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Biochemistry

ऊतकों में प्रोटीन के स्तर की मजबूत तुलना और विकास के दौरान मानकीकृत मात्रात्मक पश्चिमी Blotting का उपयोग

doi: 10.3791/59438 Published: April 9, 2019
* These authors contributed equally

Summary

यह विधि विभिन्न ऊतकों में प्रोटीन के स्तर की तुलना के लिए और एक मानकीकृत मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए विभिन्न विकासात्मक timepoints पर एक मजबूत और reproducible दृष्टिकोण का वर्णन करता है ।

Abstract

पश्चिमी सोख्ता एक तकनीक है कि सामांयतः का पता लगाने और प्रोटीन अभिव्यक्ति मात्रा का उपयोग किया जाता है । पिछले कुछ वर्षों में, इस तकनीक के दोनों बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान में कई अग्रिमों के लिए नेतृत्व किया गया है । हालांकि, के रूप में कई इसी तरह की प्रयोगात्मक तकनीकों के साथ, पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के परिणाम आसानी से डिजाइन और प्रयोग के निष्पादन में किए गए विकल्पों से प्रभावित है । विशिष्ट हाउसकीपिंग प्रोटीन परंपरागत रूप से quantification के लिए प्रोटीन के स्तर को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, तथापि, इन सीमाओं के एक नंबर है और इसलिए पिछले कुछ वर्षों में तेजी से आलोचना की गई है. यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि हम हमें विभिंन ऊतकों, माउस मॉडल (रोग मॉडल सहित), और विकासात्मक timepoints भर में प्रोटीन अभिव्यक्ति भिंनता की जटिल तुलना शुरू करने की अनुमति विकसित किया है का वर्णन । एक फ्लोरोसेंट कुल प्रोटीन दाग का उपयोग करके और एक आंतरिक लोडिंग मानक का उपयोग शुरू करने, यह नमूनों की संख्या में मौजूदा सीमाओं पर काबू पाने के लिए संभव है कि प्रयोगों के भीतर की तुलना में किया जा सकता है और व्यवस्थित एक भर में प्रोटीन के स्तर की तुलना प्रायोगिक शर्तों की श्रेणी । इस दृष्टिकोण पारंपरिक पश्चिमी ब्लॉट तकनीकों का उपयोग फैलता है, जिससे शोधकर्ताओं बेहतर विभिंन ऊतकों और नमूनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने की अनुमति ।

Introduction

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पश्चिमी सोख्ता एक तकनीक है कि सामांयतः का पता लगाने और प्रोटीन अभिव्यक्ति, ऊतक homogenates या निष्कर्षों में शामिल मात्रा का उपयोग किया जाता है । पिछले कुछ वर्षों में, इस तकनीक के दोनों बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान, जहां यह रोग1,2की उपस्थिति की पहचान करने के लिए एक नैदानिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता में कई अग्रिमों के लिए नेतृत्व किया गया है । पश्चिमी सोख्ता पहले १९७९ में एक विधि के रूप में वर्णित किया गया था polyacrylamide जैल से प्रोटीन स्थानांतरण करने के लिए नाइट्रो-सेलुलोज चादरें और बाद में माध्यमिक एंटीबॉडी है कि या तो रेडियोएक्टिव लेबल या fluorescein करने के लिए संयुग्मित थे का उपयोग प्रोटीन कल्पना या peroxidase3। वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध किट और उपकरणों के विकास के माध्यम से, पश्चिमी सोख्ता तरीकों तेजी से मानकीकृत किया गया है और वर्षों से सरलीकृत । दरअसल, तकनीक अब आसानी से अलग पृष्ठभूमि और अनुभव के स्तर के साथ वैज्ञानिकों द्वारा किया जाता है । हालांकि, के रूप में कई इसी तरह की प्रयोगात्मक तकनीकों के साथ, पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के परिणाम आसानी से डिजाइन और प्रयोग के निष्पादन में किए गए विकल्पों से प्रभावित है । यह महत्वपूर्ण है, इसलिए, कि मानकीकृत पश्चिमी सोख्ता तरीकों की पहुंच सावधान प्रयोगात्मक योजना और डिजाइन के लिए की जरूरत अस्पष्ट नहीं है । प्रयोगात्मक विचार शामिल हैं, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं, नमूना तैयार करने और हैंडलिंग, चयन और प्रोटीन का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के सत्यापन, विशेष रूप से छोटे या बड़े के जेल से झिल्ली स्थानांतरण दक्षता (< 10 या > 140 केडीए) प्रोटीन4,5,6,7,8,9. मूल नमूना के प्रोटीन की गुणवत्ता के बाद पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के परिणाम का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । के रूप में प्रोटीन के नमूनों और स्रोतों की एक विस्तृत विविधता से निकाला जा सकता है, सेल लाइनों सहित, पशु मॉडल से ऊतकों, और पोस्टमार्टम मानव ऊतकों, हैंडलिंग और प्रसंस्करण में निरंतरता की आवश्यकता है reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए । उदाहरण के लिए, जब प्रोटीन निष्कर्षण के लिए नमूनों के दीर्घकालिक भंडारण की आवश्यकता होती है, तो यह समझना महत्वपूर्ण है कि, हालांकि प्रोटीन सामान्यत:-८० डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होता है,-८० डिग्री सेल्सियस पर निकाले गए प्रोटीन और अक्षुण्ण ऊतकों के बीच प्रोटीन स्थिरता में अंतर रिपोर्ट10. इसके अलावा, प्रोटीन की मात्रा की reproducible अनुमान प्राप्त करने के लिए, नमूनों की लगातार homogenization महत्वपूर्ण है । एक बड़े पैमाने पर मात्रात्मक प्रयोग शुरू करने से पहले अलग lysis बफ़र्स और homogenization विधियों (जैसे, मैनुअल homogenization स्वचालित विधियों की तुलना में) के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।

