Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Synthese, Functionalization en karakterisatie van Fusogenic poreuze Silicon nanodeeltjes voor Oligonucleotide levering

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59440
Automatic Translation
1, 1,2
1Materials Science and Engineering Program, University of California, San Diego, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

Summary

We laten zien dat de synthese van fusogenic poreuze silicon nanodeeltjes voor effectieve in vitro en in vivo oligonucleotide levering. Poreuze silicon nanodeeltjes worden geladen met siRNA vormen de kern, die is bedekt door fusogenic lipiden door middel van extrusie te vormen van de shell. Targeting deel functionalization en karakterisering van het deeltje worden opgenomen.

Abstract

Met de komst van gentherapie, de ontwikkeling van een effectief in vivo nucleotide-nettolading uitvoeringssysteem geworden van parallelle invoer. Fusogenic poreuze silicon nanodeeltjes (F-pSiNPs) hebben onlangs aangetoond dat hoge in vivo gene werkzaamheid te wijten aan de hoge oligonucleotide laden capaciteit en unieke cellulaire opname traject dat endocytose vermijdt zwijgen. De synthese van F-pSiNPs is een multi-stap proces dat omvat: (1) laden en afdichten van oligonucleotide payloads in het silicium poriën; (2) gelijktijdige coating en dimensionering van fusogenic lipiden rond de poreuze silicon kernen; en (3) vervoeging van targeting peptiden en wassen als u wilt verwijderen van de overtollige oligonucleotide, silicium puin en peptide. Van het deeltje grootte uniformiteit wordt gekenmerkt door Dynamische lichtverstrooiing en de structuur van de kern-shell kan worden gecontroleerd door transmissie-elektronenmicroscopie. De opname van de fusogenic is gevalideerd door het laden van een lipofiele kleurstof, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI), in de fusogenic lipide dubbelgelaagde en behandelen naar cellen in vitro te observeren voor plasmamembraan kleuring endocytotische lokalisaties. De doelgerichtheid en in vivo gene silencing efficacies waren eerder gekwantificeerd in een muismodel van Staphylococcus aureus -pneumonie, waarin de targeting peptide wordt verwacht om te helpen de F-pSiNPs naar huis naar de plaats van de infectie. Buiten de toepassing ervan in S. aureus -infectie, kan de F-pSiNP-systeem worden gebruikt voor elke oligonucleotide voor gentherapie van een breed scala van ziekten, met inbegrip van virale infecties, kanker en auto-immune ziekten.

Introduction

Gentherapie moduleert specifieke genexpressie om te verkrijgen van een therapeutische resultaat. Tal van hulpmiddelen voor gene modulatie hebben ontdekt en bestudeerd, met inbegrip van RNA zuur interferentie (RNAi) met behulp van oligonucleotides (bijvoorbeeld korte Mengend RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmiden5,6, nucleasen (bijvoorbeeld zink vinger, TALENS)7,8, en9,10van de systemen van de CRISPR/Cas9. Terwijl van elk hulpprogramma werkingsmechanisme verschilt, moet alle hulpmiddelen van de cel cytoplasma of de celkern actief bereiken. Als zodanig, terwijl deze tools hebben bewezen voor het opwekken van aanzienlijke invloed bij het moduleren van genexpressie in vitro, lijdt in vivo werkzaamheid extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Wijten aan het feit dat de instrumenten van biologische oorsprong zijn, bestaan vele enzymen en goedkeuring systemen in ons lichaam die hebben de mogelijkheid om te degraderen of te verwijderen van de vreemde moleculen11. Zelfs in het geval lijden dat de extra de doelcel bereiken, zij aan endocytose; een modus van cellulaire opname die kapselt en de hulpprogramma's in de zure maag-achtige blaasjes die degraderen of royement van de hulpprogramma's uit de cel overlapt. In feite, hebben studies aangetoond dat lipide nanodeeltjes endocytosed via macropinocytosis worden, waaruit zijn ongeveer 70% van de siRNA exocytosed uit de cellen binnen de 24 uur van opname12,13. De meerderheid van de resterende siRNA zijn gedegradeerd door de lysosomale traject, en uiteindelijk slechts 1-2% van de siRNA die aanvankelijk de cel met de nanodeeltjes invoert bereiken endosomal ontsnappen naar potentieel ondergaan RNAi13,14 .

Onlangs hebben we de fusogenic poreus silicon nanodeeltjes (F-pSiNPs) die een siRNA-geladen kern bestaat uit poreus silicon nanodeeltjes en een fusogenic lipide shell15hebben ontwikkeld. De F-pSiNPs presenteren drie grote voordelen ten opzichte van andere conventionele oligonucleotide levering systemen: (1) een fusogenic lipide coating waardoor de deeltjes te omzeilen endocytose en de hele lading leveren rechtstreeks in het cytoplasma van de cel (tegenover de 1-2% bereikt door endocytosed deeltjes13,14) (Figuur 1); (2) hoge massa laden van siRNA in de pSiNPs (> 20 wt % vergeleken met 1-15 wt % door conventionele systemen)15, die snel degraderen in het cytoplasma (zodra de kern deeltjes werpen de lipide coating via fusogenic opname) tot het vrijgeven van siRNA; en (3) peptide vervoeging voor selectieve homing te richten gewenst celtypes in vivo.

De F-pSiNP systeem gebleken belangrijke gene werkzaamheid zwijgen (> 95% in vitro; > 80% in vivo) en latere therapeutisch effect in een fatale muismodel van S. aureus -pneumonie; de resultaten van die werden gepubliceerd eerder15. De complexe structuur van de F-pSiNP-systeem vereist echter delicate behandeling en verfijnd optimalisatie voor het genereren van homogeen en bestendig nanodeeltjes. Dus, is het doel van dit werk te presenteren een grondige protocol, evenals optimalisatie strategieën voor de synthese, functionalization en karakterisatie van F-pSiNPs moet worden gebruikt bij gerichte levering van siRNAs voor krachtige gene silencing effect.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. synthese van poreuze silicon nanodeeltjes (pSINPs)

Let op: Wees altijd voorzichtig bij het werken met waterstoffluoride (HF). Alle gidsen van veiligheid volgens het veiligheidsinformatieblad (SDS) volgen, omgaan met een HF-bevattende chemicaliën in een zuurkast en dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE; dubbele handschoenen met butyl handschoenen aan de buitenkant, butyl schort met laboratoriumjas onder, gezicht schild met veiligheidsbril onder). Alle universiteiten en R & D labs vereisen specifieke opleiding op HF veiligheid voorafgaand aan gebruik. Probeer niet om te werken met HF zonder voorafgaande goedkeuring van de veiligheidscoördinator van uw lokale lab, zoals aanvullende veiligheidsmaatregelen die hier niet worden beschreven, vereist zijn.

