Синтез, функционализации и характеристика Fusogenic пористого кремния наночастиц для доставки олигонуклеотида
Summary
Мы демонстрируем синтеза наночастиц fusogenic пористого кремния для эффективного в vitro и in vivo олигонуклеотида доставки. Пористого кремния наночастиц загружаются с siRNA сформировать ядро, которое покрыно fusogenic липиды путем экструзии для формирования корпуса. Нацеленности остаток функционализации и гранулометрического состава.
Abstract
С появлением генной терапии разработка системы доставки эффективной в естественных условиях нуклеотида грузоподъемность стала параллельного импорта. Fusogenic пористого кремния наночастиц (F-pSiNPs) недавно продемонстрировали высокий в-vivo гена, глушителей эффективность из-за его высокой олигонуклеотида загрузки способности и уникальные клеточного поглощения путь, который избегает эндоцитоза. Синтез F-pSiNPs представляет собой многоэтапный процесс, который включает в себя: (1) Загрузка и герметизации полезных олигонуклеотида в порах кремния; (2) одновременно покрытие и калибровки fusogenic липидов вокруг ядра пористого кремния; и (3) спряжение ориентации пептидов и мойка для удаления избыточных олигонуклеотида, кремния мусора и пептида. Однородность размера частицы характеризуется Динамическое рассеяние света, и его структура ядро оболочка может быть проверена путем просвечивающей электронной микроскопии. Fusogenic усвоение проверяется путем загрузки липофильных красителя, 1, 1′-dioctadecyl-3,3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (дии), в fusogenic липидного бислоя и рассматривая его клетки in vitro соблюдать плазматической мембраны, окрашивание по сравнению с endocytic локализаций. Ориентации и in vivo гена глушителей узкоспециализированного ранее были количественно в мышиной модели пневмонии золотистый стафилококк , в котором, как ожидается, помочь F-pSiNPs в дом к месту инфекции таргетинга пептид. Помимо его применения в инфекции S. aureus F-pSiNP система может использоваться для доставки любого олигонуклеотида для генной терапии широкого спектра заболеваний, в том числе вирусные инфекции, рак и аутоиммунные заболевания.
Introduction
Генная терапия модулирует конкретный ген выражение для получения терапевтические результаты. Многочисленные инструменты для модуляции гена были обнаружены и изучены, включая рибонуклеиновой кислоты вмешательства (RNAi) с помощью олигонуклеотиды (например, короткие интерферирующие РНК (siRNA)1,2, микроРНК (miRNA)3,4 ), ДНК плазмиды5,6, nucleases (например, цинковый палец, ТАЛЕНС)7,8и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем9,10. Хотя механизм действия каждого инструмента отличается, все инструменты должны достичь цитоплазмы клетки или ядро быть активными. Таким образом хотя эти инструменты доказали, чтобы вызвать значительный эффект в модуляции экспрессии генов в пробирке, в естественных условиях эффективность страдает от внеклеточные и внутриклеточных препятствий. С тем, что инструменты являются биологического происхождения, многие ферменты и распродажа систем существуют в нашем теле, которые имеют возможность снизить или удалить иностранных молекул11. Даже в случае инструменты достижения целевую ячейку, они страдают от эндоцитоз; режим клеточного поглощения, который инкапсулирует и ловушки инструменты в кислой желудка как пузырьки, которые деградируют или высылать инструменты из клетки. В самом деле исследования показали, что наночастицы липидов являются endocytosed через макропиноцитозом, из которых около 70% малых интерферирующих РНК exocytosed от клеток в течение 24 ч поглощения12,13. Большинство из оставшихся малых интерферирующих РНК деградации через лизосомальных пути, и в конечном итоге лишь 1-2% малых интерферирующих РНК, которая первоначально проникает в клетку с наночастицами добиться от англ побег подвергаться потенциально RNAi13,14 .
Мы недавно разработали fusogenic пористого кремния наночастиц (F-pSiNPs), у малых интерферирующих РНК загружается ядро, состоящий из пористого кремния наночастиц и липидов оболочки fusogenic15. F-pSiNPs представляют три основных преимущества перед другими системами доставки обычных олигонуклеотида: (1) fusogenic липидов, покрытие, что позволяет частицы обойти эндоцитоза и доставить все полезные данные непосредственно в цитоплазме клеток (по сравнению с 1-2% достигнутые endocytosed частицы13,14) (рис. 1); (2) высокая массовой загрузки интерферирующей РНК в pSiNPs (> 20 wt % по сравнению с 1-15 wt % обычных систем)15, который быстро деградируют в цитоплазме (после основных частиц пролить липидного покрытия через fusogenic поглощения) для выпуска малых интерферирующих РНК; и (3) ориентации пептид сопряжения для селективного самонаведения для желаемого типы клеток в естественных условиях.
F-pSiNP система продемонстрировала значительный Джин глушителей эффективность (> 95% в пробирке; > 80% в естественных условиях) и последующего терапевтического эффекта в роковой мыши модели S. aureus пневмонии; результаты которого были опубликованы ранее15. Однако сложная структура системы F-pSiNP требует осторожного обращения и доработаны оптимизации для создания единообразной и стабильной наночастиц. Таким образом цель этой работы – представить подробный протокол, а также стратегий оптимизации для синтеза, функционализации и характеристика F-pSiNPs использоваться в адресности малые интерферирующие РНК для глушителей эффект мощным ген.
Protocol
Representative Results
Discussion
На рисунке 5показан синтеза наночастиц пористого кремния. Важным шагом в синтезе fusogenic pSiNPs находится в Загрузка шаг (шаг 3). Если объединение наночастиц fusogenic после синтеза (рис. 3), причиной может быть связано следующее: (1) хлорид кальция запасов не было под?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается национальными институтами здравоохранения через контракт # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
