Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

doi: 10.3791/59438 Published: April 9, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Denna metod beskriver en robust och reproducerbar metod för jämförelse av proteinnivåer i olika vävnader och vid olika utvecklande tidpunkter med hjälp av standardiserade kvantitativa western blotting tillvägagångssättet.

Abstract

Western blotting är en teknik som ofta används för att påvisa och kvantifiera proteinuttryck. Under åren, har denna teknik lett till många framsteg inom både grundforskning och klinisk forskning. Men som med många liknande experimentella tekniker, påverkas resultatet av Western blot analyser lätt av val som gjorts i utformning och utförande av experimentet. Specifika städning proteiner har traditionellt använts till att normalisera proteinnivåer för kvantifiering, men dessa har ett antal begränsningar och har därför kritiserats alltmer de senaste åren. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll som vi har utvecklats för att tillåta oss att genomföra komplexa jämförelser av protein uttryck variation mellan olika vävnader, mus-modeller (inklusive sjukdomsmodeller) och utvecklingsmässiga tidpunkter. Med hjälp av en fluorescerande totalprotein fläck och införa användning av en intern lastning standard, är det möjligt att övervinna befintliga begränsningar i antalet prover som kan jämföras inom experiment och systematiskt jämföra proteinnivåer över en en rad experimentella förhållanden. Detta tillvägagångssätt utökar användningen av traditionella western blot teknik, vilket innebär att forskare att utforska proteinuttryck i olika vävnader och prover.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Western blotting är en teknik som ofta används för att påvisa och kvantifiera proteinuttryck, inklusive i vävnad homogenates eller extrakt. Under åren, har denna teknik lett till många framsteg inom både grundforskning och klinisk forskning, där det kan användas som ett diagnostiskt verktyg för att identifiera förekomst av sjukdom1,2. Western blotting beskrevs första gången 1979 som en metod att överföra proteiner från polyakrylamidgeler till nitrocellulosa ark och därefter visualisera proteiner med hjälp av sekundära antikroppar som antingen radioaktivt märkta eller konjugerat med fluorescein eller peroxidas3. Genom utveckling av kommersiellt tillgängliga kit och utrustning, har Western blotting metoder alltmer standardiseras och förenklas genom åren. Tekniken utförs faktiskt nu lätt av forskare med varierande bakgrunder och nivåer av erfarenhet. Men som med många liknande experimentella tekniker, påverkas resultatet av Western blot analyser lätt av val som gjorts i utformning och utförande av experimentet. Det är därför viktigt att tillgängligheten till standardiserade Western blotting metoder inte skymma behovet av noggrann experimentell planering och design. Experimentell överväganden inkluderar, men är inte begränsat till, prov förberedelse och hantering, urval och validering av antikroppar för protein upptäckt och gel-till-membran överföring effektivitet av särskilt små eller stora (< 10 eller > 140 kDa) proteiner4,5,6,7,8,9. Protein kvaliteten på det ursprungliga provet spelar en betydande roll för resultatet av den efterföljande Western blot-analysen. Som protein kan extraheras från en mängd olika prover och källor, inklusive cellinjer, vävnader från djurmodeller och post mortem mänskliga vävnader, krävs konsekvens i hantering och bearbetning för att erhålla reproducerbara resultat. Till exempel när långsiktig lagring av prover för protein utvinning krävs, är det viktigt att inse att, även om protein är generellt stabil vid-80 ° C, skillnader i protein stabilitet mellan extraherade proteiner och intakta vävnader vid-80 ° C har varit rapporterade10. Dessutom för att erhålla reproducerbara uppskattningar av kvantiteter som protein, är konsekvent homogenisering av prov avgörande. Optimera olika lysis buffertar och homogenisering metoder (t.ex. manuell homogenisering jämfört med automatiserade metoder) kan krävas innan ett storskaligt kvantitativa experiment.

Normalisering-strategier för att korrigera för protein lastning och kvantifiering variabilitet är viktiga att få robust, kvantitativa resultat av proteinuttryck. Städning proteiner som β-aktin, har α-tubulin, β-tubulin och glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) traditionellt använts till att normalisera proteinnivåer för kvantifiering. Normalisering till specifika städning proteiner för kvantifiering ändamål har dock kritiserats alltmer under de senaste par år11,12. Till exempel kan uttrycket av städning proteiner ändra över olika utvecklingsstadier13,14, över vävnader från samma djur4, och enligt olika sjukdom villkor4,15 ,16,17. Därför, användningen av specifika städning proteiner begränsar möjligheterna att göra mer komplexa jämförelser mellan proteinuttryck från olika vävnader, vid olika tidpunkter och under varierande försöksbetingelser. Ett alternativ till städning proteiner till kontroll för protein lastning variation är användningen av en totalt protein fläck (TPS) som etiketter och visualiserar alla proteiner i en provet. TPS tillåter signal normalisering baserat på totalprotein belastning i stället för att nivåerna av ett specifikt protein och därför kvantifiering av TPS signal bör vara jämförbara och reproducerbara oavsett experimentella villkor, Provtyp eller utvecklingsmässiga tidpunkt . Ponceau S, fläck-fri geler, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black och Cy5 (ses i ref. 18) är exempel på totalt proteinfläckar. Dessa metoder har särskilda fördelar och begränsningar och val av metod beror på tiden och verktygen samt de experiment4,18.

Förutom att använda en TPS för att korrigera för inom-membran lastning och kvantifiering variabilitet, kan det vara nödvändigt att jämföra prover mellan olika membran, särskilt när du utför storskaliga proteinanalys uttryck. Variabilitet i faktorer såsom antikropp bindande effektivitet och totalt protein fläcken intensitet kan dock införa ytterligare variabilitet mellan protein prover som analyseras på separata geler och membran. För robust kvantifiering i denna situation är det därför nödvändigt att införa ett ytterligare normalisering steg för mellan-membran variabilitet. Detta kan uppnås genom en intern lastning standard på varje separat analyserade membran som hålls konstant över experiment. Denna standard kan ta form av något protein lysat som kan erhållas i tillräckliga mängder för att användas över alla membran ingår i experimentet. Här använder vi en lysate av mus hjärnan (erhålls från 5 dagar gamla kontroll möss), som hjärnan är lätt homogeniseras och proteinet erhållna lysate innehåller en betydande mängd protein på en hög koncentration. Laddar en intern standard i tre exemplar kan prover på separata membran ska normaliseras och jämförs direkt.

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll som vi har utvecklats för att tillåta oss att genomföra komplexa jämförelser av protein uttryck variation mellan olika vävnader, mus-modeller (inklusive sjukdomsmodeller) och utvecklingsmässiga tidpunkter19. Genom att kombinera en fluorescerande TPS med användning av en intern lastning standard, kunde vi övervinna befintliga begränsningar i antalet prover och experimentella förhållanden som kan jämföras inom ett enda experiment. Detta tillvägagångssätt utökar användningen av traditionella Western blot teknik, vilket innebär att forskare att utforska proteinuttryck i olika vävnader och prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vävnader för detta förfarande erhölls från djurstudier som godkändes av den interna etiska kommittén vid universitetet i Edinburgh och utfördes i överensstämmelse med institutionella och UK Home Office föreskrifter under ledning av relevanta personliga och projektet licenser.

Obs: Detta protokoll har optimerats med hjälp av standardiserade, kommersiellt tillgängliga kit och reagenser för att öka reproducerbarhet (se Tabell för material).