  1. Voorbereiding van de ETS-oplossingen
    1. Om de 3:1 HF oplossing voor etsen (gebruikt in stappen 1.3 en 1.4), vul een plastic studeerde aan de cilinder met waterige 48% HF 30 mL en 10 mL van absolute ethanol (EtOH). De oplossing moet worden opgenomen in de hoge dichtheid kunststoffen (bijvoorbeeld HDPE), zoals de HF glas lost.
    2. Om een 1:29 studeerde HF oplossing voor astronauten (gebruikt in stap 1.5), vul een plastic cilinder met 1 mL waterige 48% HF en 29 mL absolute ethanol. De oplossing moet worden opgenomen in de hoge dichtheid kunststoffen (bijvoorbeeld HDPE), zoals de HF glas lost.
    3. Maak van de 1 M KOH-oplossing in 10% EtOH voor ontbinding van de overtollige pSi (gebruikt in stappen 1.3 en 1.5).
  2. De etsen-cel instellen
    1. In een Teflon etch cel met een 8.6 cm2 etch goed (gebied wordt berekend door het meten van de diameter van het silicium oppervlak beschikbaar voor etsen binnen de O-ring, en het berekenen van het gebied door A = πr2), plaats in aflopende volgorde (Figuur 2a): (1) de Teflon cel top; (2) een O-ring; (3) in een kwartaal stuk van de enkele kristallen (1 0 0) - georiënteerde p ++ - type silicium wafer gesneden in kwarten (met behulp van een diamantslijper); (4) aluminium folie; en (5) de Teflon cel basis met schroeven voorzichtig verscherpt ter voorkoming van lekkage.
    2. Vul de put met EtOH. Neem een veeg en invoegen in de spleet tussen de Teflon cel boven- en base. Als het veeg droog na verwijdering is, is de cel etsen verzegeld. Als NAT, de cel lekt, en draai verder de schroeven totdat verzegeld.
  3. Elektrolytisch polijsten de silicium wafer
    1. Doen de geassembleerde etsen-cel in een zuurkast.
    2. Vul de put met 10 mL 3:1 HF-oplossing.
    3. Sluit de positieve leiding aan de aluminiumfolie (elektrode) uit de etsen-cel en de negatieve lood met de platinum spoel (contra elektrode) ondergedompeld in de 3:1 HF-oplossing van de etsen-cel te voltooien van het circuit (Figuur 2b).
    4. Uitvoeren van een constante stroom bij 50 mA cm-2 voor 60 s. Eenmaal etch is klaar, de cel verwijderen uit het circuit, en de 3:1 HF zorgvuldig met behulp van een injectiespuit spoelen. Spoel met EtOH driemaal.
    5. Ontbinden weg de geëtste laag door het invullen van de put langzaam met 10 mL van 1 M KOH. Wacht totdat de borrelen afneemt.
    6. Spoel de KOH met water drie keer, waarna met EtOH driemaal.
  4. Elektrochemisch etsen poreuze lagen in silicium wafer
    1. Uitvoeren van een wisselstroom van een vierkante golfvorm, met lagere current density 50 mA/cm,2 voor 0,6 s en hoge stroomdichtheid van 400 mA/cm2 voor 0.36 s herhaald voor 500 cycli.
    2. Eenmaal etch is klaar, de cel verwijderen uit het circuit, en de 3:1 HF zorgvuldig met behulp van een injectiespuit spoelen. Spoel met EtOH driemaal.
  5. Tillen-off van de poreuze laag van het silicium wafer
    1. Vul de put met 10 mL van de 1:29 HF-oplossing.
    2. Uitvoeren van een constante van 3.7 mA/cm2 voor 250 s. Eenmaal etch is klaar, het verwijderen van de cel van het circuit. De pSi-laag wellicht zichtbaar rimpels die aangeeft detachement van het zegel van de kristallijn silicium. Voorzichtig wassen de 1:29 HF-oplossing en spoel met EtOH drie keer, daarna met water drie keer.
    3. Met behulp van een pipet tip, stevig barst van de omtrek van de pSi-laag voor volledige detachement. Met behulp van EtOH, etch verzamelen de pSi fragmenten (chips) uit de Teflon cel in een wegende boot. De chips overbrengen in een glazen ampul. De pSi-chips mogen worden bewaard bij kamertemperatuur in EtOH meer dan 6 maanden voor opslag.
    4. Los eventuele resterende poreuze silicium op het zegel weg door het invullen van de put langzaam met 10 mL van 1 M KOH. Wacht totdat de borrelen afneemt.
    5. Spoel de KOH met water drie keer, waarna met EtOH driemaal.
    6. Herhaal stap 1.3-1.5 totdat de gehele wafer dikte heeft is geëtst.
  6. Sonicating poreuze lagen voor nanoparticle vorming
    1. Vervang het oplosmiddel van de flacon van glas met pSi chips uit EtOH tot 2 mL DI water.
    2. Stevig sluiten van het GLB, en verzegel met behulp van parafilm.
    3. Plaats de glazen ampul in een ultrasoonapparaat bad en opgeschort zodat het volume van pSi chips is volledig ondergedompeld onder het oppervlak.
    4. Bewerk ultrasone trillingen ten voor 12u bij 35 kHz en RF vermogen van 48W. Om te voorkomen dat belangrijke waterverlies tijdens ultrasoonapparaat, plaats een maatkolf gevuld met water, omgekeerd zodat de opening van de kolf het oppervlak van het waterbad raakt.
    5. Plaats de glazen ampul op een vlakke ondergrond voor 1 h om grotere deeltjes te vestigen op de bodem. Verzamelen van de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet; de schorsing bevat sub-100 nm pSiNPs.

