Summary
Fisiologicamente, odorante receptores são ativados por moléculas odorant inaladas na fase de vapor. No entanto, mais sistemas in vitro utilizam o stimulation de odorante de fase líquida. Aqui, apresentamos um método que permite o monitoramento em tempo real e in vitro da ativação de receptores odorant após estimulação odorant em fase vapor.
Abstract
Percepção olfativa começa com a interação dos odorantes com os receptors odorant (ou) expressas pelos neurônios sensoriais olfativos (OSN). Reconhecimento de odor segue um esquema de codificação combinatório, onde um OR pode ser ativado por um conjunto de odores e um odorante pode ativar uma combinação de ORs. Através de tal codificação combinatória, organismos podem detectar e discriminar entre uma miríade de moléculas voláteis de odor. Assim, um odor em uma dada concentração pode ser descrito por um padrão de ativação do RUP, que é específico de cada odor. Nesse sentido, quebrando os mecanismos que o cérebro usa para perceber odor requer o entendimento odorant-interações OR. Eis porque a comunidade de olfação está empenhada em "de orphanize" estes receptores. Sistemas convencionais in-vitro, usados para identificar o odorant- ou interações têm utilizado a incubação mídia celular com odorante, que é distinta da natural detecção de odores através da dissolução de odores de vapor na mucosa nasal antes interagindo com RUP. Aqui, descrevemos um novo método que permite o monitoramento em tempo real de ativação OR através do vapor-fase odorantes. Nosso método se baseia na medição acampamento lançamento por luminescência usando o ensaio de Glosensor. Ele preenche lacunas atuais entre abordagens in vivo e in vitro e fornece uma base para um sensor de químicos voláteis biomimético.
Introduction
O sentido do olfato permite animais terrestres interagir com seu ambiente químico volátil para unidade comportamentos e emoções. Fundamentalmente, o processo de detecção de odor começa com a primeira interação de moléculas odorant com o sistema olfativo, ao nível da odorant receptores (ORs)1. Nos mamíferos, RUP individualmente são expressos em neurônios sensoriais olfativos (OSNs) localizados no epitélio olfatório2. Pertencem à família de receptores (GPCR) proteína G-acoplada e mais precisamente a rodopsina, como sub da família (também chamado de classe A). Casal de SRO com o estimulatórios G proteína Golf cuja ativação leva à produção de campo seguida a abertura de canais de nucleotídeo cíclico fechado e a geração de potenciais de ação. Aceita-se que um perceptivo de odor se baseia em um padrão específico de ativado ORs3,4 e, por conseguinte, o reconhecimento de odor segue um esquema de codificação combinatório, onde um OR pode ser ativado por um conjunto de odores e um odorante pode ativar um combinação de ORs. E através de tal codificação combinatória, postula-se que os organismos podem detectar e discriminar entre uma miríade de moléculas voláteis de odor. Uma das chaves para a compreensão de como os odores são percebidos é entender como e que RUP são ativadas por um determinado odor.
Na tentativa de elucidar odorant- ou interações, ensaios funcionais in vitro têm desempenhado um papel essencial. A identificação de ligantes odoríferos de agonista para órfão ORs (orphanization de OR) tem sido um campo muito ativo nos últimos vinte anos, através da utilização de vários in-vitro, ex vivo e in vivo de ensaios funcionais5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
Sistemas de ensaio in vitro são mais adequados para a caracterização funcional detalhada das RUP, incluindo a identificação dos domínios funcionais e resíduos críticos das regiões ultraperiféricas, bem como potenciais aplicações de engenharia. No entanto, mais desenvolvimento de sistemas in vitro valiosos para RUP tem sido um desafio, em parte devido à dificuldade com OSNs cultivo e expressão funcional das RUP em células heterólogos. O primeiro desafio foi estabelecer protocolos que permitiu a expressão de superfície celular de SRO funcional no mapeamento de odorante-interações OR. Um número de grupos independentes que utilizaram várias abordagens5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Uma das primeiras realizações foi feita por Krautwurst et al. em tagged N-terminal do RUP com uma sequência curta de rodopsina (Rho-marca) e observaram uma expressão superfície melhorada em células de rim humano embrionário (HEK)13. Variações feitas para a etiqueta colada à sequência de OR é ainda um caminho explorado para melhorar OR expressão e funcionalidade19,21. Saito et al.. , em seguida, identificou a proteína do receptor-transporte 1 (RTP1) e RTP2 que facilitem tráfico de OR. 22 uma versão mais curta da RTP1, chamado RTP1S, também foi mostrada para ser ainda mais eficaz do que a proteína original23. O desenvolvimento de uma linha de celular (Hana3A) que expressa estàvel Golf, REEP1, RTP1 e RTP2 24, juntamente com o uso de repórteres de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) permitiu a identificação de odorante-interações OR. O mecanismo pelo qual a família RTP de proteínas promove a expressão de superfície celular de SRO permanece para ser determinado.
Uma limitação destes métodos estabelecidos é que eles dependem de odorante estimulação na fase líquida, significando que odorantes pre-são dissolvidos em um meio de estimulação e estimulam as células, substituindo o meio. Isto é muito diferente as condições fisiológicas onde moléculas odorant atingir o epitélio olfatório em fase vapor e ativar SRO por dissolução em mucosa nasal. Para mais se assemelham a exposição de estímulo fisiologicamente relevantes, Sanz et al20 propôs um ensaio com base na estimulação vapor aplicando uma gota de solução de odorante para pendurar sob a face interna de um filme plástico colocado no topo de poços de célula. Eles gravaram as respostas de cálcio, monitorando a intensidade de fluorescência. Este método foi o primeiro a usar a estimulação de odorante ar-fase, mas não permitia uma grande seleção de ativação OR.
Aqui, nós desenvolvemos um novo método que permite o monitoramento em tempo real da ativação de OR in vitro através de estimulação de odorante de fase vapor por Glosensor ensaio (Figura 1). Este ensaio tem sido usado anteriormente no contexto do líquido odorant estimulação18,19,25,26,,27,28,29, 30 , 31. a câmara de vigilância do luminómetro primeiro é incubada com odorant vaporizado antes da placa (Figura 1A) de leitura. Odorant moléculas são então solvated o buffer, banhando as células Hana3A, expressando o ou de interesse, RTP1S e as proteínas Glosensor (Figura 1B). Se o odorant é um agonista dos OR, o OR mudar para o uma conformação registrada e vincular o Golf, ativando a adenilato ciclase (AC) e em última análise, causar níveis acampamento a subir. Este acampamento nascente irá vincular a e ativar a proteína Glosensor para gerar luminescência catalisar luciferina. Esta luminescência é então gravada pelo luminómetro e possibilita o monitoramento de ativação OR. Esse método é de grande interesse no contexto do deorphanization OR pois traz sistemas in vitro mais próxima à natural percepção de odores.
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Protocol
1. Hana3A células de cultura
- Preparar M10 (meio essencial mínimo (MEM) mais 10% de soro bovino fetal (FBS) de v/v) e M10PSF (M10 e mais de 100 µ g/mL penicilina-estreptomicina e 1,25 µ g/mL anfotericina B).
- Cultura de células em 10 mL de M10PSF em um prato de cultura de célula de 100 mm em uma incubadora a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO2).
- Divida as células a cada 2 dias na proporção de 20%: quando a confluência de 100% das células (aproximadamente 1.1 x 107 células) é observada sob um microscópio de contraste de fase, aspire a mídia e lavar as células suavemente com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS).
- Aspire PBS e adicionar 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0.48 mM). Deixe agir por cerca de 1 min, até que as células se dissociam da placa.
- Adicione 5 mL de M10 para inactivar a tripsina e eventualmente separar as células ainda ligadas à placa pipetando para cima e para baixo.
- Transfira o volume (8 mL) para um tubo de 15 mL e centrifugar a 200 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de M10PSF pipetando acima e para baixo para quebrar qualquer célula em massa. Evite criar bolhas no tubo.
- Transferir 1 mL da solução de ressuspensão de células em um novo prato de cultura celular de 100mm e adicionar 9 mL de M10PSF fresco. Incube a 37 ° C e 5% de CO2.
2. preparação das células para transfeccao
- Avalie a confluência, ou o número de células, a observá-las sob um microscópio de contraste de fase. Pelo menos 10% confluência (aproximadamente 1.1 x 106 células) é necessária para um prato.
- Aspirar a mídia e lavar as células suavemente com 10 mL de PBS. Aspire PBS e adicionar 3 mL de EDTA. Deixe agir por aproximadamente 1 min à temperatura ambiente, até que as células se dissociam da placa.
- Adicione 5 mL de M10 para inactivar a tripsina e eventualmente separar as células ainda ligadas à placa pipetando para cima e para baixo. Transferi o volume (8 mL) para um tubo de 15 mL e centrifugar 200 x g por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de M10PSF pipetando acima e para baixo para quebrar qualquer célula em massa. Evite criar bolhas no tubo.
- Dependendo do número de placas a transfected, transferi uma quantidade adequada de células em um reservatório com adequado volume correspondente de M10PSF. Uma placa de 96 poços deve ser banhada com 1/10 de um prato de 100mm confluente de 100% (aproximadamente 1.1 x 106 células) diluído em M10PSF para atingir um volume total de 6 mL. Para uma placa de 96 poços começando com um prato de 100 mm de confluência de 100%, adicione 500 µ l da 5 mL de células ressuspensa para 5,5 mL de M10PSF fresco. Misture as células e M10PSF sem gerar bolhas de ar.
- Pipete 50 µ l de células suspensas em cada poço da placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal. Incube durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
3. plasmídeo Transfection
- Observe a placa de 96 poços sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência de célula entre 30% e 50%.
- Preparar uma mistura de transfeccao primeira que contém o plasmídeo comum para o prato inteiro (RTP1S, ou e proteína Glosensor, consulte Tabela de materiais) os volumes na tabela 1a seguir. Observe que a quantidade de Rho-tag OR deve ser dividido pelo número de regiões ultraperiféricas se vários ORs.
Nota: Nós fortemente conselhos para adicionar um controle negativo do vetor vazio (aqui Rho-pCI) e qualquer controlo positivo (OR conhecido para responder para o odorant testado) para o plano de experimento. - Preparar uma mistura de transfeccao segunda contendo 500 µ l de MEM e 20 µ l de reagente Lipofectamine 2000 (válido para uma placa de 96 poços, consulte Tabela de materiais). Adicione a mistura de segunda para o primeiro e misture suavemente pipetando para cima e para baixo e incube por 15 min à temperatura ambiente. Adicionar 5 mL de M10 e misture delicadamente.
- Substitua o M10PSF na placa de 96 poços anteriormente platted por 50 µ l da mídia final do transfection. Incubar em um conjunto de incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 e a câmara do luminómetro durante a noite seguinte o procedimento descrito na etapa 6 do vácuo.
4. substrato incubação
- Observe a placa de 96 poços sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência de célula entre 60% e 100%. Prepare uma solução de estimulação de Hank está equilibrado sal solução (HBSS) contendo 10 mM de hidroxietil piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) e 5 mM de D-glicose.
- Diluir 75 µ l de reagente de acampamento (ver tabela de materiais) solução para 2,75 mL da solução de estimulação. Remova o transfeccao da placa de 96 poços e lavar as células pela adição de 50 µ l de solução fresca de estimulação para cada poço.
- Remover a solução de estimulação e adicione 25 µ l de solução de reagente acampamento preparada na etapa 4.2 a cada poço. Incube a placa de 96 poços à temperatura ambiente em um ambiente escuro e odor-free (por exemplo, uma gaveta vazia limpa longe de produtos químicos ou qualquer fonte de odorante) por 2 h.
5. Odorant estimulação
- Primeiro, equilibrar a luminómetro câmara com moléculas voláteis odorante. Dilua o odorant para a concentração desejada em 10 mL de óleo mineral(Figura 2). Antes do fim do tempo de incubação do acampamento reagente, adicione 25 µ l da solução odorant em uma nova placa de 96 poços (não aquele que contém as células). Incube a esta placa odorant à temperatura na câmara luminómetro por 5 min (Figura 2B) (nenhuma gravação luminómetro é necessária aqui).
- Definir o luminómetro para gravar a luminescência com 0 s de atraso durante 20 ciclos de medição de placa de 90 s com 0,7 s de intervalo entre os ciclos.
- Bem antes de ler a placa, remova a placa odorant da câmara. Adicione 25 µ l de odorante entre os poços da placa de 96 poços, contendo as células (não adicione o odorant dos poços contendo as células) e rapidamente começar a medida de luminescência de todas as cavidades por 20 ciclos dentro de 30 min (Figura 2C).
6. remoção de odorante restante dentro o luminómetro
- Abra a porta do luminómetro. Introduza o tubo conectado à bomba de vácuo.
- Câmara de vácuo odorantes na leitura extensivamente (pelo menos 2 h, de preferência durante a noite) entre dois odorantes para evitar a contaminação cruzada de compostos voláteis de odor de um experimento para o outro. Substitua o ar fresco, enviando ar comprimido durante 5 min antes incubando o odorant próxima.
7. análise de dados
- Exporte os dados no luminómetro.
- Média de repetições da mesma ou para cada tempo de gravação. Calcular a resposta OR normalizada para qualquer eventual controle (por exemplo, vetor vazio, Figura 3A e seção de resultados representativos) dividindo o valor em média de controle para o bloco a média de valor em cada tempo de gravação (Figura 3B e resultados representativos seção).
- Normalizar a cada resposta OR a sua atividade basal, dividindo a resposta OR em média em 0 s para cada resposta de tempo de gravação (ver Figura 3C e seção de resultados representativos).
- Calcule a área sob a curva de cada ou para obter um único valor de resposta OR. Para fazer isso, soma todos os valores de luminescência de cada tempo de gravação para cada OR.
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Representative Results
Nós selecionados a resposta de três rato RUP, Olfr746, Olfr124 e Olfr1093 usando estimulação vapor de cinamaldeído (Figura 3). Simultaneamente, usamos um controle de vetor vazio (Rho-pCI) para garantir que as atividades de odorante-induzida das RUP testadas foram específicas(Figura 3). A ativação em tempo real das RUP mediante estímulo de vapor odorante foi monitorado ciclos de medição mais de 20. Os dados para cada bem primeiro foram normalizados para o vetor vazio valor de controle em média para cada ciclo (Figura 3B). É importante notar que o RUP podem mostrar níveis variáveis de atividade basal neste ensaio de forma OR-dependente e pode ser importante normalizar também sua resposta a este parâmetro (Figura 3C). O valor médio de uma so pode ser dividido por sua resposta em t = 0 s, permitindo comparar entre RUP. Valores de ativação única para cada OR também podem ser calculados pelo cálculo da área sob a curva (AUC) para cada um ou através da soma de todos os valores de ciclo de medição (Figura 3-D).
Além disso, respostas de dose-dependente podem ser medidas usando esse método usando doses crescentes de odorante. Apresentamos a resposta do Olfr1377 a estimulação de acetofenona gravada seguindo o mesmo procedimento (Figura 4). Acetofenona volatilidade pode ser avaliada pela sua pressão de vapor, que é igual a 0,44 mm Hg a 25 ° C. A uma dada temperatura, um odorante possuindo uma menor pressão de vapor é mais volátil do que um odorante com uma menor pressão de vapor. Acetofenona é, por conseguinte, um odorante moderadamente volátil e é exposta à célula puro e diluído em 10-2, 10-4, 10-6 e 10-8. Apenas as três concentrações mais elevadas (pura, 10-2 e 10-4) são capazes de ativar Olfr1377(Figura 4). Podemos também notar que a estimulação composta pura mostra uma tendência para diminuir a resposta de OR durante o tempo, provavelmente devido à toxicidade de célula, como foi demonstrado por eugenol em uma recente publicação32. Não obstante, podemos observar um comportamento de dependência de dose típica de Olfr1377 (Figura 4B), mostrando que esse método também pode ser usado para determinar a EC50 de ou de compostos voláteis.
Note que quando são realizados experimentos de dose-dependente, nós não aspirar limpar a câmara luminómetro. No entanto, são sempre realizados experimentos de baixo a odorant alto, cada vez mais doses para minimizar contaminações. Além disso, desde que a concentração real de moléculas odorant nos meios de comunicação de célula não é conhecida, o EC50s obtido por esse método não são necessariamente comparáveis aos obtidos pela estimulação líquida. Os valores de EC50 determinados pelo nosso método de levar em conta a volatilidade de odorante, a cinética de dissolução de odorante para o meio, a solubilidade do odorant e a afinidade entre o odorant e o OR, que estão mais próximos à percepção de odor natural. Para nosso exemplo de estimulação Olfr1377 por acetofenona, o valor de EC50 de nosso vapor dose-resposta é 161 µM (% 0.001874), que é em torno de 50 dobre mais alto do que a estimulação líquida (3,28 µM de Saito et al.6). Esta diferença entre líquido e vapor estimulações também foi relatada por Sanz et al.20 , em seu ensaio de estimulação vapor onde estimulação vapor deu 100 a 1000 vezes EC50 valores inferiores a estimulação líquida.
Figura 1 : Princípio de monitoramento em tempo real da ativação de receptores de odorante por odorant vapored. (A), a placa de 96 poços foi colocado para o já equilibrado com câmara do luminómetro odor (nuvem violeta). (B) vaporizado odorant moléculas (violeta) na superfície do buffer mídia celular dissolvidas em alcançar a cavidade OR, à superfície da membrana celular Hana3A. A proteína acessória RTP1S (cinza) foi transfectada, bem como, para favorecer a expressão de superfície celular das RUP. Se a molécula odorante foi um agonista OR, o OR alternada para um estado ativado e vinculado a Golf, provocando a ativação da adenilato ciclase (AC) e a produção de AMP cíclico (cAMP; verde). A proteína Glosensor (luciferase) possui um sítio de ligação para o acampamento que, uma vez ligado, permite que a proteína ligar seu ligante, a luciferina (amarelo). O final complexo Glosensor proteína/luciferina/acampamento produzido a luminescência que foi gravada para monitorar a ativação OR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Protocolos esquemáticos para monitoramento em tempo real da ativação de receptores de odorante por odorant vapored. O odorant (violeta) foi diluído na concentração desejada em óleo mineral (A). A solução foi então banhada em uma nova placa de 96 poços, que foi colocada na câmara luminómetro por 5 min equilibrar o volume com vapored odorante antes de monitoramento da placa de 96 poços transfectada (B). A solução de odorante foi pipetada para cada espaço entre os poços da placa de 96 poços transfectada (ver zoom). A placa foi em seguida, leia para 20 ciclos na câmara luminómetro incubado vapor odorante (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Exemplo de normalização que pode ser executada após a gravação de dados. (A), um vetor vazio (negativo) controle foi inserido no plano de Transfeccao para ser capaz de identificar qualquer potencial ativações não-OR odor específico de células. Ele também forneceu informações sobre a luminescência do fundo da placa. (B) ou cada resposta foi, em seguida, normalizada, dividindo o valor de emissão de cada poço pelo valor médio do vetor de controle em cada prato. Os valores de luminescência de cada ou então foram em média ao longo de ciclos de medição. (C) ou respostas também, então podem ser normalizadas para sua atividade basal mais dividindo cada ciclo de valor pelo valor médio do ciclo de medição 1st (t = 0 s). (D) a AUC pode ser calculada somando os valores de emissão de cada ciclo de medição. Para B, C e D, barras de erro representam o erro padrão da média (SEM, n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Exemplo de respostas dependentes de dose obtida com o método. (A), a resposta do Olfr1377 a acetofenona foi gravado por cinco diferentes diluições em óleo mineral (10010-2, 10-4, 10-6, 10-8) e sem odorant (0) e normalizado após o Protocolo de normalização mostrado na Figura 3. (B) os dados durante a medição ciclos foi traduzida em um valor AUC para cada diluição. Esta figura foi modificada de Kida et al32. Esta figura está licenciada sob uma Creative Commons Attribution 4.0 internacional (CC-BY-4.0). Barras de erro representam o erro padrão da média (SEM, n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Por placa de 96 poços | |
| MEM | 500 Μ l |
| pGlosensor | 10 ng |
| RTP1S | 5 ng |
| OU | 75 ng |
Tabela 1: Mix para transfeccao. Quantidades de plasmídeos (proteína Glosensor, RTP1S e ou) para adicionar a MEM para transfect para uma placa de 96 poços.
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Discussion
A percepção de odor é fundamentalmente dependente da ativação de ORs. Por conseguinte, compreensão de sua funcionalidade é necessária para quebrar os mecanismos complexos que usam o cérebro para perceber seu ambiente químico volátil. No entanto, a compreensão deste processo tem sido dificultada pelas dificuldades em estabelecer um método robusto para o repertório de OR para funcionalidade contra odores in vitro. da tela Célula expressão heteróloga e superfície do RUP foi parcialmente resolvido com a criação de receptores marcou13,19 e pela descoberta e otimização de receptor-transportando proteínas (RTPs) expressado em OSNs22 , 23. os primeiros estudos de triagem em seguida apareceram, trazendo novas perspectivas para a nossa compreensão da função OR como seus odorant reconhecimento padrão6,7,26,33, ativação mecanismo de34,35, estrutura tridimensional teórico36,37, evolução38,39, odor espaço40,41, 42e as implicações no odor deteção43,44,,45,46. Acreditamos que melhorar os métodos in vitro poderia impulsionar o deciframento do odor de codificação. Como tal, desenvolvemos aqui um novo ensaio funcional para permitir o acompanhamento da ativação OR por moléculas odorant vaporizado.
O sucesso desse método depende de várias etapas críticas. Embora melhorado nos últimos anos, expressão heteróloga de algumas regiões ultraperiféricas continua a ser difícil, que podem influenciar a responsividade OR de odorante. A expressão do RUP na membrana celular pode ser avaliada em um experimento paralelo usando citometria de fluxo19,24. Observe que os baixos níveis de expressão de superfície podem respostas robustas ainda presentes na célula heteróloga sistemas35. Outro ponto crítico é para evitar a contaminação de odorante. Dada a sensibilidade deste teste, moléculas odorant de perfume, alimento ou ensaio anterior podem poluir o experimento através da indução de respostas de OR descontroladas. Eis porque aconselhamos a vácuo da câmara do luminómetro pelo menos 2 h, de preferência durante a noite, antes de realizar um ensaio com um odor diferente. Também é importante considerar uma citotoxidade potencial do odorant usado no experimento. Uma potencial diminuição da resposta dos OR durante o acompanhamento de 30 min pode mostrar que o odorant em si tem um efeito negativo sobre a saúde da célula. A citotoxidade de odorante pode ser avaliada através da realização de um ensaio da viabilidade celular após expor as células para o odorant. Para atenuar esse problema, é possível considerar apenas o primeiro 10 min do tempo de gravação para a análise dos dados, o corte final. Notamos que o odorant toxicidade ocorre principalmente quando é testado o odorant puro ou em concentrações muito elevadas. A sensibilidade do nosso ensaio permite a detecção de odorante diluído em óleo mineral. A concentração ideal para eliciar a resposta máxima varia de um odorante para outro, mas observamos que uma diluição de 1% é suficiente para provocar uma saturação de uma resposta de OR32. No entanto, algumas moléculas odorant podem possuir baixa pressão de vapor (e, portanto, de baixa volatilidade) e podem precisar de alguns ajustes para o protocolo apresentado. O tempo de incubação do odorant na câmara luminómetro aqui está situado a 5 min. Partimos do pressuposto que esta quantidade de tempo é suficiente para equilibrar a câmara com moléculas voláteis odorante, mas baixa volatilidade odorantes podem exigir mais tempos de incubação.
Além desses pontos críticos, esse método traz muitas novas possibilidades para explorar as relações estrutura-função de odorante-interações OR. O aspecto de monitoramento em tempo real deste método também permite a compreensão da cinética de eventos que ocorrem durante uma percepção de odor. Como exemplo, usamos o protocolo para explorar a funcionalidade de uma enzima do metabolito, a esterase carboxila 1D (Ces1d), encontrada a ser expressa na mucosa olfativa de mamíferos,47. Esta enzima é conhecida para converter ésteres de ácido carboxílico e álcool48. O transfection co de Ces1d mostrou uma modulação de respostas de OR in vitro para compostos de éster,32 , demonstrando que este novo protocolo é eficiente em explorar a importância das enzimas metabólicas na deteção de odorante. Além disso, usar esta plataforma para investigar odorant misturas e a maneira que os odores são apresentados nas configurações que são mais naturais, permitirá estudos futuros na compreensão mais complexas interações de odorante. Finalmente, a detecção de moléculas odorant por RUP também é de grande interesse no desenvolvimento de um sensor de odor. Tendo mostrado que o nosso sistema pode detectar moléculas odorant apresentadas em uma fase de vapor, este método é um primeiro passo no processo de desenvolvimento de um biossensor miniaturizado.
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Disclosures
Y.F., H. K e H.M entrou com um pedido de patente relevante para este trabalho em 27 de outubro de 2016.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH (DC014423 e DC016224) e o defesa avançada pesquisa Agência RealNose projeto. YF permaneceu na Duke University, com apoio financeiro do programa JSPS para avanço estratégico internacional redes acelerar a circulação de talentosos pesquisadores (R2801). Agradecemos a Sahar Kaleem para edição do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C |
| 100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C |
| centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
| Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum - store at -20 °C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C |
| Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants - store at room temperature |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C |
| Phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C |
References
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