Summary
Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana nach der Exposition gegenüber Immunentfernern: der vorübergehende oxidative Ausbruch und die Hemmung des Sämlingwachstums.
Abstract
Pflanzen haben ein robustes Immunsystem entwickelt, um Krankheitserreger wahrzunehmen und vor Krankheiten zu schützen. Dieses Papier beschreibt zwei Assays, die verwendet werden können, um die Stärke der Immunaktivierung in Arabidopsis thaliana nach der Behandlung mit Elicitor-Molekülen zu messen. Präsentiert zuerst ist eine Methode zur Erfassung der schnell induzierten und dynamischen oxidativen Burst, die mit einem Luminol-basierten Assay überwacht werden kann. Präsentiert zweite ist eine Methode, die beschreibt, wie immuninduzierte Hemmung des Sämlingswachstums zu messen. Diese Protokolle sind schnell und zuverlässig, erfordern keine spezielle Ausbildung oder Ausrüstung und sind weit verbreitet, um die genetische Grundlage der Pflanzenimmunität zu verstehen.
Introduction
Um Krankheitserreger wahrzunehmen und zu verteidigen, haben Pflanzen membrangebundene Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) entwickelt, die konservierte mikrobielle Moleküle außerhalb der Zelle detektieren, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster (MAMPs) bekannt sind1. Die Bindung von MAMPs an ihre kognaatierten PRRs initiiert proteinkinasevermittelte Immunsignalisierung, was zu einer Breitspektrum-Krankheitsresistenz2führt. Eine der frühesten Reaktionen nach der PRR-Aktivierung ist die Phosphorylierung und Aktivierung von integralen Plasmamembran-RESPIRATORY-BURST-OXIDASE-HOMOLOG(RBOH)-Proteinen, die die Produktion extrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) katalysieren 3 , 4. ROS spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung von Krankheitsresistenz, sowohl als sekundäre Botenstoffe zur Verbreitung von Immunsignalisierung als auch als direkte antimikrobielle Wirkstoffe5. Die erste Beobachtung eines immunentlösten oxidativen Bursts wurde mit Kartoffelknollen von cv. Rishiri nach Phytophthora infestans Inokulation6beschrieben. Die ROS-Produktion wurde in mehreren Pflanzenarten mit Blattscheiben7, Zellsuspensionskulturen8und Protoplasten6. Beschrieben hier ist eine einfache Methode für die Assaying Muster-ausgelöste ROS-Produktion in Blattscheiben von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Als Reaktion auf die MAMP-Wahrnehmung katalysieren aktivierte RBOH-Proteine die Produktion von Superoxid-Radikalen (O2-), Hydroxylradikalen (•OH) und Singlet-Sauerstoff (1O2 ), die in Wasserstoffperoxid umgewandelt werden (H2 O 2) im extrazellulären Raum9. H2O2 kann durch Luminol-basierte Chemilumineszenz in Gegenwart des Oxidationsmittels Meerrettichperoxidase (HRP)10quantifiziert werden. HRP oxidiertH2O2 und erzeugt ein Hydroxid-Ion (OH) und Sauerstoffgas (O2 ), die mit Luminol reagieren, um ein instabiles Zwischenprodukt zu erzeugen, das ein Photon von Licht10freisetzt. Photonenemission kann als relative Lichteinheiten (RLUs) mit einem Mikroplattenleser oder Imager quantifiziert werden, der in der Lage ist, Lumineszenz zu erkennen, die in den meisten molekularen Laboratorien zu Standardgeräten geworden sind. Durch die Messung des Lichts, das über ein 40-60-Minuten-Intervall erzeugt wird, kann ein transienter oxidativer Ausbruch bereits 2-5 Minuten nach der Behandlung des Entauslöserers erkannt werden, der bei 10-20 Minuten seinen Höhepunkt erreicht und nach 60 Minuten11auf basale Werte zurückkehrt. Das kumulative Licht, das in diesem Zeitverlauf erzeugt wird, kann als Maß für die Immunstärke verwendet werden, das der Aktivierung von RBOH-Proteinen12entspricht. Praktischerweise erfordert dieser Test keine spezielle Ausrüstung oder umständliche Probenvorbereitung.
