Syntese, Functionalization og karakterisering af Fusogenic porøs silicium nanopartikler til oligonukleotid levering
Summary
Vi demonstrere syntesen af fusogenic porøs silicium nanopartikler til effektiv in vitro- og in vivo oligonukleotid levering. Porøs silicium nanopartikler er lastet med siRNA til kernen, som er belagt med fusogenic lipider gennem ekstrudering at danne skallen. Målretning gruppe functionalization og partikel karakterisering er inkluderet.
Abstract
Med fremkomsten af genterapi, er udviklingen af en effektiv in vivo nukleotid-nyttelast levering system blevet parallel import. Fusogenic porøs silicium nanopartikler (F-pSiNPs) har for nylig demonstreret høj in vivo genhæmning effektivitet på grund af sin høje oligonukleotid lastning kapacitet og unikke cellulære optagelse pathway, der undgår endocytose. Syntesen af F-pSiNPs er en multi-trins proces, der omfatter: (1) indlæsning og forsegling af oligonukleotid nyttelast i silicon porer; (2) samtidige belægning og dimensionering af fusogenic lipider omkring porøs silicium kerner; og (3) konjugation af målretning peptider og vask for at fjerne overskydende oligonukleotid, silicium debris og peptid. Den partikel størrelse ensartethed er præget af dynamisk lysspredning, og dens kerne-shell struktur kan verificeres ved transmissions Elektron Mikroskopi. Fusogenic optagelse er valideret ved at indlæse en lipofile farvestof, 1, 1′-dioctadecyl-3,3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorat (DiI), i fusogenic lipid tolagede og behandler det til celler in vitro-at observere for plasma membran farvning endocytic lokaliseringer. Målretning og in vivo gene silencing efficacies var tidligere tal i en musemodel af Staphylococcus aureus lungebetændelse, hvori den målretning peptid forventes at hjælpe F-pSiNPs til hjem til infektionsstedet. Ud over dets anvendelse i S. aureus infektion, kan F-pSiNP system bruges til at levere enhver oligonukleotid for genterapi for en bred vifte af sygdomme, herunder virusinfektioner, kræft og autoimmune sygdomme.
Introduction
Genterapi modulerer specifikke genekspression for at opnå en terapeutisk resultatet. Mange værktøjer til gen graduering er blevet opdaget og undersøgt, herunder ribonukleinsyre interferens (RNAi) ved hjælp af oligonukleotider (f.eks. korte interfererende RNA (siRNA)1,2, mikroRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmider5,6, nukleaser (f.eks. zink finger, TALENS)7,8, og CRISPR/Cas9 systems9,10. Mens hver værktøjets virkningsmekanisme er forskellig, skal alle værktøjerne nå cellens cytoplasma eller kerne at være aktive. Som sådan, mens disse værktøjer har vist sig for at fremkalde signifikant effekt i modulerende genekspression in vitro, lider in vivo effekten af ekstracellulære og intracellulære forhindringer. Skyldes, at værktøjerne er af biologisk oprindelse, findes mange enzymer og clearance systemer i vores krop, der har evnen til at nedbryde eller fjerne fremmede molekyler11. Selv i tilfældet lider at værktøjerne nå målcellen, de af endocytose; en tilstand af cellulære optagelse, der indkapsler og fælder værktøjer i sure maven-lignende blærer, der nedbrydes eller udvise værktøjer ud af cellen. Undersøgelser har faktisk vist sig at lipid nanopartikler er endocytosed via macropinocytosis, hvorfra omkring 70% af siRNA er exocytosed fra celler inden for 24 timer af optagelsen12,13. Fleste af de resterende siRNA er nedbrudt gennem den lysosomale vej, og i sidste ende kun 1-2% af den siRNA, der i første omgang kommer ind i cellen med nanopartikler opnå endosomal undslippe underkastes potentielt RNAi13,14 .
Vi har for nylig udviklet fusogenic porøs silicium nanopartikler (F-pSiNPs), har en siRNA-loaded kerne består af porøs silicium nanopartikler, og en fusogenic lipid shell15. F-pSiNPs præsentere tre store fordele i forhold til andre konventionelle oligonukleotid levering systemer: (1) en fusogenic lipid belægning, som gør det muligt for partikler til at omgå endocytose og levere hele nyttelasten direkte i cellen cytoplasma (versus 1-2% opnået ved endocytosed partikler13,14) (figur 1); (2) høje masse lastning af siRNA i pSiNPs (> 20 wt % i forhold til 1-15 wt % af konventionelle systemer)15, der hurtigt nedbrydes i cytoplasma (når core partikler kaste lipid belægning via fusogenic optagelse) for at frigive siRNA; og (3) målretning peptid konjugation for selektiv homing til ønskede celletyper in vivo.
F-pSiNP-systemet har demonstreret betydelige genhæmning effektivitet (> 95% in vitro-; > 80% in vivo) og efterfølgende terapeutiske effekt i en alvorlig musemodel af S. aureus lungebetændelse; resultaterne af som blev offentliggjort tidligere15. Den komplekse struktur af F-pSiNP system kræver dog fine håndtering og finjusteres optimering til at generere ensartet og stabil nanopartikler. Formålet med dette arbejde er således, at fremlægge en grundig protokol samt optimeringsstrategier for syntese, functionalization og karakterisering af F-pSiNPs anvendes i målrettet levering af siRNAs til potente gene silencing effekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syntese af porøs silicium nanopartikler er vist i figur 5. Den kritiske trin i syntesen af fusogenic pSiNPs er i lastning trin (trin 3). Hvis fusogenic nanopartikler sammenlægning efter syntese (figur 3), årsagen kan skyldes følgende: (1) calciumchlorid lager blev ikke homogen måde forberedt, således skridt 3.1.2 skal være omhyggeligt fulgt eller raffineret; eller (2) forholdet mellem pSiNP: siRNA: CaCl2 eller koncentrationen af et eller flere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health gennem kontrakt # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