1. preparation av prover

  1. Protein utvinning
    1. Överföring snapin-fryst cell- eller vävnadsprover från-80 ° C på torris, Tina på is, och tvätta som krävs med is kallt 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (för information om vävnader och PBS tvättar, se tabell 1). Undvik onödig frysning-tining cykler eftersom detta påverkar proteinkvalitet.
    2. Lägga till radioimmunoprecipitation (RIPA) analysbuffert (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS) som innehåller 1 x proteashämmare till varje prov, använder den optimala mängden per vävnad vikt (se tabell 1 för rekommendationer).
      Obs: Beroende på programmet, typ och mängd av homogenisering buffert behöva ytterligare optimering.
    3. Använda en handhållen elektrisk Homogenisatorer med en polypropylen mortelstöten för att homogenisera vävnadsprover. Mellan varje prov, tvätta mortelstöten i dubbeldestillerat vatten och torka med en ren trasa. Ändra mortelstöten mellan olika experimentella förhållanden och vävnader.
    4. Lämna prover på is för 10 min efter homogenisering. Centrifugera proverna på > 10.000 x g vid 4 ° C i 10 min.
    5. Överför supernatanten till en ny tub på isen utan att störa pelleten. Supernatanten är protein provet. Lagra de extraherade proteinet vid-80 ° C eller direkt fortsätta att mäta protein koncentrationen.
  2. Kvantifiering och normalisering av proteinkoncentration
    1. Mätning av protein koncentrationen med en bicinchoninic syra (BCA) analys. Förbereda en BCA assay blandning enligt tillverkarens instruktioner i en 96 brunnar optiska tallrik med BCA mix 200 µL per brunn.
      Obs: Andra kvantifiering metoder såsom Lowry och Bradford analyser kan också användas för att bestämma proteinkoncentration så länge proteinkoncentration kvantifieras konsekvent över experiment.
    2. Förbereda bovint serumalbumin (BSA) standarder på ökande koncentrationer i tre exemplar och tillsätt 1 µL av varje protein prov i två exemplar. Inkubera i plattan med 96 brunnar i en förvärmd värme block vid 60 ° C i 10 min eller längre om protein koncentrationen förväntas vara låg.
    3. Efter inkubation, mäta upptaget på 560 nm med en spektrofotometer.
    4. Exportera plate reader mätningarna och beräkna protein koncentrationen genom att jämföra genomsnittliga absorptionsvärdena för varje prov som en standardkurva erhålls med hjälp av protein-standarden. R-kvadratvärdet för standardkurvan bör vara större än eller lika med 0,98 att korrekt uppskatta prov proteinkoncentration.
    5. Normalisera mängden protein genom att förbereda utspädningar av protein prover i provet buffert och ultrarent vatten. Den totala volymen kan justeras beroende på vilken typ av gel används. Laddar 30 µg protein per körfält som ett utgångsbelopp rekommenderas. Lägg till reduktionsmedel såsom Ditiotreitol (DTT; slutlig koncentration 5 mM) eller beta-merkaptoetanol (slutlig koncentration 200 mM) för varje prov som krävs. Pipettera outspädd beta-merkaptoetanol i dragskåp.
    6. Inkubera proverna i en värme block vid 70 ° C i 10 min. sätta proverna på is, vortex och spinn ner kort för att samla. Hålla på is tills lastning gelen.

2. gel-elektrofores av proteiner prover

  1. Enhet och gel ställa in
    1. Setup förtillverkade 4 – 12% Bis-Tris toning gel (se Tabell för material) i gelelektrofores kammare systemet. Skölj de geler med dubbeldestillerat vatten före användning.
      Obs: Beroende på storlek, interaktioner och överflöd av proteinet av intresse, geler med olika lutning, buffring agent eller väl storlek och antal kan användas.
    2. Tillsätt 500 mL 1 x MES SDS kör buffert utspätt i dubbeldestillerat vatten per tank. Ta försiktigt bort kammen från gelerna efter tillägger rinnande bufferten utan att störa brunnarna i stapling gelen.
  2. Protein lastning
    1. Ladda 3,5 µL av ett protein som är standard i brunnen. Beroende på provet layouten, kan laddar en protein stege på båda sidor av gelen stöd i mer exakt beräkna protein storlek. Använd spetsig gel lastning tips för mer exakt prov lastning.
    2. När du använder en intern standard för mellan-membran normalisering (se steg 5 nedan och diskussion), lasta ett belopp som är lika med de andra proverna i första 3 brunnar bredvid protein stegen.
    3. Ladda 30 µg av varje prov i återstående brunnarna. Tillsätt 1 x provet buffert till alla tomma brunnar.
  3. Elektrofores
    1. Montera gel tanken efter lastning proverna. Kör exemplen genom stapling gelen på 80 V för 10 min följt av 150 V för en ytterligare 45-60 min.

