Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting
Summary
Denna metod beskriver en robust och reproducerbar metod för jämförelse av proteinnivåer i olika vävnader och vid olika utvecklande tidpunkter med hjälp av standardiserade kvantitativa western blotting tillvägagångssättet.
Abstract
Western blotting är en teknik som ofta används för att påvisa och kvantifiera proteinuttryck. Under åren, har denna teknik lett till många framsteg inom både grundforskning och klinisk forskning. Men som med många liknande experimentella tekniker, påverkas resultatet av Western blot analyser lätt av val som gjorts i utformning och utförande av experimentet. Specifika städning proteiner har traditionellt använts till att normalisera proteinnivåer för kvantifiering, men dessa har ett antal begränsningar och har därför kritiserats alltmer de senaste åren. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll som vi har utvecklats för att tillåta oss att genomföra komplexa jämförelser av protein uttryck variation mellan olika vävnader, mus-modeller (inklusive sjukdomsmodeller) och utvecklingsmässiga tidpunkter. Med hjälp av en fluorescerande totalprotein fläck och införa användning av en intern lastning standard, är det möjligt att övervinna befintliga begränsningar i antalet prover som kan jämföras inom experiment och systematiskt jämföra proteinnivåer över en en rad experimentella förhållanden. Detta tillvägagångssätt utökar användningen av traditionella western blot teknik, vilket innebär att forskare att utforska proteinuttryck i olika vävnader och prover.
Introduction
Western blotting är en teknik som ofta används för att påvisa och kvantifiera proteinuttryck, inklusive i vävnad homogenates eller extrakt. Under åren, har denna teknik lett till många framsteg inom både grundforskning och klinisk forskning, där det kan användas som ett diagnostiskt verktyg för att identifiera förekomst av sjukdom1,2. Western blotting beskrevs första gången 1979 som en metod att överföra proteiner från polyakrylamidgeler till nitrocellulosa ark och därefter visualisera proteiner med hjälp av sekundära antikroppar som antingen radioaktivt märkta eller konjugerat med fluorescein eller peroxidas3. Genom utveckling av kommersiellt tillgängliga kit och utrustning, har Western blotting metoder alltmer standardiseras och förenklas genom åren. Tekniken utförs faktiskt nu lätt av forskare med varierande bakgrunder och nivåer av erfarenhet. Men som med många liknande experimentella tekniker, påverkas resultatet av Western blot analyser lätt av val som gjorts i utformning och utförande av experimentet. Det är därför viktigt att tillgängligheten till standardiserade Western blotting metoder inte skymma behovet av noggrann experimentell planering och design. Experimentell överväganden inkluderar, men är inte begränsat till, prov förberedelse och hantering, urval och validering av antikroppar för protein upptäckt och gel-till-membran överföring effektivitet av särskilt små eller stora ( 140 kDa) proteiner4,5,6,7,8,9. Protein kvaliteten på det ursprungliga provet spelar en betydande roll för resultatet av den efterföljande Western blot-analysen. Som protein kan extraheras från en mängd olika prover och källor, inklusive cellinjer, vävnader från djurmodeller och post mortem mänskliga vävnader, krävs konsekvens i hantering och bearbetning för att erhålla reproducerbara resultat. Till exempel när långsiktig lagring av prover för protein utvinning krävs, är det viktigt att inse att, även om protein är generellt stabil vid-80 ° C, skillnader i protein stabilitet mellan extraherade proteiner och intakta vävnader vid-80 ° C har varit rapporterade10. Dessutom för att erhålla reproducerbara uppskattningar av kvantiteter som protein, är konsekvent homogenisering av prov avgörande. Optimera olika lysis buffertar och homogenisering metoder (t.ex. manuell homogenisering jämfört med automatiserade metoder) kan krävas innan ett storskaligt kvantitativa experiment.
