Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Engineering

合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション

doi: 10.3791/59440 Published: April 16, 2019

Summary

効果的な in vitro および in vivo のオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を示します。ポーラス シリコンのナノ粒子は、シェルを形成する押し出しによる融合ペプチド脂質によるコーティングの核を形成する siRNA によって読み込まれます。ターゲット部位の機能化と粒子特性含まれます。

Abstract

遺伝子療法の出現により、効果的な体内ヌクレオチド ペイロード搬送システムの開発は並行輸入となっています。融合性ポーラス シリコンのナノ粒子 (F pSiNPs) 高 in vivo 遺伝子サイレンシング力およびエンドサイトーシスを回避するユニークな細胞内取り込み経路その高オリゴヌクレオチドによる有効性を示してきた。F pSiNPs の合成は複数の手順が含まれている: (1) 読み込みとシリコン毛穴; へのオリゴヌクレオチド ペイロードのシール(2) 同時コーティング ・融合ペプチド脂質ポーラス シリコンのコアの周りのサイジング(3) の共役ペプチドをターゲット ・洗浄の余分なオリゴヌクレオチド、シリコンの破片、およびペプチドを削除します。粒子の大きさの均一性は動的光散乱によって特徴付けられるし、そのコア ・ シェル構造は、電子顕微鏡による検証可能性があります。膜融合吸収は、脂溶性の読み込みによって検証された染料、1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸塩 (DiI) 融合ペプチドの脂質二重膜に、細胞膜と染色の観察する治療エンドサイトーシスのローカライズ。ターゲットおよび in vivo 遺伝子サイレンシング効果はターゲットのペプチドの F pSiNPs は、感染部位に家が予想される黄色ブドウ球菌肺炎マウスモデルにおける定量化された以前。黄色ブドウ球菌感染症における応用を越えて F pSiNP システムは幅広い領域の疾患、ウイルス感染症、がん、自己免疫疾患などの遺伝子治療の任意のオリゴヌクレオチドを提供する使用ことがあります。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

遺伝子治療は、治療の結果を取得する特定の遺伝子発現を調節します。遺伝子の調節のための多数のツールを検出し、(例えば、短い干渉 RNA (siRNA)12、マイクロ Rna (miRNA)3,4 のオリゴヌクレオチドを使用してリボ核酸干渉 (RNAi) などを学び、)、DNA プラスミド5,6核酸 (例えば、亜鉛指、TALENS)78、および CRISPR/Cas9 システム9,10。各ツールの作用機序とは異なる中、セルの細胞質またはアクティブ化する核に到達する必要がありますすべてのツール。など、これらのツールは、体外遺伝子発現を調節することで有意な効果を誘導するために証明されている、間に生体内での有効性は細胞外と細胞内の障害物によって苦しみます。ツールは、生物学的起源、という事実のために多くの酵素やクリアランス システムが低下または外国の分子11を削除する能力を持っている私たちの体で存在します。場合でも、彼らはエンドサイトーシス; から苦しむ目的セルをツールに到達トラップの低下またはセルからツールを追放する酸性の胃のような小胞に含まれるツールをカプセル化して細胞内取り込みモード。実際には、研究はマクロピノサイトーシス、元、siRNA の約 70% が吸収12,13の 24 h 内のセルから exocytosed 経由で貪食を脂質ナノ粒子には示しています。残りの siRNA の大半はリソソーム経路によって劣化が、最終的に当初がナノ粒子でセルに入る siRNA の唯一の 1-2% 達成潜在的 RNAi13,14 を受けるエンドソーム脱出.

最近融合ペプチド脂質シェル15とポーラス シリコン微粒子から成る siRNA ロードのコアを持つ融合性ポーラス シリコン ナノ粒子 (F pSiNPs) を開発しました。F pSiNPs 提示他従来オリゴヌクレオチド配信システムの 3 つの主要な利点: (1) エンドサイトーシスをバイパスし、ペイロード全体を (1-2% 対細胞細胞質内に直接配信する粒子ができますコーティング膜融合脂質貪食粒子13,14目標達成) (図 1)。pSiNPs の siRNA の (2) の高質量負荷 (> 1-15 wt % により、従来に比べて 20 wt %)15、急速に低下する細胞質 (一度コア粒子は膜融合吸収を介して脂質コーティングを流す); siRNA を解放するには(3) と体内細胞の種類を希望する選択的ホーミングのペプチド共役をターゲットします。

F pSiNP システムは、重要な遺伝子サイレンシング効果を実証してきました (> 95% 生体外で; > 体内の 80%)、黄色ブドウ球菌肺炎の致命的なマウスモデルでの後の治療効果結果15以前公開されました。ただし、繊細な取り扱いと均一で安定したナノ粒子を生成するために微調整の最適化、F pSiNP システムの複雑な構造が必要です。したがって、この作業の目的は徹底的なプロトコルとして合成、機能化、および強力な遺伝子サイレンシング効果に Sirna のターゲットを絞った配信で使用する F pSiNPs の特性の最適化戦略を提示します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ポーラス シリコンのナノ粒子 (pSINPs) の合成

注意: は、フッ化水素酸 (HF) を使用するときに常に注意を使用します。その安全データシート (SDS) によるとすべての安全ガイドに従ってください、発煙のフードで HF を含む化学薬品を処理し、適切な個人用保護具 (PPE; 外にブチル手袋をして二重手袋、ブチル、顔の下に白衣とエプロンを着用シールドの下に安全ゴーグル)。すべての大学と研究室を使用する前に HF 安全性に関する具体的なトレーニングが必要です。ここに記述されていない追加の安全対策が必要なため、地元の研究室安全担当の事前承認せず HF で作業をしないでください。

  1. エッチング溶液の調製
    1. プラスチックを埋めるエッチング (手順 1.3 と 1.4 で使用)、3:1 心不全のソリューションにするため水溶液 48 %hf の 30 mL と 10 mL の無水エタノール (エタノール) のシリンダーを卒業しました。ソリューションは、HF はガラスを溶解する、高密度プラスチック (例えば、HDPE) に含まれなければなりません。
    2. 1:29 にリフトオフ (で使用される手順 1.5)、プラスチック、塗りつぶし用 HF ソリューションは 1 ml の水溶液の 48 %hf と無水エタノール 29 mL シリンダーを卒業しました。ソリューションは、HF はガラスを溶解する、高密度プラスチック (例えば、HDPE) に含まれなければなりません。
    3. 10% で 1 M KOH 溶液を作る余分な pSi 解散 (手順 1.3 と 1.5 で使用) のエタノール。
  2. Etch のセルを設定します。
    1. テフロンで etch 8.6 cm セル2エッチも (o リング内エッチングおよび A によって面積を計算するのに使用できるシリコン表面の直径を測定することにより面積を計算 = πr2)、降順 (図 2 a) に: (1)、テフロン セルの上端。(2) o;(3) 単結晶の四分の一部分 (1 0 0) - 指向 p + + - 型シリコンウェーハ (ダイヤモンド カッターを使用して) の四分の一にカット(4) アルミ箔。(5) とネジで基本テフロン セル優しく漏れを防ぐためにきつく締められます。
    2. エタノールで井戸を埋めます。ワイプを取る、テフロン セルの上部と下部の隙間に差し込みます。ワイプは、除去時に乾燥が、etch セルは密封されます。ウェット、セルが漏れていると締めシールまで、ネジはさらに。
  3. 電解研磨、シリコンウエハー
    1. ヒューム フードに組み立てられたエッチング細胞をもたらします。
    2. 3:1 HF 溶液 10 mL で井戸を埋めます。
    3. エッチ携帯からアルミ箔 (電極) に肯定的な鉛と回路 (図 2 b) を完成するエッチング セルの 3:1 HF 溶液中浸漬プラチナ コイル (カウンター電極) に負のリード線を接続します。
    4. 実行定電流 50 mA cm-2 60 s。一度のエッチングが完了したら、回路からセルを削除し、慎重に注射器を使用して 3:1 HF を洗います。エタノールで 3 回を洗い流してください。
    5. 井戸を埋めることでエッチング加工層を離れて溶解 10 mL 1 M 島でゆっくりと。バブルがおさまるまで待ちます。
    6. 水 3 回とし、エタノール 3 回島を洗います。
  4. シリコンウェーハに多孔質層を電気化学的エッチング
    1. 50 mA/cm2 0.6 s の低い current density と 0.36 の 400 mA/cm2の電流密度で方形波の交流電流を実行 s が 500 サイクルで繰り返されます。
    2. 一度のエッチングが完了したら、回路からセルを削除し、慎重に注射器を使用して 3:1 HF を洗います。エタノールで 3 回を洗い流してください。
  5. シリコンウエハーから多孔質の層を持ち上げる
    1. 1:29 の 10 mL で井戸を埋める HF ソリューション。
    2. 3.7 mA/cm2 250 のための定数を実行 s。一度エッチングが完了したら、回路からセルを削除します。PSi 層は、結晶シリコン基板からの剥離を示す表示される波紋があります。優しく洗って、1:29 HF ソリューションと江藤 3 倍を水 3 回をすすいでください。
    3. 完全剥離の pSi の層のまわりの亀裂ピペット チップを使用して、しっかりと。計量ボートにセルを etch テフロンから pSi 片 (チップ) エタノールを使用すると、収集。ガラスの瓶にチップを転送します。PSi チップ保管貯蔵のため 6 ヶ月以上で江藤に室温で。
    4. 井戸を埋めることでウェーハ上残り多孔質シリコンを離れて溶解 10 mL 1 M 島でゆっくりと。バブルがおさまるまで待ちます。
    5. 水 3 回とし、エタノール 3 回島を洗います。
    6. 1.3 から 1.5 の手順を繰り返して全体の厚みが刻み込まれています。
  6. ナノ粒子形成 sonicating 多孔質層
    1. 純水 2 mL にエタノールから pSi チップを含むバイアルの溶媒を交換してください。
    2. しっかりとキャップをしめて、パラフィルムを使用して密封します。
    3. ガラス超音波発生装置バースのバイアルし、pSi チップの量は表面の下に水没するように中断された場所です。
    4. 35 kHz と 48 w フィットの高周波電力で 12 h の超音波照射します。超音波処理中に重要な水損失を防ぐため、あふれた水にフラスコのオープニング風呂の水の表面に触れるように反転メスフラスコを配置します。
    5. 下部に解決するより大きい粒子を許可するように 1 h の平らな面にガラスの瓶を置きます。ピペット; を使用して上澄みを集めサスペンションには、サブ 100 nm pSiNPs が含まれています。

