundig skrape de tilhenger cellene fra brønnen overflaten ved hjelp av en pipette spissen, og bruk 1 mL væske i brønnen for å bistå med avløsning. Overfør cellene til en ny 15 mL tube. Vask brønnene med 1 mL PBS og legg dette til det samme røret. Gjør opp innholdet i røret til 5 mL med PBS.
- Sentrifuger på 300 x g for 10 min ved RT. Fjern supernatanten, resuspend ved 1 x 107 celler/ml PBS + 2% FBS, og Overfør suspensjonen til en 5 ml rund bunn polystyren tube. Denne myelogen fraksjonen er nå klar til å flekken for celle sortering.
4. isolering av perifere blod mononukleære celler
Merk: Følgende prosedyre må utføres under sterile forhold i et BSL2 kabinett (eller høyere).
- På samme dag i bronkoskopi (vanligvis rett før BAL-samlingen), få seks rør av venøs blod fra en donor i ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) rør (ca 10 mL per tube).
- Skill blodet ved å sentrifugering blod rørene ved 300 x g i 15 minutter ved RT. Overfør plasma til 1,5 ml mikrosentrifugen rør i 1 ml alikvoter og oppbevar den ved-80 ° c.
-
Utfør tetthet gradient separasjon.
- Tilsett 2 mL RPMI 1640 til hvert blod rør og bland godt med en serologisk pipette.
- Overfør til 3x 50 mL rør og utgjør volumet i hvert rør til 25 mL med RPMI 1640.
- Forbered en ny gruppe med 3x 50 mL rør, hver inneholder 20 mL av lymfocytter (LSM) (se tabell over materialer) på RT. langsomt og forsiktig lag de 25 ml fortynnet blod på toppen av LSM for hver av de tre rørene, holder røret i en 45 ° vinkel .
- Sentrifuger på 600 x g for 25 min på RT med lav akselerasjon og ingen retardasjon (brems av).
-
Utfør en vask av perifere blod mononukleære celler (Pbmc).
- Overfør lag av celler i grensesnittet av de to væske faser i røret til en 50 mL rør ved hjelp av en serologisk pipette; Hvis det er mer enn 30 mL volum, del det i to rør. Gjør opp volumet i hvert rør til 50 mL med PBS.
- Sentrifuger på 700 x g for 5 min på RT og fjern så mye supernatanten som mulig.
- Resuspend pellet og utgjør volumet til 25 mL med PBS. Sentrifuger på 350 x g for 10 min på RT og fjern så mye supernatanten som mulig.
- Gjenta vaske trinnet som er beskrevet i trinn 4.4.3.
- Resuspend pellet i 5 mL PBS + 2% FBS og telle cellene.
5. sortering av hele BAL-celler og Pbmc
Merk: Følgende prosedyre må utføres under sterile forhold i en BSL2 (eller høyere).
- Klargjør sorterings bufferen som inneholder PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (pH 7,4). Tilbered 5 mL polystyren-rør med rund bunn med 1 mL FBS for oppsamling av sorterte celle delsett.
-
Utfør farging.
- Forbered 3x 5 mL rundt bunn polystyren rør, hver for BAL (hele celler eller lymfocytter og myelogen fraksjoner etter tilslutning) og Pbmc (se avsnitt 4). For hvert delsett, utarbeide ett rør med celler for å sortere og to rør av 5 x 105 celler til bruk for unstained og levedyktighet flekk kompensasjon kontroller.
- Sentrifuger ved 350 x g i 5 min ved 4 ° c. Fjern supernatanter, resuspend cellene for kontroller i 100 μL av PBS, og oppbevar dem ved 4 ° c til kompensasjons kontrollen kan fremstilles som beskrevet i trinn 5.2.6.
- Forbered en 1:20 fortynning av FC reseptor (FcR) blokkerer reagens i PBS + 5% FBS (se tabell over materialer-for å hindre at ikke-spesifikk binding av antistoff til FcR på FcR-uttrykker celler). Resuspend cellene til å sortere dem ved 1 x 107 celler i 250 til FcR-blokkerende blanding. Ruge dem i 1 time ved 4 ° c.
