Summary
נדגים את הסינתזה של חלקיקים fusogenic הסיליקון הנקבובי למסירה oligonucleotide במבחנה, ויוו יעיל. הסיליקון הנקבובי חלקיקים נטענים עם siRNA ליצירת הליבה, שהטיחה מאת fusogenic שומנים דרך ההבלטה כדי ליצור את הקליפה. Functionalization moiety מיקוד איפיון חלקיקים הינם כלולים.
Abstract
עם כניסתו של טיפול גנטי, הפך התפתחות מערכת משלוחים יעיל ויוו נוקלאוטיד-המטען של ייבוא מקביל. Fusogenic הסיליקון הנקבובי חלקיקים (F-pSiNPs) הראו לאחרונה גבוהה ג'ין ויוו להשתיק היעילות עקב שלה oligonucleotide גבוהה טעינה קיבולת ועל מסלול ייחודי ספיגת הסלולר זה מונע אנדוציטוזה. הסינתזה של F-pSiNPs הוא תהליך רב שלבי הכולל: טעינת ואיטום (1) oligonucleotide דים על נקבוביות הסיליקון; (2) ציפוי סימולטני ושינוי של fusogenic שומנים סביב הליבות הסיליקון הנקבובי; (3) ההטיה של פילוח פפטידים ושטיפת להסיר את עודף oligonucleotide, סיליקון פסולת ופפטיד. האחידות בגודל של החלקיק מאופיין על ידי פיזור אור דינאמי, מבנהו ליבה-קליפה ניתן לבירור על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. תפיסה fusogenic מאומתת על-ידי טעינת lipophilic לצבוע, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', פרכלורט 3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI), לתוך fusogenic שכבה ליפידית וטיפול זה לתאים במבחנה להתבונן על קרום פלזמה מכתים לעומת endocytic localizations. המטרה ואת ויוו ג'ין שתיקה efficacies היו בעבר לכמת במודל של עכברים של דלקת ריאות Staphylococcus aureus , שבו פפטיד מיקוד צפוי לעזור F-pSiNPs לבית לאתר של זיהום. מעבר היישום שלה ב- S. aureus זיהום, מערכת F-pSiNP עשוי לשמש כדי לספק כל oligonucleotide עבור ריפוי גנטי של מגוון רחב של מחלות, כולל זיהומים נגיפיים, סרטן ומחלות אוטואימוניות.
Introduction
ריפוי גנטי ממיקרו ביטוי גנים ספציפיים כדי לקבל תוצאה טיפולית. כלים רבים עבור ג'ין אפנון יש כבר גילה ולמד, כולל הפרעות חומצה ריבונוקלאית (RNAi) באמצעות oligonucleotides (למשל, קצר מפריעות RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), ה-DNA פלסמידים5,6, nucleases (למשל, אצבע אבץ, TALENS)7,8, ו CRISPR/Cas9 מערכות9,10. בזמן של הכלי כל מנגנון פעולה שונה, כל הכלים צריך להגיע הציטופלסמה של התא או את הגרעין להיות פעילים. ככזה, בעוד כלים אלה הוכיחו לזירוז השפעה משמעותית של הכוח ויסות גנים במבחנה, היעילות ויוו סובל מכשולים חוץ-תאית, תאיים. בשל העובדה כי הכלים הם ממקור ביולוגי, אנזימים רבים, מערכות סליקה קיים בגוף שלנו יש את היכולת להשפיל או להסיר את מולקולות זרות11. אפילו במקרה כי הכלים להגיע לתא המטרה, הם סובלים אנדוציטוזה; מצב של ספיגת הסלולר מבצע אנקפסולציה, מלכודות הכלים בשלפוחית כמו קיבה חומצי לבזות או לגרש את הכלים מחוץ לתאים. למעשה, מחקרים הראו כי השומנים חלקיקים הם endocytosed ויה macropinocytosis, שממנו הם כ- 70% siRNA exocytosed את התאים בתוך 24 שעות של ספיגת12,13. רוב siRNA הנותרים הם השפיל דרך השביל lysosomal, ולהשיג בסופו של דבר רק 1-2% של siRNA המוסיפה בתחילה את התא עם חלקיקים endosomal לברוח העלול לעבור RNAi13,14 .
