Denne protokollen detaljer en prosedyre der menneskelige neuronal kulturer er transduced med lentiviral konstruerer koding for mutant menneskelig tau. Transduced kulturer vise tau aggregater og tilhørende patologi.
Avvikende aggregering av protein tau er pathogenically involvert i en rekke nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD). Selv om musemodeller av tauopathy har gitt en verdifull ressurs for å undersøke nevrotoksiske mekanismer for aggregert tau, blir det stadig tydeligere at, på grunn av interspecies forskjeller i nevrofysiologi, er musen hjernen uegnet for modellering av den menneskelige tilstand. Fremskritt i cellekultur metoder har gjort menneskelige neuronal kulturer tilgjengelig for eksperimentell bruk in vitro og har hjulpet i utviklingen av neurotherapeutics. Men til tross for tilpasning av menneskelig neuronal cellekulturer, in vitro modeller av menneskelig tauopathy er ennå ikke allment tilgjengelig. Denne protokollen beskriver en mobil modell av tau aggregering der menneskelige neurons er transduced med lentiviral-avledet vektorer som koden for pathogenically mutert tau smeltet til et gult fluorescerende protein (YFP) reporter. Transduced kulturer produserer tau aggregater som flekken positivt for thioflavin og vise markører for nevrotoksisitet, slik som redusert axonal lengde og økt lysosomal volum. Denne prosedyren kan være en nyttig og kostnadseffektiv modell for å studere menneskelig tauopathies.
Patologisk aggregering av mikrotubulinettverket-assosiert protein tau er et definerende trekk ved mange nevrodegenerative sykdommer, inkludert AD, frontotemporal demens (FTD), pick ‘ s sykdom, og progressiv supranuclear parese (PSP)1. I en nondiseased tilstand, tau binder seg til og stabiliserer mikrotubulinettverket filamenter i neuronal axons2. Men, sykdom-assosiert hyperphosphorylation av tau fremmer tau aggregering, dissosiasjon fra mikrotubuli, og neuronal toksisitet3. Den toksiske effekter av aggregert tau kan innebære avvikende aktivering av kolinerge4 og glutamatergic reseptorer5 resulterer i feilregulering av intracellulære kalsium og, til slutt, celle død. I dyremodeller, reduksjon av hjernen tau forbedrer patologi i AD mus6 og i musemodeller av repeterende milde traumatisk hjerneskade7.
Montering bevis viser at strukturen og bindende affinitet av mus-avledet tau er forskjellig fra menneske-avledet tau og at musen tau er uegnet for modellering menneskelig tauopathies8. Men menneskelige celle tauopathy modeller er ikke allment kommersielt tilgjengelig. Det overordnede målet med dette arbeidet er å beskrive en in vitro modell av tau aggregering der menneskelige neurons er transduced med lentiviral-avledet vektorer som inneholder mutant menneskelige tau konstruksjoner9. Tau aggregat forårsaker lentiviral konstruerer koder for tau gjenta domenet harboring P301L og V337M mutasjoner smeltet til en YFP reporter (tau-RDLM-YFP) mens kontroll konstruerer kode for Wild-type (WT) tau gjenta domenet smeltet til en YFP reporter (tau-WT-YFP). Neuronal kulturer transduced bruker denne metoden uttrykke omtrent ni ganger mer tau enn nontransduced kulturer. Selv om mengden tau uttrykk overexpressed er omtrent lik mellom tau-RDLM-YFP-og tau-WT-YFP-transduced celler, bare neurons transduced med tau-RDLM-YFP display aggregater. Kulturer transduced med tau-RDLM-YFP flekken positivt for thioflavin og vise reduksjoner i axonal lengde og Synaptic tetthet. Derfor kan denne cellulære modellen være et nyttig verktøy for å studere tau aggregering in vitro.
Denne protokollen beskriver generering av en in vitro modell av menneskelig tauopathy som viser sølv-beis-positive aggregater og thioflavin-positive neurofibrillary floker (NFTs). Videre transduced celler viser tau-indusert patologi som morfologiske defekter, redusert synaptogenesis, og en økt lysosomal volum. Den største fordelen med denne protokollen er at det gir en tilgjengelig og kostnadseffektiv modell av neuronal tauopathy, som kan brukes til narkotika screening studier, samt for analyse av tau toksisitet. Denn…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Peter Davies ved Albert Einstein College of Medicine for å forsyne PHF-1 og CP13 antistoffer og Dr. Marc Diamond ved University of Texas, Southwestern, for å gi tau konstruksjoner. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Alzheimer ‘ s Association (NIRG-14-322164) til S.H.Y. og fra California Institute for regenererende Medicine (TB1-01193) til P.R.
10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
Cell culture incubator | Various sources | NA | |
Centrifuge | Various sources | NA | |
DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
Human neural stem cells | Various sources | NA | |
Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
Water bath | Various sources | NA |