3. protein överföring

Obs: Protein överföring i detta protokoll utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängliga halvtorr blotting system (se Tabell för material) för snabb och konsekvent resultat.

  1. Förbereda protein överföringen genom före blötläggning filterpapper i dubbeldestillerat vatten och säkerställa gel kniven, plast Pasteur pipett, blotting rullen och tången är redo att använda.
  2. Öppna överföring stacken genom att noggrant avlägsna alla wrapping folie. Ta bort toppen från botten stacken och ställ det åt sidan. Snabbt fukta membranet i botten stacken med flera droppar av elektrofores kör buffert (2-3 mL). När överföringen stacken är öppen, är det viktigt att förhindra PVDF membranet från att torka ut.
  3. Efter avslutad elektrofores, öppna förtillverkade gelen med gel kniven och skära av stapling gelen. Klipp gelen runt dess kanter att frigöra den från den plastiska gjuten. Hålla gel kniven våt för att förhindra skador till gelen.
  4. Montera överföring stacken från botten till toppen: botten stack (innehållande PVDF membranet), protein gel, filtrerpapper. Använda blotting rullen för att avlägsna alla luftbubblor. Placera den översta stacken ovanpå pappersfiltret och rulla igen för att avlägsna luftbubblor. Skjut inte alltför starkt eftersom detta kan orsaka gelen att deformera under protein överföra.
  5. Överför hela traven till överföringsenheten med elektroden på vänster sida av enheten och placera gel svampen ovanpå stacken så att det ligger i linje med de motsvarande elektriska kontakterna på enheten. Stäng locket och välj Starta lämpligt program (20 V för 7 min är en rekommenderad utgångspunkt).
  6. När du är klar lämna locket stängt i 2 min så att stacken svalna och förhindrar uttorkning av membranet. Ta bort överföring pappersbunten och skär membranet till gel storlek. Tvätta klippa membranet snabbt med dubbeldestillerat vatten innan du fortsätter med totalprotein fläcken.

4. totalt protein färgning

Obs: Med hjälp av fluorescerande upptäckt ger en betydande fördel över mer traditionella metoder (t.ex. ECL detection), som den linjära räckvidd och känslighet kan vara mycket bättre kontrollerad4. Därför, i steg 4 och 5, en fluorescerande TPS och fluorescerande sekundära antikroppar används (se Tabell för material).

  1. Rulla membranet till en 50 mL tub med protein vänd inåt. På grund av ljuskänslighet av fluorescerande TPS och sekundära antikroppar utförs alla efterföljande steg i mörkret.
  2. Tillsätt 5 mL av protein fläcken lösning (se Tabell av material) och inkubera i en roller för 5 min i rumstemperatur. Eftersom TPS och tvättbuffert innehåller metanol, bedriva dessa steg i dragskåp.
  3. Kassera färgningslösningen och tvätta två gånger snabbt med de 5 mL tvättlösning (6,3% ättiksyra i 30% metanol). Placera röret kort tillbaka på rullen mellan tvätta stegen. Skölj membranet kort med ultrarent vatten innan du fortsätter.