לאחרונה פיתחנו fusogenic הסיליקון הנקבובי חלקיקים (F-pSiNPs) בעלות של הליבה siRNA טעון מורכב הסיליקון הנקבובי חלקיקים, ו fusogenic השומנים מעטפת15. F-pSiNPs מציגים שלושה יתרונות עיקריים על פני מערכות אחרות oligonucleotide המקובלת: (1) ליפופרוטאין fusogenic ציפוי המאפשר את החלקיקים לעקוף אנדוציטוזה ולספק את כל המטען ישירות בציטופלסמה תא (לעומת % 1-2 מושגת על-ידי endocytosed חלקיקים13,14) (איור 1); (2) הטעינה מסה גבוהה של siRNA ב pSiNPs (> 20% wt לעומת wt 1-15% על ידי מערכות קונבנציונלי)15, אשר במהירות לבזות בציטופלסמה (פעם החלקיקים הליבה לשפוך את ציפוי השומנים דרך ספיגת fusogenic) כדי לשחרר את siRNA; (3) מיקוד פפטיד ההטיה של יונת סלקטיבית כדי הרצוי סוגי תאים ויוו.
מערכת F-pSiNP הוכיחה משמעותית ג'ין להשתיק יעילות (> גופית; 95% > 80% ויוו) ואת האפקט הטיפולי עוקבות במודל של עכברים קטלנית של S. aureus דלקת ריאות; התוצאות אשר פורסמו בעבר15. עם זאת, המבנה המורכב של מערכת F-pSiNP דורש התייחסות רגישה ואופטימיזציה מכויל כדי ליצור חלקיקים אחיד ויציב. לפיכך, מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול יסודי, וכן אסטרטגיות אופטימיזציה עבור סינתזה, functionalization, אפיון של F-pSiNPs כדי לשמש יישוב מסירת siRNAs לאפקט שתיקה ג'ין חזק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של הסיליקון הנקבובי חלקיקים (pSINPs)
התראה: תמיד באמצעי זהירות כאשר עובדים עם חומצה הידרופלואורית (HF). בצע את כל מדריכי בטיחות על פי גיליון הנתונים שלו בטיחות (מרחביות), לטפל בכימיקלים המכילים HF בשכונה fume בה ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; כפפות כפול עם כפפות בוטיל מבחוץ, בוטיל סינר עם חלוק המעבדה מתחת, הפנים מגן עם משקפי בטיחות מתחת.) כל אוניברסיטאות, מעבדות R & D דורשים הכשרה ספציפית על בטיחות HF לפני השימוש. אל תנסו לעבוד עם HF ללא אישור מראש של רכז בטיחות מעבדה המקומי שלך, כנדרש אמצעי בטיחות נוספים לא המתוארים כאן.
-
אופן ההכנה של פתרונות תחריט
- כדי להפוך את הפתרון HF 3:1 עבור חריטה (בשימוש צעדים 1.3 ו 1.4), מילוי פלסטיק סיים את גליל עם 30 מ של מימית HF 48% ו- 10 מ"ל אתנול מוחלט (EtOH). הפתרון חייב להיות כלול בתוכו פלסטיק צפיפות גבוהה (HDPE, למשל), כמו HF מתמוסס זכוכית.
- כדי להפוך 1:29 HF פתרון להמראה (שלב בשימוש 1.5), מילוי פלסטיק סיים את גליל עם 1 מ"ל של HF 48% מימית, 29 מיליליטר אתנול מוחלטת. הפתרון חייב להיות כלול בתוכו פלסטיק צפיפות גבוהה (HDPE, למשל), כמו HF מתמוסס זכוכית.
- להפוך את הפתרון קו 1 מ' ב 10% EtOH לפירוק עודף pSi (בשימוש צעדים 1.3 ו 1.5).