- Etter inkubasjons, tilsett den passende antistoff cocktail (se tabell 1) til cellene og ruge i 1 time ved 4 ° c i mørket.
- Etter 1 h av farging, tilsett 1 mL PBS til cellene og sentrifuger ved 350 x g i 5 min ved 4 ° c. Fjern de supernatanten og resuspend cellene i sorterings bufferen for å få 1 x 107 celler i 250 ΜL. Filtrer cellene gjennom et 70 μm filter om nødvendig.
- Klargjør kompensasjons kontroller.
- Legg tre dråper hver av anti-mus Ig, ĸ, og negativ kontroll kompensasjon perler (se tabell over materialer) per 1 ml PBS i et mikrosentrifugen rør og overføre 100 μL til hver 5 ml rund bunn polystyren rør som skal brukes til kompensasjon. Forbered ett rør for hver fluorokromkonjugert stede i cocktail som skal brukes.
- Tilsett 1 μL av hvert antistoff i cocktail til et annet rør som inneholder perler. Tilsett 1 μL levedyktighet flekk til ett av rørene på 5 x 105 celler satt til side i trinn 5.2.1. Ruge i 20 min ved 4 ° c i mørket.
- Tilsett 1 mL PBS til hvert rør og sentrifuge ved 350 x g i 5 min ved 4 ° c. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 250 til μL av PBS. Oppbevares ved 4 ° c i mørket til det trengs.
- Sorter cellene etter fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) i oppsamlings rør tilberedt med 1 mL FBS og virvel forsiktig til coat sidene av rørene med serum.
- Sorter BAL-celler ved lavt trykk. Gate celler først å utelukke støy og inkludere live, CD45+ celler, og innenfor denne populasjonen gate ut doublet celler (se Figur 3). Innenfor større myelogen befolkning sortere CD206 og CD169 doble positive celler som AMs; innenfor de mindre lymfocytter befolkningen isolere CD3+ celler og sortere både CD4 og CD8 enkelt positive populasjoner (se Figur 3; gating strategi beskrevet i delen for representative resultater).
- Når sortering Pbmc, gate celler første til å ekskludere støy og inkluderer Live, CD45+ celler, og innenfor denne populasjonen gate ut doublet celler. Deretter gate på CD3 celler og innenfor CD3- befolkningen, gate først på CD14 og sortere enkelt-positive monocytter, og deretter innenfor CD3+ befolkningen gate på CD4 og CD8 og sortere både enkelt positive populasjoner (gating strategi detaljert i Representative resultater seksjon.
6. immunfenotyping av AMs og Pbmc
Merk: Følgende prosedyre må utføres under sterile forhold i et BSL2 kabinett (eller høyere).
- Legg opp til 1 000 000 hver av AMs og Pbmc til to separate 5 mL Round-bunn polystyren rør. Sentrifuger på 300 x g i 5 min ved 4 ° c og fjern supernatanten.
- Utfør FcR blokkering for å forbedre spesifisitet av antistoff farging. For dette resuspend cellene i 100 μL av PBS + 2% FBS og tilsett 1,4 μL av FcR blokkerings reagens. Ruge for 20 min ved 4 oC.
-
Utfør ekstracellulære farging.
- Etter inkubasjons med FcR-blokk, tilsett ønsket ekstracellulære antistoff cocktail, Vortex rørene, og ruge for 1 t ved 4 ° c i mørket.
- Vask 2x ved å tilsette 500 μL av PBS og sentrifugering ved 350 x g i 5 min ved 4 ° c.
-
Forbered fiksering og permeabilization (se materialfortegnelsen for spesifikke reagenser som brukes).
- Forbered permeabilization løsning med 1 del permeabilization buffer og 3 deler fortynningsmiddel buffer. Resuspend pellet i 1 mL permeabilization oppløsning og ruge for 40 min ved 4 ° c i mørket.
- Forbered vaskeløsning med 1 del vaskebuffer og 4 deler H2O. Tilsett 2 ml vaskeløsning til permeabilized celler og sentrifuger ved 350 x g i 5 min ved 4 ° c. Fjern supernatanten.
-
Utfør intracellulære farging.