सामान्यीकरण रणनीतियों प्रोटीन लोड हो रहा है और परिमाणीकरण परिवर्तनशीलता के लिए सही करने के लिए मजबूत, प्रोटीन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । हाउसकीपिंग प्रोटीन जैसे β-ऐक्टिन, α-ट्यूबुलीन, β-ट्यूबुलीन, और ग्लिसलडिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) का पारंपरिक रूप से मात्रा के लिए प्रोटीन के स्तर को सामान्य करने के लिए प्रयोग किया गया है । हालांकि, परिमाणीकरण प्रयोजनों के लिए विशिष्ट हाउसकीपिंग प्रोटीन को सामांयीकरण तेजी से पिछले कुछ वर्षों में आलोचना की गई है11,12। उदाहरण के लिए, हाउसकीपिंग प्रोटीन की अभिव्यक्ति विभिंन विकासात्मक चरणों में13,14, एक ही पशु4से ऊतकों में बदल सकते हैं, और विभिंन रोगों की स्थिति के तहत4,15 ,16,17. इसलिए, विशिष्ट हाउसकीपिंग प्रोटीन के उपयोग से विभिन्न ऊतकों से प्रोटीन अभिव्यक्ति के बीच और अधिक जटिल तुलना करने की संभावनाएं सीमित होती हैं, विभिन्न timepoints पर और बदलती प्रायोगिक स्थितियों के अंतर्गत । प्रोटीन को लोड करने के लिए नियंत्रण करने के लिए हाउसकीपिंग प्रोटीन के लिए एक विकल्प कुल प्रोटीन दाग (TPS) है कि लेबल और एक नमूना में मौजूद सभी प्रोटीन visualizes का उपयोग है । Tps एक विशिष्ट प्रोटीन के स्तर की बजाय कुल प्रोटीन लोड के आधार पर संकेत सामांयीकरण की अनुमति देता है और इसलिए टीपीएस संकेत के परिमाणन तुलनीय होना चाहिए और reproducible प्रयोगात्मक स्थिति की परवाह किए बिना, नमूना प्रकार या विकासात्मक timepoint . कुल प्रोटीन दाग के उदाहरण Ponceau एस, दाग मुक्त जैल, Coomassie आर-३५०, Sypro-रूबी, एपिकॉकोनोन, Amydo काले, और Cy5 (रेफरी. 18 में समीक्षित) शामिल हैं । इन विधियों में से प्रत्येक विशिष्ट लाभ और सीमाएं और विधि चयन समय और उपलब्ध उपकरणों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रयोगात्मक सेटअप4,18पर निर्भर करता है ।

एक tps का उपयोग करने के लिए के अलावा के भीतर-झिल्ली लोड हो रहा है और परिमाणन परिवर्तनशीलता के लिए सही करने के लिए, यह विभिन्न झिल्ली के बीच नमूनों की तुलना करने के लिए आवश्यक हो सकता है, विशेष रूप से जब बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन. तथापि, एंटीबॉडी बाइंडिंग दक्षता और कुल प्रोटीन दाग तीव्रता के रूप में कारकों में परिवर्तनशीलता प्रोटीन नमूनों कि अलग जैल और झिल्ली पर विश्लेषण कर रहे है के बीच आगे परिवर्तनशीलता का परिचय हो सकता है । इस स्थिति में मजबूत मात्रा के लिए, यह इसलिए एक और सामान्यीकरण कदम के बीच-झिल्ली परिवर्तनशीलता के लिए खाते को लागू करने के लिए आवश्यक है । यह एक अलग विश्लेषण झिल्ली है कि प्रयोगों में लगातार रखा जाता है में से प्रत्येक पर एक आंतरिक लोडिंग मानक को शामिल करके प्राप्त किया जा सकता है । यह मानक किसी भी प्रोटीन का रूप ले सकता है जो कि प्रयोग में शामिल सभी झिल्लियों में प्रयोग किए जाने वाले पर्याप्त मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है । यहां, हम माउस मस्तिष्क के एक lysate का उपयोग करें (5 दिन पुराने नियंत्रण चूहों से प्राप्त), के रूप में मस्तिष्क को आसानी से homogenized है और प्राप्त प्रोटीन lysate एक उच्च एकाग्रता पर प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण राशि शामिल हैं । तपसिल में एक आंतरिक मानक लोड अलग झिल्ली पर नमूनों की अनुमति देता है सामांयीकृत और सीधे तुलना में ।

यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हम हमें विभिंन ऊतकों, माउस मॉडल (रोग मॉडल सहित), और विकास timepoints19भर में प्रोटीन अभिव्यक्ति भिंनता की जटिल तुलना शुरू करने की अनुमति के लिए विकसित किया है । एक आंतरिक लोडिंग मानक के उपयोग के साथ एक फ्लोरोसेंट TPS के संयोजन से, हम नमूनों और प्रयोगात्मक स्थितियों है कि एक ही प्रयोग के भीतर की तुलना में किया जा सकता है की संख्या में मौजूदा सीमाओं को दूर करने में सक्षम थे । इस दृष्टिकोण पारंपरिक पश्चिमी ब्लॉट तकनीकों का उपयोग फैलता है, जिससे शोधकर्ताओं बेहतर विभिंन ऊतकों और नमूनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने की अनुमति ।

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Protocol

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इस प्रक्रिया के लिए ऊतक पशु अध्ययनों से प्राप्त किया गया है कि एडिनबर्ग विश्वविद्यालय में आंतरिक नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और प्रासंगिक के अधिकार के तहत संस्थागत और ब्रिटेन के गृह कार्यालय के नियमों के साथ क़बूल में प्रदर्शन किया गया व्यक्तिगत और प्रोजेक्ट लायसेंस ।

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है मानकीकृत, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट और अभिकर्मकों के क्रम में बढ़ाने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