-
הגדרת תא איכול
- טפלון לחרוט התא עם 8.6 ס"מ2 לחרוט טוב (אזור מחושב על ידי מדידת הקוטר של משטח סיליקון זמין עבור תצריב בתוך o-ring חישוב השטח מאת A = πr2), במקום יורד (איור 2 א): (1) טפלון התא העליון; (2 o-ring); (3) יצירה ברבע של הגביש יחיד (1 0 0) - אוריינטציה p + + - סוג הסיליקון וופל חתוך לרבעים (באמצעות םימולהי רחוס); (4) רדיד אלומיניום; (5) התא טפלון הבסיס עם ברגים התהדקה בעדינות כדי למנוע דליפה.
- למלא את הבאר EtOH. קחו מגבון והכנס לתוך הבקיע באמצע טפלון תא, בסיס. אם המחיקה יבש על הסרת, התא איכול אטומה. אם מרטיבים התא דולף, להדק הברגים עוד יותר עד אטום.
-
אלקטרופוליש כשהפחד סיליקון
- להכניס את התא איכול שהורכב ברדס fume.
- למלא את הבאר 10 מ"ל של פתרון HF 3:1.
- להתחבר להוביל חיובי רדיד האלומיניום (אלקטרודה) מהתא איכול וחבר להוביל שלילי הסליל פלטינה (האלקטרודה הנגד) טובל את הפתרון HF 3:1 של התא איכול כדי להשלים את המעגל (איור 2b).
- הפעל קבוע הנוכחית ב- 50 ס מ מא-2 60 s. פעם לחרוט סיימו, הסר את התא של המעגל, לשטוף את HF 3:1 בזהירות באמצעות מזרק. לשטוף עם EtOH שלוש פעמים.
- להתמוסס השכבה חרוט על-ידי מילוי הבאר לאט עם 10 מ של 1 מ' KOH. המתן עד שמבעבע שוככת.
- לשטוף את קו עם מים שלוש פעמים, ולאחר מכן עם EtOH שלוש פעמים.
-
Electrochemically תצריב שכבות נקבובי לתוך הסיליקון וופל
- לרוץ על חילופין של גל מרובע, עם current density התחתון של אמא/cm 502 עבור 0.6 s, צפיפות זרם גבוהה של אמא/cm 4002 עבור 0.36 s חוזר על עצמו עבור 500 מחזורי.
- פעם לחרוט סיימו, הסר את התא של המעגל, לשטוף את HF 3:1 בזהירות באמצעות מזרק. לשטוף עם EtOH שלוש פעמים.
-
הרמת-off השכבה נקבובי מ כשהפחד סיליקון
- למלא את הבאר עם 10 מ ל 1:29 HF פתרון.
- הפעל קבוע של אמא/cm 3.72 בשביל 250 s. פעם לחרוט סיימו, הסר את התא של המעגל. השכבה pSi עשויים להיות גלויים אדוות המציין ניתוק כשהפחד סיליקון גבישי. בעדינות לשטוף 1:29 HF פתרון ולשטוף עם EtOH שלוש פעמים ולאחר מכן עם מים שלוש פעמים.
- בחוזקה באמצעות טיפ פיפטה, לפצח את היקף השכבה pSi עבור ניתוק מוחלט. שימוש EtOH, לאסוף שברי pSi (צ'יפס) טפלון לחרוט תא לתוך סירה במשקל. להעביר את האסימונים בקבוקון זכוכית. האסימונים pSi עשוי להישמר בטמפרטורת החדר EtOH מעל 6 חודשים לאחסון.
- להתמוסס כל הסיליקון הנקבובי הנותרים על כשהפחד באמצעות מילוי הבאר לאט עם 10 מ של 1 מ' KOH. המתן עד שמבעבע שוככת.
- לשטוף את קו עם מים שלוש פעמים, ולאחר מכן עם EtOH שלוש פעמים.
- חזור על שלבים 1.3-1.5 עד עובי וופל כולו היה חרוט.