5. blockering, antikropp inkubation och upptäckt

  1. Blockerar membranet: tillsätt 3 mL blockerande buffert (se Tabell för material) till 50 mL röret som innehåller membranet. Inkubera membranet på en rulle i 30 min i rumstemperatur. Beroende på valet av antikroppen kräva vilken typ av blockerande buffert används optimering.
  2. Primär antikropp inkubation
    1. Kassera blockering buffert och ersätta med primära antikroppen på lämpliga, optimerad koncentration (figur 1 och figur 2: mus-anti-SMN, på 1:1, 000, utspädd i blockerande buffert).
      Observera: Lämplig optimering av primära antikroppar bör omfatta bekräftelse att antikroppen detekterar en proteinprodukt i rätt storlek samtidigt visar ingen eller minimal bindning till andra, ospecifikt proteinprodukter. Om möjligt, testa och jämföra flera antikroppar mot proteinet av intresse.
    2. Inkubera membranet på en rulle över natten vid 4 ° C. Nästa dag, ta bort antikropp lösningen och tvätta 6 gånger för 5 min med 1 x PBS på en rulle i rumstemperatur (RT).
  3. Sekundära antikroppar inkubation
    1. Förbereda den specifika sekundära antikroppen på 1:5,000 mot värd för den primära antikroppen i 5 mL blockerande buffert. Andra sekundära antikroppar kan kräva andra utspädningar eller användning av alternativa blockerande buffertar.
    2. Inkubera membranet med sekundär antikropp lösningen på en roller för 1 h på RT. Efter inkubation, tvätta membranet tre gånger 30 min med 1 x PBS på en rulle.
    3. Torka membranet och hålla membranet skyddas från ljus med aluminiumfolie tills upptäckt. Membran kan förvaras vid 4 ° C för långtidsförvaring.
  4. Bild förvärv
    1. Logga in på datorn som är ansluten till skannern. Placera membranet på skannern med protein vänd och välj skanningsområdet i programvaran.
    2. Optimera laser intensitet för båda (700 nm och 800 nm) kanaler, genom att bekräfta ingen mättnad uppstår. Förvärva bilderna i båda kanalerna och exportera bilderna för vidare analys (steg 6).

6. Western blot analys och kvantifiering

Obs: Dessa rekommendationer är baserade på programvaran Image Studio fritt tillgängliga. Dock jämförbara analyser kan också göras med hjälp av andra mjukvarupaket, såsom ImageJ.

  1. Importera filen: skapa en lokal arbetsyta på datorn som används för analys. Detta genererar en databas över bildfiler för förvärvade western blotting. Importera filer erhålls på skannern och välj bild för analys.
  2. TPS analys
    1. Visa 700 nm kanal för att visa det totala proteinet färgning resultat. Ett exempel på en TPS bild ingår i figur 1 i vilken olika vävnader från neonatal (P5) (figur 1A-B) och 10 - vecka gamla möss (Figur 1 C-D) jämförs direkt. Likaså, figur 2 visar ett exempel på en direkt jämförelse av hjärnvävnad från möss i olika åldrar.
    2. Välj analys fliken från övre högra hörnet och välj Lägga till rektangel för att definiera området av intresse för normalisering (figur 1B, D). Kopiera och klistra in den första rektangel området på varje enskilt prov att säkerställa regionen definierad är i samma storlek för alla analyserade körfält.
    3. Kopiera resultatet från fliken former i det nedre vänstra hörnet av programvaran.
  3. Rapporteringsgräns
    Obs: Den optimala strategin för att kvantifiera prover beror på experimentell design. Vi kommer här ge ett belysande exempel på detektion av överlevnad motorneuronen proteinet (Smn; en viktig protein som deltar i neuromuskulär sjukdom spinal muskelatrofi20,21), som är kända för att minska över tid 19 och hur normalisering av Smn signalintensitet till TPS ger tillförlitliga uppskattningar av protein uttryck utveckling.
    1. Figur 2 visar en minskning av Smn uttryck med ökande ålder med TPS för djuret som protein lastning kontroll. Upprepa steg 6.2.1-6.2.3 för att kvantifiera protein lastning (figur 2B). Upprepa steg 6.2.1-6.2.3 i kanalen 800 nm (figur 2A) för att analysera proteinet av intresse.
    2. Kopiera resultatet från både TPS och protein sevärdheter till ett kalkylprogram. På kalkylbladet, först normalisera proteinet lastning genom att bestämma den högsta TPS-signalen och dividera varje TPS signalera värdet av detta värde att få proteinet normaliserade lastning värde.
    3. Dela upp 800 nm signalvärdet från varje enskilt prov av dess motsvarande normaliserade protein värde att beräkna den relativa proteinkvot uttryck i olika prover.
    4. Efter den första normaliseringen, jämföra olika tidpunkter eller vävnader till det genomsnittliga värdet av den interna standarden att möjliggöra direkta jämförelser över olika membran och experiment.

