ऊतकों में प्रोटीन के स्तर की मजबूत तुलना और विकास के दौरान मानकीकृत मात्रात्मक पश्चिमी Blotting का उपयोग
Summary
यह विधि विभिन्न ऊतकों में प्रोटीन के स्तर की तुलना के लिए और एक मानकीकृत मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए विभिन्न विकासात्मक timepoints पर एक मजबूत और reproducible दृष्टिकोण का वर्णन करता है ।
Abstract
पश्चिमी सोख्ता एक तकनीक है कि सामांयतः का पता लगाने और प्रोटीन अभिव्यक्ति मात्रा का उपयोग किया जाता है । पिछले कुछ वर्षों में, इस तकनीक के दोनों बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान में कई अग्रिमों के लिए नेतृत्व किया गया है । हालांकि, के रूप में कई इसी तरह की प्रयोगात्मक तकनीकों के साथ, पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के परिणाम आसानी से डिजाइन और प्रयोग के निष्पादन में किए गए विकल्पों से प्रभावित है । विशिष्ट हाउसकीपिंग प्रोटीन परंपरागत रूप से quantification के लिए प्रोटीन के स्तर को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, तथापि, इन सीमाओं के एक नंबर है और इसलिए पिछले कुछ वर्षों में तेजी से आलोचना की गई है. यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि हम हमें विभिंन ऊतकों, माउस मॉडल (रोग मॉडल सहित), और विकासात्मक timepoints भर में प्रोटीन अभिव्यक्ति भिंनता की जटिल तुलना शुरू करने की अनुमति विकसित किया है का वर्णन । एक फ्लोरोसेंट कुल प्रोटीन दाग का उपयोग करके और एक आंतरिक लोडिंग मानक का उपयोग शुरू करने, यह नमूनों की संख्या में मौजूदा सीमाओं पर काबू पाने के लिए संभव है कि प्रयोगों के भीतर की तुलना में किया जा सकता है और व्यवस्थित एक भर में प्रोटीन के स्तर की तुलना प्रायोगिक शर्तों की श्रेणी । इस दृष्टिकोण पारंपरिक पश्चिमी ब्लॉट तकनीकों का उपयोग फैलता है, जिससे शोधकर्ताओं बेहतर विभिंन ऊतकों और नमूनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने की अनुमति ।
Introduction
पश्चिमी सोख्ता एक तकनीक है कि सामांयतः का पता लगाने और प्रोटीन अभिव्यक्ति, ऊतक homogenates या निष्कर्षों में शामिल मात्रा का उपयोग किया जाता है । पिछले कुछ वर्षों में, इस तकनीक के दोनों बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान, जहां यह रोग1,2की उपस्थिति की पहचान करने के लिए एक नैदानिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता में कई अग्रिमों के लिए नेतृत्व किया गया है । पश्चिमी सोख्ता पहले १९७९ में एक विधि के रूप में वर्णित किया गया था polyacrylamide जैल से प्रोटीन स्थानांतरण करने के लिए नाइट्रो-सेलुलोज चादरें और बाद में माध्यमिक एंटीबॉडी है कि या तो रेडियोएक्टिव लेबल या fluorescein करने के लिए संयुग्मित थे का उपयोग प्रोटीन कल्पना या peroxidase3। वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध किट और उपकरणों के विकास के माध्यम से, पश्चिमी सोख्ता तरीकों तेजी से मानकीकृत किया गया है और वर्षों से सरलीकृत । दरअसल, तकनीक अब आसानी से अलग पृष्ठभूमि और अनुभव के स्तर के साथ वैज्ञानिकों द्वारा किया जाता है । हालांकि, के रूप में कई इसी तरह की प्रयोगात्मक तकनीकों के साथ, पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के परिणाम आसानी से डिजाइन और प्रयोग के निष्पादन में किए गए विकल्पों से प्रभावित है । यह महत्वपूर्ण है, इसलिए, कि मानकीकृत