Summary

合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション

Published: April 16, 2019
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Summary

効果的な in vitro および in vivo のオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を示します。ポーラス シリコンのナノ粒子は、シェルを形成する押し出しによる融合ペプチド脂質によるコーティングの核を形成する siRNA によって読み込まれます。ターゲット部位の機能化と粒子特性含まれます。

Abstract

遺伝子療法の出現により、効果的な体内ヌクレオチド ペイロード搬送システムの開発は並行輸入となっています。融合性ポーラス シリコンのナノ粒子 (F pSiNPs) 高 in vivo 遺伝子サイレンシング力およびエンドサイトーシスを回避するユニークな細胞内取り込み経路その高オリゴヌクレオチドによる有効性を示してきた。F pSiNPs の合成は複数の手順が含まれている: (1) 読み込みとシリコン毛穴; へのオリゴヌクレオチド ペイロードのシール(2) 同時コーティング ・融合ペプチド脂質ポーラス シリコンのコアの周りのサイジング(3) の共役ペプチドをターゲット ・洗浄の余分なオリゴヌクレオチド、シリコンの破片、およびペプチドを削除します。粒子の大きさの均一性は動的光散乱によって特徴付けられるし、そのコア ・ シェル構造は、電子顕微鏡による検証可能性があります。膜融合吸収は、脂溶性の読み込みによって検証された染料、1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸塩 (DiI) 融合ペプチドの脂質二重膜に、細胞膜と染色の観察する治療エンドサイトーシスのローカライズ。ターゲットおよび in vivo 遺伝子サイレンシング効果はターゲットのペプチドの F pSiNPs は、感染部位に家が予想される黄色ブドウ球菌肺炎マウスモデルにおける定量化された以前。黄色ブドウ球菌感染症における応用を越えて F pSiNP システムは幅広い領域の疾患、ウイルス感染症、がん、自己免疫疾患などの遺伝子治療の任意のオリゴヌクレオチドを提供する使用ことがあります。

Introduction

遺伝子治療は、治療の結果を取得する特定の遺伝子発現を調節します。遺伝子の調節のための多数のツールを検出し、(例えば、短い干渉 RNA (siRNA)12、マイクロ Rna (miRNA)3,4 のオリゴヌクレオチドを使用してリボ核酸干渉 (RNAi) などを学び、)、DNA プラスミド5,6核酸 (例えば、亜鉛指、TALENS)78、および CRISPR/Cas9 システム9,10。各ツールの作用機序とは異なる中、セルの細胞質またはアクティブ化する核に到達する必要がありますすべてのツール。など、これらのツールは、体外遺伝子発現を調節することで有意な効果を誘導するために証明されている、間に生体内での有効性は細胞外と細胞内の障害物によって苦しみます。ツールは、生物学的起源、という事実のために多くの酵素やクリアランス システムが低下または外国の分子11を削除する能力を持っている私たちの体で存在します。場合でも、彼らはエンドサイトーシス; から苦しむ目的セルをツールに到達トラップの低下またはセルからツールを追放する酸性の胃のような小胞に含まれるツールをカプセル化して細胞内取り込みモード。実際には、研究はマクロピノサイトーシス、元、siRNA の約 70% が吸収12,13の 24 h 内のセルから exocytosed 経由で貪食を脂質ナノ粒子には示しています。残りの siRNA の大半はリソソーム経路によって劣化が、最終的に当初がナノ粒子でセルに入る siRNA の唯一の 1-2% 達成潜在的 RNAi13,14 を受けるエンドソーム脱出.

最近融合ペプチド脂質シェル15とポーラス シリコン微粒子から成る siRNA ロードのコアを持つ融合性ポーラス シリコン ナノ粒子 (F pSiNPs) を開発しました。F pSiNPs 提示他従来オリゴヌクレオチド配信システムの 3 つの主要な利点: (1) エンドサイトーシスをバイパスし、ペイロード全体を (1-2% 対細胞細胞質内に直接配信する粒子ができますコーティング膜融合脂質貪食粒子13,14目標達成) (図 1)。pSiNPs の siRNA の (2) の高質量負荷 (> 1-15 wt % により、従来に比べて 20 wt %)15、急速に低下する細胞質 (一度コア粒子は膜融合吸収を介して脂質コーティングを流す); siRNA を解放するには(3) と体内細胞の種類を希望する選択的ホーミングのペプチド共役をターゲットします。

F pSiNP システムは、重要な遺伝子サイレンシング効果を実証してきました (> 95% 生体外で; > 体内の 80%)、黄色ブドウ球菌肺炎の致命的なマウスモデルでの後の治療効果結果15以前公開されました。ただし、繊細な取り扱いと均一で安定したナノ粒子を生成するために微調整の最適化、F pSiNP システムの複雑な構造が必要です。したがって、この作業の目的は徹底的なプロトコルとして合成、機能化、および強力な遺伝子サイレンシング効果に Sirna のターゲットを絞った配信で使用する F pSiNPs の特性の最適化戦略を提示します。

Protocol

1. ポーラス シリコンのナノ粒子 (pSINPs) の合成 注意: は、フッ化水素酸 (HF) を使用するときに常に注意を使用します。その安全データシート (SDS) によるとすべての安全ガイドに従ってください、発煙のフードで HF を含む化学薬品を処理し、適切な個人用保護具 (PPE; 外にブチル手袋をして二重手袋、ブチル、顔の下に白衣とエプロンを着用シールドの下に安全ゴーグル)。?…

Representative Results

融合性 pSiNPs の合成に成功は均質なわずかに不透明なソリューション (図 3 a) を生成する必要があります。比と pSiNPs の濃度を最適化に失敗しました: siRNA: CaCl2 (図 3 b) の読み込み時に集約につながる可能性があります。DLS を用いて融合ペプチド pSiNPs の平均流体力学的直径が約 200 をする必要があります 200 nm 膜を介…

Discussion

ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を図 5に示します。融合性 pSiNPs の合成に重要なステップは、読み込みの手順 (手順 3)。膜融合ナノ粒子を集約する場合後合成 (図 3)、理由次が原因である可能性があります: (1) 塩化カルシウム株式がゆく準備されていません、ステップ 3.1.2 必要があります慎重に続くまたは洗練された; するため(2) または pSiNP ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この仕事を通しての健康の国民の協会によってサポートされて # R01 AI132413-01 を契約します。

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

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Cite This Article
Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

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