2. 融合ペプチド脂質膜の作製

  1. 脂質の貯蔵液の準備
    1. 発煙のフード DMPC, DSPE ペグ MAL およびクロロホルム DOTAP 脂質を潤いで脂質の 10 mg/mL 株を作る。これらの原液を-20 ° C で保管して、タイトなパラフィルム シールの下まで 6 ヶ月間よい。
  2. 融合ペプチド脂質膜を作る
    注: 融合ペプチド組成で脂質、DMPC、DSPE ・ ペッグ、DOTAP、76.2:3.8:20、96.2:3.8:0、モル比でそれぞれされます。
    1. ガラス瓶でピペッティングによる 19.63 μ DOTAP、DSPE ・ ペッグの 15.16 μ L DMPC 72.55 μ L をミックスします。
    2. オプション: 蛍光脂質コーティングの分類、また追加 DiI の 20 μ L が 1 mg/mL の濃度でエタノールに溶解します。
    3. 一晩蒸発にクロロホルムを許可するように緩んでキャップとヒューム フードにバイアルを配置します。乾燥皮膜は、バイアルの下部曇りハード ゲル状物質になります。

3. 読み込みと pSiNPs の siRNA のシール

  1. 在庫の読み込みカルシウム塩化物の準備
    1. CaCl の 1.11 g を溶かす2 2 M CaCl2溶液を作るために RNAse フリー水 10 mL にします。
    2. > 10,000 で溶液を遠心凝集体を解決し、ピペットを使用して上澄みを集め 1 分g x。また、ソリューションをフィルター処理、0.22 μ m フィルターを通過。
  2. 在庫の読み込み siRNA の準備
    1. メタンハイド レートまたは RNAse フリー水で 150 μ M に siRNA を薄めます。この原液は避けようと頻繁に凍結融解サイクルが行われないことを考えれば、少なくとも 30 日間-20 ° C で凍結保存します。
  3. 塩化カルシウムと pSiNPs の siRNA の読み込み
    1. アイス超音波風呂を準備します。
    2. 下 15 分超音波、siRNA の優しくピペット 150 μ L、700 μ pSiNP の 150 μ L に 2 M CaCl2 。ガスの遠心チューブの蓋を開いたままにすることを確認します。
    3. SiRNA ロード カルシウム コーティング pSiNPs、超音波発生装置からの 1 つの mL を含むチューブを取り外します。