Kurz nach dem MAMP-Nachweis gilt der oxidative Ausbruch als frühe Immunantwort, zusammen mit der MAPK-Aktivierung und der Ethylenproduktion5. Spätere Immunantworten sind Transkriptionsreprogrammierung, stomataler Verschluss und Calloseablagerung2,5. Eine längere Exposition gegenüber MAMPs aktiviert kontinuierlich energetisch-kostenintensive Immunsignale, was zur Hemmung des Pflanzenwachstums führt, was auf einen Kompromiss zwischen Entwicklung und Immunität13hindeutet. Musterausgelöste Sättlingswachstumshemmung (SGI) wird häufig zur Beurteilung der Immunleistung bei Arabidopsis verwendet und war integraler Bestandteil der Identifizierung mehrerer Schlüsselkomponenten der Immunsignalisierung, einschließlich PRRs14,15 ,16. Daher präsentiert dieses Papier zusätzlich einen Test für musterausgelöste SGI in Arabidopsis, wobei Sämlinge in Multi-Well-Platten angebaut werden, die Standardmedien oder Medien enthalten, die 8-12 Tage lang mit einem Immunenteliciter ergänzt und dann gewogen werden. mit einer analytischen Skala.
Um zu demonstrieren, wie ROS- und SGI-Assays zur Überwachung der PRR-vermittelten Signalisierung verwendet werden können, wurden drei Genotypen ausgewählt, die unterschiedliche Immunausgänge darstellen: (1) der wilde Typ Arabidopsis Beitritt Columbia (Col-0), (2) der dominant-negative Bak1-5 Mutant, bei dem der multifunktionale PRR-Co-Rezeptor BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) bei der Immunsignalisierung17,18und (3) dem rezessiven cpk28-1 Mutanten, dem die CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) und zeigt erhöhte immunausgelöste Reaktionen19,20. ROS- und SGI-Assays werden als Reaktion auf ein synthetisch hergestelltes elf18-Peptid-Epitop des bakteriellen Dehnungsfaktors Tu (EF-Tu) vorgestellt, das in Arabidopsis vom PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15anerkannt wird. Diese Protokolle können mit anderen Immunentfernern wie dem bakteriellen Motilitätsprotein Flagellin14 oder endogenen Pflanzenelicitor-Proteinen (AtPeps)16verwendet werden, es sollte jedoch beachtet werden, dass die Reaktionsfähigkeit der Pflanzen je nach Elicitor21. Zusammen können ROS- und SGI-Assays für die schnelle und quantitative Bewertung früher und später PRR-vermittelter Reaktionen verwendet werden.
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Protocol
1. Erkennung von ROS-Burst in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunentlösung
- Pflanzenwachstum und -wartung.
- Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie Arabidopsis Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1% Agar [w/v] aussetzen und 3-4 Tage bei 4 °C (kein Licht) lagern.
ANMERKUNG: Stratify eine Wildtyp-Hintergrundsteuerung (z. B. Col-0) und Genotypen mit hohen und niedrigen Immunausgängen (z. B. cpk28-1 bzw. bak1-5), um als interne Kontrollen zu dienen. - Säen Sie Samen auf dem Boden und keimen unter Standard-Kurztagesbedingungen (22 °C, 10 h Licht, 150 mE/m2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit).
- Nach ca. 7 Tagen verwenden Sie Zangen, um einzelne Sämlinge in neue Töpfe zu verpflanzen, die durch mindestens 4 cm voneinander getrennt sind, um eine vollständige Rosettenentwicklung zu ermöglichen. Transplantieren Sie 6-12 Sämlinge pro Genotyp und kehren Sie zu Standard-Kurztagesbedingungen zurück. Regelmäßig Wasser- und Düngepflanzen (1 g/L 20-20-20 Dünger alle 2 Wochen).
- Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie Arabidopsis Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1% Agar [w/v] aussetzen und 3-4 Tage bei 4 °C (kein Licht) lagern.
- Sammeln Sie Blattscheiben in 96-Well-Platten für die Erholung über Nacht.
- Nach 4-5 Wochen nach der Keimung (Abbildung 1A), verwenden Sie einen scharfen 4 mm Biopsie-Punch, um eine Blattscheibe pro Pflanze zu entfernen, die Mittelvene zu vermeiden und darauf zu achten, die Verwundung zu begrenzen (Abbildung 1B). Legen Sie Blattscheiben in eine unbenutzte 96-Well-Luminometerplatte, die 100 l ddH2O enthält, wobei die adaxiale Seite nach oben zeigt, um eine Austrocknung zu verhindern22 (Abbildung 1C). Wenn Sie mehrere Elicitoren bewerten, entfernen Sie 1 Blattscheibe aus dem gleichen Blatt für jede Elicitor-Behandlung.
HINWEIS: Probenblätter, die vollständig erweitert sind, von der Spitze der Rosette an dritter bis fünfter Stelle und ungefähr die gleiche Größe und das gleiche Alter aufweisen, um die Variabilität zu begrenzen. Wenn möglich, schneiden Blattscheiben mit einer Rasierklinge vor der nächtlichen Erholung in die Hälfte, da dies die Oberfläche erhöht, die der Elicitorlösung ausgesetzt ist23. - Erholen Sie sich über Nacht bei Raumtemperatur, um die Interferenz von ROS zu verhindern, die durch Wundung während der Blattscheibensammlung entsteht. Abdeckungsplatten mit Deckel, um Verdunstung zu verhindern.
- Nach 4-5 Wochen nach der Keimung (Abbildung 1A), verwenden Sie einen scharfen 4 mm Biopsie-Punch, um eine Blattscheibe pro Pflanze zu entfernen, die Mittelvene zu vermeiden und darauf zu achten, die Verwundung zu begrenzen (Abbildung 1B). Legen Sie Blattscheiben in eine unbenutzte 96-Well-Luminometerplatte, die 100 l ddH2O enthält, wobei die adaxiale Seite nach oben zeigt, um eine Austrocknung zu verhindern22 (Abbildung 1C). Wenn Sie mehrere Elicitoren bewerten, entfernen Sie 1 Blattscheibe aus dem gleichen Blatt für jede Elicitor-Behandlung.
- Führen Sie die Elicitor-Behandlung durch und messen Sie die ROS-Produktion.
- Programmieren Sie den Plattenleser vor dem Hinzufügen der Reaktionslösung, da dies die Zeit zwischen der ROS-Burst-Initiierung und den ersten aufgezeichneten Messungen reduziert. Verwenden Sie eine kommerzielle Software, die für den Plattenleser geeignet ist. In unserem Fall (siehe Inhaltsverzeichnis) klicken Sie auf Einstellungen, und wählen Sie die LUM96-Patrone und den kinetischen Lesetyp aus. Klicken Sie auf die Kategorie "Bereich lesen", und ziehen Sie, um eine Teilmenge der Bohrungen oder die gesamte zu lesende Platte auszuwählen. Legen Sie unter der Registerkarte PMT und Optics die Integrationszeit auf 1.000 ms fest. Legen Sie unter der Registerkarte Timing die Gesamtlaufzeit auf 40-60 min und das Intervall auf 2 min. fest.
- Entfernen Sie Wasser aus jedem Brunnen mit einer Mehrkanalpipette.
HINWEIS: Punktieren Sie keine Blattscheiben, da dies zu Wundbelastung führen und zu variableren ROS-Ausgängen führen kann. - Bereiten Sie eine Reaktionslösung vor, die 100 'M Luminol, 10 'g/ml HRP und die gewünschte Konzentration von Elicitor (z. B. elf18 bei 1 nM, 10 nM, 100 nM oder 1.000 nM) in sterilem ddH2O mit 10 ml Lösung für eine 96-Well-Platte enthält.