पश्चिमी सोख्ता तरीकों की पहुंच सावधान प्रयोगात्मक योजना और डिजाइन के लिए की जरूरत अस्पष्ट नहीं है । प्रयोगात्मक विचार शामिल हैं, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं, नमूना तैयार करने और हैंडलिंग, चयन और प्रोटीन का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के सत्यापन, विशेष रूप से छोटे या बड़े के जेल से झिल्ली स्थानांतरण दक्षता ( 140 केडीए) प्रोटीन4,5,6,7,8,9. मूल नमूना के प्रोटीन की गुणवत्ता के बाद पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के परिणाम का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । के रूप में प्रोटीन के नमूनों और स्रोतों की एक विस्तृत विविधता से निकाला जा सकता है, सेल लाइनों सहित, पशु मॉडल से ऊतकों, और पोस्टमार्टम मानव ऊतकों, हैंडलिंग और प्रसंस्करण में निरंतरता की आवश्यकता है reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए । उदाहरण के लिए, जब प्रोटीन निष्कर्षण के लिए नमूनों के दीर्घकालिक भंडारण की आवश्यकता होती है, तो यह समझना महत्वपूर्ण है कि, हालांकि प्रोटीन सामान्यत:-८० डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होता है,-८० डिग्री सेल्सियस पर निकाले गए प्रोटीन और अक्षुण्ण ऊतकों के बीच प्रोटीन स्थिरता में अंतर रिपोर्ट10. इसके अलावा, प्रोटीन की मात्रा की reproducible अनुमान प्राप्त करने के लिए, नमूनों की लगातार homogenization महत्वपूर्ण है । एक बड़े पैमाने पर मात्रात्मक प्रयोग शुरू करने से पहले अलग lysis बफ़र्स और homogenization विधियों (जैसे, मैनुअल homogenization स्वचालित विधियों की तुलना में) के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
सामान्यीकरण रणनीतियों प्रोटीन लोड हो रहा है और परिमाणीकरण परिवर्तनशीलता के लिए सही करने के लिए मजबूत, प्रोटीन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । हाउसकीपिंग प्रोटीन जैसे β-ऐक्टिन, α-ट्यूबुलीन, β-ट्यूबुलीन, और ग्लिसलडिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) का पारंपरिक रूप से मात्रा के लिए प्रोटीन के स्तर को सामान्य करने के लिए प्रयोग किया गया है । हालांकि, परिमाणीकरण प्रयोजनों के लिए विशिष्ट हाउसकीपिंग प्रोटीन को सामांयीकरण तेजी से पिछले कुछ वर्षों में आलोचना की गई है11,12। उदाहरण के लिए, हाउसकीपिंग प्रोटीन की अभिव्यक्ति विभिंन विकासात्मक चरणों में13,14, एक ही पशु4से ऊतकों में बदल सकते हैं, और विभिंन रोगों की स्थिति के तहत4,15 ,16,17. इसलिए, विशिष्ट हाउसकीपिंग प्रोटीन के उपयोग से विभिन्न ऊतकों से प्रोटीन अभिव्यक्ति के बीच और अधिक जटिल तुलना करने की संभावनाएं सीमित होती हैं, विभिन्न timepoints पर और बदलती प्रायोगिक स्थितियों के अंतर्गत । प्रोटीन को लोड करने के लिए नियंत्रण करने के लिए हाउसकीपिंग प्रोटीन के लिए एक विकल्प कुल प्रोटीन दाग (TPS) है कि लेबल और एक नमूना में मौजूद सभी प्रोटीन visualizes का उपयोग है । Tps एक विशिष्ट प्रोटीन के स्तर की बजाय कुल प्रोटीन लोड के आधार पर संकेत सामांयीकरण की अनुमति देता है और इसलिए टीपीएस संकेत के परिमाणन तुलनीय होना चाहिए और reproducible प्रयोगात्मक स्थिति की परवाह किए बिना, नमूना प्रकार या विकासात्मक timepoint . कुल प्रोटीन दाग के उदाहरण Ponceau एस, दाग मुक्त जैल, Coomassie आर-३५०, Sypro-रूबी, एपिकॉकोनोन, Amydo काले, और Cy5 (रेफरी. 18 में समीक्षित) शामिल हैं । इन विधियों में से प्रत्येक विशिष्ट लाभ और सीमाएं और विधि चयन समय और उपलब्ध उपकरणों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रयोगात्मक सेटअप4,18पर निर्भर करता है ।
एक tps का उपयोग करने के लिए के अलावा के भीतर-झिल्ली लोड हो रहा है और परिमाणन परिवर्तनशीलता के लिए सही करने के लिए, यह विभिन्न झिल्ली के बीच नमूनों की तुलना करने के लिए आवश्यक हो सकता है, विशेष रूप से जब बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन. तथापि, एंटीबॉडी बाइंडिंग दक्षता और कुल प्रोटीन दाग तीव्रता के रूप में कारकों में परिवर्तनशीलता प्रोटीन नमूनों कि अलग जैल और झिल्ली पर विश्लेषण कर रहे है के बीच आगे परिवर्तनशीलता का परिचय हो सकता है । इस स्थिति में मजबूत मात्रा के लिए, यह इसलिए एक और सामान्यीकरण कदम के बीच-झिल्ली परिवर्तनशीलता के लिए खाते को लागू करने के लिए आवश्यक है । यह एक अलग विश्लेषण झिल्ली है कि प्रयोगों में लगातार रखा जाता है में से प्रत्येक पर एक आंतरिक लोडिंग मानक को शामिल करके प्राप्त किया जा सकता है । यह मानक किसी भी प्रोटीन का रूप ले सकता है जो कि प्रयोग में शामिल सभी झिल्लियों में प्रयोग किए जाने वाले पर्याप्त मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है । यहां, हम माउस मस्तिष्क के एक lysate का उपयोग करें (5 दिन पुराने नियंत्रण चूहों से प्राप्त), के रूप में मस्तिष्क को आसानी से homogenized है और प्राप्त प्रोटीन lysate एक उच्च एकाग्रता पर प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण राशि शामिल हैं । तपसिल में एक आंतरिक मानक लोड अलग झिल्ली पर नमूनों की अनुमति देता है सामांयीकृत और सीधे तुलना में ।
यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हम हमें विभिंन ऊतकों, माउस मॉडल (रोग मॉडल सहित), और विकास timepoints19भर में प्रोटीन अभिव्यक्ति भिंनता की जटिल तुलना शुरू करने की अनुमति के लिए विकसित किया है । एक आंतरिक लोडिंग मानक के उपयोग के साथ एक फ्लोरोसेंट TPS के संयोजन से, हम नमूनों और प्रयोगात्मक स्थितियों है कि एक ही प्रयोग के भीतर की तुलना में किया जा सकता है की संख्या में मौजूदा सीमाओं को दूर करने में सक्षम थे । इस दृष्टिकोण पारंपरिक पश्चिमी ब्लॉट तकनीकों का उपयोग फैलता है, जिससे शोधकर्ताओं बेहतर विभिंन ऊतकों और नमूनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने की अनुमति ।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपयुक्त प्रयोगात्मक डिजाइन, नियंत्रण उपायों और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ, पश्चिमी सोख्ता के भीतर और जैविक नमूनों की एक विविध रेंज के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्वसनीय मात्रात्मक अनुमान बनाने के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.J.N.G. वेलकम ट्रस्ट (grant 106098/Z/14/Z) द्वारा समर्थित है । अंय धन SMA ट्रस्ट (SMA ब्रिटेन कंसोर्टियम द्वारा प्रदान की गई है; T.H.G. & Y-T. एच.), एसएमए यूरोप (टी. एच. जी., D.v.D.H. & E.J.N.G.), प्रेसिजन मेडिसिन में एडिनबर्ग डीटीपी की यूनिवर्सिटी (T.H.G., L.L. & A.M.M.), और यूआन मैकडोनाल्ड सेंटर फॉर मोटर न्यूरोन डिजीज रिसर्च (टी. एच. जी.).
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
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