1. नमूनों की तैयारी

  1. प्रोटीन निष्कर्षण
    1. स्थानांतरण स्नैप-जमे हुए सेल या ऊतक के नमूने से-८० ° c सूखी बर्फ पर, बर्फ पर गल, और के रूप में बर्फ ठंडा 1x फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) के साथ आवश्यक धोने (ऊतकों और PBS washes पर विवरण के लिए, तालिका 1देखें) । अनावश्यक फ्रीज-गल चक्र से बचें क्योंकि यह प्रोटीन की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा ।
    2. (25 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.६), १५० मिमी NaCl, 1% एनपी-४०, 1% सोडियम डिऑक्सीकोलेट, ०.१% एसडीएस) एक नमूना करने के लिए 1x protease अवरोध करनेवाला से युक्त, ऊतक वजन के प्रति इष्टतम राशि का उपयोग कर ( तालिका 1 देखने के लिए सिफारिशें) ।
      नोट: आवेदन के आधार पर, प्रकार और homogenization बफर की राशि और अधिक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
    3. एक हाथ से आयोजित एक polypropylene मूसल के साथ विद्युत homogenizer का उपयोग करने के लिए ऊतक के नमूने homogenizer । प्रत्येक नमूने के बीच, एक साफ ऊतक के साथ डबल आसुत पानी और सूखी में मूसल धोने । विभिन्न प्रायोगिक स्थितियों और ऊतकों के बीच मूसल बदलें ।
    4. 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने homogenization के बाद छोड़ दें । 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर > 10000 x जी पर नमूनों सेंट्रीफ्यूज ।
    5. पेलेट को परेशान किए बिना सुपरनैंट को बर्फ पर एक नए ट्यूब में ट्रांसफर करें । सुप्रनतांत प्रोटीन का नमूना है । -८० डिग्री सेल्सियस पर निकाले गए प्रोटीन की दुकान या सीधे प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए आगे बढ़ना ।
  2. मात्रा और प्रोटीन एकाग्रता का सामान्यीकरण
    1. एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता उपाय । एक ९६ में निर्माता के निर्देश के अनुसार एक बीसीए परख मिश्रण तैयार-अच्छी तरह से ऑप्टिकल प्लेट बीसीए मिक्स के २०० μL का उपयोग कर अच्छी तरह से प्रति ।
      नोट: अन्य परिमाणन विधियों जैसे lowry और ब्रैडफोर्ड assays भी प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में प्रोटीन एकाग्रता प्रयोगों भर में लगातार परिमाणन है.
    2. गोजातीय सीरम एल्ब्युन (bsa) तपसिल में बढ़ती सांद्रता पर मानकों को तैयार करने और डुप्लिकेट में प्रत्येक प्रोटीन नमूने के 1 μl जोड़ें । ९६-well थाली में एक preheated गर्मी ब्लॉक में 10 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस या उससे अधिक समय के लिए अगर प्रोटीन एकाग्रता कम होने की उंमीद है ।
    3. ऊष्मायन के बाद, एक थाली रीडर का उपयोग ५६० एनएम पर अवशोषण उपाय ।
    4. प्लेट रीडर माप निर्यात और प्रोटीन मानक का उपयोग प्राप्त एक मानक वक्र करने के लिए प्रत्येक नमूने के औसत absorbance मूल्यों की तुलना करके प्रोटीन एकाग्रता की गणना । नमूना प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए मानक वक्र के लिए R-squared मान से अधिक या बराबर ०.९८ करने के लिए होना चाहिए ।
    5. नमूना बफर और ultrapure पानी में प्रोटीन नमूनों की dilutions तैयार करके प्रोटीन की मात्रा को सामान्य. कुल मात्रा में इस्तेमाल जेल के प्रकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । एक प्रारंभिक राशि के रूप में प्रति लेन 30 μg प्रोटीन की लोडिंग की सिफारिश की है । कम करने के एजेंट जैसे dithiothreitol (DTT; अंतिम एकाग्रता 5 मिमी) या बीटा-mercaptoethanol (अंतिम एकाग्रता २०० मिमी) के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक जोड़ें । पिपेट undiluted बीटा-एक धूआं हुड में mercaptoethanol ।
    6. नमूने को हीट ब्लॉक में 10 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर सेटे । बर्फ, भंवर पर नमूने रखो और नीचे स्पिन संक्षेप में इकट्ठा करने के लिए । जेल लोड होने तक बर्फ पर रखो ।

2. जेल प्रोटीन नमूनों की वैद्यता वैद्युत संचलन

  1. डिवाइस और जेल सेट अप
    1. सेटअप एक मिल 4 – 12% बीआईएस-Tris ढाल जेल ( सामग्री की तालिकादेखें) जेल में इलेक्ट्रोफोरेसिस चैंबर प्रणाली । उपयोग से पहले डबल आसुत पानी का उपयोग जैल कुल्ला ।
      नोट: आकार, बातचीत और ब्याज के प्रोटीन की बहुतायत पर निर्भर करता है, एक अलग ढाल, बफ़रिंग एजेंट या अच्छी तरह से आकार और संख्या के साथ जैल इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. 1x के ५०० मिलीलीटर जोड़ें एसडीएस चल बफर प्रति टैंक डबल आसुत पानी में पतला । सावधानीपूर्वक stacking जेल में कुओं को परेशान किए बिना चल रहे बफर जोड़ने के बाद जैल से कंघी निकालें ।
  2. प्रोटीन भारण
    1. अच्छी तरह से एक प्रोटीन मानक के ३.५ μL लोड । नमूना लेआउट पर निर्भर करता है, जेल के दोनों किनारों पर एक प्रोटीन सीढ़ी लोड अधिक सही प्रोटीन आकार का आकलन करने में सहायता कर सकते हैं । का प्रयोग करें ठीक tipped जेल अधिक सटीक नमूना लोड करने के लिए युक्तियां लोड हो रहा है ।
    2. के बीच के लिए एक आंतरिक मानक का उपयोग करते समय-झिल्ली सामांयीकरण (नीचे चरण 5 देखें और चर्चा), एक राशि है कि पहले 3 प्रोटीन सीढ़ी के बगल में कुओं में अंय नमूनों के बराबर है लोड ।
    3. शेष कुओं में प्रत्येक नमूने का 30 μg लोड । सभी खाली कुओं के लिए 1x नमूना बफर जोड़ें ।
  3. वैद्युतकणसंचलन
    1. नमूने लोड करने के बाद जेल टैंक इकट्ठा । नमूने को stacking जेल के माध्यम से चलाने के लिए ८० V 10 मिनट के लिए १५० V के बाद एक अतिरिक्त 45-60 मिनट के लिए ।

3. प्रोटीन अंतरण

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रोटीन स्थानांतरण एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अर्द्ध सूखी सोख्ता प्रणाली का उपयोग किया जाता है ( सामग्री की मेजदेखें) तेजी से और लगातार परिणामों के लिए ।

  1. डबल-आसुत जल में पूर्व-सोख फिल्टर पेपर द्वारा प्रोटीन अंतरण तैयार करें और जेल चाकू, प्लास्टिक पाश्चर पिपेट, सोख्ता रोलर और फोरसेप्स का उपयोग करने के लिए तैयार रहें ।
  2. सभी रैपिंग पंनी को सावधानीपूर्वक निकाल कर स्थानांतरण स्टैक खोलें । नीचे स्टैक से शीर्ष निकालें और इसे अलग सेट करें । जल्दी से नीचे पर झिल्ली गीला ट्रो के कई बूंदों के साथ स्टैक चल बफर (2-3 मिलीलीटर) । एक बार स्थानांतरण ढेर खुला है, यह बाहर सुखाने से PVDF झिल्ली को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. Electrophoresis रोकने के बाद, जेल चाकू का उपयोग कर पूर्व डाली जेल खुला और stacking जेल काट । इसे प्लास्टिक की डाली से मुक्त करने के लिए इसके किनारों के आसपास जेल काटें । जेल के लिए नुकसान को रोकने के लिए जेल चाकू गीला रखो ।
  4. नीचे से शीर्ष करने के लिए स्थानांतरण स्टैक इकट्ठा: नीचे स्टैक (PVDF झिल्ली युक्त), प्रोटीन जेल, फिल्टर कागज । सभी हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए सोख्ता रोलर का प्रयोग करें । शीर्ष स्टैक को फ़िल्टर काग़ज़ के शीर्ष पर रखें और फिर से हवा के बुलबुले निकालने के लिए स्टैक को रोल करें । बहुत दृढ़ता से धक्का नहीं के रूप में इस जेल के कारण प्रोटीन हस्तांतरण के दौरान ख़राब हो सकता है ।
  5. डिवाइस के बाईं ओर इलेक्ट्रोड के साथ हस्तांतरण डिवाइस में पूरे ढेर हस्तांतरण और स्टैक के शीर्ष पर जेल स्पंज जगह है कि यह डिवाइस पर इसी विद्युत संपर्कों के साथ गठबंधन किया है. ढक्कन बंद करें, चुनें और उचित कार्यक्रम शुरू (20 V 7 मिनट के लिए एक अनुशंसित प्रारंभिक बिंदु है) ।
  6. जब समाप्त हो, ढक्कन 2 मिनट के लिए बंद करने के लिए ठंडा करने के लिए और बाहर सुखाने से झिल्ली को रोकने के ढेर की अनुमति छोड़ दिया । स्थानांतरण स्टैक निकालें और जेल आकार करने के लिए झिल्ली में कटौती । कुल प्रोटीन दाग के साथ जारी रखने से पहले काट झिल्ली को डबल-डिस्टिल्ड पानी से जल्दी धो लें ।

4. कुल प्रोटीन धुंधला

नोट: फ्लोरोसेंट का पता लगाने का उपयोग अधिक परंपरागत दृष्टिकोण (जैसे, ECL पहचान) पर एक पर्याप्त लाभ प्रदान करता है, रैखिक सीमा और संवेदनशीलता के रूप में बहुत बेहतर4नियंत्रित किया जा सकता है । इसलिए, चरण 4 और 5 में, एक फ्लोरोसेंट टीपीएस और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी उपयोग किया जाता है ( सामग्री की मेजदेखें) ।

  1. एक ५०-मिलीलीटर ट्यूब में झिल्ली रोल प्रोटीन पक्ष के साथ आवक का सामना करना पड़ । फ्लोरोसेंट टीपीएस और माध्यमिक एंटीबॉडी की प्रकाश संवेदनशीलता के कारण, सभी अनुवर्ती कदम अंधेरे में किया जाता है ।
  2. प्रोटीन दाग समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक रोलर पर सेते । क्योंकि TPS और धोने बफर मेथनॉल होते हैं, एक धूआं हुड में इन कदमों को बाहर ले ।
  3. धुंधला समाधान छोड़ें और धो समाधान के 5 मिलीलीटर (30% मेथनॉल में ६.३% एसिटिक एसिड) के साथ दो बार जल्दी धो लें । ट्यूब संक्षेप में धोने के कदम के बीच रोलर पर वापस प्लेस । जारी रखने से पहले झिल्ली संक्षेप में ultrapure पानी के साथ कुल्ला ।