- Resuspend cellene i 100 μL av 1x vaskeløsning, tilsett de ønskede intracellulære antistoffer, Vortex rørene og ruge i minst 1 time ved 4 ° c i mørket.
- Tilsett 2 mL vaskeløsning og sentrifuger på 350 x g i 5 minutter ved RT. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 200 ΜL av PBS. Oppbevar cellene ved 4 ° c i mørket til nødvendig.
7. resten av BAL celler
Merk: Følgende prosedyre må utføres under sterile forhold i et BSL2 kabinett (eller høyere).
- Celle tall tillater, lagre nedfryste levende celler fra BAL celle pellet (fra trinn 2.2.2).
- Forbered fryse medier som inneholder 90% FBS + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO).
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 min ved 4 ° c. Fjern supernatanten og resuspend i 1,5 mL fryse medium i et kryogene hetteglass. Overfør de kryogene hetteglassene til en fryse beholder med kontrollert hastighet (se tabell over materialer) og plasser dem ved-80 ° c. Overfør cellene til flytende nitrogen for langtidslagring når temperaturen er nådd.
-
Behold BAL-cellene som tørre pellets.
- Overfør de resterende cellene til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube. Sentrifuger i en Counter-Top sentrifuger ved 6 000 x g for 1 min. Fjern så mye supernatanten som mulig uten å forstyrre pellet. Oppbevar pellet ved-80 ° c.
8. HIV DNA og RNA kvantifisering
Merk: Følgende prosedyre må utføres under sterile forhold i et BSL2 kabinett (eller høyere).
- Totalt antall HIV DNA-kvantifisering
- For å unngå hemming av polymerase kjedere reaksjon (PCR) med BAL lysat rusk, bruk et DNA Extraction Kit (se tabell over materialer) for å trekke ut DNA fra et utvalg av Bal celler i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk 15 μL av dette DNA-et kombinert med en Master mix i preamplification trinnet som er beskrevet nedenfor (trinn 8.1.3).
- Klargjør standard kurve fortynninger.
- Som ovenfor, bruk en DNA-ekstraksjon kit å trekke ut DNA fra en pellet på 2 x 106 ACH-2 celler (se tabell over materialer).
- Etter eluering av DNA, utføre seriell 10-fold fortynninger av ACH-2 DNA for å generere seks fortynninger, alt fra 3 x 105 celler til 3 celler per 15 μL.
- Utfør et preamplification trinn.
- I et eget rom klargjør du Master miksen for n + 2 prøver bestående av 1x polymerase buffer, 3 mm MgCl2, 300 ΜM dNTPs og 2,5 U fra Taq DNA polymerase (se tabell over materialer) og 300 nM for hver av de fire primere (se trinn 8.1.3.2). Utfør alle tiltak i tre eksemplarer brønner.
- Bruk primere hCD3OUT5 ', hCD3OUT3 ', ULF1 og UR1 å generere forsterket DNA fra både menneskelig CD3 og HIV (se sekvenser i tabell 2). Merk at begge genene er preamplified i samme rør. Bland forsiktig og snurre ned røret for å sikre fullstendig miksing.
- Distribuer 35 μL av Master Mix per brønn på en 96-brønn PCR-plate og tilsett 15 μL av standard-eller prøve-DNA. Det totale reaksjons volumet er 50 μL.
- Utfør preamplification (denaturering ved 95 ° c i 8 min, etterfulgt av 12 sykluser på 95 ° c i 1 min, 55 ° c for 40 s, 72 ° c i 1 min, og forlengelse ved 72 ° c i 15 min).
- Utfør PCR i sanntid.
- For å kvantifisere CD3 og HIV-DNA, klargjør du to Master blandinger som inneholder 1x PCR-reaksjon Master mix (se tabell over materialer), 1 250 NM passende grunning, og 100 NM sonde. Bruk primere HCD3IN5 ' og HCD3IN3 ' og sonde CD3 FamZen å kvantifisere menneskelig CD3 i en reaksjon, og primere UR2 og LambdaT og sonde UHIV FamZen å kvantifisere HIV DNA i en annen reaksjon (se sekvenser i tabell 2). Distribuer 13,6 μL av hver miks i qPCR-tilpassede rør.
- Fortynne det preamplification PCR fabrikat for 1:10 inne sterilt vann, DNase, RNase, og protease ledig. Tilsett 6,4 μL av hver fortynnet prøve til 13,6 μL av qPCR-blanding i qPCR-tilpassede rør for et total reaksjons volum på 20 μL.
- Utfør sann tids PCR ved hjelp av følgende program: denaturering ved 95 ° c i 4 min og 40 sykluser på 95 ° c for 3 s og 60 ° c til 10 s med ett enkelt oppkjøp.
- Ekstrapolere antall HIV-kopier og tall celle ekvivalenter i hvert reaksjons rør fra standard kurvene. Beregn antall HIV-DNA Kopier/106 celler.
- HIV RNA-kvantifisering
- Trekk ut RNA fra et utvalg av BAL-celler ved hjelp av et RNA avsugs sett (se tabell materialet) i henhold til produsentens anvisninger. Bruk 17 μL av denne RNA i motsatt transkripsjon og preamplification trinn som er beskrevet nedenfor (trinn 8.2.4).
- LTR-gag RNA syntetisert in vitro og presist kvantifisert brukes som standard; den er tilsatt i en sunn giver RNA-ekstrakt for GUSB normalisering. Forbered seks seriell 10-fold fortynninger av denne standarden, tilsvarende 3 x 105 celler til tre eksemplarer av ltr-gag RNA i 17 μL.
- Distribuer 17 μL av hver standard fortynning og hver prøve i en 96-brønn PCR plate og behandle prøvene med DNase (se tabell over materialer) i 10 min ved 25 ° c for å fjerne forurensning genomisk DNA. Stopp reaksjonen ved å tilsette 2 μL 25 mM EDTA og ruge prøvene i 10 min ved 65 ° c.
- Utfør omvendt transkripsjon (RT) og preamplification PCR.
- Utfør dette trinnet ved hjelp av ett-trinns RT-PCR-sett (se tabell over materialer) i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk primere GUSB frem 1, GUSB Reverse 1, UR1 og ULF1 å generere forsterket cDNA fra både menneskelig GUSB som housekeeping genet og LTR-gag HIV RNA (se sekvenser i tabell 2). GUSB-verdiene vil bli brukt til å normalisere HIV-verdiene.
- Distribuer 31 μL av Master Mix per brønn i den samme 96-brønnen PCR-platen som inneholder DNase-behandlede standarder og prøver, og bland godt. Det totale reaksjons volumet er 50 μL.
- Kjør platen i 16 sykluser i henhold til produsentens anvisninger, med en annealing temperatur på 55 ° c.
- Utfør PCR i sanntid.
- Forbered to Master mikser som inneholder 1x PCR reaksjon Master mix (som ovenfor i trinn 8.1.4.1), 1250 nM passende grunning, og 100 nM sonde. Bruk primere GUSB forover 2, GUSB Reverse 2, og sonde GUSB-HEX å kvantifisere GUSB cDNA i en reaksjon; bruke primere UR2, LambdaT, og sonde UHIV FamZen å kvantifisere HIV cDNA i en annen reaksjon (se sekvenser i tabell 2).
- Distribuer 13,6 μL av hver Master mix i qPCR-tilpassede rør. Fortynne RT-preamplification PCR-produkter 1:10 i sterilt vann, DNase, RNase og protease fri, og tilsett 6,4 μL av hver utvannet prøve eller standard til den aktuelle PCR-miksen. Det totale reaksjons volumet er 20 μL.
- Utfør sann tids PCR ved hjelp av følgende program: denaturering ved 95 ° c i 4 min og 40 sykluser på 95 ° c for 3 s og 60 ° c i 10 s med enkel anskaffelse (Velg den grønne kanalen for FamZen og gul for HEX).
Representative Results
I de fleste nonsmokers mottas BAL-væsken i en steril beholder og er en litt grumsete gul-oransje-farget væske. Væsken kan være Pinker i fargen hvis giveren gjennomgikk endobronchial biopsier under bronkoskopi og noen blødninger oppstod. Væsken kan være mørkere i fargen hvis giveren er en røyker. Etter sentrifugering, vil BAL supernatanten være nesten klar og litt oransje, mens cellen pellet kan variere i farge fra off-White til svært mørk brun, avhengig av tilstanden til prøven og om donor var en røyker eller ikke.