Normalisering-strategier för att korrigera för protein lastning och kvantifiering variabilitet är viktiga att få robust, kvantitativa resultat av proteinuttryck. Städning proteiner som β-aktin, har α-tubulin, β-tubulin och glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) traditionellt använts till att normalisera proteinnivåer för kvantifiering. Normalisering till specifika städning proteiner för kvantifiering ändamål har dock kritiserats alltmer under de senaste par år11,12. Till exempel kan uttrycket av städning proteiner ändra över olika utvecklingsstadier13,14, över vävnader från samma djur4, och enligt olika sjukdom villkor4,15 ,16,17. Därför, användningen av specifika städning proteiner begränsar möjligheterna att göra mer komplexa jämförelser mellan proteinuttryck från olika vävnader, vid olika tidpunkter och under varierande försöksbetingelser. Ett alternativ till städning proteiner till kontroll för protein lastning variation är användningen av en totalt protein fläck (TPS) som etiketter och visualiserar alla proteiner i en provet. TPS tillåter signal normalisering baserat på totalprotein belastning i stället för att nivåerna av ett specifikt protein och därför kvantifiering av TPS signal bör vara jämförbara och reproducerbara oavsett experimentella villkor, Provtyp eller utvecklingsmässiga tidpunkt . Ponceau S, fläck-fri geler, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black och Cy5 (ses i ref. 18) är exempel på totalt proteinfläckar. Dessa metoder har särskilda fördelar och begränsningar och val av metod beror på tiden och verktygen samt de experiment4,18.
Förutom att använda en TPS för att korrigera för inom-membran lastning och kvantifiering variabilitet, kan det vara nödvändigt att jämföra prover mellan olika membran, särskilt när du utför storskaliga proteinanalys uttryck. Variabilitet i faktorer såsom antikropp bindande effektivitet och totalt protein fläcken intensitet kan dock införa ytterligare variabilitet mellan protein prover som analyseras på separata geler och membran. För robust kvantifiering i denna situation är det därför nödvändigt att införa ett ytterligare normalisering steg för mellan-membran variabilitet. Detta kan uppnås genom en intern lastning standard på varje separat analyserade membran som hålls konstant över experiment. Denna standard kan ta form av något protein lysat som kan erhållas i tillräckliga mängder för att användas över alla membran ingår i experimentet. Här använder vi en lysate av mus hjärnan (erhålls från 5 dagar gamla kontroll möss), som hjärnan är lätt homogeniseras och proteinet erhållna lysate innehåller en betydande mängd protein på en hög koncentration. Laddar en intern standard i tre exemplar kan prover på separata membran ska normaliseras och jämförs direkt.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll som vi har utvecklats för att tillåta oss att genomföra komplexa jämförelser av protein uttryck variation mellan olika vävnader, mus-modeller (inklusive sjukdomsmodeller) och utvecklingsmässiga tidpunkter19. Genom att kombinera en fluorescerande TPS med användning av en intern lastning standard, kunde vi övervinna befintliga begränsningar i antalet prover och experimentella förhållanden som kan jämföras inom ett enda experiment. Detta tillvägagångssätt utökar användningen av traditionella Western blot teknik, vilket innebär att forskare att utforska proteinuttryck i olika vävnader och prover.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med lämplig experimentell design, kontrollåtgärder och statistisk analys, kan western blotting användas för att göra tillförlitliga kvantitativa uppskattningar av proteinuttryck inom och mellan ett varierat utbud av biologiska prover. Det protokoll som vi beskriver i det nuvarande manuskriptet syftar till att tjäna som riktlinje för forskare som vill använda Western blotting för att genomföra kvantitativ analys över större och mer komplexa grupper av prover, med hjälp av en kombination av fluorescens-baser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.J.N.G. stöds av Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Annan finansiering har lämnats av SMA Trust (SMA UK konsortiet. T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP i Precision Medicine (T.H.G., L.L. & ask.) och Euan MacDonald centrum för motorneuronsjukdom Disease Research (T.H.G).
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. . Applied longitudinal analysis. , (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