-
Sonicating נקבובי שכבות על היווצרות nanoparticle
- החלף את הממס של המיכל זכוכית המכילה שבבי pSi החל EtOH 2 מ של מים DI.
- בחוזקה לסגור את הפקק, לאטום באמצעות מצלמות-מיקרוסקופים.
- מקום הזכוכית בקבוקון באמבט sonicator והחזיקה כך עוצמת הקול של שבבי pSi לגמרי שקוע מתחת לפני השטח.
- Sonicate במשך 12 שעות-35 קילו-הרץ והכוח RF של 48W. כדי למנוע אובדן מים משמעותי במהלך sonication, במקום על סטריליות מלא מים, הפוך כך פתיחת הבקבוק נוגע השטח של האמבט במים.
- מניחים את המבחנה זכוכית על משטח שטוח עבור h 1 לאפשר חלקיקים גדולים יותר להתיישב בחלק התחתון. לאסוף את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה; ההשעיה מכיל pSiNPs תת-100 ננומטר.
2. הכנת הסרט השומנים fusogenic
-
אופן ההכנה של פתרונות מניות של השומנים
- בשכונה fume, לעשות 10 מ"ג/מ"ל מניות של שומנים על ידי לחות DMPC, DSPE-פג-מל ושומנים DOTAP ב כלורופורם. פתרונות מניות אלה נשמרות ב-20 ° C עד 6 חודשים תחת חותם חזק מצלמות-מיקרוסקופים.
-
בעשיית הסרט השומנים fusogenic
הערה: fusogenic עשוי של ליפידים, DMPC, DSPE-יתד, DOTAP, על היחס טוחנת של 76.2:3.8:20 ו- 96.2:3.8:0, בהתאמה.- בבקבוקון זכוכית, לערבב μL 72.55 של DMPC, μL 15.16 של DSPE-יתד μL 19.63 של DOTAP על ידי pipetting.
- אופציונלי: פלורסנט labelling של ציפוי השומנים, בנוסף להוסיף 20 µL של DiI מומס EtOH-ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
- הכנס את המבחנה ברדס fume עם כובע רופף כדי לאפשר את הכלורופורם מתמוססות בן לילה. הסרט מיובשים יהיה מעונן חומר דמוי ג'ל קשה בתחתית המבחנה.
3. טעינת ואיטום של siRNA ב- pSiNPs
-
הכנת סידן כלורי טעינת מניות
- להמיס 1.11 גר' CaCl2 ב- 10 מ"ל של מים RNAse-חופשית כדי ליצור פתרון2 CaCl 2 מ'.
- Centrifuge הפתרון > 10,000 x g עבור 1 דקות ליישב מצרפי ולאסוף את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של. לחלופין, לסנן את הפתרון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
-
הכנת siRNA טעינת מניות
- מימה או לדלל את siRNA מיקרומטר 150 במים נטולי RNAse. פתרון מניות זה ייתכן aliquoted, נשמרים קפואים ב-20 ° C למשך 30 ימים לפחות נתון כי זה אינו עובר מחזורים ההקפאה בתדירות גבוהה-הפשרה.
-
טעינה של siRNA ב pSiNPs עם סידן כלורי
- הכנת אמבט sonication קר.
- תחת 15 דקות ultrasonication, בעדינות פיפטה 150 µL של siRNA ו- 700 µL של 2 M CaCl2 לתוך 150 µL של pSiNP. הקפד להשאיר את המכסה של הצינור microcentrifuge פתוח לדור גז.
- הסר את הצינור המכיל 1 מ"ל של סידן טעון siRNA מצופה pSiNPs מ sonicator.
4. ציפוי שנטענו siRNA pSiNPs עם fusogenic שומנים
-
הכנת ערכת ההבלטה ליפוזום
- למלא גביע רחב במים DI. להשרות פוליקרבונט 1 קרום (200 ננומטר נקבוביות), וכן תומך מסנן 4 מאת צף אותם על פני המים. להרכיב את הקיט ההבלטה ליפוזום לפי הוראות היצרן
-
לחות הסרט ליפיד עם pSiNps טעון siRNA
- מימה הסרט השומנים מיובשים בבקבוקון זכוכית עם 1 מיליליטר של סידן טעון siRNA מצופה pSiNPs המתקבל שלב 3.3.3. פיפטה עד כל הסרט שומנים לקחתם מתחתית המבחנה יש מעורבבות פתרון הומוגני מעונן.
- במקום בר מלהיב מגנטי בבקבוקון זכוכית, ומניחים את הצנצנת על גבי צלחת חמה לחמם את החלקיקים 40 ° צ' (או מספיק גבוה מעל שלב שינוי הטמפרטורה של ליפידים כדי לשמור על ליפידים בשלב גביש נוזלי יותר fluidic) בעוד מגנטית זע הפתרון עבור 20 דקות.
-
הבלטת ממד של pSiNPs מצופים השומנים לבקרת גודל
- וביופסיה 1 מ"ל של פתרון מצופים השומנים pSiNP-siRNA במזרק ההבלטה. הכנס של מזרק ריק בצד אחד של המתקן, ואת המזרק מלא בצד השני.
- להתחיל ההבלטה דוחף את הבוכנה לאט לדחוף את החלקיקים של מזרק אחד, דרך קרום פוליקרבונט, ועל לתוך האחר. חזור על פי 20. אם הבוכנה תקוע, ייתכן סתומות את המסנן ואת קרום. לפרק את המתקן ולהחליף תומך ממברנה וסינון. אם הבעיה נמשכת, לדלל את החלקיקים עד סתימת לניהול.
- לאסוף את החלקיקים מעוקם לתוך צינור microcentrifuge.
5. ההטיה של מיקוד פפטידים
-
Conjugating פפטיד מיקוד כדי ציפוי השומנים
- הכינו המניה פפטיד עם 1 מ"ג/מ"ל פפטיד ריכוז במים נטולי RNAse.
- ב microcentrifuge הצינור המכיל fusogenic מצופים השומנים pSiNPs, להוסיף 100 µL של 1 מ"ג/מ"ל פפטיד מניות, pipet בעדינות. שמור את הצינור סטטי בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות (לחלופין, > 2 h ב 4 ° C).
- כדי להסיר את עודף פפטיד או siRNA וחומרים אחרים בלתי פעילים, לשטוף במסנן צנטריפוגלי 30 kDa מאת ספינינג בשעה x 5,000 g ב- 25 ° C עבור 1 ח' צנטריפוגה עוד פעמיים עם 1 מ"ל של PBS תחת אותה הגדרה.
- Resuspend את pSiNPs מצופים השומנים fusogenic מצומדת-פפטיד הסופי ב- PBS ב הריכוז הרצויה. החלקיקים ניתן עכשיו aliquoted וקפואים ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לפחות 30 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שילוב מוצלח של fusogenic pSiNPs צריך לייצר פתרון הומוגני, כמעצמה (איור 3 א). כשל כדי למטב את היחס ואת ריכוז של pSiNPs: siRNA: CaCl2 עשוי להוביל צבירה בעת טעינת (איור 3b). כל החלקיקים הם extruded דרך ממברנות 200 ננומטר, קוטר hydrodynamic הממוצע pSiNPs fusogenic נמדדת DLS צריך להיות כ-200 nm, ו- mV פוטנציאל זטה הממוצע כ +7 כמוצג באיור4. לאחר שינוי פני השטח עם מיקוד פפטידים, הקוטר הכולל צריך להיות מוגברת להיות תחת 230 ננומטר, לבין ממוצע פוטנציאל זטה ירד ל- -3.4 mV15. וכל סטייה מהגודל ההבלטה מקיף הוא מרמז על ההבלטה כושל (dחלקיקים >> dההבלטה), או נכשל בטעינת (dחלקיקים << dההבלטה). הסיכומים עשויים גם ניתן לכמת באמצעות DLS. יתר על כן, חייב להיות הקרת aliquots קפואים רק פעם אחת, כמו הקפאת חוזרות ונשנות-הפשרה מחזורים לשבש את השומנים ממברנה, פיוז'ן intraparticular ואת צבירת (איור 4). כפי איור 4a , ייתכן fusogenic pSiNPs המאוחסן 30 ימים ויש הקרת מבלי לגרום שינויים מבניים. עם זאת, חזר על הפשרת ההקפאה מחזורי aliquot יחיד לגרום צבירת חמורה (d >> nm 1,000), תוך 4 ימים של מחזור יומי (איור 4b), לכן מומלץ כי החלקיקים להיות aliquoted כדי חד-פעמיים כרכים.