Når du teller hele Bal prøven, kan forskjellige celletyper bli sett, inkludert større, runde makrofager rundt 17 μm i diameter og mindre runde lymfocytter rundt 7,3 μm i diameter18,19 (se figur 2). Makrofager er forstørret i røykere med ca 40%18. Skillet mellom celletyper gjør det mulig å telle makrofager og lymfocytter separat. Det kan også være noen rusk synlig i feltet, spesielt i prøver fra røykere. Makrofager er den mest tallrike celle type i BAL, sto for ca 85% av cellene i nonsmokers20, og de er beriket med røykere slik at de kan virke nesten eksklusivt.
BAL-cellene har en tendens til å samle, så de må blandes godt under alle manipulasjoner. Pellet kan vises mørkt selv etter flere vask trinn. Hvis trådformede rusk er tydelig i brøk etter farging for celle sortering, passerer cellene gjennom et 70 μm filter før du kjører dem gjennom celle sorteringen.
Sorteringen av BAL celler må gjøres ved et lavt trykk for å sikre dråpestørrelser store nok til å imøtekomme makrofager. Cellene er først gated å inkludere alle CD45+21 celler, og deretter basert på levedyktighet for å sikre at alle døde celler er utelukket (se Figur 3). Singlet celler er så valgt, og innenfor dette, to populasjoner er gated basert på størrelse og morfologi, nemlig større myelogen celler og mindre lymfocytter (se Figur 3). Innenfor de større cellene, er celler gated på CD20622,23 og CD16922 og dobbelt-positive celler er sortert som AMs, mens innenfor de mindre cellene, CD3+ celler er valgt og gated på CD4 og CD8; CD4 enkelt-positive og CD8 enkelt-positive celler er sortert (se Figur 3). Markørene som ble brukt ble valgt basert på tidligere beskrevet fenotyper av AMs, slik som mannose reseptoren CD206, funnet på phagocytic celler23, og SIALOADHESIN reseptoren CD16922.
Når sortering av Pbmc, celler er først gated på fremover og side scatter som skal vise en homogen lymfocytter befolkning, som alle er tatt, unntatt støy nær null-aksen (data ikke vist). Befolkningen er gated på levedyktighet og CD45, og leve CD45+ celler brukes. Denne populasjonen er da inngjerdet på CD3; å isolere monocytter, er CD3- befolkningen senere GATED på CD14 og alle enkelt positive celler er sortert. Å isolere lymfocytter delsett, CD3+ celler er GATED på CD4 og CD8 og både enkelt positive og celle populasjoner er sortert.
Figur 1 : Protokoll oversikt. En skjematisk fremstilling av arbeidsflyten i protokollen, inkludert potensiell nedstrøms bruk av de genererte prøvene. PBMC = perifert blod mononukleære celler; BAL = lunges tømming; LSM = skille mellom lymfocytter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Visning av hele Bal-væsken i mikroskop. Mikroskop bilder fra (a) en nonsmoker og (B) en røyker med synlige lymfocytter (L), makrofager (M), og røde blodlegemer (RBC). Forstørrelsen er 1, 000x (10x øye og 100 ganger objektiv med olje nedsenking). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representative gating strategi for celle sortering av hele Bal-celler. Gating strategi brukes til å sortere alveolære makrofager (AM), CD4, og CD8 T-celler fra hele BAL celleprøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel | Antistoff | Fluorokromkonjugert | Klone | Volum per test (μL) |
| MOTKONTO og PBMC | Live/Dead | APC-H7 | - | 1 |
| CD45 | PE-Cy7 | HI30 | 5 | |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 2 | |
| CD4 | PE-cy5 | RPA-T4 | 4 | |
| CD8 | BV605 | SK1 | 3 | |
| Bare MOTKONTO | CD206 | Pe | 19,2 | 10 |
| CD169 | BB515 | 7-239 | 5 | |
| Bare PBMC | CD14 | BV786 | M5E2 | 5 |
Tabell 1: flyt panel for sortering av hele BAL-celler og isolerte Pbmc.
| Målet | Trinn | Primer navn | Primer sekvens | |||
| HIV totalt DNA eller HIV LTR-gag RNA | Pre-forsterkning PCR | UR1 | 5 '-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3 ' | |||
| ULF1 | 5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3 ' | |||||
| PCR i sanntid | UR2 | 5 '-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3 ' | ||||
| LambdaT | 5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3 ' | |||||
| UHIV FamZen: | 5 '-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3 ' | |||||
| CD3 DNA | Pre-forsterkning PCR | HCD3 ut 5 ' | 5-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3 ' | |||
| HCD3 ut 3 ' | 5 '-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3 ' | |||||
| PCR i sanntid | HCD3 i 5 ' | 5 '-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3 ' | ||||
| HCD 3 i 3 ' | 5 '-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3 ' | |||||
| CD3 FamZen: | 5 '-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3 ' | |||||
| GUSB RNA | Pre-forsterkning PCR | GUSB frem 1: | 5 '-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3 ' | |||
| GUSB omvendt 1: | 5 '-GTT LUFTFARTSTILSYNET ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3 ' | |||||
| PCR i sanntid | GUSB frem 2: | 5 '-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3 ' | ||||
| GUSB omvendt 2: | 5 '-CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3 ' | |||||
| GUSB-HEX: | 5 '-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 ' | |||||
Tabell 2: primer-og sonde sekvenser for HIV-DNA og RNA-kvantifisering.
Discussion
Heri har vi beskrevet en metode for behandling av BAL Fluid å få CD4 T celler og AMs, sammen matchet Pbmc, som kan bli studert for å undersøke HIV reservoaret i lungene. Vi har nylig rapportert om HIV DNA kvantifisering i CD4 T-celler fra matchet perifert blod og BAL prøver, og vår gruppe viste at HIV er 13 ganger mer rikelig i lunge CD4 T-celler enn i de fra perifert blod15. Men nivåene av HIV-DNA i AMs er donor-avhengige og så, så langt har det ikke vært en konsistent sammenheng mellom HIV-DNA nivåer i lymfocytter sammenlignet med makrofager15. Tilgangen til disse primære macrophage celle delsett, men vil være et viktig verktøy for å forhører dette spørsmålet og få en bedre forståelse av viral belastning i lungene i sammenheng med HIV-reservoaret.
I pre-ART æra og i flere andre studier utnytte BAL væske, deltakerne gjennomgikk bronkoskopi for å diagnostisere en mistenkt patologi eller få en mikrobiologisk diagnose for respiratoriske symptomer3. Vi var imidlertid i stand til å rekruttere deltakere uten aktive lungesymptomer eller patologi, og alle deltakerne signerte et etisk samtykke skjema15. Vi var i stand til å rekruttere deltakere fra vårt senter som deltok i andre studier, for eksempel en Spirometri screening studie for obstruktiv lungesykdom24, samt de som gjennomgår andre forsknings prosedyrer, for eksempel leukaferese og Koloskopi. Tidligere forskning blant mennesker som lever med HIV demonstrert at altruisme er en viktig faktor motiverende deltakelse i forskningsstudier25. Som med mange menneskelige prøver, noterte vi en stor del av person-til-person variasjon. Det var ingen måte å "forutsi" som deltakerne vi ville få BAL med god versus dårlig celle gir. I motsetning til perifert blod, som gir ganske konsistent antall lymfocytter, celle tallene i BAL Fluid er svært variabel. Injisere et større volum av normal saltvann i lungene (med håp om å få en større avkastning på BAL væske) er ikke alltid mulig som større volumer av normal saltvann er ofte forbundet med mer hoste og en høyere risiko for feber postbronchoscopy. Vi la merke til at ved hjelp av en mindre (i stedet for større) diameter bronkoskop aktivert respirologist å nå dypere inn i bronkiene og få væske som inneholder større mengder av celler. En konsistent funn var at tobakk røykere hadde mye større proporsjoner av AMs enn lymfocytter innenfor deres BAL-væske, som er forventet som AMs sluker rusk og partikler. Videre observerte vi at BAL væske fra røykere inneholdt rusk som kan blokkere utstyret som brukes, for eksempel PCR-maskiner og strømnings cytometers. Lignende problemer kan observeres i områder med høy forurensning eller individer eksponert oftere til dårlig luftkvalitet.
