Summary
Hier bieten wir einen nützlichen Ansatz für die Untersuchung des Mechanismus des rechtsventrikulären Versagens. Ein bequemerer und effizienterer Ansatz zur Verengung der Lungenarterie wird mit chirurgischen Instrumenten aus dem eigenen Haus etabliert. Darüber hinaus werden Methoden zur Bewertung der Qualität dieses Ansatzes durch Echokardiographie und Katheterisierung bereitgestellt.
Abstract
Der Mechanismus des rechtsventrikulären Versagens (RVF) erfordert eine Klärung aufgrund der Einzigartigkeit, hohen Morbidität, hohen Sterblichkeit und feuerfesten Natur von RVF. Frühere Rattenmodelle, die die RVF-Progression imitieren, wurden beschrieben. Im Vergleich zu Ratten sind Mäuse zugänglicher, wirtschaftlicher und weit verbreitet in Tierversuchen. Wir entwickelten einen Ansatz zur Pulmonarterienverenstriktion (PAC), der darin besteht, den Lungenstamm bei Mäusen zu bandieren, um eine rechtsventrikuläre Hypertrophie (RV) zu induzieren. Eine spezielle chirurgische Verriegelungsnadel wurde entwickelt, die eine einfachere Trennung der Aorta und des Lungenstammes ermöglicht. In unseren Experimenten reduzierte die Verwendung dieser hergestellten Riegelnadel das Risiko einer Arteriorrhexis und verbesserte die chirurgische Erfolgsrate auf 90%. Wir verwendeten verschiedene Polsternadeldurchmesser, um präzise quantitative Verengung zu erzeugen, die verschiedene Grade der RV-Hypertrophie induzieren kann. Wir quantifizierten den Grad der Verengung durch Die Auswertung der Durchblutungsgeschwindigkeit der PA, die durch nichtinvasive transthorakale Echokardiographie gemessen wurde. Die RV-Funktion wurde nach 8 Wochen nach der Operation durch rechte Herzkatheterisation genau bewertet. Die chirurgischen Instrumente aus dem Eigenen Haus wurden aus gängigen Materialien mit einem einfachen Verfahren, das leicht zu meistern ist. Daher ist der hier beschriebene PAC-Ansatz mit Instrumenten aus dem Labor leicht zu imitieren und kann in anderen Labors weit verbreitet sein. Diese Studie präsentiert einen modifizierten PAC-Ansatz, der eine höhere Erfolgsrate als andere Modelle und eine 8-wöchige postsurgeryische Überlebensrate von 97,8% hat. Dieser PAC-Ansatz bietet eine nützliche Technik zum Studium des RVF-Mechanismus und ermöglicht ein besseres Verständnis von RVF.
Introduction
RV Dysfunktion (RVD), hier als Beweis für eine abnormale RV-Struktur oder Funktion definiert, ist mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden. RVF, als Endstufe der RV-Funktion, ist ein klinisches Syndrom mit Anzeichen und Symptomen von Herzinsuffizienz, die aus progressiver RVD1resultieren. Bei Unterschieden in Struktur und physiologischer Funktion haben linksventrikuläres (LV) Versagen und RVF unterschiedliche pathophysiologische Mechanismen. Es wurden einige unabhängige pathophysiologische Mechanismen in RVF berichtet, einschließlich der Überexpression von 2-adrenergen Rezeptorsignalisierung2, Entzündung3, Quertubuli-Umbau und Ca2+ Umgang mit Dysfunktion4 .
RVF kann durch Volumen- oder Drucküberlastung des Wohnmobils verursacht werden. Frühere Tiermodelle haben SU5416 (einen potenten und selektiven Inhibitor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptors) in Kombination mit Hypoxie (SuHx)5,6 oder Monocrotain7 verwendet, um eine pulmonale Hypertonie zu induzieren, führt zu RVF sekundär zu pulmonalen Gefäßerkrankungen2. Die Forscher, die diese Studien durchführten, konzentrierten sich auf die Vaskulatur anstelle der pathologischen Progression von RVF. Darüber hinaus hat Monocrotain extra-kardiale Wirkungen, die nicht genau kardiogene Krankheit darstellen können. Andere Modelle haben arterienförmige Shunts verwendet, um Volumenüberlastung und RVF8zu induzieren. Diese Operation ist jedoch schwierig durchzuführen und ungeeignet für Mäuse, die lange Induktionsperioden für die Produktion von RVF benötigen.
Ratte PAC-Modelle mit Banding-Clips existieren auch9,10. Im Vergleich zu Ratten haben Mäuse viele Vorteile als Tiermodelle von Herzerkrankungen, wie eine einfachere Fortpflanzung, eine breitere Nutzung, reduzierte Kosten und Zugang zur Genmodifikation11. Die Durchmesser der Bandclips reichen jedoch in der Regel zwischen 0,5 mm und 1,0 mm, die für Mäuse zu groß sind9. Darüber hinaus ist der Banding-Clip schwer zu produzieren, zu imitieren und in anderen Labors zu popularisieren.
Wir bieten ein Protokoll zur Entwicklung eines modifizierten reproduktiven RVF-Mausmodells auf der Grundlage von berichteten Studien, das PAC verwendet, um die Tetralogie des Fallot- und Noonan-Syndroms oder anderer pulmonaler arterieller hypertensiver Erkrankungen nachzuahmen12,13, 14,15,16,17,18,19. Dieser PAC-Ansatz wird durch Liganderung des Lungenstamms von Mäusen mit einem Riegel und einer Polsternadel aus dem eigenen Haus erzeugt, um den Grad der Verengung zu kontrollieren. Die Verriegelungsnadel besteht aus einer 90° gebogenen Injektionsspritze mit einer geflochtenen Seidennaht, die durch die Spritze geleitet wird. Die Nadel wird aus gängigen Materialien mit einem Prozess hergestellt, der einfach zu meistern ist. Die Polsternadel ist 120° von der Messnadel gekrümmt. Je nach Gewicht der Mäuse (20-35 g) werden Polsternadeln mit unterschiedlichen Durchmessern (0,6-0,8 mm) verwendet. Zusätzlich legen wir ein Bewertungskriterium fest, um die Stabilität und Qualität des RVF-Modells durch Echokardiographie und rechte Herzkatheterisierung zu bestimmen. Wir verwenden Mäuse als Mustertier wegen ihrer weit verbreiteten Verwendung in anderen Experimenten. Die Nadeln aus dem Labor sind leicht zu reproduzieren und können in anderen Labors weit verbreitet werden. Diese Studie bietet einen guten Ansatz für Forscher, um den Mechanismus von RVF zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Leitlinien für die Tierforschung durchgeführt, die dem von den US National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996) entsprechen. C57BL/6 männliche Mäuse (8-10 Wochen alt, mit einem Gewicht von 20-25 g) wurden vom Animal Center der South Medical University zur Verfügung gestellt. Nach der Ankunft wurden die Mäuse unter einem 12/12 h Dunkel-Licht-Zyklus mit ausreichend Nahrung und Wasser untergebracht.
1. Vorbereitung der chirurgischen Instrumente und Herstellung der Nadeln
- Bereiten Sie die sterilen chirurgischen Instrumente (Abbildung1A), eine 6-0 geflochtene Seidennaht (Abbildung1B[a]) für die Ligation und eine 5-0 Nylonnaht für Schnittverschluss vor (Abbildung 1B[b]).
- Übergeben Sie die 6-0 geflochtene Seidennaht (Abbildung1B[a]) durch eine 25 G Nadel, die aus einer 1 ml Injektionsspritze demontiert wird. Dann krümmen Sie die Nadel um 90° mit hämostatischen Zangen, um eine Verriegelungsnadel zu bilden (Abbildung 1C[a]). Die 22 G-Nadel 120° (Abbildung1C (b)) zu einer Polsternadel zu biegen.
2. Vorbereitung auf die Operation
- Autoklaven Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Stellen Sie das Heizkissen auf 37 °C ein. Anästhesisieren Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit einer Mischung aus Xylazin (5 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg) zur Schmerzlinderung. Legen Sie die Mäuse in einzelne Boxen, um auf den Beginn des Betäubungsmittels zu warten.
HINWEIS: Es wird auch empfohlen, 1,5% Isofluran zur inhalativen Anästhesie zu verwenden. - Überwachen Sie die Angemessenheit der Anästhesie durch das Verschwinden des Pedalentzugsreflexes. Halten Sie die Mäuse in der Supine-Position auf dem Heizkissen, indem Sie die Schneidezähne mit einer Naht befestigen und die Beine mit Klebeband fixieren. Überprüfen Sie den Reflex erneut, um die Tiefe der Anästhesie zu gewährleisten.
- Tragen Sie die Enthaarungspaste vom Hals auf die Haut auf. Desinfizieren Sie den Bereich mit Jod gefolgt von 75% Alkohol.
- Führen Sie endotracheale Intubation durch.
- Passen Sie die Parameter des Tierminiventilators (Abbildung 1D) an und stellen Sie die Atemfrequenz auf 150/min und das Gezeitenvolumen auf 300 l ein.
- Ziehen Sie die Zunge leicht heraus, indem Sie eine spitzen Zange verwenden, heben Sie den Unterkiefer mit einem Labor gemacht Spachtel Figur 1C[c]), um die Glottis zu belichten, und sanft einfügen eine Labor gemacht Luftröhre (Abbildung1C[d]) durch die Glottis, während eine kalte Lichtquelle ist auf den Kehlkopf gerichtet.
- Schließen Sie das Rohr und das Beatmungsgerät an, um zu überprüfen, ob die Kanüle in die Luftröhre eingeführt wurde. Korrigieren Sie die Luftröhre mit Klebeband, wenn die Kanüle richtig eingelegt wurde.
3. Chirurgie
- Öffnen Sie die Brust.
- Machen Sie einen Schnitt in der Haut parallel zur zweiten Rippe, ca. 10 mm lang, mit einer Augenschere. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt aus dem Sternwinkel beginnt und auf der linken vorderen Achsellinie endet. Identifizieren Sie den zweiten interkostalen Raum, indem Sie die Rippen aus dem Sternwinkel zählen.
- Trennen und schneiden Sie die pectoralis major und pectoralis minor Muskeln mit Schere und Ellbogen Pinzette über dem zweiten interkostalen Raum, um diesen Raum zu belichten.
HINWEIS: Es wird auch empfohlen, die Pectoralis-Muskeln unverblümt nach rechts und kranially zu trennen, zu mobilisieren und zu bewegen. - Mit einer Ellbogenpinzette dringen Sie in den zweiten interkostalen Raum ein und öffnen Sie diesen Raum. Dann trennen Sie das Parenchym und den Thymus unverblümt, bis der Lungenstamm sichtbar ist.
- Verengen Sie die Lungenarterie.
- Den Lungenstamm und die aufsteigende Aorta mit ellbogener Pinzette stumpf trennen. Passieren Sie die Naht durch das Bindegewebe zwischen dem Lungenstamm und der aufsteigenden Aorta mit einer Riegelnadel.
- Legen Sie die Polsternadel (siehe Schritt 1.2) auf den Lungenstamm und legen Sie dann den Lungenstamm zusammen mit der Polsternadel mit der 6-0 geflochtenen Seidennaht auf. Entfernen Sie die Polsternadel unmittelbar nach der Füllung des Lungenkonus beobachtet und schneiden Sie die Enden der Naht.
- Beobachten Sie die Füllung des Lungenkonus, um zu beurteilen, ob eine Verengung vorhanden ist. Bewerten Sie den Reflex des Tieres erneut, um den Erfolg der Ligation zu gewährleisten.
HINWEIS: Führen Sie eine Scheinoperation durch, indem Sie alle oben genannten Schritte mit Ausnahme der Verengung befolgen.
- Schließen Sie die Brust und die Haut mit der 5-0 Nylon Naht. Desinfizieren Sie die Haut erneut mit 75% Alkohol.
- Injizieren Sie 0,5 ml Saline subkutan, um flüssigkeitsverluste während der Operation zu ersetzen. Legen Sie die Maus separat mit Heizkissen in den Käfig, um die Erholung zu fördern. Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige in einem 12/12 h hellen/dunklen Zyklusraum zurück, wenn das Bewusstsein zurückkehrt. Behandeln Sie die Mäuse mit Buprenorphin über ihr Trinkwasser für die folgenden 3 Tage.
- Achten Sie besonders auf die Heilung der Thorakotomiewunde, indem Sie die Mäuse in der ersten Woche 2x pro Tag überwachen, um Anzeichen einer unzureichenden Heilung, eingeschränkter Beweglichkeit oder Gewichtsverlust zu erkennen.
4. Echokardiographische Beurteilung der RV-Funktion nach der Operation
HINWEIS: Echokardiographische Veränderungen können 3 Tage nach der Operation erkannt werden.
- Anästhesisieren Sie die Mäuse mit 3% Isofluran durch Inhalation und halten Sie die Tiefe der Anästhesie mit 1,5% Isofluran. Befestigen Sie eine Maus auf der Plattform, kleben Sie ihre Krallen an die Elektrode und halten Sie das Tier in einer Supine-Position. Halten Sie die Herzfrequenz der Maus zwischen 450-550 Schlägen/min, indem Sie die Konzentration von Isofluran zwischen 1,5% und 2,5% einstellen.
- Entfernen Sie das Haar auf der Brust der Maus mit Enthaarungscreme und tragen Sie Ultraschallgel auf die Haut der Brust auf.
- Bewerten Sie die Lungenstammverengung mit einer 30 MHz Sonde.
- Halten Sie die Sonde bei 30° gegen den Uhrzeigersinn relativ zur linken parasternalen Linie, während Sie die Kerbe in kaudaler Richtung ausrichten. Regulieren Sie die y-Achse und diex-Achse unter dem B-Modus, bis die Mitralklappe, Aorta und LV-Kammer deutlich sichtbar sind.
- Drehen Sie die Sonde 30°-40° auf ihrer y-Achse in Richtung Brust. Regulieren Sie die y-Achse und diex-Achse, bis der Lungenkonus deutlich sichtbar ist.
- Platzieren Sie den Cursor an der Spitze der Lungenventil-Broschüren, um die Spitzenströmungsgeschwindigkeit zu messen. Verwenden Sie den Farbdopplermodus, indem Sie Farbe, gefolgt von PW, drücken und dann den Cursor bewegen, um die PW-gestrichelte Linie parallel zur Richtung des Blutflusses zu platzieren.
- Messen Sie die Spitzengeschwindigkeit der Lungenarterie. Speichern Sie die Daten und das Bild mit Cine Store und Frame Store.
- Bewerten Sie die RV-Parameter mit einem 30 MHz-Sonden.
- Stellen Sie die linke Seite des Pads so ein, dass es niedriger als die rechte Seite ist. Halten Sie die Sonde bei 30° zum Horizont entlang der rechten vorderen Achsellinie mit der Kerbe in kaudaler Richtung ausgerichtet. Regulieren Sie die y-Achse und diex-Achse, bis das Wohnmobil deutlich angezeigt wird.
- Drücken Sie M-Mode 2x, um die Indikatorlinie anzuzeigen. Messen Sie die RV-Kammerdimension, die fraktionale Verkürzung und die RV-Wanddicke. Speichern Sie die Daten und das Bild mit Cine Store und Frame Store.
- Stoppen Sie die Isofluran-Inhalation, damit die Mäuse das Bewusstsein wiedererlangen und die Tiere dann in einem 12 h hellen/dunklen Zyklusraum in ihre Käfige zurückbringen können.
5. Rechte Herzkatheterung zur Beurteilung der RV-Funktion
HINWEIS: Die rechte Herzkatheterisierung wurde 8 Wochen nach der Operation durchgeführt, um die RV-Funktion mit einem 1,0-F-Katheter und einem Überwachungssystem zu bewerten.
- Autoklaven Sie alle chirurgischen Instrumente. Anästhesisieren Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion mit einer Mischung aus Xylazin (5 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg).
- Nachdem der Pedalentzugsreflex verschwindet, fixieren Sie die Maus auf der Plattform, kleben Sie ihre Krallen an die Elektrode und halten Sie die Maus in Supine-Position. Entfernen Sie das Haar im chirurgischen Bereich mit Enthaarungscreme.
- Desinfizieren Sie die Haut des Operationsbereichs mit 75% Alkohol. Mit spitzen Zangen, ziehen Sie die Zunge leicht heraus, heben Sie den Unterkiefer mit einem Spachtel im Haus gemacht, um die Glottis zu belichten, und sanft einfügen Sie die Luftröhre im Haus durch die Glottis gemacht, während eine kalte Lichtquelle auf den Kehlkopf gerichtet ist. Verwenden Sie ein Beatmungsgerät (Abbildung1E), um die Beatmung zu unterstützen.
- Öffnen Sie die Brusthöhle mit einem 1,5 cm großen beidseitlichen Schnitt unterhalb des Xiphoid-Prozesses durch das Zwerchfell mit Augenschere und Zange. Schneiden Sie durch die Membran und Rippen mit augenheilbeomischen Scheren, um das Herz zu belichten. Durchdringen Sie die RV-freie Wand mit einer 23 G Nadel und entfernen Sie die Nadel; Drücken Sie die Punktionsstelle vorsichtig mit einem Wattestäbchen, um Blutungen zu stoppen. Punktieren Sie den Ventrikel mit der Katheterspitze durch die Wunde.
HINWEIS: Es wird auch empfohlen, die rechte Herzkatheterisierung über die richtige juguläre Vene6durchzuführen. Wenn sich die Katheterspitze im Ventrikel befindet, zeigt der Monitor die RV-Druckkurve an. - Zeichnen Sie den systolischen RV-Blutdruck, den RV-Enddiastolischen Druck, den RV dP/dt, die Herzfrequenz der Maus und die RV-Exponentialzeitkonstante der Entspannung (Tau) für 10 min auf, wenn die Kurve stabil ist. Klicken Sie mit der Software auf Auswählen und dann auf Analysieren.
- Regulieren Sie die Spitze des Katheters in Richtung des RV-Abflusstraktes. Ziehen Sie den Katheter heraus, nachdem die Aufnahme abgeschlossen ist. Legen Sie den Katheter in die Saline, wenn die Messungen abgeschlossen sind.
- Euthanisieren Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektionen von Pentobarbital-Natrium 150 mg/kg, gefolgt von zervikalen Dislokation. Dann ernten Sie Herz, Lunge und Tibia für histomorphologische und molekularbiologische Analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dieser Studie wurden Mäuse nach dem Zufallsprinzip der PAC-Gruppe (n = 9) oder der Schein-Operationsgruppe (n = 10) zugeordnet. Die Echokardiographie wurde 1, 4 und 8 Wochen nach der Operation durchgeführt. Acht Wochen nach der Operation wurden die Mäuse nach den letzten Echokardiographie- und Katheteruntersuchungen eingeschläfert und ihre Herzen für eine morphologische und histologische Beurteilung geerntet.
Lungenstammverengung verursachte RV-Hypertrophie (Abbildung 2). Im Vergleich zur Scheingruppe wurden eine höhere Spitzengeschwindigkeit (Abbildung 2A, C), ein größerer Druckgradient (Abbildung 2A,D) und eine größere RV-Wanddicke (Abbildung 2B,E) aus der parasternalen Langachsenansicht 8 Wochen nach der Operation in der PAC-Gruppe erhalten. Zusätzlich wurde die systolische Funktion des RV (RV-Auswurffraktion und RV-Fraktionsverkürzung) in der PAC-Gruppe im Vergleich zur Scheingruppe 8 Wochen nach der Operation signifikant reduziert (Abbildung 2F, G).
Wir stellten fest, dass die systolische und diastolische Funktion des RV 8 Wochen nach PAC beeinträchtigt waren (Abbildung 3A-E). Die PAC-Gruppe hatte einen höheren RV-Druck in der Systole und Diastole, und der Kontraktilitätsindex wurde in der PAC-Gruppe im Vergleich zu dem der Scheingruppe reduziert. Der RV Tau war in der PAC-Gruppe größer als in der Scheingruppe, und RV dP/dt war auch größer als das in der Scheingruppe. Diese Ergebnisse zeigten, dass RV Dysfunktion bei Mäusen nach 8 Wochen der Lungenarterie Banding induziert wurde. Als wir invasive hämodynamische Tests im RV durchführten, blieb die Herzfrequenz, die mit einem physiologischen Aufzeichnungssystem bestimmt wurde, vor und nach der Katheterüberwachung stabil (Abbildung 3F).
Die durch PAC induzierte RV-Umgestaltung ist in Abbildung 4dargestellt. Im Vergleich zur Scheingruppe wurde die RV-Dimension deutlich vergrößert, und das RV-Gewicht war in der PAC-Gruppe höher. Faktoren, die den Grad der RV-Hypertrophie angeben, wie das Verhältnis von Herzgewicht/Körpergewicht, RV/(linke Herzkammer + Septum) und RV/tibiale Länge, waren nach 8 Wochen PAC größer als die der Scheingruppe. Darüber hinaus zeigte eine histologische Untersuchung, dass die Herzfibrose und der von Kardiomyozyten abgedeckte Bereich in der PAC-Gruppe größer waren als in der Scheingruppe. Zusammenfassend haben wir ein reproduktives, kostengünstiges und einfaches RVF-Modell entwickelt und Bewertungskriterien festgelegt, um das RVF-Modell erfolgreich zu bewerten.
Abbildung 1 : Chirurgische Instrumente, Werkzeuge aus dem Eigenen Haus und Materialien, die für die PAC-Verfahren benötigt werden. (A) Die chirurgischen Instrumente, die für das PAC-Verfahren verwendet werden. (B) (a) 6-0 medizinische geflochtene Seide Naht und (b) 5-0 medizinische Nylon Naht. (C) Werkzeuge aus dem eigenen Haus. (a) Latchnadel. (b) Polsternadel. (c) Spachtel im Eigenen Haus. (d) Endotrachealintubation. (D). Tier-Mini-Beatmungsgerät. (E) ALC-V8S Beatmungsgerät. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse der Ultraschall-Bildgebung des Lungenstammes und der RV-Funktion von Schein- und PAC-Mäusen. (A) Farb- und gepulste Doppler-Bildgebung des Lungenstammes von Mäusen nach 8 Wochen. Rote Markierungen stellten den Blutfluss in Richtung der Sonde dar; Blaue Markierungen stellten den Blutfluss rückwärts der Sonde dar. (B) B-Modus und M-Mode Ultraschallbildgebung des Wohnmobils von Schein- und PAC-Mäusen nach 8 Wochen. (a) Rechte Herzkammer. (b) Linker Ventrikel. (C) Die RV-Spitzengeschwindigkeit PLAX (V), (D) Druckgradient (Druckgradient = 4 x V2) und (E) RV-Wandstärke aus der parasternalen Langachsenansicht wurden nach 8 Wochen deutlich erhöht. (F) Die RV-Kurzachsverkürzungsrate (RVFS) wurde nach 8 Wochen deutlich reduziert. (G) Die RV-Auswurffraktion (RVEF) wurde nach 8 Wochen deutlich reduziert. Für Panels C-G,*P < 0.01 vs. Scheinoperation (n = 9 in der PAC-Gruppe, n = 10 in der Scheingruppe). PAC = Lungenarterienverengung. Die Daten werden als Mittelwert -SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Repräsentative Ergebnisse der RV-Hämodynamik bei Mäusen, die 8 Wochen nach der Operation einer PAC oder einer Scheinoperation unterzogen wurden. (A) Repräsentative Kurven von RVP und RV dP/dt bei Schein- und PAC-Mäusen 8 Wochen nach der Operation. (B) Rechtsventrikulärer systolischer Blutdruck (RVSBP) und rechtsventrikulärer enddiastolischer Druck (RVEDP). (C) RV Maximum und Minimum dP/dt. (D) RV Tau. (E) Kontraktilitätsindex. (F) Herzfrequenz. RVP = rechter ventrikulärer Druck; RVSBP = rechtsventrikulärer systolischer Blutdruck; RVEDP = rechtsventrikulärer enddiastolischer Druck; Tau = exponentielle Zeitkonstante der Entspannung; max und min dp/dt = maximaler und minimaler Anstieg und Rückgang des rechten ventrikulären Drucks; PAC = Lungenarterienverengung. Für die Panels B-F, n = 9 in der PAC-Gruppe und n = 10 in der Scheingruppe. *P < 0.01 vs. Scheinoperation. Die Daten werden als Mittelwert -SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Lungenarterienverengung