Labelling ליפידים fusogenic עם DiI lipophilic (שלב 2.2.2) ולאחר התבוננות ההתאמה במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עשוי לאשר פיוז'ן. D איור 1 מראה היתוך מוצלח, להעביר DiI את קרום פלזמה ואיפה הם נקודתיים עצמאית של lysosomes שומנים של pSiNP fusogenic. היתוך לא מוצלח יציג ההתאמה DiI בתוך הציטופלסמה של התא, colocalization עם lysosomes (איור 1 c).
איור 1: Fusogenic הסיליקון הנקבובי nanoparticle מערכת (F-pSiNP). () מפרטים טכניים בסה כ מציג endocytic ספיגת של חלקיקים קונבנציונלי ו endosomal הבאים מלכודת. (b) מפרטים טכניים בסה כ מציג תפיסה fusogenic של F-pSiNPs ומסירת cytosolic עוקבות של המטען siRNA. (ג) תמונה מיקרוסקופית קונאפוקלית של CAOV-3 תא pSiNPs הלא-fusogenic endocytosed שנטענו עם צבע lipophilic DiI. CAOV-3 תאים התמר כדי 80% זרימה לתוך צלחת טוב 6, מטופלים עם µL 10 של חלקיקים ו מודגרות ב 37 ° C ב- 5% CO2 למשך 15 דקות. התאים היו קבוע ב- paraformaldehyde 1% כדי להיות מותקן על שקופיות זכוכית עם דאפי, מיובשים, באפלה עד שבדק מיקרוסקופיה קונפוקלית. (ד) קונאפוקלית תמונה מיקרוסקופית של תא CAOV-3 לקח את pSiNPs fusogenic שנטענו עם צבע lipophilic DiI. התאים היו מראש מוכתמים LysoTracker ירוק עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 לפי הנחיות היצרן. התאים ואז נשטפו PBS שלוש פעמים ולאחר שטופלו μL 10 של חלקיקים טעונים DiI למשך 15 דקות. התאים נשטפו עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר כל חלקיקים לא נלקחו למעלה, ואת הבארות היו מלאים 1 מ"ל של PBS ונלקח מיידית עבור הדמיה לחיות תאים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית; דאפי מייצג הכתם גרעינית ו ליזוזום מייצג מכתים lysosomal מאת LysoTracker Green; סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לחרוט ההתקנה תא. () מפרטים טכניים לחרוט רכיבים תא וסדר הרכבה; (b) תרשים של ההתקנה עבור חריטה אלקטרוכימי של סיליקון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: צילום של המוצר הסופי F-pSiNP. () מוצלחת סינתזה מציג פתרון הומוגני מעונן; (b) סינתזה כושל מציג צבירה של חלקיקים (צהוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הקפאת חוזרות ונשנות-הפשרה מעגל fusogenic pSiNPs לגרום צבירת. גודל () ממוצע של זטה-הפוטנציאל של fusogenic pSiNPs נשאר יציב למשך 30 ימים כאשר הקרת ברגע שלאחר קפוא; (b) ממוצע הגודל של זטה-הפוטנציאל של pSiNPs fusogenic מראה סימנים של צבירת ואובדן המבנית תוך 4 ימים לאחר שעברו מחזורים ההקפאה-הפשרה מדי יום. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: תרשים של סינתזה nanoparticle הסיליקון הנקבובי. מפרטים טכניים מציג איכול אלקטרוכימי של סיליקון וופל (שלב 1.4), ההמראה של השכבה נקבובי (שלב 1.5), sonication של השכבה נקבובי לתוך חלקיקים, ואוסף של הסיליקון הנקבובי חלקיקים (שלב 1.6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סינתזה של חלקיקים הסיליקון הנקבובי מוצג באיור5. השלב הקריטי בסינתזה של fusogenic pSiNPs הוא שלב ההעמסה (שלב 3). אם הנך מסכם חלקיקים fusogenic שלאחר סינתזה (איור 3), הסיבה לכך יכול להיות בגלל הבאות: (1) סידן כלורי המניה לא הוכן למשל, ולכן שלב 3.1.2 יש בקפידה עקב או מעודן; או (2) היחס בין pSiNP: siRNA: CaCl2 או את הריכוז של אחד או יותר שלושת המרכיבים לא ייתכן אופטימלית. אופטימיזציה מחדש החל מריכוז2 CaCl הוא הציע (למשל, שינוי 2 מ' 1 מ' או 3 מ'). יתר על כן, חשוב לוודא כי CaCl2 הוא מהספק אותו, כפי שמצאנו כי אותו חומר כימי של ספקים שונים גרמו pH נמוך יותר-שלב ההעמסה, וכישלון הבאים כדי לטעון את siRNA. PSiNPs עשוי גם להיות מרוכז, מדולל, או מפורק עוד לפני תהליך הטעינה בלעזוב את החלקיקים מושעה במים נטולי RNAse 2 ימים לאחר שלב 1.6.6.
פוסט-טעינה, לבטל השומנים ציפוי לעיתים קרובות מוביל הקושי ההבלטה עקב ריכוז או צפיפות של החלקיקים (שלב 4). אם קרום שחול זה סתם, מכריח ההבלטה עלול לקרוע את הקרום. על סתימת, לפרק את המתקן, להחליף את הקרום ותומך עם סדרה חדשה אם ההפסד וסותם קטן. אם ההפסד הוא גדול, ואז לדלל את המתלים של חלקיקים ולא sonicate לפני 30 s כדי ההבלטה. אם הבעיה נמשכת, אופטימיזציה מחדש של pSiNP גודל ויחס טעינה כדי למזער אגרגטים מומלץ. לבסוף, אנו מציעים סינון ההשעיה חלקיק דרך מסנן מיקרומטר-נקבובית 0.22 לחסל את כל המזהמים או אגרגטים לפני התא או טיפול בבעלי חיים. סינון במיוחד מומלץ אם החלקיקים היו מסונתז בסביבה שאינו סטרילי, או לאחר מפשיר aliquot קפוא של החלקיקים.
Fusogenicity של החלקיקים ניתן לוודא את חוקיות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (כפי שמוצג באיור 1 c, d), ועל ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים של תאים שטופלו החלקיקים להתבונן על הסיליקון הנקבובי השומנים-המחסן ליבות בציטופלסמה 15.
את pSiNPs fusogenic והפרוטוקול סינתזה יש מספר מגבלות. עבור ג'ין במבחנה להשתיק יישומים, הוכיחו pSiNPs fusogenic הציג לזירוז > 90% יעילות תמונות ציפורים בטווח של שורות תאים במינון 100 ננומטר; כולל את שורת התאים נוירובלסטומה העכבר נוירו-2a, הקו תאים סרטניים אנושיים השחלות CAOV-3 לשמצה קשה-עד-transfect 264.7 גלם העכבר macrophage התא הקו. עם זאת, הבחנו > 50% יעילות תמונות ציפורים ב המתחילים במינון 25 ננומטר, אשר היה דומה לזה של Lipofectamine. ואילו שומנים cationic חייב לשמש מינימלית כדי להפחית את אפקט ציטוטוקסיות, בעבר הראו הבטיחות שלה במינון השומנים של עד 1 מ ג15. עבור ג'ין ויוו להשתיק יישומים, pSiNPs fusogenic מוגבלים על ידי סלקטיביות. כפי ליפידים cationic electrostatically למשוך את כל קרום התא, החלקיקים חייב לשמש מקומי טיפולית, או משטח שופרת moiety מיקוד (למשל, פפטידים, נוגדנים, וכו '.). פרוטוקול סינתזה עבור fusogenic pSiNPs הוא כעת ממוטב, מוגבל למסירה siRNA בלבד. באותה השיטה אומתה בהצלחה לטעון miRNA, המשוערות כדי שניתן יהיה לטעון mRNA cDNA, אחרים עצמים נוקלאוטיד גדולים יותר, אבל אלה שעדיין לא ניתן למטב.
העבודה הציג הופך תרומה משמעותית לתחום של טיפול גנטי. אמת המידה סטנדרטי במבחנה ג'ין להחרשת הוא 2000 Lipofectamine. יש להדגים pSiNPs fusogenic יכול לגרום תמונות ציפורים אפקט של השוואה, אם לא גבוה יותר, היעילות15. היתרון העיקרי של pSiNPs fusogenic מעל Lipofectamine 2000 הוא יכולתה לשמש ליישומים ויוו עם זריקות מערכתית. בעוד סוכנים אחרים, כגון Invivofectamine 3.0, יש כבר ממוסחר לשימושים ויוו, מתאימים רק משלוח בכבד והם דורשים siRNAs כימית שונה (עם או בלי המסוכך או במבנה חומצת גרעין נעול (מגבר קדם)) כדי להגדיל יציבות וספציפיות. 16 , 17 , 18 . אולם, pSiNPs fusogenic יכול להיות ששונה שלאחר סינתזה כדי נזווג moieties מיקוד בכימיה פשוטה תיול-maleimide, שבו נקשר לקבוצת תיול ב פפטיד מיקוד (אשר נושאת של ציסטאין נוספת למטרה זו) בונדד כפול פחמן בזירה maleimide בקצה של ליפידים PEGylated בציפוי fusogenic. יתר על כן, המסה גבוה יעילות וטעינה של משלוח אל הציטופלסמה תא מצמצם את הצורך של ירידה לפרטים תאיים, משיגה ג'ין חזקה להשתיק אפקט עם siRNAs-לאחרונה15. חסרון אחד של pSiNPs fusogenic הוא פרוטוקול סינתזה הוא תהליך הנמשך מורכבת יותר סוכני תקנים זמינים מסחרית. עם זאת, בעת בחינת המוצרים חייבים להיות טריים מוכנים לפני תרביות תאים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, pSiNPs fusogenic עשוי להיות aliquoted קפואים לפחות 30 ימים בלי להפחית את היעילות תמונות ציפורים.
יישומים עתידיים עבור שיטה זו כוללים אופטימיזציה וטעינה של מסירת מטענים חומצת גרעין גדול יותר, כגון mRNAs ו- cDNAs. בנוסף, משלוח של המתחם חלבון-sgRNA CRISPR/Cas9, או קוקטייל של Cas9 mRNA, sgRNA, הוא גם אפשרות פיתוח, כמו המערכת אופטימלית עבור טעינת מטענים anionic. באופן כללי, מערכת F-pSiNP היא nanoplatform מודולרי עבור ריפוי גנטי לטיפול במחלות מעבר זיהומים, כולל זיהומים נגיפיים, סרטן ומחלות אוטואימוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MJS הוא מייסד מדעי ספינקר החיים, inc., ויש לו אינטרס הון החברה. למרות המענק הזה זוהתה לניהול ניגוד עניינים המבוסס על הטווח הכולל של הפרויקט ואת התועלת הפוטנציאלית שלה כדי ספינקר החיים, inc., ממצאי המחקר כללו בפרסום מסוים זה לא בהכרח מתייחסת לאינטרסים של הספינקר החיים, inc. תנאי ההסדר הזה יש כבר נבדקו, שאושרו על-ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו מדיניותה ניגוד אינטרסים. מחברים אחרים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מכוני הבריאות הלאומיים דרך חוזה # R01 AI132413-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