7. statistik

  1. För att fastställa några statistiskt signifikanta skillnader i proteinuttryck över komplexa och stora grupper av prover, krävs lämpliga statistiska metoder. Även om en detaljerad diskussion av statistiska bakgrund går utanför ramen för denna uppsats, vill vi lyfta fram flera överväganden och detalj en framgångsrik strategi att vi har använt tidigare19.
  2. När det gäller många experiment representerar protein kvantifiering mätningarna inte helt oberoende uppgifter. Här, till exempel erhålls flera vävnader allmänhet från enstaka djur att bestämma proteinnivåer över flera organ vid en enda experimentell tid-punkt. Därför använde vi en blandade effekter modeller för att analysera skillnader i proteinuttryck över tid och mellan vävnader.  I allmänhet, ger blandade effekter modeller ett effektivt sätt ta itu med icke-självständighet och därmed undvika pseudo replikering22,23. I förevarande fall öka blandade effekter modeller statistiska styrkan av redovisning för upprepade mätningar bland vävnader, inom individer. Vi använder statistiska programpaketet R för att utföra dessa analyser, eftersom detta är fritt tillgänglig och mångsidig. Dock kan andra kommersiellt tillgängliga paket kunna utföra liknande analyser.
  3. Den nuvarande experimentell designen innebär en ”split plot” design eftersom varje mus tillhörde bara en åldersgrupp. Därför modelleras vi enskilda möss (mus-ID) som en slumpmässig effekt med en unik identifierare; Vi stod också för vävnad, ålder och deras interaktion som fasta effekter. Vi modellerade data med hjälp av funktionen lmer i R-biblioteket, lme4. Som kvalitetskontroll steg vi visualiseras residualer att bedöma antagandena om lika varians och en normalfördelning och förvandlade data vid behov att möta dessa antaganden. För att testa för en signifikant interaktion mellan vävnad och ålder, passar vi en identisk modell som saknade denna interaktion, och jämfört med de modeller som använder parametriska bootstrapping (R funktion PBmodcomp i biblioteket, pbkrtest).  Där uppstod signifikanta interaktioner, använde vi den funktion emmeans (i emmeans R biblioteket) att fastställa orsaken till interaktionen.  Till exempel, jämförde vi genomsnittlig uttryck bland klasser inom varje vävnad; en signifikant interaktion kan uppstå mellan ålder och vävnad om, säg, två givna åldersklasser skilde sig för en vävnad men inte en annan. Sammanfattningsvis ger dessa synsätt ett sätt att förlänga robustheten av slutsatser från western blot experiment genom statistiska stöd till dessa resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har exempel på användning av TPS och intern standard för att underlätta jämförelser av proteinnivåer över vävnader och tidpunkter. Figur 1 visar resultat från Western blotting på protein som utvinns ur vävnaderna från neonatal (postnatal dag 5) jämfört med vuxna möss (10 - vecka gammal). TPS och Smn immunoblot visas i figur 1A, C. Kvantifiering av fluorescensintensiteten hos TPS uppnåddes genom att mäta fluorescensintensiteten inuti rutan rektangel på varje lane och dess resultat visas i tabellerna i figur 1B och 1 D. Observera att prover från olika vävnader kännetecknas av olika TPS protein band mönster och det är därför nödvändigt att använda hela körfältet för normalisering ändamål. Verkligen, när hela körfält analyseras, fluorescensintensiteten fortfarande relativt liknande över prover, som anger TPS för normalisering är lämpliga för detta ändamål. Intern standard bestående av en P5 hjärnan lysate blandning ingick också för att illustrera hur det kan användas för ytterligare jämförelser mellan olika membran. I figur 2visar vi dessutom hur en fluorescerande TPS kan användas för att jämföra proteinnivåer vid olika utvecklande tidpunkter. Här visar vi Smn nivåer i hjärnan lysates från neonatal (P5), avvänjning ålder (P20) och vuxen (10W) möss (figur 2A). Även om Smn nivåer tydligt minskar med åldern, förblir TPS kvantifiering konstant som illustreras i figur 2B.

