Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting
Summary
Este método describe un enfoque robusto y reproducible para la comparación de los niveles de proteína en distintos tejidos y en diferentes puntos de tiempo del desarrollo usando un enfoque Blot western cuantitativo estandarizado.
Abstract
Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en investigación básica y clínica. Sin embargo, como con muchas técnicas experimentales similares, los resultados de los análisis de Western blot es fácilmente influenciado por decisiones en el diseño y ejecución del experimento. Proteínas específicas de limpieza se han utilizado tradicionalmente para normalizar los niveles de proteína para la cuantificación, sin embargo, éstos tienen una serie de limitaciones y por lo tanto han sido cada vez más criticados en los últimos años. Aquí, describimos un protocolo detallado que hemos desarrollado para que podamos llevar a cabo complejas comparaciones de la variación de expresión de proteínas en diferentes tejidos, modelos de ratón (incluyendo modelos de la enfermedad) y los puntos de tiempo del desarrollo. Mediante una tinción fluorescente proteína total e introduciendo el uso de un estándar interno de la carga, es posible superar las limitaciones existentes en el número de muestras que pueden compararse en experimentos y comparar sistemáticamente los niveles de la proteína a través de un rango de condiciones experimentales. Este enfoque amplía el uso de técnicas de inmunoblot tradicional, lo que permite a los investigadores explorar mejor expresión de la proteína a través de muestras y diferentes tejidos.
Introduction
Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína, incluyendo en homogenados de tejido o extractos. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en la investigación básica y clínica, donde puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para identificar la presencia de enfermedad1,2. Primero borrar occidental fue descrito en 1979 como un método para transferir proteínas de geles de poliacrilamida a hojas de nitrocelulosa y posteriormente visualizar las proteínas usando los anticuerpos secundarios que fueron radiactivo etiquetados o conjugados con fluoresceína o peroxidasa3. Mediante el desarrollo de kits disponibles en el mercado y el equipo, Western Blot métodos han sido cada vez más estandarizados y simplificadas sobre los años. De hecho, la técnica ahora es fácilmente realizada por científicos con diferentes orígenes y niveles de experiencia. Sin embargo, como con muchas técnicas experimentales similares, los resultados de los análisis de Western blot es fácilmente influenciado por decisiones en el diseño y ejecución del experimento. Es importante, por lo tanto, que la accesibilidad de métodos estandarizados de Blot Western no obscurecer la necesidad de una cuidadosa planificación experimental y diseño. Consideraciones experimentales incluyen, pero no limitada a, muestra la preparación y manipulación, selección y validación de anticuerpos para la detección de la proteína y la eficiencia de transferencia de gel a la membrana de particularmente grande o pequeño ( 140 kDa) proteínas4,5,6,7,8,9. Calidad de la proteína de la muestra original juega un papel importante en la determinación de los resultados de los análisis de Western blot posterior. Como proteína puede ser extraída de una gran variedad de muestras y de fuentes, incluyendo líneas celulares, tejidos de modelos animales y tejidos humanos post mortem, consistencia en el manejo y procesamiento es necesaria para obtener resultados reproducibles. Por ejemplo, cuando se requiere almacenamiento a largo plazo de muestras para la extracción de proteínas, es importante tener en cuenta que, aunque la proteína es generalmente estable a-80 º C, diferencias en la estabilidad de la proteína extraída de las proteínas y los tejidos intactos a-80 ° C han sido reportado10. Además, para obtener estimaciones reproducibles de cantidades de proteína, consecuente homogeneización de las muestras es crucial. Optimización de métodos de homogeneización (p. ej., homogeneización manual en comparación con métodos automatizados) y almacenadores intermediarios de la lisis diferentes puede ser necesario antes de comenzar un experimento a gran escala cuantitativo.