bei Mäusen führt nach 8 Wochen zum Umbau der Rv. (A) Repräsentative Bilder des ganzen Herzens (Skalenbalken = 3 mm). (a) Rechter Vorhof, roter Pfeil: Ligation des Lungenarterienstammes. (B) Verhältnis Herzgewicht/Körpergewicht (HW/BW). (C) Verhältnis der rechten ventrikulären Masse zur linken ventrikulären Masse plus Septummasse (RV/[LV+S]). (D) Verhältnis der rechten ventrikulären Masse zur Tibialänge (RV/TL). Für die Panels B-D, n = 9 in der PAC-Gruppe und n = 10 in der Scheingruppe. *P < 0.01 vs. Scheinoperation. (E) Repräsentative Bilder von mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten Herzquerschnitten (erste Reihe: der Skalenbalken = 2 mm; zweite Reihe: der Skalenbalken = 50 m). (F) Vertreter Masson-gefärbte Bilder von Myokardfibrose in jeder Gruppe. Der Maßstabsbalken = 100 m. Für die Panels E und F, n = 4 in jeder Gruppe. *P < 0.01 gegen die Scheingruppe. RV = rechter Ventrikel; PAC = Lungenarterienverengung. RV/[LV+S] = Verhältnis der rechten ventrikulären Masse zur linken ventrikulären Masse plus Septummasse. Die Daten werden als Mittelwert -SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pathologische Erhöhungen der RV-Fülldrücke führen zu einer Linksverschiebung des Septums, die die LV-Geometrie21verändern kann. Diese Veränderungen tragen zu einer reduzierten Herzleistung und LV-Auswurffraktion (LVEF) bei, die eine hämodynamische Störung des Kreislaufsystems verursachen können22. Daher ist ein effizientes, stabiles und wirtschaftliches Modell zur Untersuchung des Mechanismus von RVF wertvoll.
Wir haben einen effektiveren und hochreproduzierbareren Ansatz für PAC mit einer Verriegelung und Polsternadel aus dem eigenen Haus entwickelt. Die verriegelung im Haus ermöglicht eine einfachere Trennung der Aorta und des Lungenstammes, was das Risiko einer Arteriorrhexis reduziert und die chirurgische Erfolgsrate verbessert. Durch die Auswahl unterschiedlicher Durchmesser der Polsternadel haben wir unterschiedliche Grade der RV-Hypertrophie induziert.
Auch wenn die allgemeinen Verfahren der Lungenstammbanding hier beschrieben sind wie die in früheren Berichten4,9,10,14,15, haben wir Verbesserungen an der chirurgische Instrumente. So reduzierten wir die Schwierigkeit der Operation, verkürzten die Betriebszeit und erhöhten die Erfolgsrate der Operation. Die Durchmesser der von uns verwendeten Polsternadeln reichten von 0,6 mm bis 0,8 mm, die nur geeignet waren, wenn die Mäuse zwischen 20 g und 35 g wogen. Bei Ratten kann die Anwendung der Polsternadeln (0,6-0,8 mm) zu akutem RVF und Tod führen. Darüber hinaus können die Polsternadeln (0,6-0,8 mm) nicht leicht zu RVD führen, wenn die Mäuse weniger als 20 g wiegen. Daher sollte der richtige Polsternadeldurchmesser entsprechend dem Gewicht des Tieres ausgewählt werden.
Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) wird in der Regel durch eine subkutane Injektion des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitors SU5416 und die Fütterung in einer hypoxischen Umgebung länger als 3 Wochen23,24, 25 , 26 , 27 , 28. Diese Bedingungen imitieren den pathophysiologischen Prozess der chronischen Ischämie und Hypoxie der Lungenarterie, um PAH und Lungenarterienfibrose zu induzieren. Jedoch, RV-Remodeling, Hypertrophie, oder RVF erfordert mehr als 12 Wochen für die Induktion durch chronische Hypoxie in diesen Modellen. Zusätzlich können SU5416 und hypoxische Behandlung andere Organe beeinflussen. Darüber hinaus sind teure Maschinen erforderlich, um eine hypoxische Umgebung zu schaffen. Daher ist ein schnelleres und effizienteres RVF-Modell erforderlich. Reddy et al. berichteten über eine Methode des RV-Umbaus, indem sie die beiden vorderen vorderen Lungenklappen-Blätter13einfangen. Anstatt ein Mikroskop und teure chirurgische Gefäßclips29zu verwenden, verwendeten wir eine Riegelnadel und verschiedene Arten von Polsternadeln aus dem eigenen Haus, um eine quantitative Verengung zusammen mit einer Bewertung der Durchblutungsgeschwindigkeit durch Echokardiographie.
Darüber hinaus wurden die Verriegelung und die Polsternadel aus dem eigenen Haus auch verwendet, um eine transversale Aortenverengung (TAC) bei Mäusen zu induzieren. Der inhausgebundene Riegel kann auch verwendet werden, um PAC oder TAC bei Ratten zu induzieren. Bei der Umsetzung der großen Gefäße stößt das LV nicht auf genügend Widerstand, so dass es durch die Anwendung der Lungenarterienverengung zur Vorbereitung der Korrekturoperation30,31verstärkt werden muss. Der PAC-Ansatz, den wir bereitgestellt haben, kann zu einer erhöhten Lungenarterienresistenz führen, die Studien der zugrunde liegenden Mechanismen unterstützen wird. Bei der Einstellung einer Herztransplantation kann das Spender-RV einer erhöhten Lungenarterienresistenz beim Empfänger ausgesetzt sein, wodurch das Wohnmobil fehlschlägt. Die hier vorgestellte PAC-Methode kann Studien über die Mechanismen von Post-Herz-Transplantationskomplikationen32,33 und angeborene Herzerkrankungen34helfen.
Der PAC-Ansatz hat einige Einschränkungen. Erstens kann die durch die Ligatur um den Lungenstamm induzierte RVD RVD in PAH5,7nicht imitieren. Zweitens verursacht PAC einen sehr plötzlichen Anstieg der RV-Nachlast, der sich von der allmählichen Erhöhung der pulmonalen Gefäßresistenz in PAH9,19unterscheidet.
In Übereinstimmung mit den hier vorgestellten Ergebnissen haben frühere Berichte gezeigt, dass signifikante Zunahmen bei echokarographischen Tests bei Derinmonariatsspitzengeschwindigkeit, RV-Wanddicke und RV-Diastolischer Innendurchmesser eine erfolgreiche Verengung aufweisen. und Hypertrophie der RV13,35. Erhöhter RV-Druck, RV dP/dt und Kontraktilitätsindex weisen auf die Entwicklung von RVF und eine dekompensierte Periode der RV-Funktion36hin. Abschließend haben wir die Anwendung von zwei neuartigen Laborinstrumenten demonstriert, um RVD kostengünstig und bequem zu etablieren. Wir verwendeten eine nichtinvasive echokardiographische Technik und eine invasive rechte Herzkatheterisierung, um die Qualität der RVF-Methode zu bewerten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81570464, 81770271; an Dr. Liao) und der Municipal Planning Projects of Scientific Technology of Guangzhou (201804020083) (an Dr. Liao) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALC-V8S ventilator | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-V8S | Assist ventilation |
| Animal Mini Ventilator | Haverd | Type 845 | Assist ventilation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical braided silk suture (6-0) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co. | 6-0 | Ligation |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Suture |
| Millar Catheter (1.0 F) | AD instruments | 1.0F | For right heart catheterization |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| PowerLab multi-Directional physiological Recording System | AD instruments | 4/35 | Record the result of right heart catheterization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made latch needle | Separate the aorta and pulmonary trunk | ||
| Self-made padding needle | Constriction | ||
| Self-made tracheal intubation | Tracheal intubation | ||
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
| Vertical small animal surgery microscope | Yihua Optical Instrument | Y-HX-4A | For right heart catheterization |
References
- Mehra, M. R., et al. Right heart failure: toward a common language. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart Transplantation. 33, 123-126 (2014).
- Sun, F., et al. Stagedependent changes of beta2adrenergic receptor signaling in right ventricular remodeling in monocrotalineinduced pulmonary arterial hypertension. International Journal of Molecular Medicine. 41, 2493-2504 (2018).
- Sun, X. Q., Abbate, A., Bogaard, H. J. Role of cardiac inflammation in right ventricular failure. Cardiovascular Research. 113, 1441-1452 (2017).
- Xie, Y. P., et al. Sildenafil prevents and reverses transverse-tubule remodeling and Ca(2+) handling dysfunction in right ventricle failure induced by pulmonary artery hypertension. Hypertension. 59, 355-362 (2012).
- de Raaf, M. A., et al. SuHx rat model: partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. European Respiratory Journal. 44, 160-168 (2014).
- Abe, K., et al. Haemodynamic unloading reverses occlusive vascular lesions in severe pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 111, 16-25 (2016).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L363-L369 (2012).
- van der Feen, D. E., et al. Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (120), e55065 (2017).
- Andersen, S., et al. A Pulmonary Trunk Banding Model of Pressure Overload Induced Right Ventricular Hypertrophy and Failure. Journal of Visualized Experiments. (141), e58050 (2018).
- Hirata, M., et al. Novel Model of Pulmonary Artery Banding Leading to Right Heart Failure in Rats. BioMed Research International. 2015, 753210 (2015).
- Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K., Chow, B. K. Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice. Journal of Visualized Experiments. (121), e55293 (2017).
- Rockman, H. A., et al. Molecular and physiological alterations in murine ventricular dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2694-2698 (1994).
- Reddy, S., et al. miR-21 is associated with fibrosis and right ventricular failure. JCI Insight. 2, (2017).
- Kusakari, Y., et al. Impairment of Excitation-Contraction Coupling in Right Ventricular Hypertrophied Muscle with Fibrosis Induced by Pulmonary Artery Banding. PLoS ONE. 12, e0169564 (2017).
- Hu, J., Sharifi-Sanjani, M., Tofovic, S. P. Nitrite Prevents Right Ventricular Failure and Remodeling Induced by Pulmonary Artery Banding. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69, 93-100 (2017).
- Hemnes, A. R., et al. Testosterone negatively regulates right ventricular load stress responses in mice. Pulmonary Circulation. 2, 352-358 (2012).
- Mendes-Ferreira, P., et al. Distinct right ventricle remodeling in response to pressure overload in the rat. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 311, H85-H95 (2016).
- Razavi, H., et al. Chronic effects of pulmonary artery stenosis on hemodynamic and structural development of the lungs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 304, L17-L28 (2013).
- Tarnavski, O., et al. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiological Genomics. 16, 349-360 (2004).
- Jessen, L., Christensen, S., Bjerrum, O. J. The antinociceptive efficacy of buprenorphine administered through the drinking water of rats. Laboratory Animals. 41, 185-196 (2007).
- Haddad, F., Doyle, R., Murphy, D. J., Hunt, S. A. Right ventricular function in cardiovascular disease, part II: pathophysiology, clinical importance, and management of right ventricular failure. Circulation. 117, 1717-1731 (2008).
- Bosch, L., et al. Right ventricular dysfunction in left-sided heart failure with preserved versus reduced ejection fraction. European Journal of Heart Failure. 19, 1664-1671 (2017).
- Sianos, G., et al. Recanalisation of chronic total coronary occlusions: 2012 consensus document from the EuroCTO club. EuroIntervention: Journal of EuroPCR in Collaboration with the Working Group on Interventional Cardiology of the European Society of Cardiology. 8, 139-145 (2012).
- Bardaji, A., Rodriguez-Lopez, J., Torres-Sanchez, M. Chronic total occlusion: To treat or not to treat. World Journal of Cardiology. 6, 621-629 (2014).
- Choi, J. H., et al. Noninvasive Discrimination of Coronary Chronic Total Occlusion and Subtotal Occlusion by Coronary Computed Tomography Angiography. JACC. Cardiovascular Interventions. 8, 1143-1153 (2015).
- Danek, B. A., et al. Effect of Lesion Age on Outcomes of Chronic Total Occlusion Percutaneous Coronary Intervention: Insights From a Contemporary US Multicenter Registry. The Canadian Journal of Cardiology. 32, 1433-1439 (2016).
- Savai, R., et al. Pro-proliferative and inflammatory signaling converge on FoxO1 transcription factor in pulmonary hypertension. Nature Medicine. 20, 1289-1300 (2014).
- Zhiyu Dai, P., et al. Endothelial and Smooth Muscle Cell Interaction via FoxM1 Signaling Mediates Vascular Remodeling and Pulmonary Hypertension. American Journal of Respiratory and Critical. 198, 788-802 (2018).
- Hill, M. R., et al. Structural and mechanical adaptations of right ventricle free wall myocardium to pressure overload. Annals of Biomedical Engineering. 42, 2451-2465 (2014).
- Poirier, N. C., Mee, R. B. Left ventricular reconditioning and anatomical correction for systemic right ventricular dysfunction. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. Pediatric Cardiac Surgery Annual. 3, 198-215 (2000).
- Wei, X., et al. Myocardial Hypertrophic Preconditioning Attenuates Cardiomyocyte Hypertrophy and Slows Progression to Heart Failure Through Upregulation of S100A8/A9. Circulation. 131, 1506-1517 (2015).
- Zakliczynski, M., et al. Mechanical circulatory support is effective to treat pulmonary hypertension in heart transplant candidates disqualified due to unacceptable pulmonary vascular resistance. Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska (Polish Journal of Cardio-Thoracic Surgery). 15, 23-26 (2018).
- De Santo, L. S., et al. Pulmonary artery hypertension in heart transplant recipients: how much is too much? European Journal of Cardio-Thoracic Surgery: Official Journal of the European Association for Cardio-Thoracic Surgery. 42, 864-870 (2012).
- Cheng, X. L., et al. Prognostic Value of Pulmonary Artery Compliance in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension Associated with Adult Congenital Heart Disease. International Heart Journal. 58, 731-738 (2017).
- Egemnazarov, B., et al. Pressure Overload Creates Right Ventricular Diastolic Dysfunction in a Mouse Model: Assessment by Echocardiography. Journal of the American Society of Echocardiography. 28, 828-843 (2015).
- Jang, S., et al. Biomechanical and Hemodynamic Measures of Right Ventricular Diastolic Function: Translating Tissue Biomechanics to Clinical Relevance. Journal of the American Heart Association. 6 (9), e006084 (2017).
