Ce protocole détaille une procédure dans laquelle les cultures neuronales humaines sont transproduites avec des constructions Lentivirales codant pour le tau humain mutant. Les cultures transproduites présentent des agrégats Tau et des pathologies associées.
L’agrégation aberrante de la protéine tau est pathogénique impliquée dans un certain nombre de maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer (AD). Bien que les modèles de souris de la tauopathie ont fourni une ressource précieuse pour enquêter sur les mécanismes neurotoxiques de Tau agrégé, il devient de plus en plus évident que, en raison de différences interespèces dans la neurophysiologie, le cerveau de la souris est inapproprié pour modélisation de la condition humaine. Les progrès dans les méthodes de culture cellulaire ont rendu les cultures neuronales humaines accessibles pour une utilisation expérimentale in vitro et ont aidé au développement de la neurothérapeutique. Cependant, malgré l’adaptation des cultures cellulaires neuronales humaines, les modèles in vitro de la tauopathie humaine ne sont pas encore largement disponibles. Ce protocole décrit un modèle cellulaire d’agrégation Tau dans lequel les neurones humains sont transgéniques avec des vecteurs LENTIVIRAUX qui code pour Tau pathogène mutant fusionné à une protéine fluorescente jaune (YFP) reporter. Les cultures transproduites produisent des agrégats tau qui coloraient positivement la thioflavine et affichaient des marqueurs de neurotoxicité, comme une diminution de la longueur axonale et une augmentation du volume lysosomique. Cette procédure peut être un modèle utile et rentable pour l’étude des tauopathies humaines.
L’agrégation pathologique de la protéine tau associée aux microtubules est une caractéristique déterminante de nombreuses maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer, la démence frontotemporelle (FTD), le prélèvement et la paralysie supranucléaire progressive (PSP)1. Dans un État non malade, TAU se lie et stabilise les filaments microtubules dans les axones neuronaux2. Cependant, l’hyperphosphorylée de Tau associée à la maladie favorise l’agrégation Tau, la dissociation des microtubules et la toxicité neuronale3. Les effets toxiques du Tau agrégé peuvent impliquer une activation aberrante des récepteurs cholinergiques4 et glutamatergiques5 entraînant une dysrégulation du calcium intracellulaire et, finalement, la mort cellulaire. Dans les modèles animaux, la réduction du Tau cérébral améliore la pathologie chez les souris AD6 et dans les modèles de souris de lésions cérébrales traumatiques légères répétitives7.
La preuve de montage démontre que la structure et l’affinité de liaison des Tau dérivées de la souris sont distinctes des Tau dérivées de l’homme et que la souris Tau n’est pas apte à modéliser les tauopathies humaines8. Cependant, les modèles de tauopathie cellulaire humaine ne sont pas largement disponibles dans le commerce. L’objectif général de ce travail est de décrire un modèle in vitro d’agrégation Tau dans lequel les neurones humains sont transduit avec des vecteurs LENTIVIRAUX contenant des constructions Tau humaines mutantes9. L’agrégat Tau causant des constructions Lentivirales encode pour le domaine de répétition Tau P301L et V337M mutations fusionnées à un reporter YFP (Tau-RDLM-YFP) tandis que le contrôle construit le code pour le domaine de répétition de type Wild (WT) Tau fusionné avec un reporter YFP (Tau-WT-YFP). Les cultures neuronales transproduites à l’aide de cette méthode expriment environ neuf fois plus de Tau que les cultures non transproduites. Bien que la quantité d’expression Tau surexprimée soit à peu près égale entre les cellules transproduites Tau-RDLM-YFP-et Tau-WT-YFP, seuls les neurones transprésentés avec des agrégats d’affichage Tau-RDLM-YFP. Les cultures transproduites avec Tau-RDLM-YFP tache positivement pour la thioflavine et affichent des diminutions de la longueur axonale et de la densité synaptique. Par conséquent, ce modèle cellulaire peut être un outil utile pour étudier l’agrégation Tau in vitro.
Ce protocole décrit la génération d’un modèle in vitro de tauopathie humaine qui présente des agrégats d’argent-tache-positif et des enchevêtrements neurofibrillaires positifs de thioflavine (NFTS). En outre, les cellules transproduites présentent des pathologies induites par le tau telles que des anomalies morphologiques, une réduction de la synaptogenèse et un volume lysosomique accru. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit un modèle accessible et rentable de la tauopathie neuronale, q…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs aimeraient remercier le Dr Peter Davies au Collège Albert Einstein de médecine pour avoir fourni des anticorps PHF-1 et CP13 et le Dr Marc Diamond à l’Université du Texas, au sud-ouest, pour avoir fourni les constructions Tau. Ce travail a été appuyé par des subventions de l’Association Alzheimer (NIRG-14-322164) à S.H.Y. et de l’Institut californien de médecine régénérative (TB1-01193) à P.R.
10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
Cell culture incubator | Various sources | NA | |
Centrifuge | Various sources | NA | |
DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
Human neural stem cells | Various sources | NA | |
Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
Water bath | Various sources | NA |