HINWEIS: Lyophilisierte Peptide in sterilenH2O in bindungsarmen Schläuchen auflösen, um einen 10 mM-Bestand herzustellen, in Flüssig N2zu blitzen und bei -80 °C aufzubewahren. Wenn Sie einsatzbereit sind, verdünnen Sie die Vorräte in sterilen H2O, um einen Arbeitsbestand von 100 m zu erzeugen und bei -20 °C aufzubewahren. - Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um 100 l des Reaktionsgemisches an jeden Brunnen zu verteilen, wobei die Lösung allen Blattscheiben der gleichen Behandlung zur gleichen Zeit hinzugefügt wird22. Schließen Sie eine Kontrollreaktion (kein Elicitor) für jeden Genotyp ein, um die basalen ROS-Spiegel in Ermangelung einer Auslösung zu bewerten. Messen Sie sofort die Lichtemission für alle Wellenlängen im sichtbaren Spektrum mit einem Mikroplattenleser.
HINWEIS: Bereiten Sie die Reaktionslösung bei schwachem Licht vor und wenden Sie sie auf, da Luminol und HRP lichtempfindliche Reagenzien sind. Reagenzien auf Eis oder bei -20°C aufbewahren, sofern nicht verwendet. - Messen Sie die Lichtemission mit einer Integrationszeit von 1.000 ms in 2 minuten Intervallen über einen Zeitraum von 40-60 min in einem Mikroplattenleser, um den dynamischen oxidativen Burst zu erfassen (Abbildung 1D).
HINWEIS: Verwenden Sie eine längere Integrationszeit, um die Assayempfindlichkeit11zu verbessern und gleichzeitig sicherzustellen, dass alle Proben in einer 96-Well-Platte innerhalb eines Intervalls gemessen werden können.
- Dateninterpretation.
- Verwenden Sie für jeden Genotyp eine Tabellenkalkulationsanwendung, um die durchschnittliche Photonenanzahl und den Standardfehler zu jedem Zeitpunkt zu berechnen, und zeigen Sie die ROS-Produktion als Funktion der Zeit mithilfe eines Streudiagramms an.
Wo t = jeder Zeitpunkt - Alternativ können Sie die Photonenanzahl für jede Blattscheibe summieren und den Durchschnitt dieser Werte für jeden Genotyp mithilfe eines Balkendiagramms mit Standardfehlerbalken oder einer Box- und Schnurrhaardiagramm darstellen.
- Verwenden Sie für jeden Genotyp eine Tabellenkalkulationsanwendung, um die durchschnittliche Photonenanzahl und den Standardfehler zu jedem Zeitpunkt zu berechnen, und zeigen Sie die ROS-Produktion als Funktion der Zeit mithilfe eines Streudiagramms an.
2. Seedling Growth Inhibition Assay
- Sterilisieren Sie Samen und säen Sie auf Murashige und Skoog (MS) Teller.
- Bereiten Sie sterile Halbstärke (0,5x) MS medium (2,16 g/L) mit 0,8% Agar [w/v] vor. Gießen Sie Medien in Platten (90 x 15 mm) in einer laminaren Durchflusshaube.
- Sterilisieren Sie ca. 100 Samen in einem Mikrozentrifugenrohr, indem Sie mit 1 ml 70% Ethanol für 2 min waschen und durch Aspiration entfernen. 1 ml 40% Bleichmittel hinzufügen und bei Raumtemperatur 1 ml 40% Bleichmittel und sanft eskhereintigen Gestein. Bleichmittel durch Aspiration entfernen und dreimal in 1 ml sterilem Wasser für 5 min waschen. Resuspend in 1 ml sterilen 0,1% Agar.
HINWEIS: Alternativ verwenden Sie ein Chlorgassamen-Sterilisationsprotokoll24. - Säen Sie ca. 100 Samen pro Genotyp auf MS-Agarplatten mit einer Pipette und versiegeln Sie mit Mikroporenband in einer laminaren Durchflusshaube.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, Samen in unmittelbarer Nähe zu platzieren, da dies die Transplantation von Sämlingen später schwierig macht. - Satifizieren Sie Samen, indem Sie Teller bei 4 °C (kein Licht) für 3-4 Tage, um die Keimung zu synchronisieren (Abbildung 2A).
- Transplantieren Sie Sämlinge in 48-Well-Platten, die Immun-Entsende-Peptide enthalten.
- Nach der Schichtung die Platten unter kurzen Tagesbedingungen (22 °C, 10 hLicht, 150 mE/m 2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit) für 3-4 Tage zum Licht bewegen, um eine Keimung zu ermöglichen.
- In einer laminaren Durchflusshaube Peptidverdünnungen (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM und 1.000 nM) in sterilen 0,5x MS-Flüssigkeitsmedien mit 1% Saccharose [w/v] zubereiten, wobei 25 ml MS für jede 48-Well-Platte verwendet werden. Bereiten Sie Platten vor, indem Sie 500 l MS flüssiges Medium oder MS-Medium mit Peptiden pro Brunnen pipetieren. Falls verfügbar, verwenden Sie einen Repeat Pipettor für die Plattenvorbereitung, um den Prozess zu beschleunigen.
HINWEIS: Für jeden Genotyp, wachsen Sämlinge in MS ohne Elicitor, um inhärente Unterschiede im Sämlingwachstum zu berücksichtigen. - Mit sterilen Zangen sorgfältig verpflanzn einen Sämling zu jedem Brunnen der gleichen Größe und Alter, um sicherzustellen, dass es keine Schäden an der Sämling oder Bruch der Wurzel und dass die Wurzel in medienversinken. Für jeden Genotyp mindestens 6-8 Sämlinge in jede Peptidverdünnung transplantieren (Abbildung 2B).
HINWEIS: Transplantieren Sie Sämlinge nach 4 Tagen nach der Keimung, da Kurzwurzeln leichter zu manipulieren sind und ältere Sämlinge weniger optimale Ergebnisse liefern können. - Platten mit Mikroporenband versiegeln und unter normalen Kurztagesbedingungen (22 °C, 10 hLicht, 150 mE/m 2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit) wieder ans Licht rücken. Sämlinge 8-12 Tage wachsen lassen.
- Bestimmen Sie die prozentuale Wachstumshemmung.
- Sämlinge vorsichtig von 48-Well-Platten entfernen und trocknen, indem Sie auf Papiertuch dabben. Gewichten Sie Sämlinge auf einer analytischen Skala und zeichnen Sie Werte auf. Verwenden Sie, falls verfügbar, eine analyseskala mit USB-Ausgang, um neue Gewichtungswerte in einer Kalkulationstabelle aufzuzeichnen. Bevor Sie Sämlinge wiegen, nehmen Sie ein Foto auf, um die Wachstumshemmung visuell darzustellen (Abbildung 2C).
- Bestimmen Sie die prozentuale Wachstumshemmung von mit Elicitor behandelten Sämlingen im Vergleich zu Sämlingen, die nur in MS angebaut werden (Abbildung 2D), wie folgt:
- Zeichnen Sie Daten mithilfe eines Balkendiagramms mit Standardfehlerbalken oder mithilfe eines Box- und Whisker-Plots, um die interexperimentelle Varianz besser anzuzeigen.
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Representative Results
Mutant cpk28-119,25 und bak1-517,18 Pflanzen wurden verwendet, um erwartete Ergebnisse für Genotypen mit hohen und niedrigen Immunantworten zu demonstrieren, bzw. in oxidativen Burst und SGI Tests relativ zu einem Wildtyp-Hintergrundsteuerelement (Col-0). Zur Beurteilung dosisabhängiger Wirkungen wurde eine 10-fache Peptidverdünnungsreihe (1-1.000 nM) von elf18 verwendet. Wie erwartet hatten cpk28-1 Funktionsverluste einen höheren kumulativen (Abbildung 3A) und einen durchschnittlichen (Abbildung 3B) ROS-Burst im Vergleich zu Col-0, während bak1-5 eine reduzierte ROS-Produktion bei Konzentrationen zwischen 10 nM und 1.000 nM (Abbildung 3). Erwartete Unterschiede in der SGI konnten zwischen allen Genotypen in 100 nM und 1.000 nM elf18 (Abbildung 4A) festgestellt werden, die auch bei der Behandlung von 1.000 nM elf18 visuell beobachtet werden konnten (Abbildung 4B). Charakteristisch für die hohe Immunsignalisierung waren cpk28-1 Mutanten deutlich kleiner als Col-0, wenn sie in 1.000 nM elf18 angebaut wurden, während Bak1-5-Mutanten eine schwache Wachstumshemmung im Vergleich zu Col-0 aufgrund einer gestörten MAMP-Erkennung zeigten.
Abbildung 1. Luminol-basierte oxidative Burst-Assay nach Immuninduktion bei Arabidopsis. (A) Pflanzen auf dem Boden in kurzen Tagesbedingungen für 4-5 Wochen wachsen. (B) Verwenden Sie einen 4 mm Biopsie-Punch, um Blattscheiben aus jeder Pflanze zu sammeln und sich über Nacht in ddH2O. (C) Reaktionslösung (100 m Luminol, 10 g/ml HRP und die gewünschte Entrückungskonzentration) zu addieren und die Lichtemission über 40-60 min in 2 min Intervallen zu messen. mit einer Integrationszeit von 1.000 ms. (D) Bestimmen Sie die durchschnittliche Photonenanzahl für jeden Genotyp relativ zu Col-0 (in Grün dargestellt), eine hohe ROS-Steuerung wie cpk28-1 (in Violett dargestellt) und eine niedrige ROS-Steuerung wie bak1-5 (in Orange dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Elicitor-induzierte Sämling Wachstumshemmung Assay in Arabidopsis. (A) Sämlinge auf MS-Agar säen und 3-4 Tage unter normalen Kurztagesbedingungen anbauen. (B) Verpflanzen von Sämlingen auf 48-Well-Platten, die MS-Medium oder MS mit unterschiedlichen Konzentrationen von elf18 enthalten. (C) Nach 8-12 Tagen die Sämlingsgröße visuell bewerten und dann das frische Gewicht anhand einer analytischen Skala messen, um die prozentuale Wachstumshemmung zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentativer elf18-induzierter oxidativer Ausbruch in drei Arabidopsis-Genotypen. Vier Wochen alte Pflanzen wurden mit einer Verdünnungsserie von elf18 (0 nM 'Mock', 1 nM, 10 nM, 100 nM und 1.000 nM) behandelt. Col-0 stellt die Wildtyp-Hintergrundsteuerung dar, wobei cpk28-1 und bak1-5 hohe bzw. niedrige ROS-Phänotypen darstellen. (A) Gesamtanzahl der Photonen, die nachder Behandlung von elf18 als relative Lichteinheiten dargestellt werden (n =6 Blattscheiben von unabhängigen Pflanzen). Statistische Unterschiede werden durch Kleinbuchstaben dargestellt und mit einer einseitigen ANOVA mit einem Post-hocTukey es Honest Significant Difference Test (p <0.05) berechnet. (B) Durchschnittliche Photonenanzahl, dargestellt als relative Lichteinheiten, über40 min nach elf18 Behandlung (n =6 Blattscheiben von unabhängigen Pflanzen). Fehlerbalken stellen einen Standardfehler des Mittelwerts dar. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei von drei Experimenten erzielt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Repräsentative elf18-induzierte Setzlingswachstumshemmung bei drei Arabidopsis-Genotypen. Wildtyp (Col-0), cpk28-1und bak1-5 Sämlinge wurden in einer 10-fachen Verdünnungsserie (0-1.000 nM) von elf18 angebaut. (A) Die prozentuale Wachstumshemmung wurde berechnet, indem das Gewicht der einzelnen Sämlinge, die in elf18 (n=6 Einzelsämlinge) angebaut wurden, mit dem Durchschnittlichgewicht der Setzlinge desselben Genotyps verglichen wurde, die nur in MS angebaut wurden ('Mock') (n=6 einzelne Sämlinge) über einen Zeitraum von 10 Tagen. Statistische Unterschiede werden durch Kleinbuchstaben dargestellt und mit einer einseitigen ANOVA mit einem Post-hoc-Test für ehrliche signifikante Unterschiede(p<0.05) berechnet. (B) Visuelle Demonstration von SGI in zwei repräsentativen Sämlingen von Col-0, cpk28-1 und bak1-5 als Reaktion auf die erhöhungen Konzentrationen von elf18. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei von vier Experimenten erzielt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Beurteilung von mustergesteuerten Immunantworten in Arabidopsis, die quantitative Ansätze zur Bewertung der Immunleistung ohne den Einsatz spezieller Geräte anbieten. In Kombination können mustergesteuerte ROS und SGI verwendet werden, um frühe bzw. späte Reaktionen auf die Mikrobenwahrnehmung zu bewerten.
Die Hauptbeschränkung des oxidativen Burst-Assays ist die Variabilität. Aus Gründen, die nicht vollständig verstanden werden, unterscheiden sich absolute RLUs oft durch eine Größenordnung zwischen den Experimenten. Da die Variabilität zwischen den Experimenten hoch ist, ist es ratsam, neben einer Wildtypsteuerung (z. B. Col-0) auch interne Referenzsteuerungen mit hohen(z.B. cpk28-1) und niedrigen(z.B. bak1-5) oxidativen Bursts einzuschließen. Es können jedoch Maßnahmen ergriffen werden, um die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten zu erhöhen. Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Photoperiode und Lichtintensität sollten zwischen Replikationen identisch sein. Das Alter und die Gesundheit der Pflanzen sollten auch bei der Probenahme berücksichtigt werden. Blattscheiben können von Pflanzen gesammelt werden, die zwischen 4 und 7 Wochen alt sind und unter kurzen Tagesbedingungen (6-10 Stunden Licht) angebaut werden. Anekdotisch wurden die konsistentesten Ergebnisse bei Pflanzen gefunden, die älter als 6 Wochen nach der Keimung sind, aber noch nicht blühen oder seneszieren. Es ist wichtig, Pflanzen in sauberen Umweltkammern anzubauen, damit sie nicht häufigen Gewächshausschädlingen wie Mehltau oder Kauinsekten ausgesetzt sind. Da Sämlinge für SGI in sterilen MS-Medien angebaut werden, und für eine kürzere Zeit, Umweltschwankungen sind weitgehend kein Problem. Variationen können jedoch auftreten, wenn Sämlinge während der Transplantation beschädigt werden, wenn Sämlinge, die für Elicitor-Behandlungen ausgewählt wurden, unterschiedlich groß sind oder wenn die Wachstumsmedien kontaminiert werden. Es wird empfohlen, die oben beschriebenen internen Referenzkontroll-Genotypen auch in SGI-Experimente einzubeziehen.
Elicitor-Konzentration ist eine weitere wichtige Überlegung bei der Durchführung von Immun-Assays. Elicitors werden von PRRs wahrgenommen, was zu einem schnellen und robusten ROS Burst führt, der 10-20 Minuten nach der Elicitor-Behandlung ihren Höhepunkt erreicht (Abbildung 2B). Die Größe des Bursts hängt jedoch sowohl vom Elicitor als auch vom Pflanzengenotyp ab. Daher wird eine Entösedosisserie, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellt, empfohlen, um eine geeignete Entsendekonzentration zu identifizieren. Muster-ausgelöste ROS kann auch durch Impfung von Blattscheiben mit lebenden Mikroben23,26 oder mikrobiellen Extrakten26,27,28. Zum Beispiel können transiente und dosisabhängige ROS-Bursts in Arabidopsis als Reaktion auf virulente Pathovar von Pseudomonas syringaenachgewiesen werden, die bei 35-40 Minuten ihren Höhepunkt erreichen und nach der Auslösung ein Basalniveau von ca. 70 Minuten erreichen. 23 , 29. Als Reaktion auf avirulent Bakterien29 oder den Pilzerreger P. infestans30,31wird eine zweite ausgeprägte Ansammlung von ROS produziert, die 6-10 Stunden nach impfung. Für schwächere Entwörer, wie Pilzchitin32 oder Chitosan33, können empfindlichere Leuchtindikatoren verwendet werden, wie das Luminol-Derivat L-012, jedoch ist das erzeugte Hintergrundsignal oft höher32, 34. Wichtig ist, dass der Pflanzenökotyp auch seine Reaktionsfähigkeit auf bestimmte Elicitoren diktiert35,36. Während z. B. bakterielles Flagellin in mehreren Arabidopsis-Ökotypen, einschließlich Col-0, Immunantworten hervorrufen kann, drückt der Wassilewskija (Ws-0) Ökotyp eine nicht-funktionelle Variante des PRR FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2) aus und daher unempfindlich gegenüber Flagellin14,37.
Immuninduzierte ROS kann auch in Blattscheiben anderer dikotyledonöser Pflanzen beobachtet werden, einschließlich Brassica napus38, Tomato39, Nicotiana benthamiana22,40,41, und mehrere andere Solanaceous-Arten41. Zusätzliche luminol-basierte ROS-Detektionstests wurden für Pflanzen mit Gewebeextrakten10, Zellsuspensionskulturen8,42und Protoplasten43 entwickeltund sind besonders nützlich in Systemen wobei Blattscheibenprotokolle nicht wirksam sind42. Zum Beispiel wurden elicitor-induzierte ROS-Bursts mit Zellsuspensionskulturen in Reis42,44 und Weizen45,46,sowie dem Gymnosperm Araucaria angustifolia beschrieben. 47 und das Moos Physcomitrella patens48. SGI wurde nicht so breit verwendet, um Immunsignalisierung zu messen. Jedoch, Wachstumshemmung als Reaktion auf Elicitoren wurde in N. benthamiana41 und B. napus38,49gezeigt. Schnelle Wachstumshemmung wurde auch in P. patens als Reaktion auf Pilzchitin gezeigt, das innerhalb von 2 Min. der Exposition auftritt, die mit Zeitrafferfotografie beobachtet werden kann48.
Mit Modifikation können sowohl SGI als auch oxidative Burst-Assays für Bildschirme mit hohem Durchsatz verwendet werden, um Immunregulatoren zu identifizieren. Zum Beispiel können mutagenisierte Populationen von Arabidopsis auf MS-Medium angebaut und mit Elicitoren überflutet werden, um unempfindliche Mutanten15,50,51,52,53zu identifizieren. Alternativ können mutagenisierte Populationen auf auslösergesteuerte ROS untersucht werden, die erfolgreich mit Blattscheiben54 und ganzen Sämlingen, die auf MS-Platten angebaut wurden, durchgeführt wurde19. Eine weitere nützliche Screening-Methode ist die transiente Expression von Proteinen in N. benthamiana für die ROS-Analyse vor der Entwicklung transgener Überexpressionslinien22,40,55. Die intraexperimentelle Variation ist jedoch aufgrund der Differentialproteinexpression in N. benthamiana 22höher als in stabilen Arabidopsis-Linien. Kontrollen auf demselben Blatt wie Versuchsproben.
Zusammenfassend sind immuninduzierter oxidativer Burst und SGI-Assays schnelle und zuverlässige Methoden zur Beurteilung der PRR-vermittelten Signalisierung bei Arabidopsis. Diese Methoden können auf andere Systeme ausgedehnt und für Großbildschirme verwendet werden, um neuartige Immunregulatoren aufzudecken.
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Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Die Arbeit in unserem Labor wird durch das Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, die Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader es Fund und die Queen es University finanziert. KS und IS werden durch Tandem Ontario Graduate Scholarships und NSERC Canada Graduate Scholarships für Master-Studenten (CGS-M) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
References
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