2. bereiding van fusogenic lipide film

  1. Voorbereiding van de voorraadoplossingen van lipide
    1. Zorg in een zuurkast, 10 mg/mL voorraden van lipiden door hydraterende DMPC, DSPE-PEG-MAL en DOTAP lipiden in chloroform. Deze stamoplossingen kunnen worden bewaard bij-20 ° C voor maximaal 6 maanden onder strakke parafilm zegel.
  2. Maken van de fusogenic-lipide-film
    Opmerking: De samenstelling van de fusogenic is gemaakt van de lipiden, DMPC, DSPE-PEG en DOTAP, op de molaire verhouding tussen 76.2:3.8:20 en 96.2:3.8:0, respectievelijk.
    1. Meng in een glazen ampul, 72.55 μL van 19.63 μL van DOTAP, DMPC en 15.16 μL van DSPE-PEG door pipetteren.
    2. Optioneel: Voor fluorescerende etikettering van de lipide-coating, bovendien toevoegen 20 µL van DiI opgelost in EtOH bij een concentratie van 1 mg/mL.
    3. Plaats de ampul in een zuurkast met een losse dop om de chloroform te verdampen 's nachts. De gedroogde film zullen een bewolkt harde gel-achtige substantie aan de onderkant van de flacon.

3. veilig laden en afdichten van siRNA in pSiNPs

  1. Voorbereiding van het calciumchloride laden voorraad
    1. Los 1.11 g CaCl2 in 10 mL water RNAse-vrij te maken van een 2 M CaCl2 oplossing.
    2. Centrifugeer de oplossing bij > 10.000 x g voor 1 min te regelen van de aggregaten en verzamelen de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet. Als alternatief, filtreer de oplossing door een 0,22 µm filter.
  2. Voorbereiding van siRNA laden voorraad
    1. Hydrate of siRNA tot 150 µM in RNAse-gratis water verdund. Deze stamoplossing kan worden aliquoted en bevroren bij-20 ° C bewaard gedurende ten minste 30 dagen gezien het feit dat het geen frequente bevriezen-ontdooien cycli ondergaan.
  3. Laden van siRNA in pSiNPs met calciumchloride
    1. Bereiden een iced ultrasoonapparaat bad.
    2. Onder de 15 min met ultrasone trillingen, zachtjes Pipetteer 150 µL van siRNA en 700 µL van 2 M CaCl2 in 150 µL van pSiNP. Zorg ervoor dat het deksel van de microcentrifuge buis openlaten voor gas generatie.
    3. Het verwijderen van de buis met 1 mL van siRNA-geladen calcium gecoat pSiNPs uit het ultrasoonapparaat.

4. coating siRNA-geladen pSiNPs met lipiden van fusogenic

  1. Voorbereiding van de liposomen extrusie kit
    1. Vul een groot bekerglas met DI water. Weken 1 polycarbonaat membraan (200 nm poriën), en 4 filter ondersteunt door hen drijvend op het watervlak. De liposomen extrusie kit monteren door het volgen van de instructies van de fabrikant
  2. Hydraterende de lipide-film met siRNA-geladen pSiNps
    1. Hydrateer de gedroogde lipide-film in de glazen ampul met 1 mL van siRNA-geladen calcium gecoat pSiNPs verkregen uit stap 3.3.3. Pipetteer totdat alle lipiden film hebben opgeheven vanaf de onderkant van de flacon en hebben gemengd in een homogene oplossing van bewolkt.
    2. Plaats van een magnetische roeren bar in de glazen ampul, en plaats de ampul op een hete plaat voor het opwarmen van de deeltjes naar 40 ° C (of hoog genoeg boven de lipiden fase transformatietemperatuur om de lipiden in de meer fluidic vloeibare fase) terwijl magnetisch Roer de oplossing voor 20 min.
  3. Diepte van het lipide-gecoate pSiNPs voor controle van de grootte
    1. De 1 mL van lipide-gecoate pSiNP-siRNA oplossing in de extrusie spuit gecombineerd. Voeg een lege spuit aan één zijde van de extruder, en de gevulde spuit aan de andere kant.
    2. Allereerst dat extrusie duwen de zuiger langzaam in te duwen de deeltjes uit een spuit, door het membraan van polycarbonaat, en in de andere. Herhaal 20 keer. Als de zuiger vastzit, kunnen het filter en de membraan worden verstopt. Demonteren van de extruder en vervangen van het membraan en filter ondersteunt. Als het probleem aanhoudt, Verdun de deeltjes tot verstopping beheersbaar is.
    3. De geëxtrudeerde deeltjes in een buis van microcentrifuge verzamelen.

5. de vervoeging van targeting van peptiden

  1. Conjugating targeting peptide aan lipide coating
    1. Bereid de voorraad van de peptide met 1 mg/mL peptide concentratie in RNAse-gratis water.
    2. In de buis van de microcentrifuge met fusogenic Voeg lipide-gecoate pSiNPs, 100 µL van de 1 mg/mL peptide materieel en Pipetteer zachtjes. Houd de buis statische bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten (als alternatief, > 2 uur bij 4 ° C).
    3. Als u wilt verwijderen van de overtollige peptide of siRNA en andere hulpstoffen, wassen in een 30 kDa centrifugaal filteren door spinnen bij 5.000 x g bij 25 ° C gedurende 1 h. Centrifuge tweemaal meer met 1 mL PBS onder dezelfde instelling.
    4. Resuspendeer de uiteindelijke peptide-geconjugeerde fusogenic lipide-gecoate pSiNPs in PBS met de gewenste concentratie. De deeltjes kunnen nu aliquoted en bevroren bij-80 ° C voor opslag van ten minste 30 dagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een succesvolle synthese van fusogenic pSiNPs moet produceren een homogene, enigszins ondoorzichtig oplossing (Figuur 3a). Falen om de verhouding en de concentratie van pSiNPs te optimaliseren: siRNA: CaCl2 kan leiden tot samenvoeging bij het laden van (Figuur 3b). De deeltjes zijn warm geperst door 200 nm membranen, de gemiddelde hydrodynamische diameter van de pSiNPs van de fusogenic gemeten door DLS moeten ongeveer 200 nm, en het gemiddelde zeta-potentieel ongeveer HALSLENGTE + 7 mV zoals weergegeven in Figuur 4. Na wijziging van de oppervlakte met targeting peptiden, de totale diameter moet worden verhoogd worden onder 230 nm, en het gemiddelde zeta-potentieel daalde neer aan-3.4 mV-15. Uitgebreide afwijkingen van de grootte van de extrusie is een indicatie van mislukte extrusie (ddeeltje >> dextrusie), of niet laden (ddeeltje << dextrusie). Samenvoegingen kunnen ook worden gekwantificeerd aan de hand DLS. Bovendien moeten de bevroren aliquots worden ontdooid slechts eenmaal in, als herhaalde bevriezen-ontdooien cycli verstoren het lipide membraan en intraparticular fusion en aggregatie (Figuur 4). Zoals blijkt uit figuur 4a , kan fusogenic pSiNPs worden opgeslagen voor 30 dagen en ontdooid zonder structurele veranderingen. Echter herhaald bevriezen-ontdooien cycli van een één aliquot veroorzaken ernstige aggregatie (d >> 1000 nm) en binnen 4 dagen van de dagelijkse cyclus (figuur 4b), dus het is aangeraden dat de deeltjes aliquoted worden voor eenmalig gebruik volumes.

Fusie kan worden bevestigd door de etikettering de lipiden van fusogenic met de lipofiele DiI (stap 2.2.2) en observeren van de in vitro lokalisatie gebruiken confocale microscopie. Figuur 1 d toont succesvolle fusie, waar de fusogenic pSiNP van lipiden de DiI overbrengen in het plasma-membraan en onafhankelijk van lysosomen zijn gelokaliseerd. Mislukte fusie zal tonen de DiI lokalisatie in het cytoplasma van de cel en de colocalization met lysosomen (Figuur 1 c).

Figure 1
Figuur 1: Fusogenic poreuze silicium nanoparticle systeem (F-pSiNP). (een) schematisch weergegeven: endocytotische benutting van conventionele nanodeeltjes en latere endosomal entrapment. (b) schematisch weergegeven: fusogenic opname van de F-pSiNPs en daaropvolgende cytosolische levering van de siRNA lading. (c) Confocal microscopische opname van een CAOV-3 cel met endocytosed niet-fusogenic-pSiNPs die zijn geladen met DiI lipofiele kleurstof. CAOV-3 cellen werden verbouwd tot 80% samenkomst in een 6 goed-plaat, behandeld met 10 µL van nanodeeltjes en geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO2 voor 15 min. De cellen waren opgelost in 1% paraformaldehyde te worden gemonteerd op glas dia's met DAPI, gedroogd en in het donker totdat onderzocht door confocale microscopie bewaard. (D) confocal microscopische opname van een CAOV-3-cel, die heeft overgenomen fusogenic pSiNPs die zijn geladen met DiI lipofiele kleurstof. Cellen werden vooraf gekleurd met LysoTracker Green gedurende 1 uur bij 37 ° C in 5% CO2 volgens de instructies van de fabrikant. De cellen werden dan gewassen PBS driemaal, en werden behandeld met 10 μL van DiI-geladen deeltjes gedurende 15 minuten. De cellen werden gewassen met PBS driemaal te verwijderen van alle deeltjes die niet zijn overgenomen, en de putjes werden gevuld met 1 mL PBS en onmiddellijk wordt genomen voor live-cel beeldvorming door confocale microscopie; DAPI vertegenwoordigt nucleaire vlek en lysosoom lysosomale kleuring door LysoTracker Green; schaal staaf vertegenwoordigt 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: cel setup Etch. (een) schematisch weergegeven: etch celbestanddelen en vergadering orde; en (b) diagram van setup voor elektrochemisch etsen van silicium. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: foto van het eindproduct van de F-pSiNP. (een) succesvol synthese waaruit blijkt van homogene en bewolkt oplossing; (b) mislukte synthese tonen aggregatie van deeltjes (geel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: herhaalde freeze-dooi cyclus van fusogenic pSiNPs veroorzaken aggregatie. (een) gemiddelde omvang en zeta-mogelijkheden van fusogenic pSiNPs blijft gestaag voor 30 dagen wanneer ontdooid zodra na invriezen; (b) gemiddelde omvang en zeta-mogelijkheden van de fusogenic pSiNPs toont tekenen van aggregatie en verlies van de structurele integriteit binnen 4 dagen na het ondergaan van dagelijks de cycli bevriezen-ontdooien. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (n = 5). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Diagram van poreuze silicium nanoparticle synthese. Schema toont elektrochemisch etsen van silicium wafer (stap 1.4), astronauten van de poreuze laag (stap 1.5), ultrasoonapparaat van de poreuze laag tot deeltjes, en het verzamelen van poreuze silicon nanodeeltjes (stap 1.6). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Synthese van poreuze silicon nanodeeltjes is afgebeeld in Figuur 5. De kritische stap in de synthese van fusogenic pSiNPs is in de laden stap (stap 3). Als de fusogenic-nanodeeltjes zijn aggregeren na synthese (Figuur 3), de reden kan worden veroorzaakt door het volgende: (1) calciumchloride voorraad homogeen niet bereid was, dus stap 3.1.2 moet zorgvuldig gevolgd of geraffineerd; of (2) de verhouding tussen pSiNP: siRNA: CaCl2 of de concentratie van een of meer van de drie onderdelen mogelijk niet optimaal. Opnieuw optimalisatie vanaf de CaCl2 -concentratie wordt voorgesteld (bijvoorbeeld wijzigen van 2 M 1 M tot 3 M). Bovendien is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de CaCl2 van dezelfde leverancier is, zoals we gevonden dat dezelfde chemische stof bij verschillende leveranciers hebben geleid tot lagere pH op de laden stap, en laden van siRNA latere mislukt. De pSiNPs kan ook worden geconcentreerd, verdund, of verder aangetaste voorafgaand aan het laadproces door het verlaten van de deeltjes die in het water RNAse-gratis voor 2 dagen na stap 1.6.6.

Na het laden, leidt de lipide coating vaak tot problemen in de extrusie als gevolg van de concentratie of de dichtheid van de deeltjes (stap 4). Als de extrusie membraan is verstopt, kan dwingen de extrusie rippen van het membraan. Bij verstopping, het demonteren van de extruder en vervangen door het membraan en het ondersteunt een nieuwe set als het verlies van verstopping klein is. Als het verlies groot is, vervolgens verdund het deeltje schorsing en bewerk ultrasone trillingen ten voor 30 s voorafgaand aan de extrusie. Als het probleem aanhoudt, wordt opnieuw optimalisatie van pSiNP grootte en laden in verhouding tot het minimaliseren van aggregaten geadviseerd. Tot slot, wij stellen voor filtering van het deeltje schorsing door een 0,22 µm-porie-filter om te elimineren alle verontreinigingen of aggregaten voorafgaand aan cel of behandeling van dierlijk. Filteren is vooral aan te raden als de deeltjes werden gesynthetiseerd in een niet-steriele omgeving, of na het ontdooien van een bevroren aliquoot deel van de deeltjes.

De fusogenicity van de deeltjes kan worden gevalideerd door confocale microscopie (zoals afgebeeld in Figuur 1 c, d), en transmissie-elektronenmicroscopie van de cellen met de deeltjes te observeren voor lipide-loods poreuze silicon kernen in het cytoplasma behandeld 15.

De pSiNPs van de fusogenic en het bijbehorende protocol van synthese hebben een paar beperkingen. Voor in-vitrodiagnostiek gen monddood maken van de toepassingen, de gepresenteerde fusogenic pSiNPs hebben bewezen voor het opwekken van > 90% vechtpartij efficiëntie in een waaier van cellijnen bij de 100 nM dosis; met inbegrip van de Neuro-2a muis neuroblastoom cellijn, de menselijke eierstokkanker cellijn van CAOV-3 en de notoir moeilijk-aan-transfect RAW 264.7 muis macrofaag cellijn. Echter we hebben waargenomen > 50% vechtpartij efficiëntie op zo laag als 25 nM dosis, die was vergelijkbaar met die van Lipofectamine. Terwijl kationische lipiden moeten minimaal worden gebruikt voor cytotoxisch effect verminderen, hebben we de veiligheid bij een lipide dosis van maar liefst 1 mg15eerder aangetoond. Voor in vivo gen monddood maken van de toepassingen, zijn de pSiNPs van de fusogenic beperkt door de selectiviteit. Zoals de kationische lipiden via een elektrostatisch proces naar een celmembraan aantrekken, de deeltjes moeten worden gebruikt als een lokale therapeutische of oppervlak bewerkt met een gerichte groep (bijv. peptiden, antilichamen, enz.). De synthese protocol voor fusogenic pSiNPs is momenteel geoptimaliseerd en beperkt voor siRNA levering alleen. Dezelfde methode is geverifieerd voor het met succes laden van miRNA, en veronderstelde is om het laden van mRNA, cDNA en andere grotere nucleotide-nettoladingen te kunnen, maar deze nog moeten worden geoptimaliseerd.

Het gepresenteerde werk levert een belangrijke bijdrage aan het gebied van gentherapie. De standaard benchmark voor in vitro gene silencing is de Lipofectamine 2000. We hebben aangetoond dat de pSiNPs van de fusogenic een vechtpartij effect van vergelijkbare, kan veroorzaken als niet hoger, efficiëntie15. Het grote voordeel van de fusogenic pSiNPs over Lipofectamine 2000 is de mogelijkheid om te worden gebruikt voor in vivo toepassingen met systemische injecties. Terwijl andere agenten, zoals Invivofectamine 3.0, hebben al gecommercialiseerd voor in vivo gebruik, ze zijn alleen geschikt voor lever levering, en vereisen van chemisch gewijzigd siRNAs (met of zonder overhangen, of in vergrendelde nucleïnezuur (LNA) structuur) te verhogen stabiliteit en specificiteit. 16 , 17 , 18 de fusogenic pSiNPs kan echter gewijzigd na synthese te conjugaat targeting wordt met eenvoudige thiol-maleimide chemie, waarin een thiol-groep in de targeting peptide (die draagt een extra cysteïne voor dit doel) bindt een dubbel-gebonden koolstof in de ring van de maleimide aan het einde van gepegyleerde lipiden in de coating van fusogenic. Bovendien, de hoogmis laden en levering werkzaamheid naar het cytoplasma van de cel minimaliseert de noodzaak van intracellulaire specificiteit en sterke gene silencing effect met niet-gemodificeerde siRNAs15verkrijgt. Een nadeel van de fusogenic pSiNPs is dat het protocol van de synthese is een meerdaags proces dat is complexer dan de verkrijgbare transfectie agenten. Echter terwijl de benchmark-producten moeten vers worden bereid voor Transfectie om de beste resultaten te verkrijgen, mag de pSiNPs van de fusogenic aliquoted en bevroren voor ten minste 30 dagen zonder het afnemen van de vechtpartij efficiëntie.

Toekomstige toepassingen voor deze methode omvatten de optimalisatie voor het laden en de levering van grotere laadvermogens van nucleic zuur, zoals mRNAs en cDNAs. Bovendien, is levering van het complex van de eiwit-sgRNA CRISPR/Cas9, of een cocktail van de Cas9 mRNA en sgRNA, ook een ontwikkeling optie, aangezien het systeem optimaal is voor het laden van anionactieve laadvermogens. Globaal, is het systeem van de F-pSiNP is een modulaire nanoplatform voor gentherapie om ziekten buiten infecties, met inbegrip van virale infecties, kanker en auto-immune ziekten te behandelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MJS is een wetenschappelijke grondlegger van Spinnaker Biosciences, Inc., en heeft een aandelenbelang in het bedrijf.  Hoewel deze subsidie is vastgesteld voor het beheer van de belangenconflicten op basis van het algemene toepassingsgebied van het project en zijn potentiële voordelen voor Spinnaker Biosciences, Inc., kunnen de onderzoeksresultaten opgenomen in deze bijzondere publicatie niet noodzakelijkerwijs betrekking hebben op de belangen van Spinnaker Biosciences, Inc. De bepalingen van deze overeenkomst zijn herzien en goedgekeurd door de University of California, San Diego overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling. Andere auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health door contract # R01 AI132413-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).

Tags

Engineering drug kwestie 146 poreuze silicium nanogeneeskunde delivery gentherapie siRNA synthese nanoparticle liposomen fusion oligonucleotide knockdown
Synthese, Functionalization en karakterisatie van Fusogenic poreuze Silicon nanodeeltjes voor Oligonucleotide levering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis,… More

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter