Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Engineering

Синтез, функционализации и характеристика Fusogenic пористого кремния наночастиц для доставки олигонуклеотида

doi: 10.3791/59440 Published: April 16, 2019

Summary

Мы демонстрируем синтеза наночастиц fusogenic пористого кремния для эффективного в vitro и in vivo олигонуклеотида доставки. Пористого кремния наночастиц загружаются с siRNA сформировать ядро, которое покрыно fusogenic липиды путем экструзии для формирования корпуса. Нацеленности остаток функционализации и гранулометрического состава.

Abstract

С появлением генной терапии разработка системы доставки эффективной в естественных условиях нуклеотида грузоподъемность стала параллельного импорта. Fusogenic пористого кремния наночастиц (F-pSiNPs) недавно продемонстрировали высокий в-vivo гена, глушителей эффективность из-за его высокой олигонуклеотида загрузки способности и уникальные клеточного поглощения путь, который избегает эндоцитоза. Синтез F-pSiNPs представляет собой многоэтапный процесс, который включает в себя: (1) Загрузка и герметизации полезных олигонуклеотида в порах кремния; (2) одновременно покрытие и калибровки fusogenic липидов вокруг ядра пористого кремния; и (3) спряжение ориентации пептидов и мойка для удаления избыточных олигонуклеотида, кремния мусора и пептида. Однородность размера частицы характеризуется Динамическое рассеяние света, и его структура ядро оболочка может быть проверена путем просвечивающей электронной микроскопии. Fusogenic усвоение проверяется путем загрузки липофильных красителя, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (дии), в fusogenic липидного бислоя и рассматривая его клетки in vitro соблюдать плазматической мембраны, окрашивание по сравнению с endocytic локализаций. Ориентации и in vivo гена глушителей узкоспециализированного ранее были количественно в мышиной модели пневмонии золотистый стафилококк , в котором, как ожидается, помочь F-pSiNPs в дом к месту инфекции таргетинга пептид. Помимо его применения в инфекции S. aureus F-pSiNP система может использоваться для доставки любого олигонуклеотида для генной терапии широкого спектра заболеваний, в том числе вирусные инфекции, рак и аутоиммунные заболевания.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Генная терапия модулирует конкретный ген выражение для получения терапевтические результаты. Многочисленные инструменты для модуляции гена были обнаружены и изучены, включая рибонуклеиновой кислоты вмешательства (RNAi) с помощью олигонуклеотиды (например, короткие интерферирующие РНК (siRNA)1,2, микроРНК (miRNA)3,4 ), ДНК плазмиды5,6, nucleases (например, цинковый палец, ТАЛЕНС)7,8и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем9,10. Хотя механизм действия каждого инструмента отличается, все инструменты должны достичь цитоплазмы клетки или ядро быть активными. Таким образом хотя эти инструменты доказали, чтобы вызвать значительный эффект в модуляции экспрессии генов в пробирке, в естественных условиях эффективность страдает от внеклеточные и внутриклеточных препятствий. С тем, что инструменты являются биологического происхождения, многие ферменты и распродажа систем существуют в нашем теле, которые имеют возможность снизить или удалить иностранных молекул11. Даже в случае инструменты достижения целевую ячейку, они страдают от эндоцитоз; режим клеточного поглощения, который инкапсулирует и ловушки инструменты в кислой желудка как пузырьки, которые деградируют или высылать инструменты из клетки. В самом деле исследования показали, что наночастицы липидов являются endocytosed через макропиноцитозом, из которых около 70% малых интерферирующих РНК exocytosed от клеток в течение 24 ч поглощения12,13. Большинство из оставшихся малых интерферирующих РНК деградации через лизосомальных пути, и в конечном итоге лишь 1-2% малых интерферирующих РНК, которая первоначально проникает в клетку с наночастицами добиться от англ побег подвергаться потенциально RNAi13,14 .

Мы недавно разработали fusogenic пористого кремния наночастиц (F-pSiNPs), у малых интерферирующих РНК загружается ядро, состоящий из пористого кремния наночастиц и липидов оболочки fusogenic15. F-pSiNPs представляют три основных преимущества перед другими системами доставки обычных олигонуклеотида: (1) fusogenic липидов, покрытие, что позволяет частицы обойти эндоцитоза и доставить все полезные данные непосредственно в цитоплазме клеток (по сравнению с 1-2% достигнутые endocytosed частицы13,14) (рис. 1); (2) высокая массовой загрузки интерферирующей РНК в pSiNPs (> 20 wt % по сравнению с 1-15 wt % обычных систем)15, который быстро деградируют в цитоплазме (после основных частиц пролить липидного покрытия через fusogenic поглощения) для выпуска малых интерферирующих РНК; и (3) ориентации пептид сопряжения для селективного самонаведения для желаемого типы клеток в естественных условиях.

F-pSiNP система продемонстрировала значительный Джин глушителей эффективность (> 95% в пробирке; > 80% в естественных условиях) и последующего терапевтического эффекта в роковой мыши модели S. aureus пневмонии; результаты которого были опубликованы ранее15. Однако сложная структура системы F-pSiNP требует осторожного обращения и доработаны оптимизации для создания единообразной и стабильной наночастиц. Таким образом цель этой работы – представить подробный протокол, а также стратегий оптимизации для синтеза, функционализации и характеристика F-pSiNPs использоваться в адресности малые интерферирующие РНК для глушителей эффект мощным ген.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. синтез наночастиц пористого кремния (pSINPs)

Предупреждение: Всегда будьте осторожны при работе с фтористоводородную кислоту (HF). Выполните все руководства по безопасности согласно ее лист данным по безопасности (ПБ), обрабатывать любые ВЧ содержащих химические вещества в зонта и носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ; двойных перчаток с бутил перчатки на внешней стороне, бутил фартук с пальто лаборатории под, лицо щит с очки под). Все университеты и научно -исследовательских лабораторий требуют специальной подготовки по ВЧ безопасности перед использованием. Не пытаться работать с ВЧ без предварительного одобрения координатора по вопросам безопасности вашей местной лаборатории, которые требуются дополнительные меры безопасности не описанные здесь.

  1. Подготовка травильных растворов
    1. Чтобы сделать 3:1 ВЧ раствора для травления (используется в шаги 1.3 и 1.4), заполнить пластиковый окончил цилиндр с водный 48% HF по 30 мл и 10 мл абсолютного этанола (EtOH). Решения должны содержаться в высокой плотности пластмассы (например, HDPE), как HF растворяет стекла.
    2. Чтобы сделать 1:29 кв решение для взлета (используется в шаге 1.5), заполнить в пластиковые окончил цилиндр с 1 мл водного раствора 48% HF и 29 мл абсолютного этанола. Решения должны содержаться в высокой плотности пластмассы (например, HDPE), как HF растворяет стекла.
    3. Сделать решение Кох 1 M 10% EtOH для растворения избыток pSi (используется в шаги 1.3 и 1.5).
  2. Настройка ячейки etch
    1. Тефлон etch клеток с 8,6 см2 хорошо etch (площадь вычисляется путем измерения диаметра поверхности кремния для травления в кольцо и вычисление площади, A = πr2), место в убывающем порядке (Рисунок 2a): (1) Тефлон ячейки сверху; (2) кольцо; (3) часть квартала одного кристалла (1 0 0) - ориентированной p ++ - типа кремниевой пластины, разрезать на четверти (с помощью алмазного резца); (4) алюминиевая фольга; и (5) тефлон ячейку база с винтами нежно затянуты для предотвращения утечки.
    2. Заполнение скважины с EtOH. Возьмите wipe и вставьте в расщелину между верхней ячейки тефлон и базы. Если протрите сухой после удаления, запечатан в etch ячейку. Если мокрый, ячейка протекает и затяните винты дальше пока не опечатаны.
  3. Электрополировка кремниевой пластины
    1. Принесите собрал etch ячейки в зонта.
    2. Заполнение скважины с 10 мл раствора 3:1 кв.
    3. Подключите положительный провод к алюминиевой фольги (электрод) из etch ячейки и подключите отрицательный провод к Платиновый катушки (борьбы с электродом) погружен в раствор HF 3:1 etch ячейки для завершения схемы (рис. 2b).
    4. Запуск постоянного тока в 50 мА см-2 для 60 s. Когда-то etch закончен, удалить ячейки из цепи и промыть тщательно с помощью шприца ВЧ 3:1. Промойте с EtOH три раза.
    5. Распустить прочь травления слоя, заполнив колодец медленно с 10 мл 1 м Кох. Подождите, пока восходящей спадает.
    6. Промойте Кох водой три раза, а затем с EtOH три раза.
  4. Электрохимически травления пористые слои в кремниевой пластины
    1. Запуск переменного тока квадратные волны, с Нижняя current density 50 мА/см2 для 0.6 s и высокая плотность тока 400 мА/см2 для 0,36 s повторяется для 500 циклов.
    2. Когда-то etch закончен, удалить ячейки из цепи и промыть тщательно с помощью шприца ВЧ 3:1. Промойте с EtOH три раза.
  5. Лифтинг офф пористый слой из кремниевой пластины
    1. Заполнение скважины с 10 мл 1:29 кв решение.
    2. Запуск константа 3.7 мА/см2 250 s. Когда-то etch закончен, удалить ячейки из цепи. PSi слой может иметь видимых рябь, указывающее отрешенности от кристаллический кремниевой пластины. Осторожно промыть 1:29 раствор HF и промойте с EtOH три раза, а затем с водой три раза.
    3. С помощью кончика пипетки, твердо трещины окружности pSi слоя для полный отряд. С помощью EtOH, собирать фрагменты pSi (чипов) с тефлоновым etch клеток в весом лодку. Передачи чипов стекла флакона. Фишки pSi может храниться при комнатной температуре в EtOH в течение 6 месяцев для хранения.
    4. Распустить прочь любые оставшиеся пористого кремния на пластины, заполнив колодец медленно с 10 мл 1 м Кох. Подождите, пока восходящей спадает.
    5. Промойте Кох водой три раза, а затем с EtOH три раза.
    6. Повторите шаги 1.3-1.5 травленная толщина всего пластин.
  6. Sonicating пористые слои для формирования наночастиц
    1. Замените растворителя флакон стекла, содержащие pSi фишки с EtOH до 2 мл воды ди.
    2. Плотно закройте крышку и печать с использованием парафина.
    3. Место стекла флаконе в ванне с sonicator и приостановлено, таким образом, чтобы объем pSi фишек полностью погружена ниже поверхности.
    4. Sonicate для 12 h 35 кГц и RF Мощность 48W. Чтобы предотвратить потерю значительных воды во время sonication, место объемные колбу с водой, таким образом, чтобы открытие колбу касается поверхности водяной бани.
    5. Место стеклянный флакон на плоскую поверхность для 1 h разрешить крупные частицы оседают на дне. Собирать супернатанта, с помощью пипетки; суспензии содержит pSiNPs суб-100 Нм.

2. Подготовка fusogenic липидной пленки

  1. Подготовка решений фондовых липидов
    1. В Зонта сделать 10 мг/мл запасы липидов, увлажняющая DMPC, DSPE-PEG-MAL и DOTAP липидов в хлороформе. Эти акции решения могут храниться при-20 ° C до 6 месяцев опечатанном туго парафина.
  2. Создание фильма липидов fusogenic
    Примечание: Состав fusogenic производится из липидов, DMPC, DSPE-КОЛЫШЕК и DOTAP, на молярное соотношение 76.2:3.8:20 и 96.2:3.8:0, соответственно.
    1. В стеклянный флакон Смешайте 72.55 мкл DMPC, 15,16 мкл DSPE-КОЛЫШЕК и 19,63 мкл DOTAP, закупорить.
    2. Опционально: Люминесцентные маркировки липидного покрытия, дополнительно добавьте 20 мкл DiI растворяют в EtOH в концентрации 1 мг/мл.
    3. Поместите ампулу в Зонта с потерять колпачок разрешить метилхлороформа на ночь испарится. Высушенные пленки будет облачно твердое вещество гелеобразной в нижней части флакона.

3. Загрузка и герметизация малых интерферирующих РНК в pSiNPs

  1. Подготовка хлорида кальция, Загрузка фондовой
    1. Распустить 1,11 g CaCl2 в 10 мл РНКазы свободной воды, чтобы сделать раствор2 2м CaCl.
    2. Центрифуга для решения > 10 000 x g 1 мин урегулировать агрегатов и собирать с помощью пипетки супернатант. Кроме того фильтр решение через фильтр 0,22 мкм.
  2. Подготовка siRNA, Загрузка фондовой
    1. Гидрат или разбавлять siRNA до 150 мкм в РНКазы свободной воды. Этот раствор может быть aliquoted и хранятся замороженные при температуре-20 ° C для по крайней мере 30 дней, учитывая, что он не подвергается циклов часто замораживания оттаивания.
  3. Загрузка малых интерферирующих РНК в pSiNPs с хлорид кальция
    1. Подготовьте Ванна ледяной sonication.
    2. 15 мин ultrasonication, нежно дозатор 150 мкл siRNA и 700 мкл CaCl 2 М2 в 150 мкл pSiNP. Убедитесь в том оставить открытой крышке пробки microcentrifuge для газа поколения.
    3. Снять трубку, содержащую 1 мл pSiNPs загружен siRNA кальция с покрытием из sonicator.

4. покрытие siRNA загружен pSiNPs с fusogenic липиды

  1. Подготовка комплекта экструзии липосом
    1. Заполните широкий стакан с водой ди. Выдержите 1 поликарбоната мембраны (200 Нм поры) и 4 фильтр поддерживает путем их плавает на поверхности воды. Соберите комплект экструзии липосом, следуя инструкциям производителя
  2. Гидратирующий липидов фильм с малых интерферирующих РНК загружена pSiNps
    1. Увлажнения сушеные липидных Фильм в стеклянный флакон с 1 мл раствора загружен siRNA кальция с покрытием pSiNPs, полученные от шага 3.3.3. Пипетка до тех пор, пока все липиды фильм подняли со дна флакона и смешались в пасмурный однородный раствор.
    2. Магнитный перемешивания бар в стеклянный флакон и поместите ампулу на горячей пластине для нагрева частиц до 40 ° C (или достаточно высокий, выше липиды фазы преобразования температуры для поддержания липидов в более жидкой фазе жидкий кристалл) магнитно хотя Перемешивание раствора на 20 мин.
  3. Экструзия липидов покрытием pSiNPs для размера элемента управления
    1. Аспирационная 1 мл раствора липидов покрытием pSiNP-малых интерферирующих РНК в шприц экструзии. Вставьте пустой шприц на одной стороне экструдера и заполненный шприц на другом конце.
    2. Начала экструзии толкает поршень медленно толкать частицы от одного шприца, через мембрану из поликарбоната и в другой. Повторите 20 раз. Если поршень застрял, фильтр и мембраны может быть засорен. Разберите экструдера и Замените мембрану и фильтр поддерживает. Если проблема сохраняется, разбавляют частицы до тех пор, пока засорения является управляемым.
    3. Соберите экструдированные частицы в пробки microcentrifuge.

5. спряжение таргетинга пептиды

  1. Спряжение таргетинга пептид липидного покрытия
    1. Подготовьте запас пептид с 1 мг/мл концентрация пептида в РНКазы свободной воды.
    2. В пробки microcentrifuge, содержащие fusogenic липидов покрытием pSiNPs, добавить 100 мкл пептид 1 мг/мл и пипетки осторожно. Держите трубку статические при комнатной температуре в течение 20 минут (в качестве альтернативы, > 2 ч при температуре 4 ° C).
    3. Чтобы удалить избыток пептид или siRNA и другие наполнители, стирать в 30 кДа центробежного фильтра спиннинг на 5000 x g при 25 ° C в течение 1 ч. Центрифуга вдвое больше с 1 мл PBS под те же настройки.
    4. Ресуспензируйте окончательный конъюгированных пептидные fusogenic липидов покрытием pSiNPs в PBS в нужной концентрации. Частицы могут теперь быть aliquoted и замороженные при температуре-80 ° C для хранения по крайней мере 30 дней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Успешный синтез fusogenic pSiNPs следует производить однородный, слегка непрозрачные решения (рис. 3a). Неспособность оптимизировать соотношение и концентрации pSiNPs: siRNA: CaCl2 может привести к агрегации после загрузки (рис. 3b). Поскольку частицы выдавливаются через 200 Нм мембраны, гидродинамические средний диаметр fusogenic pSiNPs, измеряется DLS должно быть приблизительно 200 Нм и средняя Зета потенциал приблизительно + 7 mV, как показано на рисунке 4. После модификации поверхности с таргетингом на пептиды, Общий диаметр должен быть увеличен до быть под 230 Нм и средний Зета потенциал снизился до-3.415МВ. Любое обширные отклонение от размера экструзии свидетельствует о неудачных экструзии (dчастиц >> dэкструзии), или сбой загрузки (dчастиц << dэкструзии). Агрегаты могут быть количественно с помощью DLS. Кроме того замороженные аликвоты необходимо разморозить, только один раз, как неоднократные замораживания оттаивания циклов нарушить липидные мембраны и intraparticular синтеза и агрегации (рис. 4). Как показано на рисунке 4a , fusogenic pSiNPs могут храниться в течение 30 дней и разморозить не вызывая структурных изменений. Однако, повторил циклов замораживания оттаивания одного Алиготе вызывают серьезные агрегации (d >> 1000 Нм) и в течение 4 дней с суточным циклом (рис. 4b), таким образом он сообщил, что частицы быть aliquoted для однократного использования тома.

Слияние может быть подтвержден маркировки fusogenic липидов с липофильных DiI (шаг 2.2.2) и наблюдения в пробирке локализации с помощью конфокальной микроскопии. Рисунок 1 d показывает успешное фьюжн, где fusogenic pSiNP липиды передать плазматической мембраны DiI и локализованы независимо от лизосом. Неудачной фьюжн покажет DiI локализации в цитоплазме клетки и colocalization с лизосом (рис. 1С).

Figure 1
Рисунок 1: Fusogenic пористого кремния наночастиц системы (F-pSiNP). () схемы показаны endocytic поглощения обычных наночастиц и захвата последующих от англ. (b) схемы показаны fusogenic усвоение F-pSiNPs и последующих цитозольной доставки полезной нагрузки siRNA. (c) конфокальный микроскопических изображений CAOV-3 ячейки, которая имеет endocytosed не fusogenic pSiNPs, которые были загружены с липофильных красителя DiI. CAOV-3 клетки были выращены на 80% слияния в 6 скважин плита и относиться с 10 мкл наночастиц, инкубировали при 37 ° C в 5% CO2 за 15 мин. Клетки были зафиксированы в 1% параформальдегида монтируется на стеклянных скольжениях с DAPI, сушеные и в неведении до тех пор, пока рассмотрены confocal микроскопии. (D) конфокальный микроскопических изображений CAOV-3 ячейки, которая взяла на себя fusogenic pSiNPs, которые были загружены с липофильных красителя DiI. Клетки окрашивали предварительно с зеленым LysoTracker за 1 ч при 37 ° C в 5% CO2 в соответствии с инструкциями производителя. Клетки были затем промывают PBS три раза и относились с 10 мкл загружен DiI частиц на 15 мин. Клетки были смыты с PBS три раза, чтобы удалить частицы, которые не были рассмотрены, и колодцы были заполнены с 1 мл раствора PBS и немедленно принятые для клеток воображения confocal микроскопии; DAPI представляет ядерная пятно а Лизосома лизосомальных окрашивание LysoTracker Грин; линейки шкалы представляет 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: мобильные установки Etch. () схемы показаны etch клеточных компонентов и порядок сборки; и (b)-схема установки для электрохимического травления кремния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: фотография конечного продукта F-pSiNP. () успешный синтез показаны однородных и облачное решение; (b) неудачной синтез показаны агрегации частиц (желтый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: цикл повторного замораживания оттаивания fusogenic pSiNPs вызвать агрегации. () средний размер и Дзета потенциал fusogenic pSiNPs остается стабильным в течение 30 дней, когда оттаяла после после замораживания; (b) средний размер и Дзета потенциал fusogenic pSiNPs показывает признаки агрегации и потеря структурной целостности в течение 4 дней после прохождения ежедневно циклов замораживания оттаивания. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (n = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: схема синтеза пористого кремния наночастиц. Схема, показаны электрохимического травления кремниевых пластин (шаг 1.4), старт пористого слоя (шаг 1.5), sonication пористый слой в частицы и коллекции пористого кремния наночастиц (шаг 1.6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

На рисунке 5показан синтеза наночастиц пористого кремния. Важным шагом в синтезе fusogenic pSiNPs находится в Загрузка шаг (шаг 3). Если объединение наночастиц fusogenic после синтеза (рис. 3), причиной может быть связано следующее: (1) хлорид кальция запасов не было подготовлено содержанием однородно, таким образом шаг 3.1.2 необходимо тщательно следовать или рафинированное; или (2) отношение pSiNP: siRNA:2 CaCl или концентрацию одного или более из этих трех компонентов не может быть оптимальным. Предложено повторно оптимизации, начиная от концентрации2 CaCl (например, изменяя от 2 М до 1 М или 3 М). Кроме того важно, чтобы убедиться, что CaCl2 от того же поставщика, как мы обнаружили, что то же химическое вещество от разных производителей привели к нижней рН на загрузку шаг и последующий отказ загрузки siRNA. PSiNPs может также быть сосредоточены, разбавленным, или дальнейшей деградации до процесса загрузки, оставляя частиц, взвешенных в РНКазы свободной воды в течение 2 дней после шага 1.6.6.

После загрузки, липидов, покрытие часто приводит к сложности в экструзии из-за концентрации или плотности частиц (шаг 4). Если забиты экструзии мембраны, заставляя экструзии могут рип мембраны. После засорения, разбирать экструдера и Замените мембрану и поддерживает новый набор если потери от засорения мал. Если потеря является большой, затем разбавить подвеска частиц и sonicate за 30 s до для экструзии. Если проблема сохраняется, рекомендуется повторно оптимизации размера pSiNP и коэффициент загрузки для сведения к минимуму агрегатов. И наконец мы предлагаем, фильтрация частиц подвеска через фильтр 0,22 мкм поры для устранения любых загрязнений или агрегатов до ячейки или животных лечения. Фильтрация особенно рекомендуется если частицы были синтезированы в среде нестерильные, или после отогрева замороженных Алиготе частиц.

Fusogenicity частицы могут быть проверены confocal микроскопии (как показано на рисунке 1 c, d) и просвечивающей электронной микроскопии относились с частицами соблюдать для пористого кремния липидов сарай ядер в цитоплазме клеток 15.

Fusogenic pSiNPs и его протокол синтеза имеют несколько ограничений. В пробирке гена глушителей приложений, представленная fusogenic pSiNPs доказали побудить > нокдаун КПД 90% в диапазоне клеточных линий в дозе 100 Нм; включая нейро 2a мыши нейробластома клеток линии, линии клеток человека рак яичников CAOV-3 и крайне трудным для transfect СЫРОГО 264.7 мыши макрофагов линии клетки. Однако, мы наблюдали > нокдаун эффективность 50% на столь же низко как 25 Нм дозы, которая была сравнима с Lipofectamine. Хотя Катионный липиды должны использоваться минимально сократить цитотоксическое действие, ранее мы продемонстрировали свою безопасность липидов дозе выше 1 мг15. В-vivo гена глушителей приложений fusogenic pSiNPs ограничены избирательности. Как Катионный липидов электростатически привлекают к любой клеточной мембраны, частицы должны использоваться в качестве локальной терапевтический, или быть поверхности, изменение ориентации группу (например, пептиды, антитела, и т.д.). Синтез протокол для fusogenic pSiNPs в настоящее время оптимизирован и ограничены только доставку siRNA. Тот же метод был проверен успешно загрузить Мирна и предположил, чтобы иметь возможность загрузить мРНК, cDNA и других крупных полезных нуклеотидов, но они до сих пор быть оптимизированы.

Представленная работа вносит значительный вклад в области генной терапии. Стандартный эталоном в пробирке генов является Lipofectamine 2000. Мы продемонстрировали, что fusogenic pSiNPs может вызвать нокдаун эффект сопоставимых, если не выше, эффективность15. Основным преимуществом fusogenic pSiNPs над Lipofectamine 2000 является его способность использоваться для в-vivo приложений с системными инъекции. В то время как другие агенты, такие как Invivofectamine 3.0, освоено в естественных условиях использования, они подходят только для печени доставки и требуют химически модифицированных малые интерферирующие РНК (с или без свесы или заблокированных нуклеиновой кислоты (LNA) структуры) для увеличения стабильность и специфичности. 16 , 17 , 18 однако, fusogenic pSiNPs может быть изменение после синтез конъюгата таргетинга постановление с простой тиоловых maleimide химии, в котором связывает группу тиоловых в нацеленности пептида (которая осуществляет дополнительную цистеина для этой цели) Двухместный стружечные углерода в maleimide кольцо в конце Пегилированный липидов в fusogenic покрытие. Кроме того высокая масса погрузки и доставки эффективность в цитоплазму клетки минимизирует необходимость для внутриклеточного специфичность и достигает сильное Джин глушителей эффект с немодифицированных малые интерферирующие РНК15. Один из недостатков fusogenic pSiNPs протокол синтеза является многодневный процесс, который является более сложным, чем коммерчески доступных трансфекции агентов. Однако в то время как ориентир продукты должны быть свежеприготовленные до трансфекции для получения лучших результатов, fusogenic pSiNPs может быть aliquoted и замороженных по крайней мере 30 дней без подрыва эффективности нокдаун.

Будущих приложений для этого метода включают оптимизацию для погрузки и доставки больших нуклеиновой кислоты полезных нагрузок, например мРНК и cDNAs. Кроме того, доставки ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белок sgRNA комплекса, или коктейль мРНК Cas9 и sgRNA, также является вариант развития, как системы является оптимальным для загрузки анионные полезных данных. В целом F-pSiNP система является модульной nanoplatform для генной терапии для лечения заболеваний за пределы инфекций, в том числе вирусные инфекции, рак и аутоиммунные заболевания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MJS является основателем научной спинакер Biosciences, Inc. и владеет долей в компании.  Хотя этот грант был определен порядок управления конфликтом интересов, на основе общей сферы охвата проекта и его потенциальную выгоду для спинакер Biosciences, Inc., результаты исследований, включенных в этой конкретной публикации может не обязательно относятся к интересам спинакер Biosciences, Inc. Условия этого соглашения были рассмотрены и утверждена в университете Калифорнии, Сан-Диего в соответствии со своей политикой конфликта интересов. Другие авторы имеют ничего не разглашать.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается национальными институтами здравоохранения через контракт # R01 AI132413-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6, (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91, (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18, (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9, (1), 1911 (2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136, (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31, (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31, (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31, (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9, (1), 1969 (2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63, (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8, (1), 2045893217750613 (2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
Синтез, функционализации и характеристика Fusogenic пористого кремния наночастиц для доставки олигонуклеотида
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).More

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter