Summary

Synthèse, fonctionnalisation et caractérisation de nanoparticules de silicium poreux Fusogène pour la livraison de l’oligonucléotide

Published: April 16, 2019
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Summary

Nous démontrons la synthèse de nanoparticules de silicium poreux fusogène pour livraison efficace oligonucléotide in vitro et in vivo. Nanoparticules de silicium poreux sont chargés avec des siARN pour former le noyau, qui est recouvert par les lipides fusogène par extrusion pour former la coquille. Ciblage portion fonctionnalisation et caractérisation des particules sont inclus.

Abstract

Avec l’avènement de la thérapie génique, le développement d’un système de livraison efficace in vivo nucléotide-charge utile est devenu d’importation parallèle. Nanoparticules de silicium poreux Fusogène (F-pSiNPs) ont récemment démontré des gènes in vivo haute silence efficacité en raison de sa haute oligonucléotide chargement de capacité et la voie d’absorption cellulaire unique qui évite l’endocytose. La synthèse de F-pSiNPs est un processus multi-étapes qui comprend : (1) chargement et la fermeture des oligonucléotides charges utiles dans les pores de silicium ; (2) simultanée de revêtement et de dimensionnement des lipides coniques autour les carottes de silicium poreux ; et (3) la conjugaison de ciblage de peptides et de lavage pour éliminer les excès oligonucléotide, débris de silicium et le peptide. Uniformité de taille de la particule se caractérise par la diffusion dynamique de la lumière, et sa structure de noyau-enveloppe peut être vérifiée par microscopie électronique à transmission. L’absorption de fusogène est validée en chargeant un lipophile teindre, 1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI), dans la bicouche lipidique fusogène et traitant aux cellules in vitro d’observer pour la coloration par rapport à la membrane plasmique localisations endocytose. L’efficacité de silencieux de gène ciblage et in vivo ont été quantifiées précédemment dans un modèle murin de pneumonie à Staphylococcus aureus , dans lequel le peptide de ciblage devrait aider le F-pSiNPs à domicile pour le site de l’infection. Au-delà de son application dans l’infection à Staphylococcus aureus , le système F-pSiNP peut servir à livrer un oligonucléotide pour la thérapie génique d’un large éventail de maladies, y compris les infections virales, le cancer et les maladies auto-immunes.

Introduction

Thérapie génique module l’expression de gènes spécifiques afin d’obtenir un résultat thérapeutique. Nombreux outils pour la modulation de gène ont été découverts et étudiés, y compris l’acide ribonucléique interférence (Arni) utilisant des oligonucléotides (p. ex., court interférence ARN (siRNA)1,2, microARN (miARN)3,4 ), ADN plasmides5,6, nucléases (p. ex., doigt de zinc, TALENS)7,8et CRISPR/Cas9 systèmes9,10. Alors que le mécanisme de chaque outil d’action est différent, tous les outils doivent parvenir à cytoplasme de la cellule ou le noyau actif. Ainsi, alors que ces outils se sont avérés pour induire un effet significatif dans la modulation de l’expression génique in vitro, l’efficacité in vivo souffre d’obstacles extracellulaires et intracellulaires. Dû au fait que les outils sont d’origine biologique, plusieurs enzymes et les systèmes d’autorisation existent dans notre corps qui ont la capacité de dégrader ou de supprimer les molécules étrangères11. Même dans le cas que les outils atteignent la cellule cible, ils souffrent d’endocytose ; un mode d’absorption cellulaire qui encapsule et emprisonne les outils dans les vésicules d’estomac comme acides qui se dégradent ou expulser les outils hors de la cellule. En fait, les études ont montré que les nanoparticules lipidiques sont mégacaryocyte via macropinocytose, dont environ 70 % de des siARN sont exocytosed des cellules dans les 24h d’absorption12,13. La majorité des siARN restant est dégradée par la voie lysosomiale, et en fin de compte que 1 à 2 % des siARN qui initialement pénètre dans la cellule avec les nanoparticules atteindre évasion endosomal potentiellement subir Arni13,14 .

Nous avons récemment développé des nanoparticules de silicium poreux fusogène (F-pSiNPs) qui ont un noyau chargés en siARN composé de nanoparticules de silicium poreux et un fusogène lipides coquille15. Les F-pSiNPs présente trois avantages majeurs sur les autres vecteurs d’oligonucléotide classiques : (1) un lipide fusogène revêtement qui permet aux particules de contourner l’endocytose et distribuer la surcharge ensemble directement dans le cytoplasme des cellules (contre le 1-2 % réalisé par mégacaryocyte particules13,14) (Figure 1) ; (2) haute emplissage de siARN dans la pSiNPs (> 20 % en poids par rapport à 1-15 % en poids par les systèmes conventionnels)15, qui dégradent rapidement dans le cytoplasme (une fois que les particules de base versé la couche lipidique via fusogène absorption) pour libérer le siARN ; et (3) ciblant la conjugaison de peptide pour domiciliation sélective à désiré types cellulaires in vivo.

Le système F-pSiNP a démontré le silençage efficacité de gènes importants (> 95 % in vitro ; > 80 % in vivo) et un effet thérapeutique ultérieur dans un modèle de souris mortel de pneumonie à Staphylococcus aureus ; les résultats qui ont été publiées auparavant15. Cependant, la structure complexe du système F-pSiNP suppose une manipulation délicate et optimisation adaptée pour générer des nanoparticules homogène et stables. Ainsi, le but de ce travail est de présenter un protocole complet, ainsi que des stratégies d’optimisation pour la synthèse, fonctionnalisation et caractérisation de F-pSiNPs à utiliser dans l’administration ciblée des siRNAs pour un effet puissant gène silencieux.

Protocol

1. synthèse de nanoparticules de silicium poreux (pSINPs) Attention : Soyez toujours prudent lorsque vous travaillez avec de l’acide fluorhydrique (HF). Suivez tous les guides de sécurité selon sa fiche de données de sécurité (SDS), gérer les produits chimiques contenant du HF dans une hotte aspirante et porter les équipements de protection individuelle appropriés (PPE, gants doubles avec gants butyl sur l’extérieur, tablier de butyle avec blouse en dessous, visage protéger avec …

Representative Results

Une synthèse réussie des coniques pSiNPs devrait produire une solution homogène, légèrement opaque (Figure 3 a). Échec d’optimiser le ratio et la concentration de pSiNPs : siARN : CaCl2 peut conduire à l’agrégation lorsqu’il se charge (Figure 3 b). Comme les particules sont extrudés à travers les 200 membranes nm, le diamètre moyen hydrodynamique de la pSiNPs fusogène mesurée par DLS devrait être …

Discussion

Synthèse de nanoparticules de silicium poreux est illustrée à la Figure 5. L’étape critique dans la synthèse des pSiNPs coniques est à l’étape de chargement (étape 3). Si les nanoparticules fusogène agrégez post-synthèse (Figure 3), la raison peut être en raison de ce qui suit : (1) actions de chlorure de calcium ne préparait pas homogène, donc étape 3.1.2 doit être soigneusement suivi ou raffiné ; ou (2) le rapport de pSiNP : siARN : Ca…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health à travers contrat no R01 AI132413-01.

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

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Cite This Article
Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

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