Figure 1
Figur 1. Western blotting visar TPS och Smn proteinnivåer i mus vävnader vid två olika åldrar. TPS och Smn protein för P5 (A) och 10 veckor gamla (C) möss. (B, D) Fluorescensintensiteten hos hela-lane TPS beräknades och indikeras (i godtyckliga enheter). M: markör och protein standard; kDa: kilodalton; a.u.: godtyckliga enhet; P5: a postnatala dagen 5; 10W: 10 veckor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Analys av Smn uttryck i mus vävnader vid olika tidpunkter för utvecklingstoxicitet. (A) hjärnan lysates från vävnad från P5, P20 och 10 veckor gamla möss analyserades med hjälp av TPS (övre panelen) och SMN (nedre panelen). (B) fluorescensintensiteten hos TPS beräknades och indikeras i godtyckliga enheter. M: markör och protein standard; kDa: kilodalton; a.u.: godtyckliga enhet; P5: a postnatala dagen 5; P20: a postnatala dagen 20; 10W: 10 veckor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Vävnad Ca vikt * 1xPBS tvätta (4 ° C) Upprepa wash Homogeniserande buffert **
Ryggmärgen 40 mg 150 mL 3 x 100 mL
Muskel (GC) 20 mg 150 mL 3 x 100 mL
Hjärnan 240 mg 400 mL 4 x 400 mL
Hjärtat 60 mg 400 mL 4 x 200 mL
Lever 130 mg 400 mL 4 x 400 mL
Njure 45 mg 400 mL 4 x 200 mL
* Dessa vikter är vägledande värden för vävnad som erhållits från P8 möss.
** Dessa volymer är indikationer och kan justeras ytterligare beroende vikten av vävnaden.

Tabell 1. Översikt av förväntade vävnader vikter och motsvarande rekommendationer för PBS tvättar och lysis buffert volym som ska användas för homogenisering. Vikterna är indikationer för vävnad som erhållits från postnatal dag 8 (P8) möss. PBS och lysis buffert volymer kan skalas upp och ner enligt experimentella behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med lämplig experimentell design, kontrollåtgärder och statistisk analys, kan western blotting användas för att göra tillförlitliga kvantitativa uppskattningar av proteinuttryck inom och mellan ett varierat utbud av biologiska prover. Det protokoll som vi beskriver i det nuvarande manuskriptet syftar till att tjäna som riktlinje för forskare som vill använda Western blotting för att genomföra kvantitativ analys över större och mer komplexa grupper av prover, med hjälp av en kombination av fluorescens-baserade identifieringsmetoder, totalt protein lastning normalisering och interna standarder. Även om fokus ligger på att fastställa och jämföra proteinuttryck från olika mus vävnader och i olika åldrar, kan detta synsätt också utvidgas till att jämföra proteinuttryck i andra försöksbetingelser.

Ett centralt steg i vår nuvarande protokoll är normalisering av proteiner av intresse för totalprotein laddas av kvantifiera en fluorescerande totalprotein fläck. TPS normalisering korrigerar för variation i provet lastning och felmarginaler i protein kvantifiering metoder. Men eftersom antalet protein prov som kan analyseras på ett enda membran är ofta begränsat, kan ytterligare normalisering krävas att jämföra flera membran. Faktiskt, variation mellan hur proteiner är identifierade på olika membran (på grund av till exempel antikropp inkubation tid eller temperatur variation) kan orsaka variation utöver som infördes genom lastning och kvantifiering steg i protokollet. Här, använder vi en intern standard som består av en enda protein lysate mix som är lastat i tre exemplar på varje gel och möjliggör jämförelse och normalisering mellan geler/membran. Teoretiskt, detta kan vara något protein urval så länge den kan göras i tillräckliga mängder så att samma prov kan användas för alla experiment. I vårt experiment använder vi en blandning av hjärnan protein lysates, eftersom hjärnan homogenates innehåller stora mängder protein och erhålls vanligtvis på en hög koncentration. Genomsnitt kvantifiering av tre exemplar standard bör ytterligare öka precisionen i kvantifieringar över membran och bidra till reproducerbarheten av experimentet.

Proteinnivåer kan bestämmas genom ett antal olika tekniker och att föredra beror på vilken provet analyseras och målet för experimentet. Reproducerbara kvantifiering av Western blot fungerar bäst i situationer där experimentella förhållanden kan vara väl kontrollerad, såsom när använda musen eller andra djurmodeller av definierade genetiska bakgrund. Däremot i många experiment med mänskliga patientprover, detta kan vara mindre genomförbara som ålder, genetiska variabilityen och vävnad provtagningstider är mycket svårare att kontrollera än i (djur) modellsystem. Tallrik-baserade tekniker såsom ELISA kanske passar bättre för dessa analyser, trots noggrann validering av antikropp specificitet är avgörande. Exempelvis i bräckliga X syndrom forskning, antikroppar har visat att upptäcka olika isoformer och när den används i ELISA detta skulle leda till överskattning av den totala mängden protein som ELISA avgör en signal för alla isoformer kombinerat24. Optimalt val för metoder för att bestämma proteinuttryck är därför prova beroende på sammanhanget, typ och forskningsfrågan att utreds.

Utföra adekvat statistisk analys är en förutsättning för tillförlitligheten av några slutsatser dras från kvantifiering av biologiska data. Statistiskt analysera komplexa data som genererats genom att jämföra olika vävnader, tid pekar eller andra experimentella förhållanden och kombinationer av dessa kan kräva mer avancerad statistisk modellering än ANOVA med post hoc-test kan leverera. För mer komplex statistisk modellering, som de blandade effekterna modell strategi, beskriver vi i det nuvarande manuskriptet, kan det vara lämpligt att söka ytterligare råd från biostatistiker. Adekvat statistisk analys av storskaliga proteinuttryck kan förbättra robustheten av resultaten och den pålitlighet och reproducerbarhet av resultat.

Sammanfattningsvis ger den experimentella metod som vi beskriver här en robust och reproducerbar metod för forskare som vill bestämma proteinuttryck med western blot i komplexa prover så att besvara nya och spännande forskningsfrågor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen konkurrerande intressen att avslöja.

Acknowledgments

E.J.N.G. stöds av Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Annan finansiering har lämnats av SMA Trust (SMA UK konsortiet. T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP i Precision Medicine (T.H.G., L.L. & ask.) och Euan MacDonald centrum för motorneuronsjukdom Disease Research (T.H.G).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Tipped Gel Loading Tips Alpha Laboratories GL20057SNTL
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL ThermoFisher Scientific 78437
Handheld homogeniser  VWR Collection 431-0100
iBlot 2 Gel Transfer Device ThermoFisher Scientific IB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size ThermoFisher Scientific IB401031
Image Studio Lite Licor N/A Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/
IRDye 800CW secondary antibodies Licor -- Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) ThermoFisher Scientific NP0001
Odyssey Blocking Buffer Licor 927-40000
Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody BD Transduction Laboratories 610646 Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number
REVERT Total Protein Stain, 250 mL  Licor 926-11021 
REVERT Wash Solution  Licor 926-11012 
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19, (11), 1887-1888 (2012).
  2. Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
  3. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  4. Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8, (8), e72457 (2013).
  5. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11, (5), 549-560 (2014).
  6. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379, (4), 409-412 (2009).
  7. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379, (4), 389-395 (2009).
  8. Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16, (2), 196-198, 200-192 (1994).
  9. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
  10. Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24, (11), 973-977 (2014).
  11. Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290, (50), 29692-29694 (2015).
  12. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55, (3), 217-226 (2013).
  13. Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37, (4), 630-634 (2016).
  14. Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7, (8), e43028 (2012).
  15. Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13, (11), 4546-4557 (2014).
  16. Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
  17. Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23, (12), 1794-1801 (2006).
  18. Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17, (20), (2017).
  19. Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27, (16), 2851-2862 (2018).
  20. Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. (2018).
  21. Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14, (4), 214-224 (2018).
  22. Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. Wiley-Interscience. (2004).
  23. Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16, (10), e2007054 (2018).
  24. LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7, (12), (2016).
Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).More

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter