Summary
肺気管支胞洗浄液を処理し、慢性HIV感染者の末梢血を抗レトロウイルス療法で処理し、肺HIV貯留部を評価する方法を説明する。これらの方法は、超高感性ポリメラーゼ連鎖反応による免疫フェノタイピングおよびHIV DNA/RNA定量に使用できる、非常に純粋なCD4 T細胞および肺胞マクロファージの獲得をもたらす。
Abstract
気管支鏡検査は、正常な生理食塩水を気管支鏡を介して肺に注入し、吸引を適用し、気管支肺胞洗浄(BAL)液を除去する医療処置である。BAL流体は細胞が豊富であり、したがって、肺免疫milieuの「スナップショット」を提供することができます。CD4 T細胞は、最高の特徴を持つHIV貯蔵所であり、肺胞マクロファージ(AM)を含む組織マクロファージもウイルス貯留部として機能することを示唆する強力な証拠がある。しかし、HIV貯水池の設置とメンテナンスの文脈におけるAMの役割については、まだ多くは不明です。したがって、BAL流体を処理して、肺内の細胞集団およびサブセットを特徴付け、評価するためにウイルス学的および免疫学的アッセイに使用できる細胞を得るためのプロトコルを開発することは、HIVとしての肺の役割を理解するのに関連する。貯水池。ここでは、このようなプロトコルについて説明し、単純遠心分離およびフローサイトメトリーなどの標準的な技術を用いる。CD4 T細胞およびAMは、免疫フェノタイピングおよびHIV DNAおよびRNA定量を含むその後の用途に使用されてもよい。
Introduction
HIV感染の治療に直面する最も重要な課題の1つは、抗レトロウイルス療法(ART)1、2の中断後に血漿ウイルス血症のリバウンドを引き起こす潜伏HIV貯蔵所の存在である。長期ART中のHIV貯蔵所は、二次リンパ球器官、腸関連リンパ組織(GALT)、中枢神経系(CNS)を含むいくつかの組織区画でよく文書化されているが、肺は研究の領域として見落とされてきた。プレアート時代から3.しかし、肺はHIVの病因において中心的な役割を果たしている。実際、肺症状はエイズ関連の日和見感染症の最初の指標の一つであった4.現代のART時代でさえ、HIVを持つ人は、HIVを持たない人よりも感染性および非感染性肺疾患の両方を発症するリスクが高い。例えば、HIV感染者は、侵襲性連鎖球菌性肺炎感染症、ならびに慢性閉塞性肺疾患(COPD)5、6のリスクが高い。さらに、結核(結核)とHIVの共感染は、世界の特定の地域、特にサハラ以南のアフリカでは、HIV感染者がHIV7を持たない人よりも結核を有する可能性が16~27倍高いため、公衆衛生上の重要な課題である。肺感染症や慢性疾患に対するこの感受性に関するいくつかの説明が提案されているが、HIVを抑制した個人による正確な細胞機構は8、9、10である。血漿ウイルス負荷は、肺合併症のリスクが高いままで、完全には解明されていない。重要なことに、HIVは肺感染症および慢性疾患の非常に強い危険因子であり、喫煙状況6とは無関係である。
したがって、肺の免疫環境の分析は、健康および疾患におけるその役割を理解するために重要である。非侵襲的であるが、誘導された痰サンプルは、まれな肺リンパ球とAMを持つ大量の上皮細胞および破片を含む傾向があり、その役割は特定の用途に限定される。逆に、組織の大きな生検は、重大な出血および気胸(肺の崩壊)の関連リスクのために疑わしい疾患がない場合には得ることができない。さらに、肺免疫細胞の大部分は、主に呼吸中に抗原によって肺が継続的に刺激される粘膜レベルに位置しています。そのために、BAL液を得るための気管支鏡検査は、リンパ球およびAMへの比較的安全なアクセスを提供するという利点がある(図1参照)。マクロファージはBAL流体内の細胞の最大の割合を構成し、続いてリンパ球11が続く。したがって、免疫表現型、細胞培養、トランスクリプトミクス、またはそれ以上のアプリケーションなどの後続のアプリケーションで使用するためにBAL流体を処理する方法を確立することは有用である。ここで概説するBAL流体を処理するためのプロトコルは、前述の一般的な手順から適合され、採用される様々な下流アッセイ用に最適化されています。この方法論は、肺リンパ球と骨髄粘膜免疫細胞の両方の表現型および機能的特徴付けのための分離を可能にするだけでなく、HIVと一緒に住んでいる成人におけるHIV貯蔵所の評価を可能にする。
このプロトコルを確立するために、以下の基準を使用して、研究参加者15を募集しました。この研究に参加するには、(1)ARTに関する基準を満たすHIV感染者が少なくとも3年間、その人である必要がありました。(2)最低3年間のウイルス負荷(VL)を抑制した。(3) CD4 T セル数 ≥200/mm3;(4)スピロメトリーと気管支鏡検査の研究を受けることを喜んで。以下の基準を有する患者は、研究から除外された: (1) 気管支鏡検査への禁忌;(2)高出血リスク:凝固症またはワルファリンまたはクロピドグレル療法;(3) 血小板減少症 (低血小板);(4)活動的な肺感染症または他の急性肺プロセス;(5)妊娠/妊娠しようとしている。
Protocol
この研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に含まれる原則に基づいて直接設立され、マギル大学保健センター(RI-MUHC、#15-031)、ケベック大学の機関審査委員会から承認を受けました。モントリオール(UQAM、#602)とセンター・ド・レヒャー・デュ・センターホスピタリティー・ド・レヴェルシテ・デ・モントリオール(CR-CHUM、#15-180)。
1. 気管支アルベオラーラベージ
注:このセクションでは、呼吸療法士16,17の助けを借りて認可された呼吸器科医によって行われる気管支鏡検査について説明する。
- 気管支鏡や生理生理生理を含む、手順に必要な装置の断片を準備します。患者の喉の後ろに麻酔スプレーを投与する。可能な限り局所麻酔の過度の使用を避ける.心拍数とリズムを監視するために胸部に心臓リードを適用し、酸素飽和度を監視するために手の最初の指に酸素プローブを適用します。鼻カニューレを鼻孔に挿入し、酸素を補給します。
- 患者を位置付けし、好ましくは上の位置に置く。以下のように静止を投与する:ミダゾラム0.01-0.04 mg/kgおよびフェンタニル50-100 μg(患者の快適性を促進し、咳反射を最小限に抑えるために)静脈内、呼吸器科医または麻酔科医の存在下で。
- フレキシブル気管支鏡が目的のセグメント下気管支にくさび付くまで進めます。生理生理生理生理生理生理生理物(一度に50〜60 mL)を注射器で浸透させ、穏やかな吸引(50-80 mmHg)を適用します。洗浄液は注射器に集まり、回収容器に移される。
- 洗浄の合計200-300 mLにフラッシュを繰り返します。可能であれば、少なくとも100 mLのBAL液を回収してください。
- BAL液を氷の上に置く。
2. BAL細胞の分離
注:以下の手順は、生物学的安全キャビネット、クラスII(BSL2)以上の無菌条件下で行われなければならない。
-
BAL サンプルは処理されるまで氷の上に保管してください。
- 元のコレクションチューブ内のBALを渦にし、血清ピペットを使用して50 mLチューブに移します。BAL流体が非常に濁っているか、糸状組織によって汚染されているように見える場合は、70 μmのナイロンメッシュフィルターを通して流体を新しい50 mLチューブに濾過します。
- 4 °Cで10分のための200 x gの遠心分離機。上清を新しい50mLチューブに移します。ピペットチップでペレットをゆっくりと分解し、RPMI 1640培地の1mLで再サスペンドします。
- 上清の1mLを10x 1.5mLマイクロ遠心分離管と残りの上清を15mLチューブ、それぞれ10mLに移す。すべての上清チューブを-80 °C.で保管してください。
-
BAL細胞ペレットを処理します。
- 元のサンプルの25 mLごとにRPMI 1640の10 mLでペレットを再ステースします。4 °Cで10分のための200 x gの遠心分離機。上清を新しい15mLチューブに移します(ペレットに十分な細胞があることを確認した後に廃棄します)。
- RPMI 1640 +10%の胎児ウシ血清(FBS)の1mLでペレットを再中断し、トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用してカウントします。
注:BAL流体がソート前に細胞の付着によって分離されていない場合は、セクション4に進みます。
3. BALセルの付着(オプション)
注:この代替プロトコルは、セルの並べ替えの前または代わりに実行できます。以下の手順は、BSL2キャビネット(またはそれ以上)の滅菌条件下で行う必要があります。
- 新しい15 mLチューブにソートするためのBALセルの所望の数を転送し、1.5 x 106マクロファージ/mLの正しい容積を構成します。6ウェルプレートでウェル当たりの細胞のプレート2 mLを、5%CO2で37°Cで2時間インキュベートし、付着する時間を可能にする。
- インキュベーションに続いて、非付着細胞を含む培温を慎重に吸引し、15mLチューブに移す。室温(RT)で10分間300 x gで遠心分離機。リン酸緩衝生理食生(PBS)+2%FBSで上清を取り出し、1 x 107セル/mLで再懸濁し、5 mLの丸底ポリスチレンチューブに懸濁液を移します。このリンパ球画分画は、細胞の選別のために染色する準備が整いました。
- プレート内の残りの付着細胞に、細胞分解溶液(材料表参照)のウェルあたり1mLを追加し、5%CO2で37°Cで少なくとも15分間インキュベートし、細胞がピペット先端でプレートから容易に分離するまで。
- ピペット先端を使用してウェル表面から付着細胞をやさしく完全に削り取り、1mLの液体を井戸に取り付けて剥離を助けます。セルを新しい 15 mL チューブに移します。PBSの1 mLで井戸を洗浄し、同じチューブにこれを追加します。PBSでチューブの含有量を5mLにします。
- RTで10分間300 x gで遠心分離機を取り出し、1 x 107セル/mL PBS+2%FBSで再懸濁し、5 mLの丸底ポリスチレンチューブに懸濁液を移します。この骨髄画分は、細胞のソートのために染色する準備が整いました。
4. 末梢血単核細胞の分離
注:以下の手順は、BSL2キャビネット(またはそれ以上)の滅菌条件下で行う必要があります。
- 気管支鏡検査の同じ日(一般的にBALコレクションの直前)に、エチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)チューブ(チューブ当たり約10mL)のドナーから静脈血液の6本のチューブを得る。
- RTで15分間300xgで血液チューブを遠心分離して血液を分離し、1mLのアリコートで1.5mLマイクロセントリフュージチューブに血漿を移し、-80°Cに保存します。
-
密度勾配の分離を実行します。
- 各血液管にRPMI 1640の2 mLを追加し、血清ピペットを使用してよく混合します。
- 3x 50 mLチューブに転送し、RPMI 1640で25 mLに各チューブの容積を構成します。
- 3x 50 mLチューブの別のバッチを準備し、それぞれがRTでリンパ球分離媒体(LSM)の20 mLを含有する(材料の表を参照)RTで、ゆっくりと穏やかに3つの管のそれぞれのためのLSMの上に希釈された血液の25 mLを層にし、45°の角度で管を保持する。.
- 低加速と減速なし(ブレーキオフ)でRTで25分間600 x gの遠心分離機。
-
末梢血単核細胞(PBMC)の洗浄を行う。
- 血清的なピペットを使用して50 mLチューブにチューブ内の2つの液体相の界面で細胞の層を転送します。体積が30mLを超える場合は、2本のチューブに分けます。PBSで各チューブの容積を50 mLにします。
- RTで5分間700 x gで遠心分離機を取り除き、できるだけ多くの上清を取り除きます。
- ペレットを再ステーペントし、PBSで25 mLの体積を構成します。RTで10分間350 x gで遠心分離機を取り除き、できるだけ多くの上清を取り除きます。
- ステップ 4.4.3 に記載の洗浄手順を繰り返します。
- PBS + 2% FBSの5 mLでペレットを再ステーペンし、細胞を数えます。
5. BAL セル全体と PBMC の並べ替え
注:以下の手順は、BSL2(またはそれ以上)の滅菌条件下で行わなければならない。
- PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (pH 7.4) を含むソートバッファを調べます。ソートされたセルサブセットのコレクションのために、FBSの1 mLを持つ5 mLの丸底ポリスチレンチューブを準備します。
-
染色を行います。
- BAL(付着後の全細胞またはリンパ球および骨髄画分)およびPBMC(セクション4参照)のためにそれぞれ3x 5 mLの丸底ポリスチレンチューブを調製する。各サブセットに対して、ソートするセルを持つチューブを1本、5 x 105セルの2本のチューブを準備して、染色されていない汚れ補正コントロールに使用します。
- 4 °Cで5分間350 x gの遠心分離機。上清を取り除き、PBSの100 μLでコントロール用の細胞を再中断し、ステップ5.2.6で説明するように補正コントロールを準備できるまで4°Cに保存します。
- PBS+5%FBSにおけるFc受容体(FcR)遮断試薬の1:20希釈を調製する(FcR発現細胞上のFcRに対する抗体の非特異的結合を防止するために-材料表を参照)。細胞を再中断し、FcR遮断混合物の250 μLで1 x 107細胞でそれらをソートする。4°Cで1時間インキュベートします。
- インキュベーション後、適切な抗体カクテル(表1参照)を細胞に加え、暗闇の中で4°Cで1時間インキュベートする。
- 1時間の染色の後、細胞に1 mLのPBSを加え、遠心分離機を350 x gで4°Cで5分間加えます。ソートバッファー内の上清を取り除き、ソートバッファー内の細胞を再サスペンドし、250 μLで1 x 107セルを持つ。
- 報酬コントロールを準備します。
- マイクロ遠心管内のPBSの1mL当たり1mLの抗マウスIg、κ、および負の制御補償ビーズ(材料の表を参照)をそれぞれ3滴ずつ追加し、補償に使用する各5 mL丸底ポリスチレンチューブに100 μLを移します。使用するカクテルに存在するフルオロクロムごとに1本のチューブを準備します。
- カクテル中の各抗体の1 μLをビーズを含む別のチューブに添加する。ステップ5.2.1に取っておいた5 x 105細胞のチューブの1つに1 μLの生存性汚れを加えます。暗闇の中で4°Cで20分間インキュベートします。
- 各チューブに1 mLのPBSを加え、遠心分離機を350 x gで4°Cで5分間追加します。上清を取り出し、PBSの250 μLでペレットを再中断します。必要になるまで暗闇の中で4°Cに保管してください。
- 蛍光活性化細胞選別(FACS)で細胞をFBSの1mLで調製した集量チューブに並べ替え、チューブの側面を血清でコーティングするために穏やかに旋回する。
- 低圧でBAL細胞をソートします。ゲートセルは、最初にノイズを除外し、ライブ、CD45+セルを含み、この集団内でダブルトセルをゲートアウトします(図3参照)。より大きな骨髄性集団内では、CD206とCD169の二重陽性細胞をAMとしてソートする。より小さいリンパ球集団内でCD3+細胞を単離し、CD4およびCD8の単一陽性集団の両方をソートする(図3;代表的な結果セクションで詳述されたゲーティング戦略を参照)。
- PBMCをソートする場合、ゲートセルは最初にノイズを除外し、ライブ、CD45+セルを含み、この集団内でダブルトセルをゲートアウトします。次に、CD3細胞およびCD3内のゲート-集団、CD14で最初にゲートを開き、単正単球をソートし、次にCD4およびCD8のCD3+母集団内でソートし、両方の単正母集団をソートする( 代表的な結果セクション。
6. AMおよびPBMCの免疫表現型
注:以下の手順は、BSL2キャビネット(またはそれ以上)の滅菌条件下で行う必要があります。
- 2 つの別々の 5 mL 丸底ポリスチレン チューブに、各 100 万個の AM と PBMC を追加します。4°Cで5分間300 x gで遠心分離機を取り除き、上清を取り除きます。
- 抗体染色の特異性を改善するためにFcRブロッキングを行う。このために、PBS+ 2% FBSの100 μLで細胞を再中断し、FcR遮断試薬の1.4 μLを添加する。4°Cで20分間インキュベートします。
-
細胞外染色を行う。
- FcRブロックによるインキュベーションに続いて、所望の細胞外抗体カクテルを加え、チューブを渦状にし、暗闇の中で4°Cで1時間インキュベートする。
- PBSの500 μLを加え、4°Cで5分間350xgで遠心分離を加えて2倍洗います。
-
固定および透過性の準備をします(使用される特定の試薬については材料の表を参照してください)。
- 1部透過性バッファーと3部希釈バッファーで透過化溶液を調記します。ペルメアビリゼーション溶液の1mLでペレットを再中断し、暗闇の中で4°Cで40分間インキュベートする。
- 1部洗浄バッファーと4部H2 O.を用いて洗浄液を調分し、透過性細胞に2mLの洗浄液を加え、4°Cで5分間350×gの遠心分離機を加える。 上清を取り除く。
-
細胞内染色を行う。
- 1x洗浄溶液の100μLで細胞を再定置し、所望の細胞内抗体を加え、チューブを渦状にし、暗闇の中で4°Cで少なくとも1時間インキュベートする。
- 洗浄液の2 mLを追加し、遠心分離機をRTで5分間350 x gで追加し、PBSの200 μLでペレットを取り出します。必要になるまで暗闇の中で4°Cで細胞を保管してください。
7. BAL細胞の残り
注:以下の手順は、BSL2キャビネット(またはそれ以上)の滅菌条件下で行う必要があります。
- 細胞数が許可され、BAL細胞ペレットから生細胞を凍結保存する(ステップ2.2.2から)。
- 90%FBS+10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む凍結培温剤を調調用する。
- 4°Cで10分間300xgで細胞を遠心分離します。 上清を取り出し、極低温バイアルで凍結培温剤の1.5 mLで再中断します。低温バイアルを制御速度の凍結容器に移し(材料の表を参照)、-80 °Cに置きます。温度に達したら、長期保存のために液体窒素に細胞を転送します。
-
BAL細胞を乾燥ペレットとして保存します。
- 残りの細胞を1.5mLマイクロ遠心管に移します。カウンタートップ遠心分離機の遠心分離機を6,000 x gで1分間1分間遠心分離機で取り除き、ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清を取り除きます。ペレットを-80 °Cに保管します。
8. HIV DNAおよびRNA定量
注:以下の手順は、BSL2キャビネット(またはそれ以上)の滅菌条件下で行う必要があります。
- 総HIV DNA定量
- BALリサートデブリによるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の阻害を避けるために、DNA抽出キット(材料の表を参照)を使用して、製造元の指示に従ってBAL細胞のサンプルからDNAを抽出します。このDNAの15 μLを以下に説明する予備増幅工程でマスターミックスと組み合わせて使用します(ステップ8.1.3)。
- 標準曲線希釈を準備します。
- 上記のように、DNA抽出キットを使用して、2 x 106 ACH-2細胞のペレットからDNAを抽出します(材料の表を参照)。
- DNAの溶出後、ACH-2 DNAの連続10倍希釈を行い、15μLあたり3 x 105細胞から3細胞までの6つの希釈を生成します。
- プリアンプ化ステップを実行します。
- 別の部屋で、1xポリメラーゼバッファー、MgCl2の3 mM、300 μM dNTP、および2.5 UのTaq DNAポリメラーゼ(材料の表を参照)と4つのプライマーのそれぞれ300 nMを含むn +2サンプルのマスターミックスを準備します(参照) ステップ8.1.3.2)。三つ毛井戸のすべての測定を実行します。
- プライマーhCD3OUT5'、hCD3OUT3'、ULF1、およびUR1を使用して、ヒトCD3とHIVの両方から増幅されたDNAを生成します(表2の配列を参照)。両方の遺伝子が同じチューブでプリアンプ化されていることに注意してください。穏やかに混合し、完全な混合を保障するために管を下に回す。
- 96ウェルPCRプレートにウェルあたり35 μLのマスターミックスを分配し、標準またはサンプルDNAの15 μLを追加します。総反応量は50μLです。
- 予増幅を行い(95°Cで8分間、次いで1分間95°Cの12サイクル、40sで55°C、1分間で72°C、15分間72°Cで伸び)。
- リアルタイム PCR を実行します。
- CD3およびHIV DNAを定量化するには、1x PCR反応マスターミックス(材料表参照)、1,250 nM適切なプライマー、および100 nMプローブを含む2つのマスターミックスを調調します。プライマーHCD3IN5'とHCD3IN3'とプローブCD3 FamZenを使用して1つの反応でヒトCD3を定量し、プライマーUR2とラムダットとプローブUHIV FamZenを用いて別の反応でHIV DNAを定量化する(表2の配列を参照)。各ミックスの13.6 μLをqPCR適合チューブに分配します。
- 無菌水、DNase、RNase、プロテアーゼフリーで1:10で予備増幅PCR製品を希釈します。各希釈サンプルの6.4 μLをqPCR適合チューブの13.6 μLに加え、総反応量を20μLにします。
- 次のプログラムを使用してリアルタイム PCR を実行します:単一の取得で 10 s の場合は 95 °C の 95 °C、95 °C の 40 サイクルで 10 ° C を使用します。
- 標準曲線から各反応管内のHIVコピー数と数セル相当数を外挿する。HIV DNAコピー/106細胞の数を計算します。
- HIV RNA 定量
- BAL細胞のサンプルからRNAを抽出し、製造元の指示に従ってRNA抽出キット(材料の表を参照)を使用します。このRNAの17 μLを以下に説明する逆転写およびプリ増幅工程で使用します(ステップ8.2.4)。
- インビトロで合成され、正確に定量されたLTR-gag RNAが標準として使用されます。それはGUSB正常化のための健康なドナーRNA抽出物にスパイクされる。この規格の6つのシリアル10倍希釈を準備し、17 μLでLTR-gag RNAの3つのコピーに3 x 105細胞に対応する。
- 各標準希釈と各サンプルを96ウェルPCRプレートに17μLを分配し、DNase(材料の表を参照)でサンプルを25°Cで10分間処理し、汚染物質ゲノムDNAを除去します。25 mM EDTAの2 μLを加えて反応を停止し、65°Cで10分間サンプルをインキュベートします。
- 逆転写(RT)およびプリアンプ化PCRを実行します。
- 製造元の指示に従って、ワンステップ RT-PCR キット (材料の表を参照) を使用してこの手順を実行します。プライマーGUSBフォワード1、GUSBリバース1、UR1、およびULF1を使用して、ハウスキーピング遺伝子とLTR-gag HIV RNAの両方から増幅されたcDNAを生成します(表2の配列を参照)。GUSB 値は、HIV 値の正規化に使用されます。
- DNase処理規格とサンプルを含む同じ96ウェルPCRプレートにウェルあたり31 μLのマスターミックスを分配し、よく混合します。総反応量は50μLです。
- 製造元の指示に従って16サイクルのプレートを実行し、55°Cのアニーリング温度で使用します。
- リアルタイム PCR を実行します。
- 1x PCR反応マスターミックス(ステップ8.1.4.1で上記のように)、1250 nM適切なプライマー、および100 nMプローブを含む2つのマスターミックスを準備します。プライマーGUSBフォワード2、GUSBリバース2、プローブGUSB-HEXを使用して、1回の反応でGUSB cDNAを定量化します。プライマーUR2、ラムダT、プローブUHIV FamZenを使用して、HIV cDNAを別の反応で定量化する(表2の配列を参照)。
- 各マスターミックスの13.6 μLをqPCR適合チューブに分配します。無菌水、DNase、RNase、プロテアーゼフリーでRTプリ増幅PCR産物1:10を希釈し、各希釈サンプルまたは標準の6.4 μLを適切なPCRミックスに加えます。総反応量は20μLです。
- 次のプログラムを使用してリアルタイム PCR を実行します:95 °C で 4 分間、単一の集録で 10 s の場合は 95 °C、60 °C の 40 サイクルで変性します(FamZen の緑色チャネルと HEX の場合は黄色を選択します)。
Representative Results
ほとんどの非喫煙者では、BAL液は無菌容器で受け取られ、わずかに濁った黄色とオレンジ色の液体である。ドナーが気管支鏡検査中に気管支内生検を受け、いくつかの出血が起こった場合、流体は色がピンカーである可能性があります。ドナーが喫煙者である場合、流体は色が暗くなることがあります。遠心分離の後、BAL上清はほぼ透明でわずかにオレンジ色になり、細胞ペレットはサンプルの状態とドナーが喫煙者であったかどうかに応じて、オフホワイトから非常に暗い茶色に色の範囲をすることができます。
BALサンプル全体をカウントする場合、直径17μm前後の大きな丸いマクロファージと直径18,19の約7.3μmの小さな丸いリンパ球を含む、異なる細胞タイプを可視化することができます(図2参照)。マクロファージは喫煙者で約40%18まで拡大される。細胞型の区別は、マクロファージとリンパ球を別々にカウントすることを可能にする。また、特に喫煙者からのサンプルでは、フィールドに見えるいくつかの破片があるかもしれません。マクロファージはBALの中で最も豊富な細胞型であり、非喫煙者20の細胞の約85%を占めており、喫煙者に富んでいるため、ほとんど排他的に見えるかもしれません。
BAL セルは凝集する傾向があるため、すべての操作中に適切に混合する必要があります。ペレットは、いくつかの洗浄ステップの後でも暗く見えることがあります。細胞選別のために染色した後の分数に糸状の破片が明らかな場合は、細胞選別機を通してそれらを実行する前に、70 μmフィルターを通して細胞を通過します。
BAL細胞の選別は、マクロファージを収容するのに十分な大きさの液滴サイズを確保するために、低圧で行う必要があります。細胞は、最初にすべてのCD45 +21細胞を含むようにゲートされ、次に、すべての死んだ細胞が除外されることを確実にするために生存率に基づいています(図3参照)。その後、単一細胞が選択され、この中で、2つの集団は、サイズと形態、すなわちより大きな骨髄細胞とより小さなリンパ球に基づいてゲートされます(図3参照)。より大きなセル内では、細胞はCD20622、23およびCD16922でゲートされ、二重陽性細胞はAMとしてソートされ、小さなセル内ではCD3+セルが選択され、CD4およびCD8上でゲートされます。 CD4単正および CD8 単一陽性細胞がソートされます (図 3参照)。使用されたマーカーは、前述のAMの表現型に基づいて選択した、例えばマンノース受容体CD206、咽頭細胞23、およびシアロゲシン受容体CD16922に見出される。
PBMCをソートする場合、細胞は最初に前方および側散乱にゲートされ、そのすべてが均質なリンパ球集団を示す必要があり、そのすべてがゼロ軸に近いノイズを除いて撮影される(データは示されていない)。集団は生存率およびCD45にゲートされ、生きているCD45+細胞が使用される。この人口は CD3 にゲートされます。単球を単球に単離するために、CD3-集団はCD14上でゲートされ、すべての単一陽性細胞がソートされる。リンパ球サブセットを単離するために、CD3+細胞はCD4およびCD8上でゲートされ、単一陽性および細胞集団の両方がソートされる。
図 1: プロトコルの概要。生成されたサンプルの潜在的なダウンストリーム使用を含む、プロトコルのワークフローを示す回路図。PBMC = 末梢血単核細胞;BAL = 気管支藻胞洗浄;LSM=リンパ球分離培地。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:BAL液全体の顕微鏡視野。(A)非喫煙者および(B)目に見えるリンパ球(L)、マクロファージ(M)、および赤血球(RBC)を有する喫煙者からの顕微鏡画像。倍率は1,000倍(10倍眼、油浸入100倍レンズ)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:BAL細胞全体の細胞選別のための代表的なゲーティング戦略。ALVEolarマクロファージ(AM)、CD4、およびCD8 T細胞をBAL細胞全体サンプルからソートするために使用されるゲーティング戦略。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプル | 抗体 | フルオロクロム | クローン | テストあたりの体積(μL) |
| バルおよび PBMC | ライブ/デッド | APC-H7 | - | 1 |
| CD45 | PE-サイ7 | こんにちは30 | 5 | |
| CD3 | アレクサ700 | UCHT1 | 2 | |
| CD4 | PE-サイ5 | RPA-T4 | 4 | |
| CD8 | BV605 | SK1 | 3 | |
| BAL のみ | CD206 | Pe | 19.2年 | 10歳 |
| CD169 | BB515 | 7~239 | 5 | |
| PBMC のみ | CD14 | バンブ786 | M5E2 | 5 |
表1:BALセル全体と単離されたPBMCのソートのためのフローパネル。
| ターゲット | ステップ | プライマー名 | プライマーシーケンス | |||
| HIV総DNAまたはHIV LTR-ギャグRNA | プリアンプ化 PCR | UR1 | 5'-CCA TCT CTC TCC TTC タグ C-3' | |||
| ウルフ1 | 5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3' | |||||
| リアルタイム PCR | UR2 | 5'-CTG AGGガット CTC タグ TTA CC-3' | ||||
| ラムダット | 5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3' | |||||
| ウヒヴ・ファムゼン: | 5'-//56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TGA GGC/3IABkFQ/-3' | |||||
| CD3 DNA | プリアンプ化 PCR | HCD3 アウト 5' | 5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3' | |||
| HCD3 アウト 3' | 5'-CCA GCT CTG タグ GGA ACA TAT-3' | |||||
| リアルタイム PCR | HCD3 in 5' | 5'-GGCタットキャットTCT TCT TCA Agg T-3' | ||||
| HCD 3 in 3' | 5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3' | |||||
| CD3 ファムゼン: | 5'-/56-FAM/AG CAG AGA AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA CCA T/3IABkFQ/-3' | |||||
| GUSB RNA | プリアンプ化 PCR | GUSBフォワード1: | 5'-ACC タグ AAT CTG CTG GCT ACT A-3' | |||
| GUSBリバース1: | 5'- GTT CAAアカガットCAC ATC CAC ATA C-3' | |||||
| リアルタイム PCR | GUSBフォワード2: | 5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3' | ||||
| GUSBリバース2: | 5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT タグ A-3' | |||||
| GUSB-HEX: | 5'-/5HEX/TCGCTCACA/禅/CCAAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3' | |||||
表2:HIVDNAおよびRNA定量のためのプライマーおよびプローブ配列。
Discussion
ここでは、BAL液を処理してCD4 T細胞およびAMを得る方法を説明し、一致したPBMCと共に、肺内のHIV貯留部を調べるために研究することができる。我々は最近、一致した末梢血およびBALサンプルからのCD4 T細胞におけるHIVDNA定量について報告し、我々のグループは、HIVが末梢血15のものよりも肺CD4 T細胞に13倍多く存在することを実証した。しかし、AMにおけるHIV DNAのレベルはドナー依存であり、これまでのところ、マクロファージ15と比較してリンパ球中のHIV DNAレベルとの間に一貫した相関関係は存在しない。しかし、これらの主要なマクロファージ細胞サブセットへのアクセスは、この質問を尋問し、HIV貯蔵所の文脈で肺のウイルス負荷のより良い理解を得るための重要なツールとなります。
ART前の時代およびBAL流体を利用した他のいくつかの研究では、参加者は疑わしい病理を診断するか、呼吸器症状3の微生物学的診断を得るために気管支鏡検査を受けた。しかし、我々は、任意のアクティブな肺症状や病理なしで参加者を募集することができ、すべての参加者は、倫理的な同意フォーム15に署名しました.閉塞性肺疾患24のスピロメトリースクリーニング研究など、他の研究に参加した当センターから参加者を募集することができました。大腸 内視鏡 検査。HIVと一緒に住んでいる人々の間で以前の研究は利他主義が研究研究への参加を動機づける重要な要因であることを実証しました 25.多くの人間の標本と同様に、我々は人と人のばらつきの多くを指摘した。良好な細胞収率と低い細胞収率でBALを得る参加者を「予測」する方法はありませんでした。リンパ球のかなり一貫した数を生み出す末梢血とは異なり、BAL流体の細胞数は非常に変動する。肺に通常の生理食べ物のより多くの量を注入する(BAL液のより大きなリターンを得ることを期待して)通常の生理食生活の大きなボリュームは、多くの場合、より多くの咳と発熱後の気管支鏡検査のリスクが高いと関連しているので、常に可能ではありません。直径が小さい(大きい)気管支鏡を使用することで、呼吸器科医は気管支の奥深くに到達し、より多くの細胞を含む流体を得ることができることに気づきました。一貫した発見は、タバコ喫煙者はBAL流体内のリンパ球よりもはるかに大きな割合を持っていたというもので、これはAMが破片や粒子状物質を巻き込むと予想される。さらに、喫煙者からのBAL流体には、PCR装置や流量計などの機器を遮断する破片が含まれていることを観察しました。同様の問題は、汚染の多い地域や、大気の質の悪さにさらされる頻度が高い個人でも見られる可能性があります。
HIV貯留槽の確立とウイルス持続性における役割に関しては、CD4 T細胞およびAMの純度が重要な考慮事項である。このため、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、高純度の細胞集団を得ることを選びました。また、気管支鏡検査中に軽度の出血が予想されるため、採取されたBAL液が血液で汚染される可能性もある。ナイーブB細胞の存在はこれを示し、この問題を回避するために赤血球リシスバッファーで細胞を洗浄することができる。BAL流体を研究するもう一つの課題は、HIV持続性26を理解するために重要である炎症マーカーおよびサイトカインの定量化に関する。インスティファインされた生理食液がBAL液を希釈するにつれて、炎症性メディエーターおよびサイトカインのレベルを測定することは困難である場合がある。希尿素補正因子は希釈を考慮して提案されているが、その使用を説明する文献は比較的少ない27,28である。
AMは高度に自己蛍光性であり、細胞の選別とフローサイトメトリーのプノティピック解析中に問題を引き起します。特に、AMが完全に黒色で、自己蛍光に大きな影響を与える喫煙者では、その効果がより顕著です。標準的な青色の488 nmレーザーによって励起されると、AMの自己蛍光は約540 nmでピークにあり、FITCおよびPE29、30のような一般的に使用されるコンジュゲートの蛍光スペクトルと重なる。2つの別々のレーザーは、FITCとPEを励起するために使用することができることは注目に値します(例えば、青い488レーザーによって黄色/緑とFITCによるPE)。FITCで固有の自己蛍光を克服するために、染色されていないAMを使用して自己蛍光の背景を決定しました。さらに、蛍光マイナス1(FMO)制御の使用は、これらの技術的な問題に対処するために非常に有用であることができます。より大きなビーズ(例えば、7.5 μm)を使用することができ、これは、リンパ球集団の補償に使用できる小さなビーズ(例えば、3.0 μm)と比較して、マクロファージ集団を補償するためのサイズが近い。さらに適切なアプローチは、HLA-DRやCD45などのサブセット上の既知の高発現マーカーを使用して、単一染色コントロールとして細胞のごく一部を使用することです。ビーズで達成することができるよりも正確な補償。喫煙者のサンプルの場合、マクロファージがはるかに大きく、より自己蛍光性が高いため、この戦術は特に有用である。さらに、調製工程から、BALサンプル全体を、プロトコルのセクション3に記載されているようにソートする前にプレート内で培養することができ、接着により集団の分離を可能にする。このようにして、付着性マクロファージは、リンパ球などの他の非付着細胞から単離することができる。リンパ球とAM集団が一緒に調べるのではなく分離されている場合、補償ははるかに困難です。ただし、付着に頼るとマクロファージが失われ、セル数が既に制限されている場合に重要な考慮事項となります。また、付着ステップは、これらの細胞を使用して生成された下流の結果に影響を与える可能性があり、付着性単球の不要な活性化をもたらす可能性があります。細胞を効率的に純粋な集団に分類する価値は、その後の実験のためにそのような細胞を少なくするという制限に対して重み付けされなければならない。
他のモデル、特にマウスモデルは、マクロファージ免疫学的特性および生物学を研究するために使用されてきた。これらのモデルは非常に便利であり、操作が困難なセルタイプに対する大きな洞察を可能にしますが、制限があります。細胞表面マーカーの多くはマウスとヒトの間で変化し、ヒトAMの免疫表現型が完全に理解されていない。しかし、このモデルシステムは、各動物から入手可能な低い細胞数のためにアッセイのためにいくつかのマウスのプールを必要とします。さらに、標本をプールする必要性は、遺伝的素因と性別の考慮を排除します。近年、制限因子SAMHD-131の異なる発現に起因するHIV-1によるマクロファージの感染性において性が役割を果たすることが示されている。非ヒト霊長類(NHP)は、ヒトに最も近いモデルを表し、シミアン免疫不全ウイルス(SIV)感染の研究と免疫系への影響を促進し、組織常駐マクロファージの役割に関する洞察を提供した。単球由来マクロファージ。カゲサスマカクでは、肺マクロファージがBAL港から複製性の高いウイルスを単離することも示されている。ウイルス増殖アッセイ(VOA)は、組織常駐細胞32におけるSIVの挙動を分析するために用いた。このような知見は重要な研究価値であるが、適用する前にヒトで検証する必要があり、HPを使用するコストが高いため、大規模なサンプル集団の使用が妨げられます。さらに、ヒトAMは、インビトロウイルス/微生物感染アッセイなどの他の多くの用途や、結核/HIV共感染などの他の病原体の研究に役立ちます。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、カナダ保健研究所(CIHR)(CC、MAJ、NCに#153082を付与する)の資金提供者を認めしたいと考えています。レソー・シダらマラディ感染症は、CCとMAJとCCに資金を与えたマギル大学医学部に資金を与えたデュ・フォンス・デ・レチェルチェ・デ・ケベック・サンテ(FRQ-S)です。この研究はまた、カナダ保健研究所(CIHR)-資金提供カナダHIVキュアエンタープライズ(CanCURE)チームグラントHB2 - 164064 MAJ、CCおよびNCに一部でサポートされました。MAJは、免疫学とCCとNCのCIHRカナダ研究委員長層2を保持し、それぞれFRQ-Sジュニア1とジュニア2研究給与賞を保持しています。ETはRI-MUHC学生シップ修士賞を受賞しています。
さらに、著者は、ホセ・ジルアードとサンプルの調整と取得に関与するすべての臨床スタッフ、ならびに呼吸療法士を認めしたいと考えています。RI-MUHC免疫フェノタイピングプラットフォームのエカテリーナ・イウルチェンコ、ヘレーヌ・パジェ=ヴェイレット、マリー=ヘレーヌ・ラコンブ。そして、顕微鏡写真の提供のためのマリアンナ・オルロヴァ博士。最も重要なことは、著者は、この研究が不可能であろう多くのボランティアに感謝したいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
| ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
| BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
| BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
| Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
| Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
| CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
| CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
| CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
| CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
| CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
| dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
| EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
| FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
| FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
| FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
| HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
| HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
| Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1 °C/min, the optimal rate for cell preservation |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
| PBS 1x | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
| PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
| PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2x concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
| QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
| Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
| RPMI 1640 1x | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
| Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
| Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10x PCR buffer, magnesium chloride |
| Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |
References
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