Med hensyn til deres rolle i etableringen av HIV-reservoarer og viral utholdenhet, renheten av CD4 T-celler og AMs er en viktig faktor. Av denne grunn valgte vi å bruke fluorescens-aktiverte celle sortering (FACS) for å oppnå svært rene celle populasjoner. Det er også mulig at den innsamlede BAL væsken kan være forurenset med blod som noen mindre blødning er forventet under en bronkoskopi; tilstedeværelsen av naive B-celler ville indikere dette, og cellene kan vaskes i en rød blod cellelyse buffer for å omgå dette problemet. En annen utfordring med å studere BAL væske relaterer til kvantifisere inflammatoriske markører og cytokiner, som er viktige for å forstå HIV utholdenhet26. Som innpodet saltvann utvanner BAL Fluid, nivåer av inflammatoriske meglere og cytokiner kan være vanskelig å måle. Selv om en urea korreksjon faktor har blitt foreslått å gjøre rede for fortynning, er det relativt lite litteratur som beskriver bruken27,28.
AMs er svært autofluorescent, som utgjør et problem under celle sortering og flyt flowcytometri fenotypiske analyse. Spesielt effekten er mer uttalt hos røykere som AMs kan være helt svart i fargen, betydelig påvirker deres autofluorescence. Når opphisset av en standard blå 488 NM laser, er am autofluorescence på sitt høydepunkt på ca 540 NM, som overlapper med fluorescens Spectra brukte konjugater som FITC og PE29,30. Det er verdt å merke seg at to separate lasere kan brukes til å opphisse FITC og PE (f. eks PE av gul/grønn og FITC av den blå 488 laser). For å overvinne den iboende autofluorescence med FITC, brukte vi unstained AMs for å bestemme autofluorescence bakgrunn. I tillegg kan bruken av fluorescens minus en (FMO)-kontroller være svært nyttig for å bekjempe disse tekniske problemene. Større perler (f. eks 7,5 μm) kan brukes, som er nærmere i størrelse for kompenserende macrophage populasjoner, sammenlignet med mindre perler (f. eks 3,0 μm), som kan brukes for kompenserende lymfocytter. En enda mer egnet tilnærming ville være å bruke en liten brøkdel av celler som enkelt-flekken kontroller, ved hjelp av en kjent, svært uttrykt markør på undergruppe, for eksempel HLA-DR eller CD45, bøyd til hver av de ønskede fluorokromer, som ville gi rom for en mye mer nøyaktig kompensasjon enn det som kan oppnås med perler. I tilfelle av røykere ' prøver, er denne taktikken spesielt nyttig som makrofager er mye større og mer autofluorescent. I tillegg, fra utarbeidelsen trinn, kan hele BAL prøven være kultivert i en tallerken før sortering som beskrevet i del 3 av protokollen, for å tillate en separasjon av befolkningen ved tilslutning. På denne måten kan tilhenger makrofager isoleres fra andre nonadherent celler som lymfocytter. Kompensasjon er langt mindre utfordrende dersom lymfocytter og AM-populasjoner er separert i stedet for undersøkt sammen; men å stole på etterlevelse vil resultere i tap av makrofager, som er en viktig faktor når celle tall er allerede begrensende. Også, en tilslutning skritt kan føre til uønsket aktivering av tilhenger monocytter, som kan påvirke nedstrøms resultater generert ved hjelp av disse cellene. Verdien av effektivt å sortere celler til renere populasjoner må veies opp mot begrensningen av å ha færre slike celler for senere eksperimenter.