Estrategias de normalización para corregir la variabilidad de carga y la cuantificación de proteína son esenciales para obtener resultados robustos, cuantitativos de la expresión de la proteína. Servicio de limpieza tales como β-actina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), α-tubulina y β-tubulina han tradicionalmente utilizados para normalizar los niveles de proteína para la cuantificación. Sin embargo, normalización a las proteínas de limpieza específico para propósitos de cuantificación ha sido criticado cada vez más en el pasado pocos años11,12. Por ejemplo, puede cambiar la expresión de proteínas de limpieza a través de diferentes etapas de desarrollo13,14, a través de los tejidos del animal mismo4y bajo diversas enfermedades condiciones4,15 ,16,17. Por lo tanto, el uso de proteínas específicas de limpieza limita las posibilidades de realizar comparaciones más complejas entre la expresión de proteínas de diversos tejidos, en diferentes puntos de tiempo y bajo diferentes condiciones experimentales. Una alternativa a las proteínas de la limpieza a control para variación de la carga de la proteína es el uso de un colorante de proteínas totales (TPS) que las etiquetas y visualiza todas las proteínas presentes en una muestra. TPS permite la normalización de la señal en base a proteína total carga en lugar de niveles de una proteína específica y por lo tanto la cuantificación de la señal TPS deben ser comparables y reproducibles independientemente de la condición experimental, tipo de muestra o punto de tiempo del desarrollo . Ejemplos de manchas de proteína total incluyen Ponceau S, geles mancha-libre, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black y Cy5 (revisado en Ref. 18). Cada uno de estos métodos tiene limitaciones y ventajas específicas y selección del método depende del tiempo y las herramientas disponibles así como la disposición experimental4,18.
Además de utilizar un TPS para corregir para la carga dentro de la membrana y variabilidad de cuantificación, puede ser necesario comparar muestras entre diferentes membranas, particularmente cuando se realiza el análisis de expresión de proteínas a gran escala. Sin embargo, variabilidad en los factores tales como eficiencia y total intensidad de tinción de proteínas de unión del anticuerpo puede introducir mayor variabilidad entre las muestras de proteína que se analizan en diferentes geles y membranas. Para la cuantificación sólida en esta situación, por lo tanto es necesario introducir un nuevo paso de normalización para tener en cuenta la variabilidad entre la membrana. Esto puede lograrse mediante la inclusión de una norma interna de la carga en cada una de las membranas analizadas por separado que se mantiene constante a través de experimentos. Esta norma puede tomar la forma de cualquier proteína lisada que puede obtenerse en cantidad suficiente para usarse en todas las membranas en el experimento. Aquí, utilizamos un lisado de cerebro de ratón (Obtenido de los ratones de control 5 días de edad), como cerebro fácilmente está homogeneizado y la proteína obtenida lisada contiene una cantidad significativa de proteína en alta concentración. Carga estándar interno por triplicado permite muestras en separar las membranas a ser normalizado y comparadas directamente.
Aquí, describimos un protocolo detallado que hemos desarrollado para que podamos llevar a cabo complejas comparaciones de la variación de expresión de la proteína a través de diferentes tejidos, modelos de ratón (incluyendo modelos de la enfermedad) y los puntos de tiempo del desarrollo19. Combinando un TPS fluorescente con el uso de un estándar interno de la carga, hemos sido capaces de superar las limitaciones existentes en el número de muestras y condiciones experimentales que pueden compararse en un solo experimento. Este enfoque amplía el uso de técnicas tradicionales de Western blot, lo que permite a los investigadores explorar mejor expresión de la proteína a través de muestras y diferentes tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el diseño experimental adecuado, medidas de control y análisis estadístico, el borrar occidental puede utilizarse para hacer estimaciones cuantitativas fiables de expresión de la proteína dentro de y entre una gran variedad de muestras biológicas. El protocolo que se describe en el manuscrito actual pretende servir de guía para los investigadores que buscan para utilizar el Western blot para llevar a cabo análisis cuantitativo a través de grupos más grandes y más complejos de muestras, usando una combinaci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.J.N.G. es apoyado por el Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Otros fondos han sido facilitados por el SMA Trust (Consorcio de Reino Unido de SMA; T.H.G. & Y-T. H.), Europa de SMA (T.H.G, D.v.D.H. y E.J.N.G.), el DTP de la Universidad de Edimburgo en medicina precisión (T.H.G., L.L. & a.m.m.) y el centro de Euan MacDonald para la investigación de la enfermedad de neurona motora (T.H.G).
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
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