Síntesis, funcionalización y caracterización de nanopartículas de silicio poroso fusogénicas para entrega de oligonucleótidos
Summary
Demostramos la síntesis de nanopartículas de silicio poroso fusogénicas para la entrega eficaz de oligonucleótidos in vitro e in vivo. Nanopartículas de silicio poroso están cargadas de siRNA para formar el núcleo, que es cubierto por fusogénicas lípidos a través de la protuberancia para formar la cáscara. Funcionalización de parte de la segmentación y caracterización de partículas están incluidos.
Abstract
Con el advenimiento de la terapia génica, ha sido el desarrollo de un sistema de entrega de efectivo en vivo nucleótido-carga de importación paralela. Nanopartículas de silicio poroso fusogénica (F-pSiNPs) recientemente han demostrado alta eficacia debido a su alta capacidad de cargamento y vía única absorción celular que evita la endocitosis de oligonucleótidos de silenciamiento del gen en vivo. La síntesis de F-pSiNPs es un proceso de múltiples paso que incluye: (1) de carga y sellado de cargas útiles de los oligonucleótidos en los poros de silicio; (2) simultánea capa y apresto de lípidos fusogénicas alrededor de los núcleos de silicio poroso; y (3) Conjugación de dirigidos a péptidos y lavado para eliminar exceso de oligonucleótidos, restos de silicio y péptidos. Uniformidad de tamaño de partícula se caracteriza por la dispersión ligera dinámica y su estructura de core-shell puede ser verificada por microscopía electrónica de transmisión. La absorción fusogénicas es validada por cargar un lipofílico del tinte, 1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), en el bilayer del lípido fusogénicas y tratar a las células in vitro para observar membrana de plasma versus la coloración endocíticas localizaciones. Previamente se cuantificaron los efficacies gene silenciamiento de segmentación e in vivo en un modelo murino de neumonía por Staphylococcus aureus en el targeting peptide se espera que a la F-pSiNPs a casa en el sitio de la infección. Más allá de su aplicación en S. aureus la infección, el sistema de F-pSiNP puede utilizarse para entregar cualquier oligonucleótidos para terapia del gene de una amplia gama de enfermedades, incluyendo infecciones virales, cáncer y enfermedades autoinmunes.
Introduction
Terapia génica modula la expresión del gen específico para obtener un resultado terapéutico. Numerosas herramientas para modulación de genes han sido descubiertos y estudiados, incluyendo el ácido ribonucleico de interferencia (ARNi) usando oligonucleótidos (por ejemplo, corta interferencia RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), ADN plásmidos5,6, nucleasas (p. ej., dedo de zinc, TALENS)7,8y CRISPR/Cas9 sistemas9,10. Mientras que el mecanismo de la herramienta de acción es diferente, todas las herramientas deben alcanzar el citoplasma de la célula o el núcleo activo. Como tal, mientras que estas herramientas han demostrado para inducir un efecto significativo en la modulación de la expresión génica in vitro, la eficacia in vivo sufre obstáculos extracelulares e intracelulares. Debido a que las herramientas son de origen biológico, muchas enzimas y sistemas de separación existen en nuestro cuerpo que tienen la capacidad para degradar o eliminar los extranjeros moléculas11. Incluso en el caso que los instrumentos lleguen a la célula diana, sufren de endocitosis; un modo de absorción celular que encapsula y atrapa las herramientas en vesículas de estómago como ácidas que degradan o expulsan las herramientas fuera de la célula. De hecho, estudios han demostrado que las nanopartículas lipídicas son endocytosed través de macropinocitosis, de los cuales aproximadamente el 70% de lo siRNA se exocytosed de las células dentro de las 24h de absorción12,13. La mayoría de lo restantes siRNA es degradada a través de la vía lisosomal, y alcanzar en última instancia solamente 1-2% de lo siRNA que inicialmente entra en la célula con las nanopartículas escape endosomal a potencialmente ARNi13,14 .
Recientemente hemos desarrollado nanopartículas de silicio poroso fusogénica (F-pSiNPs) que tienen un núcleo cargado de siRNA compuesta por nanopartículas de silicio poroso y fusogénicas lípidos concha15. F-pSiNPs presenta tres grandes ventajas sobre otros sistemas convencionales de oligonucleótidos: (1) un lípido fusogénicas capa que permite que las partículas de omitir la endocitosis y entregar la carga entera directamente en el citoplasma de la célula (en comparación con el 1-2% mediante la endocitosis partículas13,14) (figura 1); (2) alta carga de masa siRNA en la pSiNPs (> 20% de peso en comparación con el 1-15% de peso por los sistemas convencionales)15, que rápidamente se degradan en el citoplasma (una vez que las partículas del núcleo arrojan la capa lipídica mediante absorción fusogénicas) para liberar el siRNA; y (3) orientación verbal de péptido homing selectivo a deseado tipos celulares in vivo.
El sistema F-pSiNP ha demostrado eficacia de silenciamiento del gen significativo (> 95% en vitro; > 80% in vivo) y posterior efecto terapéutico en un modelo de ratón fatal de la pulmonía de S. aureus ; los resultados de que se publicaron previamente15. Sin embargo, la compleja estructura del sistema F-pSiNP requiere manejo delicado y optimización optimizado para generar nanopartículas de uniforme y estables. Así, el propósito de este trabajo es presentar un protocolo exhaustivo, así como estrategias de optimización de la síntesis, funcionalización y caracterización de F-pSiNPs para ser utilizado en la entrega específica de siRNAs para efecto de silenciamiento del gene potente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Síntesis de nanopartículas de silicio poroso se muestran en la figura 5. El paso crítico en la síntesis de pSiNPs fusogénicas es en el paso de carga (paso 3). Si las nanopartículas fusogénicas están agregando la síntesis (figura 3), la razón puede deberse a lo siguiente: (1) stock de cloruro de calcio forma homogénea no estaba preparada, así paso 3.1.2 debe ser cuidadosamente seguido o refinado; o (2) la relación de pSiNP: siRNA: CaCl2 o …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por los institutos nacionales de salud a través de contrato # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