Andre modeller, spesielt murine modeller, har blitt brukt til å studere macrophage immunologiske egenskaper og biologi. Selv om disse modellene er svært nyttige og gir stor innsikt i en celle type som er vanskelig å manipulere, har de begrensninger. Mange av celleoverflaten markører varierer mellom mus og mennesker slik at immunophenotype av menneskelig AMs er ikke helt forstått. Imidlertid krever denne modellen systemet pooling av flere mus for analyser på grunn av den lave celle tall tilgjengelig fra hvert dyr. I tillegg er nødvendigheten av å Pool prøvene utelukker betraktninger av genetisk predisposisjon og sex. Nylig har det vært vist at sex spiller en rolle i infectivity av makrofager av HIV-1 på grunn av ulike uttrykk for begrensningen faktor SAMHD-131. Nonhuman primater (NHP) representerer den nærmeste modellen til mennesker og tilrettelagt studiet av Simian immunsviktvirus (SIV) infeksjon og dens effekt på immunsystemet, gir innsikt i rollen som vev-Resident makrofager i forhold til monocytt-avledet makrofager. I rhesus aper, det har også vist at lunge macrophage isolerer fra BAL Harbor en replikering-kompetent virus; en viral utvekst analysen (VOA) ble brukt til å analysere oppførselen til SIV i vev-Resident celler32. En slik oppdagelse er av betydelig forsknings verdi, men må fortsatt være validert hos mennesker før den kan anvendes, og den høye kostnaden ved å bruke NHPs utelukker bruk av store utvalgs populasjoner. I tillegg vil menneskelige AMs være nyttig for mange andre programmer som in vitro viral/mikrobiell infeksjon analyser og i studier av andre patogener som tuberkulose/HIV Coinfection.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne erkjenne sine Oppdragsgivers: Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (gi #153082 til CC, MAJ, NC); Réseau SIDA et sykdommer infectieuses du fonds de Recherche du Québec-santé (FRQ-S) som innvilget finansiering til CC og MAJ og McGill University Faculty of Medicine som innvilget finansiering til CC. Denne studien ble også støttet i del Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-finansiert kanadiske HIV Cure Enterprise (Dukurere) Team Grant HB2-164064 til MAJ, CC og NC. MAJ holder CIHR Canada Research Chair Tier 2 i Immunovirology og CC og NC holder en FRQ-S Junior 1 og Junior 2 forskning lønn prisen, henholdsvis. ET har en RI-MUHC studentship MSc Award.
I tillegg vil forfatterne ønsker å erkjenne Josée Girouard og alle kliniske ansatte involvert i koordinering og innhenting av prøvene, så vel som luftveiene terapeuter; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette, og Marie-Hélène Lacombe på RI-MUHC Immunfenotyping plattform; og Dr. Marianna Orlova for levering av mikroskopi bilder. Viktigst, forfatterne ønsker å takke de mange frivillige uten hvem denne forskningen ikke ville være mulig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
| ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
| BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
| BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
| Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
| Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
| CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
| CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
| CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
| CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
| CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
| dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
| EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
| FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
| FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
| FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
| HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
| HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
| Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1 °C/min, the optimal rate for cell preservation |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
| PBS 1x | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
| PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
| PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2x concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
| QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
| Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
| RPMI 1640 1x | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
| Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
| Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10x PCR buffer, magnesium chloride |
| Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |
References
- Chun, T. W., Fauci, A. S. Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).
- Finzi, D., et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy. Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).
- Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection. Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).
- Center for Disease Control and Prevention. A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California. Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).
- Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus. Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).
- Kunisaki, K. M. Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease? Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).
- World Health Organization. WHO | Tuberculosis and HIV. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).
- Jambo, K. C., et al. Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function. Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).
- Yeligar, S. M., et al. Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ. AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).
- Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages. AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).
- Holt, P. G., et al. Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure. Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).
- Brenchley, J. M., et al. High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage. Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).
- Mwandumba, H. C., et al. Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection. The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).
- Gordon, S. B., et al. Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses. Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).
- Costiniuk, C. T., et al. HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy. AIDS. 32, 2279-2289 (2018).
- American Thoracic Society. American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).
- King, T. E. Jr Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).
- Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls. European Respiratory Journal. 50, (2017).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50, 243-248 (1985).
- Heron, M., et al. Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung. Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).
- Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Yu, Y. R. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).
- Geiser, M. Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).
- Costiniuk, C. T., et al. Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study. HIV Medicine. , (2019).
- Balfour, L., et al. Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173). AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).
- Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir. Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).
- Rennard, S. I., et al. Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution. Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).
- Twigg, H. L., et al. Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects. The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).
- Duan, M., et al. Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease. The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).
- Garn, H. Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).
- Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Avalos, C. R., et al. Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).