4. 脂質の膜融合 siRNA ロード pSiNPs のコーティング

  1. リポソーム押出キットの準備
    1. DI 水で広いビーカーを埋めます。ソーク 1 ポリカーボネート膜 (200 nm 毛穴) と水の表面に浮かんでそれら 4 フィルターのサポート。製造元の指示に従い、リポソーム押出キットを組み立てる
  2. SiRNA ロード pSiNps と脂質膜の水和
    1. 3.3.3 ステップから取得された siRNA ロード カルシウム コーティング pSiNPs の 1 ml のガラス瓶の乾燥した脂質膜をメタンハイド レートします。ピペットのすべての脂質膜がバイアルの底から持ち上げたし、曇りの同種のソリューションに混在しているまで。
    2. ガラス瓶の磁気撹拌棒を置き、40 ° C (または十分に高いより流体液晶相の脂質を維持するために脂質の相変化温度より上) に粒子を加熱するホット プレートの上に瓶を置く一方、磁気20 分のためのソリューションをかき混ぜます。
  3. サイズ コントロールの脂質コーティング pSiNPs を押し出す
    1. 押出シリンジの脂質コーティング pSiNP siRNA 溶液の 1 mL を吸引します。、押出機の片側に空の注射器と反対側に満たされた注射器を挿入します。
    2. 1 シリンジ、ポリカーボネート膜と他の粒子をプッシュするゆっくりピストンを押して、押し出しを開始します。20 回繰り返します。ピストンがスタックしている場合は、フィルター、膜が目詰まり可能性があります。押出機を分解し、膜・ フィルターのサポートを交換します。問題が解決しない場合は、管理が目詰まりするまで粒子を希釈します。
    3. 微量遠心チューブに押し出された粒子を収集します。

5. ペプチドをターゲットの活用

  1. 脂質のコーティングにターゲットのペプチドを活用
    1. RNAse フリーの水中ペプチド濃度 1 mg/mL とペプチドのストックを準備します。
    2. 融合ペプチド脂質コーティング pSiNPs を含む遠心チューブ、1 mg/mL ペプチド株式のピペット 100 μ L をそっと追加します。(また、> 2 h 4 ° c) に 20 分間室温でチューブを静的に保存します。
    3. 過剰なペプチド siRNA やその他の賦形剤を削除するには、30 kDa 遠心フィルター 1 h. 遠心 1 ml の PBS の同じ設定でさらに 2 回 25 ° C で 5,000 × gで回して洗ってください。
    4. 必要な濃度で PBS で最終的なペプチド共役融合ペプチド脂質コーティング pSiNPs を再懸濁します。避けようと-80 ° c 少なくとも 30 日間の保存のため冷凍粒子できるようになりました。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

融合性 pSiNPs の合成に成功は均質なわずかに不透明なソリューション (図 3 a) を生成する必要があります。比と pSiNPs の濃度を最適化に失敗しました: siRNA: CaCl2 (図 3 b) の読み込み時に集約につながる可能性があります。DLS を用いて融合ペプチド pSiNPs の平均流体力学的直径が約 200 をする必要があります 200 nm 膜を介して粒子が押し出されると、nm、および図 4に示すように、平均約 +7 ゼータ電位 mV。ペプチドをターゲット表面改質後全体の直径は 230 下に増やす必要があります-3.4 まで減少した nm の, と平均ゼータ電位 mV15。押出サイズから広範な逸脱は失敗した押し出しの説法 (d粒子>> d押出)、または読み込みに失敗しました (d粒子<< d押出)。集計は、DLS を使用して定量化するも可能性があります。さらに、冷凍の因数は、脂質膜と intraparticular の融合と集計 (図 4) を混乱させるサイクル繰り返し凍結融解として一度だけ解凍する必要があります。図 4 aに示すよう融合性 pSiNPs を 30 日間保存され、構造変化を引き起こすことがなく解凍があります。ただし、1 つの因数の凍結融解を引き起こす深刻な集約を繰り返し (d >> 1,000 nm) (図 4 b) の毎日のサイクルの 4 日以内こうして勧め粒子が単一使用ボリュームを避けようとします。

融合の確認は脂溶性の DiI (ステップ 2.2.2) と融合ペプチド脂質をラベリングと共焦点顕微鏡を用いた in vitro における局在を観察します。図 1 dは、成功の融合、融合ペプチド pSiNP の脂質膜に、DiI を転送し、リソソームの独立したローカライズを示しています。失敗した融合細胞の細胞質とリソソーム (図 1 c) との共存内 DiI ローカリゼーションが表示されます。

Figure 1
図 1: 融合性ポーラス シリコンのナノ粒子システム (F pSiNP).() 回路図表示取り込み従来のナノ粒子とその後エンドソームわなに掛ける事の。F pSiNPs と siRNA ペイロードの後続のゾル性細胞質の配信の回路図 (b) 示す膜融合吸収。DiI 脂溶性色素のロードされた貪食非融合ペプチド pSiNPs (c) CAOV 3 の共焦点顕微鏡画像セル。CAOV 3 セル 6 ウェル プレート、80% 合流に栽培したとナノ粒子の 10 μ L で扱われ、15 分間 5% CO2の 37 ° C で培養しました。セルは、DAPI をスライド ガラスに搭載される 1% パラホルムアルデヒドで固定、乾燥させ、共焦点顕微鏡を用いてまで暗闇の中で保管します。(DiI 脂溶性色素で読み込まれた融合性 pSiNPs を取り上げている CAOV 3 セルの D) 共焦点顕微鏡画像。細胞は、製造元の指示に従って 5% CO2の 37 ° C で 1 時間 LysoTracker 緑の事前に染色された.セル洗浄したし PBS 3 回、15 分間の粒子の DiI ロードの 10 μ L を施した。セルは、とられなかったすべての粒子を除去する 3 回 PBS で洗浄したと井戸が 1 mL の PBS で満たされ、すぐに住セルイメージ投射の共焦点顕微鏡で撮影核染色で表し、リソソームを表します LysoTracker 緑によるライソゾーム染色 DAPIスケール バーを表す 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: セル セットアップを Etch 。() の回路図を示すエッチング細胞の部品およびアセンブリの順序;シリコンの電気化学エッチングのためのセットアップの (b) 図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 最終的な F pSiNP 商品写真。同種と曇りソリューションを示す () 成功の合成(b) 失敗した合成の粒子 (黄色) の集計を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 融合ペプチド pSiNPs の繰り返し凍結融解サイクルを引き起こす集計します。() の平均サイズと融合ペプチド pSiNPs のゼータ電位の後凍結; 一度解凍した場合 30 日間安定したまま(b) 平均サイズと融合ペプチド pSiNPs のゼータ電位毎日凍結融解を受けた後 4 日以内集計の兆候と構造的完全性の損失を示しています。エラーバーは標準偏差を表す (n = 5)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: ポーラス シリコンのナノ粒子合成のダイアグラム。シリコンウエハー (手順 1.4)、多孔質層 (ステップ 1.5)、粒子に多孔質層の超音波処理とポーラス シリコンのナノ粒子 (ステップ 1.6) のコレクションのリフトオフの電気化学的エッチングを示す模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を図 5に示します。融合性 pSiNPs の合成に重要なステップは、読み込みの手順 (手順 3)。膜融合ナノ粒子を集約する場合後合成 (図 3)、理由次が原因である可能性があります: (1) 塩化カルシウム株式がゆく準備されていません、ステップ 3.1.2 必要があります慎重に続くまたは洗練された; するため(2) または pSiNP の比率: siRNA: CaCl2または 3 つのコンポーネントの 1 つ以上の濃度を最適なできない場合があります。CaCl2濃度から始まって再最適化を提案した (例えば、2 M から 1 M または 3 M に変更)。さらに、我々 は、異なるベンダーから同じ化学物質が読み込みステップ、および siRNA を読み込めませんでした。 その後でより低い pH の結果を見られるような同じベンダーから CaCl2があることを確認することが重要です。PSiNPs がまた集中する、希釈、または読み込みプロセスの前にさらに劣化したステップ 1.6.6 の後 2 日間の RNAse フリー水で懸濁粒子を残すことによって。

読み込み後、しばしばコーティング脂質は押出濃度や粒子 (ステップ 4) の密度のために難しさに します。押出成形膜が目詰まりしている場合は、強制的に押し出し膜が裂けるかもしれない。目詰まり時に、押出機を分解し、目詰まりから損失が小さい場合、膜およびサポートを新しいセットに置き換えます。損失が大きい場合、粒子懸濁を希釈し、30 秒前に押し出しの超音波。問題が解決しない場合は pSiNP サイズと積載率集計を最小限に抑えるための再最適化をお勧めします。最後に、汚染物質や細胞や動物の治療の前に集計をなくすため 0.22 μ m 孔フィルターを介して粒子懸濁液をフィルタ リングをお勧めします。粒子を合成したかどうか特にお勧めはフィルタ リング非滅菌環境または粒子の冷凍因数分解の後。

示す図 1 c、d)、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡で観察し、細胞質脂質小屋ポーラス シリコンのコア粒子治療細胞の粒子の fusogenicity を検証する場合があります。15

融合性 pSiNPs およびそのプロトコルで合成数の制限があります。In vitro におけるジーンサイレンシングのアプリケーション、提示された融合ペプチド pSiNPs が誘発する証明 > 100 nM 用量; でセル行の範囲でノックダウン効率を 90%2 a マウス神経芽腫細胞株、CAOV 3 ひと卵巣癌細胞株および悪名高く困難な-に-transfect 未加工 264.7 マウスのマクロファージ細胞株を含みます。しかし、我々 が観察している > のノックダウン効率を 50 %25 nM 投与量は、Lipofectamine のそれに匹敵するほど。カチオン性脂質は、細胞毒素の効果を減らすために最小限使用する必要があります、我々 は以前 1 mg15高い脂質投与量でその安全性を実証しました。生体内でのジーンサイレンシングのアプリケーションの融合性 pSiNPs は選択性によって制限されます。カチオン性脂質は、細胞膜に静電誘致、粒子治療、ローカルとして使用する必要があります。 または表面ターゲットの部位 (例えば、ペプチド、抗体等) を変更します。融合性 pSiNPs の合成プロトコルは現在最適化、siRNA 配信のみの限定。同じメソッドが、miRNA を正常に読み込むときに検証されているし、mRNA、cDNA、および他のより大きいヌクレオチドのペイロードをロードすることができると仮定が、これらはまだ最適化しなければなりません。

遺伝子治療の分野に重要な貢献を提示された作品になります。体外遺伝子サイレンシングの標準的なベンチマークは、Lipofectamine 2000 です。場合それ以上効率15融合ペプチド pSiNPs が同等のノックダウン効果を引き起こすことができることを確認しました。Lipofectamine 2000 以上融合ペプチド pSiNPs の主な利点は、全身注射で体内のアプリケーションに使用する機能です。Invivofectamine 3.0 などの他のエージェントは、生体内でを使用しての製品化されている、彼ら肝臓配信に適しているだけあり増加する化学修飾 Sirna (やオーバー ハング、なしまたはロックされた核酸 (LNA) 構造で) を必要があります。安定性と特異性。16,17,18ただし、膜融合 pSiNPs することができます単純なチオール マレイミド化学、前記 (この目的のためには、余分なシステインを運ぶ) ターゲットのペプチドのチオール グループのバインドとターゲット鎖共役に変更した後合成、ペグインターフェロン脂質膜融合のコーティングの終わりにしたマレイミド リングで二重結合の炭素。また、高い固まり細胞細胞質に読み込みおよび配信の効果細胞特異性の必要性を最小限に抑え、強いジーンサイレンシングの Sirna の非変更された15の効果を達成します。融合ペプチド pSiNPs の 1 つの欠点は、市販トランスフェクション エージェントよりも複雑な複数日にわたるプロセスである合成プロトコルです。しかし、ベンチマーク製品は、最高の結果を得るためトランスフェクション前に新鮮な準備する必要があります、膜融合 pSiNPs かもしれません避けようと冷凍少なくとも 30 日間のノックダウン効率を損なうことがなく。

このメソッドの将来のアプリケーションでは、読み込みと Mrna と Cdna などのより大きい核酸ペイロードの配信のための最適化などがあります。また、CRISPR/Cas9 タンパク質 sgRNA 複合体の配信または Cas9 mRNA と sgRNA、カクテルもです開発オプション システムがアニオン性ペイロードの読み込みに最適。全体的に、F pSiNP システムはを超えて感染症、ウイルス感染症、がん、自己免疫疾患などの病気を治療する遺伝子治療用モジュール式 nanoplatform です。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MJS はサイエンス株式会社スピンネーカーの科学の創設者で、会社の持分。 この補助金は、プロジェクトおよびサイエンス株式会社スピネーカーにその潜在的な利益の全体的な範囲に基づく利益相反管理のため確認されていますが、この特定のパブリケーションに含まれている研究成果は必ずしもスピンネーカー バイオ サイエンス社の利益に関連してこの整理の言葉が検討されており、その利益相反ポリシーに従って、サンディエゴ カリフォルニア大学によって承認されました。他の作家が何を開示するあります。

Acknowledgments

この仕事を通しての健康の国民の協会によってサポートされて # R01 AI132413-01 を契約します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6, (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91, (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18, (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9, (1), 1911 (2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136, (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31, (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31, (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31, (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9, (1), 1969 (2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63, (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8, (1), 2045893217750613 (2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).More

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter