Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Diese Assays können verwendet werden, um Immunleistungen verschiedener Pflanzengenotypen zu bewerten und zu vergleichen. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist, dass sie schnell, zuverlässig sind und gängige Laborgeräte verwenden. Für den Wachstumshemmungstest sollten Sämlinge gleicher Größe und Alter transplantiert und vor dem Wiegen vollständig ausgeschmiert werden, um die Variation zu begrenzen.

Nach vier bis fünf Wochen nach der Keimung, verwenden Sie einen scharfen Vier-Millimeter-Biopsie-Punch, um eine Blattscheibe pro Arabidopsis Pflanze zu entfernen, den Mittelvenen zu vermeiden und vorsichtig zu sein, die Verwundung zu begrenzen. Sammeln Sie die Scheiben in einzelne Brunnen einer ungenutzten 96-Well-Luminometer-Platte mit 100 Mikroliter doppeldestilliertem Wasser pro Brunnen, adaxiale Seite nach oben, um austrocknung zu verhindern. Wenn Sie mehrere Entferner bewerten, entfernen Sie für jede Elicitor-Behandlung eine zweite Blattscheibe aus demselben Blatt und bedecken Sie die Platte mit dem Deckel, damit sich die Blattscheiben über Nacht bei Raumtemperatur erholen können.

Am nächsten Morgen stellen Sie die Mikroplattenleserparameter in Zwei-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 40 bis 60 Minuten auf eine Integrationszeit von 1.000 Millisekunden ein, um den dynamischen oxidativen Ausbruch zu erfassen. Als nächstes verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um das Wasser in jedem Brunnen durch 100 Mikroliter frisch vorbereiteter Reaktionslösung zu ersetzen, einschließlich einer Kontrolle, keine Entsendereaktion für jeden Genotyp, um den Gehalt an Basalreaktionssauerstoffspezies in Ermangelung von Auslösung zu bewerten. Messen Sie dann sofort die Lichtemission für alle Wellenlängen im sichtbaren Spektrum auf dem Mikroplattenleser.

An vier Tagen nach der Keimung, laden Sie jeden Brunnen einer 48-Well-Platte mit 500 Mikroliter MS Medium mit einer Verdünnung von Elicitor Peptid ergänzt. Als nächstes verwenden Sie sterile Zangen, um sorgfältig sechs bis acht Sämlinge der gleichen Größe, des gleichen Alters und des gleichen Genotyps in jede Peptidverdünnung zu transplantieren, wobei darauf zu achten ist, dass der Sämling oder Bruch der Wurzel nicht beschädigt wird und dass die Wurzel in medium getaucht wird. Wenn alle Sämlinge plattiert sind, versiegeln Sie die Platten mit Micropore-Band und stellen Sie die Pflanzen acht bis zwölf Tage lang unter Standard-Kurztagsbedingungen.

Um die prozentuale Wachstumshemmung zu bestimmen, nehmen Sie ein Foto auf, um die Wachstumshemmung visuell aufzuzeichnen, bevor Sie die Sämlinge vorsichtig aus jedem Brunnen entfernen. Dann die Wurzeln auf einem Papiertuch zum Trocknen abwerfen und jeden Sämling auf analytischer Skala wiegen. In diesem repräsentativen Experiment zeigten mutierte Pflanzen mit hyperaktiver Immunsignalisierung einen höheren kumulativen und durchschnittlichen oxidativen Ausbruch im Vergleich zu Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen, während mutierte Pflanzen mit eingeschränkter Immunsignalisierung einen reduzierten oxidativen Ausbruch in Konzentrationen zwischen 10 und 1 000 Nanomolar zeigten.

Erwartete Unterschiede in der Setzlingswachstumshemmung konnten auch zwischen allen Genotypen erkennbar sein, die in 100 und 1.000 nanomolaren Auslaugenden Peptidkonzentrationen angebaut werden. Bei der Verdünnung von 1 000 nanomolaren Peptidverdünnungen waren die Mutanten mit hyperaktiver Immunsignalisierung deutlich kleiner als Wildpflanzen, die unter den gleichen Bedingungen angebaut wurden, während die Mutanten mit eingeschränkter Immunsignalisierung eine schwache Wachstumshemmung im Vergleich zu Wildpflanzen zeigten. Diese Methoden liefern Hinweise auf frühe und späte Immunreaktionen.

Mehrere andere Techniken, einschließlich MAP-Kinase-Assays, pathogen-induzierte Genexpression und Infektionstests, können verwendet werden, um diese Wege abzuleiten. Diese Techniken wurden für den Einsatz in Großbildschirmen modifiziert, die erfolgreich Pathogenrezeptorproteine und mehrere andere Signalkomponenten identifiziert haben.