5. अवरुद्ध, एंटीबॉडी ऊष्मायन और पहचान

  1. झिल्ली को अवरुद्ध: अवरुद्ध बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) ५० मिलीलीटर झिल्ली युक्त ट्यूब के लिए । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक रोलर पर झिल्ली सेटे । एंटीबॉडी के विकल्प पर निर्भर करता है, अवरुद्ध बफर के प्रकार अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. अवरुद्ध बफर छोड़ें और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ उपयुक्त, अनुकूलित एकाग्रता में बदलें (चित्रा 1 और चित्रा 2: माउस-विरोधी smn, पर 1:1000, बफर अवरुद्ध में पतला).
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के पर्याप्त अनुकूलन पुष्टि शामिल होना चाहिए कि एंटीबॉडी सही आकार के एक प्रोटीन उत्पाद का पता लगाता है whilst कोई या ंयूनतम अंय, अविशिष्ट प्रोटीन उत्पादों के लिए बाध्यकारी दिखा । यदि संभव हो तो, परीक्षण और ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ एकाधिक एंटीबॉडी की तुलना करें ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक रोलर पर झिल्ली सेते हैं । अगले दिन, एंटीबॉडी समाधान निकालें और कमरे के तापमान (आरटी) पर एक रोलर पर 1x PBS के साथ 5 मिनट के लिए 6 बार धो लें ।
  3. द्वितीयक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. विशिष्ट द्वितीयक एंटीबॉडी को 1:5000 में प्राथमिक एंटीबॉडी के होस्ट के विरुद्ध 5 मिलीलीटर ब्लॉकिंग बफ़र में तैयार करें । अन्य द्वितीयक एंटीबॉडी अन्य dilutions या वैकल्पिक ब्लॉक बफ़र्स का उपयोग की आवश्यकता हो सकती है ।
    2. आरटी पर 1 ज के लिए एक रोलर पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ झिल्ली सेते । ऊष्मायन के बाद, झिल्ली एक रोलर पर 1x PBS के साथ तीन बार 30 मिनट धोने ।
    3. झिल्ली सूखी और पता लगाने तक एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से संरक्षित झिल्ली रखने के लिए । लंबी अवधि के भंडारण के लिए झिल्ली 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।
  4. प्रतिबिंब अर्जन
    1. स्कैनर से अनुलग्न कंप्यूटर पर लॉगिन करें । स्कैनर पर प्रोटीन की ओर नीचे का सामना करना पड़ के साथ झिल्ली प्लेस और सॉफ्टवेयर में स्कैनिंग क्षेत्र का चयन करें ।
    2. दोनों के लिए लेजर तीव्रता का अनुकूलन (७०० एनएम और ८०० एनएम) चैनल, कोई संतृप्ति की पुष्टि से होता है । दोनों चैनलों में छवियों को प्राप्त करने और आगे विश्लेषण (6 कदम) के लिए छवियों को निर्यात ।

6. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण और परिमाणन

नोट: इन सिफारिशों को आज़ादी से उपलब्ध छवि स्टूडियो सॉफ्टवेयर पर आधारित हैं । हालांकि, तुलनीय विश्लेषण भी अंय सॉफ्टवेयर संकुल, जैसे ImageJ का उपयोग किया जा सकता है ।

  1. फ़ाइल आयात करें: विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए कंप्यूटर पर स्थानीय कार्यस्थान बनाएं । यह अधिग्रहीत पश्चिमी blots के लिए छवि फ़ाइलों का एक डाटाबेस उत्पंन करता है । स्कैनर पर प्राप्त फ़ाइलों को आयात और विश्लेषण के लिए छवि का चयन करें ।
  2. टीपीएस विश्लेषण
    1. कुल प्रोटीन धुंधला परिणाम दिखाने के लिए ७०० एनएम चैनल प्रदर्शित करें । एक टीपीएस छवि का एक उदाहरण चित्रा 1 में शामिल है जिसमें नवजात (P5) से अलग ऊतकों (चित्र 1a-बी) और 10 सप्ताह पुराने चूहों (चित्रा 1c-D) सीधे तुलना कर रहे हैं । इसी प्रकार, चित्रा 2 अलग उम्र के चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों की एक सीधी तुलना का एक उदाहरण से पता चलता है.
    2. ऊपर दाएं कोने से विश्लेषण टैब का चयन करें और सामांयीकरण के लिए रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए आयत जोड़ें का चयन करें (चित्र 1b, D) । प्रत्येक व्यक्ति के नमूने पर प्रथम आयत क्षेत्र की प्रतिलिपि बनाएं और चिपकाएं यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी विश्लेषित लेन के लिए एक ही आकार में निर्धारित क्षेत्र है ।
    3. सॉफ़्टवेयर के निचले बाएँ कोने में आकृतियों टैब से परिणाम की प्रतिलिपि बनाएँ.
  3. परिमाणन
    नोट: नमूनों बढ़ाता के लिए इष्टतम दृष्टिकोण प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है । हम यहां अस्तित्व मोटर ंयूरन प्रोटीन (smn; एक प्रमुख प्रोटीन neuromuscular रोग रीढ़ की हड्डी पेशी शोष20,21), कि समय के साथ कम करने के लिए जाना जाता है में शामिल का पता लगाने का उदाहरण प्रदान करेगा 19 और कैसे Tps को smn संकेत तीव्रता के सामान्यीकरण प्रोटीन अभिव्यक्ति विकास के विश्वसनीय अनुमान प्रदान करता है ।
    1. चित्रा 2 प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण के रूप में टीपीएस के साथ पशु की बढ़ती उम्र के साथ smn अभिव्यक्ति की कमी से पता चलता है. दोहराएं चरण 6.2.1-6.2.3 प्रोटीन लदान (चित्रा 2b) यों तो करने के लिए । दोहराएँ चरण 6.2.1-6.2.3 में ८०० एनएम चैनल (चित्रा 2A) ब्याज के प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए.
    2. दोनों TPS और एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम के लिए ब्याज की प्रोटीन से परिणामों की प्रतिलिपि बनाएं । स्प्रेडशीट पर, सबसे पहले मानक TPS संकेत और प्रत्येक TPS इस मान के द्वारा सामांयीकृत प्रोटीन लोडिंग मान प्राप्त करने के लिए संकेत मान विभाजन निर्धारित करके प्रोटीन लोड हो रहा है सामान्य ।
    3. विभिन्न नमूनों में सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति अनुपात की गणना करने के लिए अपने इसी सामान्यीकृत प्रोटीन मान द्वारा प्रत्येक व्यक्ति के नमूने से ८०० एनएम संकेत मान विभाजित करें ।
    4. पहले सामान्यीकरण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं या ऊतकों की तुलना आंतरिक मानक के औसत मूल्य के लिए विभिन्न झिल्लियों और प्रयोगों में प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देने के लिए करें ।

7. सांख्यिकी

  1. नमूनों के जटिल और बड़े समूहों में प्रोटीन अभिव्यक्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का निर्धारण करने के लिए, उपयुक्त सांख्यिकीय पद्धति की आवश्यकता है । हालांकि सांख्यिकीय पृष्ठभूमि की एक विस्तृत चर्चा इस पत्र के दायरे से परे चला जाता है, हम कई विचार और विस्तार से एक सफल दृष्टिकोण है कि हम पहले19का इस्तेमाल किया है पर प्रकाश डाला जाना चाहता हूं ।
  2. कई प्रयोगों के लिए के रूप में, प्रोटीन परिमाणन माप पूरी तरह से स्वतंत्र डेटा का प्रतिनिधित्व नहीं करते. यहाँ, उदाहरण के लिए, एक ही प्रायोगिक समय-बिंदु पर एकाधिक अंगों में प्रोटीन स्तर निर्धारित करने के लिए एक से अधिक ऊतकों आमतौर पर एकल जानवरों से प्राप्त कर रहे हैं. इसलिए, हम समय के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति में अंतर का विश्लेषण करने के लिए एक मिश्रित प्रभाव मॉडल का इस्तेमाल किया, और ऊतकों के बीच.  सामांय में, मिश्रित प्रभाव मॉडल गैर स्वतंत्रता से निपटने के लिए एक प्रभावी साधन प्रदान करते है और इस तरह छद्म प्रतिकृति22,23से बचें । वर्तमान मामले में, मिश्रित प्रभाव मॉडल व्यक्तियों के भीतर, ऊतकों में दोहराया माप के लिए लेखांकन द्वारा सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि । हम इन विश्लेषणों को करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज R का उपयोग करते हैं, क्योंकि यह स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है और बहुमुखी है । तथापि, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध अन्य पैकेज इसी प्रकार के विश्लेषणों को निष्पादित करने में समर्थ हो सकते हैं ।
  3. वर्तमान प्रयोगात्मक डिजाइन एक "विभाजित साजिश" डिजाइन शामिल है क्योंकि प्रत्येक माउस केवल एक आयु समूह के थे । इसलिए, हम एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ एक यादृच्छिक प्रभाव के रूप में व्यक्तिगत चूहों (माउस आईडी) मॉडलिंग; हम भी ऊतक, उंर के लिए जिंमेदार है, और निश्चित प्रभाव के रूप में उनकी बातचीत । हम R पुस्तकालय, lme4 में समारोह lmer का उपयोग कर डेटा मॉडलिंग । एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के रूप में, हम समान विचरण और एक सामांय वितरण की मान्यताओं का आकलन करने के लिए अवशिष्ट की कल्पना की और इन मान्यताओं को पूरा करने के लिए जहां आवश्यक डेटा बदल दिया । ऊतक और उंर के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत के लिए परीक्षण करने के लिए, हम एक समान मॉडल है कि इस बातचीत के अभाव में फिट है, और पैरामीट्रिक bootstrapping (आर समारोह पुस्तकालय, pbmodcomp में PBmodcomp) का उपयोग कर मॉडल की तुलना में ।  जहां महत्वपूर्ण बातचीत उठी, हम समारोह emmeans (emmeans आर पुस्तकालय में) का उपयोग करने के लिए बातचीत का कारण निर्धारित करते हैं ।  उदाहरण के लिए, हम प्रत्येक ऊतक के भीतर आयु वर्ग के बीच मतलब अभिव्यक्ति की तुलना में; एक महत्वपूर्ण बातचीत उंर और ऊतक के बीच पैदा हो सकता है अगर, कहते हैं, दो दिया आयु वर्ग काफी एक ऊतक के लिए नहीं बल्कि दूसरे के लिए मतभेद । संक्षेप में, इन तरीकों के लिए इन परिणामों के लिए सांख्यिकीय समर्थन प्रदान करके पश्चिमी ब्लॉट प्रयोगों से निष्कर्ष की मजबूती का विस्तार करने के लिए एक रास्ता प्रदान करते हैं ।

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Representative Results

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हम टीपीएस के उपयोग के उदाहरण और ऊतकों और समय बिंदुओं में प्रोटीन के स्तर की तुलना को सुविधाजनक बनाने के लिए एक आंतरिक मानक शामिल हैं । चित्रा 1 वयस्क चूहों (10 सप्ताह पुराने) की तुलना में नवजात शिशु (प्रसव के बाद 5 दिन) से प्राप्त ऊतकों से निकाले गए प्रोटीन पर पश्चिमी सोख्ता से परिणाम से पता चलता है. TPS और Smn immunoblot चित्र 1a, Cमें दिखाए जाते हैं । प्रत्येक लेन पर आयत बॉक्स के अंदर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा टीपीएस की प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाणन प्राप्त किया गया और इसके परिणाम चित्र 1b और 1 घमें सारणी में दर्शाए गए हैं । ध्यान दें कि विभिंन ऊतकों से नमूने अलग TPS प्रोटीन बैंड पैटर्न की विशेषता है और इसलिए यह सामांयीकरण प्रयोजनों के लिए पूरी लेन का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । वास्तव में, जब पूरी गलियों का विश्लेषण कर रहे हैं, प्रतिदीप्ति तीव्रता नमूनों भर में अपेक्षाकृत समान रहता है, सामांय के लिए टीपीएस संकेत इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त है । एक आंतरिक मानक P5 मस्तिष्क lysate मिश्रण भी शामिल किया गया था वर्णन करने के लिए कैसे यह विभिंन झिल्ली के बीच आगे की तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, चित्रा 2में, हम बताएंगे कि कैसे एक फ्लोरोसेंट टीपीएस विभिंन विकासात्मक समय बिंदुओं पर प्रोटीन के स्तर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हम नवजात शिशुओं (P5), प्रातः आयु (P20) और वयस्क (10W) चूहों (चित्रा 2A) से मस्तिष्क lysates में smn स्तर दिखा । हालांकि smn स्तर स्पष्ट रूप से उम्र के साथ कम है, tps परिमाणन स्थिर रहता है के रूप में चित्रा 2bमें सचित्र.

Figure 1
चित्रा 1. पश्चिमी blots TPS दिखा रहा है और दो अलग उम्र में माउस के ऊतकों में Smn प्रोटीन का स्तर । टीपीएस और Smn प्रोटीन के लिए P5 () और 10 सप्ताह पुराने () चूहों. (ख, घ) पूरे लेन टीपीएस की प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना की गई थी और (मनमाने ढंग से इकाइयों में) दर्शाई गई है । एम: मार्कर/ केडीए: किलोडल्टन; एदिव: मनमाना इकाई; P5: प्रसवोत्तर दिवस 5; 10W: 10 सप्ताह । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2. विभिंन विकासात्मक समय बिंदुओं पर माउस ऊतकों में Smn अभिव्यक्ति का विश्लेषण । () टीपी5, P20 और 10 सप्ताह पुराने चूहों से प्राप्त ऊतक से मस्तिष्क के लिजेट्स (शीर्ष पैनल) और smn (नीचे पैनल) tps का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । () टीपीएस की प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना की गई थी और इसे मनमाने ढंग से यूनिटों में दर्शाया गया है । एम: मार्कर/ केडीए: किलोडल्टन; एदिव: मनमाना इकाई; P5: प्रसवोत्तर दिवस 5; P20: प्रसवोत्तर दिवस 20; 10W: 10 सप्ताह । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ऊतक लगभग वजन * 1xPBS wash (4 डिग्री सेल्सियस) दोहरा वाश अनुमन्य बफर * *
रीढ़ की हड्डी ४० मिलीग्राम १५० मिलीलीटर 3x १०० मिलीलीटर
मांसपेशी (जीसी) 20 मिलीग्राम १५० मिलीलीटर 3x १०० मिलीलीटर
मस्तिष्क २४० मिलीग्राम ४०० मिलीलीटर 4x ४०० मिलीलीटर
दिल ६० मिलीग्राम ४०० मिलीलीटर 4x २०० मिलीलीटर
जिगर १३० मिलीग्राम ४०० मिलीलीटर 4x ४०० मिलीलीटर
गुर्दे ४५ मिलीग्राम ४०० मिलीलीटर 4x २०० मिलीलीटर
* ये भार P8 चूहों से प्राप्त ऊतक के लिए सांकेतिक मान रहे हैं.
* * इन खंडों संकेत कर रहे है और आगे ऊतक के वजन के अनुसार समायोजित किया जा सकता है ।

तालिका 1. अपेक्षित ऊतकों वजन और PBS washes और lysis बफर वॉल्यूम के लिए इसी सिफारिशों का अवलोकन homogenization के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए । वजन प्रसव के बाद 8 (P8) चूहों से प्राप्त ऊतक के लिए संकेत कर रहे हैं । PBS और lysis बफर वॉल्यूम ऊपर और नीचे प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार बढ़ाया जा सकता है ।

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Discussion

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उपयुक्त प्रयोगात्मक डिजाइन, नियंत्रण उपायों और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ, पश्चिमी सोख्ता के भीतर और जैविक नमूनों की एक विविध रेंज के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्वसनीय मात्रात्मक अनुमान बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटोकॉल हम वर्तमान पांडुलिपि में वर्णन के शोधकर्ताओं के लिए एक दिशानिर्देश के लिए पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करने के लिए नमूने के बड़े और अधिक जटिल समूहों भर में मात्रात्मक विश्लेषण शुरू करने के लिए, प्रतिदीप्ति का एक संयोजन का उपयोग करके आधारित के रूप में सेवा करना उद्देश्य पता लगाने के तरीके, कुल प्रोटीन लोड हो रहा है सामांयीकरण और आंतरिक मानकों । हालांकि यहां ध्यान निर्धारित करने और विभिंन माउस के ऊतकों से और विभिंन उंर में प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना पर है, यह दृष्टिकोण भी अंय प्रायोगिक परिस्थितियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल में एक केंद्रीय कदम एक फ्लोरोसेंट कुल प्रोटीन दाग बढ़ाता द्वारा लोड कुल प्रोटीन के लिए ब्याज की प्रोटीन के सामान्यीकरण है । TPS सामांयीकरण नमूना लोड हो रहा है और प्रोटीन परिमाणन विधियों में त्रुटि मार्जिन में भिन्नता के लिए सही करता है । हालांकि, क्योंकि एक ही झिल्ली पर विश्लेषण किया जा सकता है कि प्रोटीन नमूनों की संख्या अक्सर सीमित है, और सामान्यीकरण एकाधिक झिल्ली की तुलना करने के लिए आवश्यक हो सकता है. दरअसल, विभिन्न झिल्ली पर प्रोटीन का पता लगाने के बीच परिवर्तनशीलता (उदाहरण के लिए एंटीबॉडी इंक्यूबेशन समय या तापमान भिन्नता के कारण) प्रोटोकॉल के लदान और मात्रा के चरणों के माध्यम से शुरू से परे भिन्नता पैदा कर सकता है । यहां, हम एक आंतरिक मानक है कि एक एकल प्रोटीन lysate मिश्रण है कि प्रत्येक जेल पर तपसिल में भरी हुई है और तुलना के लिए अनुमति देता है का उपयोग करें और gels के बीच सामांयीकरण/ सैद्धांतिक रूप से, यह किसी भी प्रोटीन नमूना हो सकता है, जब तक यह पर्याप्त मात्रा में बनाया जा सकता है ताकि एक ही नमूना सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे प्रयोगों में, हम मस्तिष्क प्रोटीन का एक मिश्रण का उपयोग करें, के रूप में मस्तिष्क homogenates प्रोटीन की बड़ी मात्रा में होते हैं और आम तौर पर एक उच्च एकाग्रता पर प्राप्त कर रहे हैं । तपसिल मानक की मात्रा का औसत और आगे झिल्ली भर में परिमाणन की सटीकता में वृद्धि और प्रयोग की reproducibility में योगदान करना चाहिए ।

प्रोटीन का स्तर विभिन्न तकनीकों के एक नंबर द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और पसंदीदा विधि नमूना प्रकार का विश्लेषण किया जा रहा है और प्रयोग के लक्ष्य पर निर्भर करता है । पश्चिमी ब्लॉट का पुनरुद्भवन परिमाणन उन परिस्थितियों में सबसे अच्छा कार्य करता है जहां प्रयोगात्मक स्थितियां अच्छी तरह नियंत्रित हो सकती हैं, जैसे माउस या परिभाषित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के अन्य पशु मॉडलों का उपयोग करते समय । इसके विपरीत, कई प्रयोगों में मानव रोगी के नमूनों का उपयोग कर, यह उंर के रूप में कम संभव हो सकता है, आनुवंशिक परिवर्तनशीलता और ऊतक नमूना बार ज्यादा (पशु) मॉडल सिस्टम में से नियंत्रित करने के लिए कठिन हैं । इस तरह के ELISA के रूप में थाली आधारित तकनीकों इन विश्लेषण के लिए और अधिक उपयुक्त हो सकता है, हालांकि एंटीबॉडी विशिष्टता के सावधान सत्यापन महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, नाजुक एक्स सिंड्रोम अनुसंधान में, एंटीबॉडी अलग isoforms का पता लगाने के लिए दिखाया गया है और जब ELISA में इस्तेमाल किया यह प्रोटीन की कुल राशि का overestimation के रूप में ELISA सभी24संयुक्त isoforms के लिए एक संकेत निर्धारित करता है का नेतृत्व करेंगे । तरीकों के लिए इष्टतम विकल्प प्रोटीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए इसलिए संदर्भ, नमूना प्रकार और अनुसंधान सवाल है कि जांच की जा रही है पर निर्भर कर रहे हैं ।

जैविक आंकड़ों के परिमाणन से तैयार किए गए किसी निष्कर्ष की विश्वसनीयता के लिए पर्याप्त सांख्यिकीय विश्लेषण करना एक पूर्वापेक्षित है । सांख्यिकीय विभिंन ऊतकों, समय अंक या अंय प्रायोगिक शर्तों और उसके संयोजनों की तुलना द्वारा उत्पंन के रूप में जटिल डेटा का विश्लेषण करने के बाद के साथ ANOVA से अधिक उंनत सांख्यिकीय मॉडलिंग की आवश्यकता हो सकती है प्रदान कर सकते हैं । इस तरह के मिश्रित प्रभाव मॉडल दृष्टिकोण के रूप में अधिक जटिल सांख्यिकीय मॉडलिंग, के लिए, हम वर्तमान पांडुलिपि में वर्णन, यह आगे biostatisticians से सलाह लेने के लिए उचित हो सकता है । बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति का पर्याप्त सांख्यिकीय विश्लेषण बहुत परिणामों की मजबूती और विश्वसनीयता और परिणामों की reproducibility में सुधार कर सकते हैं ।

सारांश में, प्रयोगात्मक दृष्टिकोण हम यहां का वर्णन शोधकर्ताओं है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति जटिल नमूनों में पश्चिमी ब्लॉट का उपयोग करने के लिए नए और रोमांचक अनुसंधान सवालों के जवाब देने की अनुमति का निर्धारण करना चाहते है के लिए एक मजबूत और reproducible विधि प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धा हितों का खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

E.J.N.G. वेलकम ट्रस्ट (grant 106098/Z/14/Z) द्वारा समर्थित है । अंय धन SMA ट्रस्ट (SMA ब्रिटेन कंसोर्टियम द्वारा प्रदान की गई है; T.H.G. & Y-T. एच.), एसएमए यूरोप (टी. एच. जी., D.v.D.H. & E.J.N.G.), प्रेसिजन मेडिसिन में एडिनबर्ग डीटीपी की यूनिवर्सिटी (T.H.G., L.L. & A.M.M.), और यूआन मैकडोनाल्ड सेंटर फॉर मोटर न्यूरोन डिजीज रिसर्च (टी. एच. जी.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Tipped Gel Loading Tips Alpha Laboratories GL20057SNTL
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL ThermoFisher Scientific 78437
Handheld homogeniser  VWR Collection 431-0100
iBlot 2 Gel Transfer Device ThermoFisher Scientific IB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size ThermoFisher Scientific IB401031
Image Studio Lite Licor N/A Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/
IRDye 800CW secondary antibodies Licor -- Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) ThermoFisher Scientific NP0001
Odyssey Blocking Buffer Licor 927-40000
Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody BD Transduction Laboratories 610646 Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number
REVERT Total Protein Stain, 250 mL  Licor 926-11021 
REVERT Wash Solution  Licor 926-11012 
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001

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References

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ऊतकों में प्रोटीन के स्तर की मजबूत तुलना और विकास के दौरान मानकीकृत मात्रात्मक पश्चिमी Blotting का उपयोग
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Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).More

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).

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