Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Eksitasjon-skanning hyperspektral tenkelig mikroskopi å effektivt diskriminere fluorescens signaler

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

Spectral Imaging har blitt en pålitelig løsning for identifisering og separasjon av flere fluorescens signaler i en enkelt prøve og kan lett skille signaler av interesse fra bakgrunn eller autofluorescence. Eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging forbedrer på denne teknikken ved å redusere den nødvendige bildet oppkjøpet tid samtidig øke signal-til-støy-forhold.

Abstract

Flere teknikker er avhengige av påvisning av fluorescens signaler for å identifisere eller studere fenomener eller belyse funksjoner. Separasjon av disse fluorescens signalene ble påvist tungvint inntil advent av hyperspektral Imaging, der fluorescens kilder kan skilles fra hverandre så vel som fra bakgrunnen signaler og autofluorescence (gitt kjennskap til deres Spectral signaturer). Imidlertid, tradisjonell, utstråling-skanning hyperspektral tenkelig lide fra langsom oppkjøpet timene og lav signal-å-bråk forhold på grunn av det på krevd filterene av begge to eksitasjon og utstråling lyset. Det har tidligere vist at eksitasjon hyperspektral Imaging reduserer nødvendig anskaffelsestid samtidig øke signal-til-støy ratio av ervervet data. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelig utstyr, beskriver denne protokollen hvordan å montere, kalibrere, og bruke et eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging mikroskopi system for separasjon av signaler fra flere fluorescens kilder i en enkelt prøve. Mens svært aktuelt for mikroskopisk bildebehandling av celler og vev, denne teknikken kan også være nyttig for alle typer eksperiment utnytte fluorescens der det er mulig å variere eksitasjon bølgelengder, inkludert men ikke begrenset til: kjemisk Imaging, miljø applikasjoner, øye pleie, mat vitenskap, rettsmedisinske vitenskap, medisinsk vitenskap, og mineralogi.

Introduction

Spectral Imaging kan utføres på en rekke måter, og er referert til av flere termer1,2,3,4. Vanligvis refererer Spectral Imaging til data ervervet i minst to romlige dimensjoner og en Spectral dimensjon. Multispectral og hyperspektral bilde er oftest preget av antall bølgelengde bånd eller om Spectral band er sammenhengende1. For dette programmet er hyperspektral data definert som Spectral data ervervet med sammenhengende bølgelengde band oppnås ved avstand fra sentrum bølgelengder ikke mindre enn halvparten av full bredde ved halv maksimal (FWHM) av hvert båndpassfilter som brukes for eksitasjon (dvs. 5 NM senter bølgelengde avstand for bånd pass filtre med 14-20 NM båndbredder). Sammenhengende natur av data båndene tillater en oversampling av datasettet, slik at Nyquist kriterier er oppfylt når prøvetaking av Spectral domenet.

Hyperspektral Imaging ble utviklet av NASA på 1970-og 1980-tallet i forbindelse med den første Landsat satellitten5,6. Innsamling av data fra flere sammenhengende Spectral band tillot generering av et utstråling spektrum av hver piksel. Identifisere og definere stråleglans spekteret av individuelle komponenter gjorde det mulig å ikke bare oppdage overflate materialer av deres karakteristiske Spectra, men det også tillatt for fjerning av mellomliggende signaler, for eksempel variasjoner i signalet på grunn av atmosfæriske forhold. Konseptet med å påvise materialer ved hjelp av deres karakteristiske Spectra ble brukt på biologiske systemer i 1996, da Schröck et al. brukte kombinasjoner av fem forskjellige fluorophores og deres kjent Spectra å skille merket kromosomer i en prosess betegnes Spectral karyotyping7. Denne teknikken ble utarbeidet på 2000 av Tsurui et al. for fluorescens avbildning av vevsprøver, ved hjelp av syv fluorescerende fargestoffer og en talls verdi nedbryting for å oppnå Spectral separasjon av hver piksel i lineære kombinasjoner av Spectra i referansen bibliotek8. I likhet med sine eksterne sensing motstykker, kan bidraget til hver kjente fluoroforen beregnes fra hyperspektral bildet, gitt a priori informasjon av spekteret av hver fluoroforen.

Hyperspektral Imaging har også blitt brukt i områdene landbruk9, astronomi10, biomedisin11, Chemical Imaging12, miljømessige applikasjoner13, Eye Care14, mat Science15, Forensic Science16,17, Medical Science18, mineralogi19, og overvåkning20. En nøkkel begrensning av gjeldende fluorescens mikroskop hyperspektral Imaging systemer er at standard hyperspektral Imaging teknologi isolerer fluorescens signaler i trange bånd med 1) først filtrere eksitasjon lys for å kontrollere prøven eksitasjon, deretter 2) ytterligere filtrering slippes lys for å skille fluorescens utslipp til smale band som senere kan skilles matematisk21. Filtrering både eksitasjon belysning og slippes fluorescens reduserer mengden tilgjengelig signal, som senker signal-til-støy-forhold og nødvendiggjør lengre oppkjøp ganger. Den lave signal og lange oppkjøpet ganger begrense anvendelsen av hyperspektral Imaging som et diagnostisk verktøy.

En Imaging modalitet er utviklet som gjør bruk av hyperspektral Imaging men øker tilgjengelig signal, og dermed redusere den nødvendige oppkjøpet tid21,22. Denne nye modalitet, kalt eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging, kjøper Spectral bildedata ved å variere eksitasjon bølgelengde og samle et bredt spekter av slippes ut lys. Det har tidligere vist at denne teknikken gir størrelsesordener økninger i signal-til-støy-forhold i forhold til utslipps skanning teknikker21,22. Økningen i signal-til-støy-forhold er i stor grad på grunn av den brede bånd pass (~ 600 NM) av utslipps lyset oppdaget, mens spesifisitet er gitt ved å filtrere bare eksitasjon lys i stedet for fluorescens utslipp. Dette gjør at alle slippes lys (for hver eksitasjon bølgelengde) for å nå detektoren21. I tillegg kan denne teknikken brukes til å diskriminere autofluorescence fra eksogene etiketter. Videre kan evnen til å redusere anskaffelses tiden på grunn av økt synlig signal reduserer faren for photobleaching i tillegg til at Spectral skanner på en anskaffelses hastighet som er akseptabelt for Spectral video Imaging.

Målet med denne protokollen er å tjene som en datainnsamling guide for eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging mikroskopi. I tillegg er beskrivelser inkludert som bidrar til å forstå lys banen og maskinvaren. Også beskrevet er gjennomføringen av åpen kildekode-programvare for en eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging mikroskop. Til slutt, beskrivelser er gitt for hvordan du skal kalibrere systemet til en NIST-sporbar standard, justere programvare og maskinvare for nøyaktige resultater, og unmix det oppdagede signalet inn bidrag fra enkelte komponenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. enhetsoppsett

  1. Lyskilde: Velg en bred bånds lys kilde med høy effekt og høy kollimasjon (en 300 W XE lys bue lampe ble brukt til disse studiene).
  2. Shutter (valgfritt): Legg til en lukker til den optiske banen for å redusere photobleaching for tidsforløp avbildning.
  3. Tunable filter system: innlemme en mekanisk tuning montering og Thin-Film tunable filter (TFTF) satt til å muliggjøre ønsket bølgelengde-justerbar eksitasjon rekkevidde (f. eks, 360-485 NM).
  4. Mikroskop: Bruk en invertert fluorescens mikroskop inkludert en motorisert dichroic filter turret og kontrolleren.
    1. Fluorescens filter kube: sette sammen en lang-pass fluorescens filter kube. For best resultat, Velg et dichroic speil og et utslipps filter med lang pass på samme bølgelengde for å oppnå optimal separasjon av eksitasjon fra utslipps lys (f.eks. 495 NM).
    2. Mål: Bruk et passende apochromatic mål for å sikre ensartet fokus over bølgelengdeområdet som brukes for eksperimentet (et 60x vann mål ble brukt i denne studien).
    3. Automatisert fase (valgfritt): Bruk en automatisert fase for rask prøvetaking av flere visningsfelt og/eller svært store felt gjennom bilde søm. Kalibrer scenen med målet og kameraet.
  5. Kamera: Velg et passende kamera for å oppnå den romlige oppløsningen, følsomheten og støy kravene til eksperimentet (dette systemet benyttet et høysensitiv sCMOS-kamera).

2. programvare for oppkjøp

  1. Velg en programvarepakke som tillater uavhengig kontroll av hver maskinvarekomponent, for eksempel Micro-Manager.
    1. Opprette konfigurasjonsfilen: konfigurasjonsfilen er et lagret sett av instrumenter og instruksjoner som Micro-Manager vil laste for å drive systemets maskinvare. Hvis du vil opprette en konfigurasjonsfil, klikker du verktøy ≫ Veiviser for maskinvarekonfigurasjon.
      1. I trinn 1 klikker du Opprett ny konfigurasjons ≫ neste for å fortsette. Merk at brukeren kan velge å endre eller utforske eksisterende konfigurasjon hvis en er tilgjengelig allerede.
      2. I trinn 2 blar du gjennom listen over tilgjengelige enheter for å finne enhetene som kan styre gjennom Micro-Manager, for eksempel mikroskopet, lampen, scenen, lukkeren og kameraet. Når uthevet, klikker du Legg til... -knappen for å legge enheten til i listen over installerte enheter. Dette vil åpne et nytt vindu.
        1. Angi enhetens etikett i etikett -boksen. (f.eks. sCMOS-kamera)
        2. Under verdivelger du den aktuelle com-porten for hver enhet. Dette fører til at en liste over enhetsegenskaper vises nederst i vinduet.
        3. La enhetsegenskapene være i standardinnstillingene. Legg merke til at egendefinerte verdier for hver enhets egenskap kan angis som ønsket.
        4. Når hver enhet er lagt til, klikker du neste for å fortsette til neste trinn. Merk at hvis noen enheter er utelatt eller må endres, kan konfigurasjonsfilen endres senere som beskrevet i trinn 2.1.1.1.
      3. I trinn 3 bruker du rullegardinmenyene til å velge standard kamera, lukker og fokus trinn. Hvis automatisk utløser er ønsket, klikker du avmerkings boksen under rullegardinlisten fokus trinn. Hvis fokus retningen til Z-stadiet er kjent, velger du den fra rullegardinlisten under trinn fokus retninger (avansert). Hvis ikke, lar du standardverdien være Ukjent.
      4. I trinn 4 dobbeltklikker du boksene under forsinkelse [MS] for å angi forsinkelser som er knyttet til de automatiserte enhetene, for eksempel forsinkelser på 100 MS for lampen, stadiet og lukkeren, og en 250 ms forsinkelse for kommandoer til den mekaniske justerings samlingen for å gjøre rede for mekanisk koblingstid mellom filtrene.
      5. I trinn 5 tilordner du etiketter for tilstands enhetene. Konfigurasjonen for mikroskop systemet for eksitasjon bruker etiketter i filter blokken til å identifisere hver fluorescens filter kube (for eksempel tilstand 0 tilsvarer etiketten Bright, den tomme filter kuben som brukes under skarp felt avbildning; mens stat 3 tilsvarer etiketten 495 NM og tilpasset 495 NM dichroic filter kube brukes til å skille eksitasjon og utslipps lys på 495 NM). Etikettene er også brukt i den mekaniske tuning forsamlingen til å lagre bytte kommandoer for hver eksitasjon bølgelengde (f. eks tilstand 0 tilsvarer 340 NM eksitasjon bølgelengde tuning kommando for mekanisk tuning forsamlingen).
      6. I trinn 6 klikker du Bla gjennom ved siden av boksen konfigurasjonsfil for å velge en lagringsplassering og et filnavn for konfigurasjonsfilen. Klikk Fullfør for å lagre konfigurasjonsfilen.
    2. Oppstarts grupper og forhåndsinnstillinger: Micro-Manager kan lagre ulike grupper i hver konfigurasjonsfil for å aktivere eller endre et delsett av maskinvaren. For eksempel, en "system oppstart" gruppe og tilstedeværelse kombinasjonen ville lager retten innfatningene som binning størrelse og avlesning ratene for kameraet.
      1. Opprett en gruppe (f.eks. system) ved å klikke på + i hovedvinduet i gruppe avsnittet.
      2. Kontrollere Bruk i gruppe? bokser inne i gruppen som krever en standardverdi som skal angis (for eksempel binning i det tilknyttede standard kameraet).
      3. Opprett en ny forhåndsinnstilling (for eksempel "oppstart") ved å klikke på + i hovedvinduet i det forhåndsinnstilte avsnittet.
      4. Hver boks som er merket i trinn 2, vises som et forhåndsinnstilt alternativ her. Velg en standardverdi som skal lastes inn for hver boks som kontrolleres.
    3. Gruppe og forhåndsinnstillinger for eksitasjon bølgelengder: Micro-Manager behandler hver eksitasjon bølgelengde som sin egen kanal med den sin egen bølgelengde bytte kommando; Derfor må hver av dem lagres som sin egen forhåndsinnstilling.
      1. Opprett en ny gruppe som skal inneholde et sett med ønskede eksitasjon bølgelengder (for eksempel "495 NM dichroic")
      2. Kontrollere Bruk i gruppe? -boksen kalt etikett som tilsvarer VF-5-enheten.
      3. Opprett en ny forhåndsinnstilling oppkalt etter hver eksitasjon bølgelengde (for eksempel "340 NM").
      4. Tildel til hver forhåndsinnstilling riktig egenskapsnavn og forhåndsinnstilt verdi (f.eks. egenskapsnavn: «etikett»; forhåndsinnstilt verdi: «340 NM»).
    4. Multi-dimensjonale oppkjøpet verktøyet: KlikkMulti-D-Acq.øverst til venstre i Micro-Manager-vinduet for å åpne et verktøy som kan tilpasses, for å ta et bilde av prøven ved hver eksitasjon bølgelengde ved å klikke på en enkelt knapp. Det finnes flere tilpasningsalternativer for å konstruere anskaffelsen nøyaktig slik du ønsker.
      1. Tidspunkter (ikke brukt i dette eksempelet): for studier uten tidsforløp komponent, la boksen ukontrollert. Hvis tidsforløp studier er ønsket, Merk av i denne boksen. Hvis avmerket, skriver du inn antall ganger du vil utføre resten av anskaffelses innstillingene i tall -boksen. Angi tiden mellom etterfølgende anskaffelser ved å angi varigheten i intervall -boksen, og velg riktig enhet (millisekunder, sekunder eller minutter, vanligvis sekunder).
      2. Flere posisjoner (XY; ikke brukt i dette eksemplet): for studier av en enkelt XY-posisjon, lar du boksen være umerket. Hvis flere XY-posisjoner er ønsket, merker du av i boksen og klikker på Rediger stillings liste knappen for å åpne et eget vindu. Flytt scenen til hver ønsket plassering og klikk på Merk -knappen for å lagre den posisjonen i programvaren. Gjenta til alle ønskede XY-posisjoner er merket. Lukk dette vinduet for å fortsette.
      3. Z-stabler (lysbilder, ikke brukt i dette eksempelet): for studier av en enkelt Z-posisjon, la boksen ukontrollert. Hvis det ønskes flere Z-posisjoner, merker du av i boksen. Flytt scenen til ønsket Start Z-posisjon, og klikk på Angi -knappen ved siden av z-Start- boksen. Flytt scenen til ønsket avsluttende Z-posisjon, og klikk på Angi -knappen ved siden av z-end- boksen. Angi ønsket trinn størrelse (i mikron) i Z-trinn- boksen.
      4. Kanaler: Kontroller at det er merket av i boksen kanaler . Her er kanaler navnene gitt til den enkelte eksitasjon bølgelengder. Tilgjengelige "kanaler" svarer til "Groups" som beskrevet i trinn 2.1.2 og 2.1.3.
        1. Gruppe: Klikk på rullegardinlisten for å velge en gruppe der du kan velge tilgjengelige eksitasjon bølgelengder (for eksempel 495 NM dichroic).
        2. Klikk på Behold lukker åpne -boksen for å holde lukkeren åpen mellom anskaffelser for hver kanal. Legg merke til at lukkeren fortsatt vil lukke mellom påfølgende Spectral-skanninger Hvis denne boksen er avmerket, forutsatt at autoshutter-alternativet også er valgt i hovedvinduet.
      5. Klikk på ny -knappen for å legge til kanaler i anskaffelses listen. Note det det fjerne knapp kan brukes å fjerne alle kanalene ikke lenger ønsket og det opp og ned kan brukes å omorganisere alle valgt kanalen.
        1. Kontroller at Bruk? avkrysningsruten er valgt for hver bølgelengde i Spectral Scan.
        2. Konfigurasjon: Klikk på rullegardinlisten under konfigurasjon og velg den første bølgelengden i ønsket Spectral Range (f.eks. 340 NM).
        3. Eksponering: Dobbeltklikk på boksen under eksponering og skriv inn ønsket eksponeringstid for den valgte bølgelengden (for eksempel "100" for 100 MS). Se avsnitt 5 ("data innhenting") for forslag om å velge passende eksponeringstider.
        4. Z-forskyvning (gjelder ikke i en Spectral Scan): la denne boksen stå tom (ved 0) når du utfører en Spectral Scan.
        5. Z-stack: Sørg for at denne boksen er merket for hver bølgelengde i Spectral området hvis du utfører en Z-stack.
        6. Hopp fr. (ikke aktuelt i en Spectral Scan): la denne boksen stå tom (ved 0) når du utfører en Spectral Scan. Merk at det kan være nyttig å selektivt hoppe over rammer i tilfelle en eller noen eksitasjon bølgelengder er betydelig kraftigere enn andre, eller om individuelle eksitasjon bølgelengder vise seg å være spesielt fototoksisk.
        7. Farge: la denne boksen stå tom når du utfører en Spectral Scan. Merk at farger kan velges for individuelle bølgelengde bånd for data visualisering formål, men fargen er upassende for påfølgende Spectral unmixing.
        8. Gjenta disse trinnene til hver ønsket eksitasjon bølgelengde innenfor den gitte Spectral skanneområdet er lagt til.
      6. Anskaffelses ordre: Klikk på rullegardinlisten for å velge i hvilken rekkefølge de ovennevnte alternativene (2.1.4.1-2.1.4.5) vil bli utført. For Spectral skanninger som den som vises her, er anskaffelses ordren ganske enkelt kanal. Legg merke til at flere alternativer vises som flere bokser er kontrollert i multi-dimensjonale oppkjøpet verktøyet [tidspunkter, flere stillinger (XY) og Z-stabler (skiver)] og tillate valg av enten posisjon eller tid først, etterfulgt av enten skive eller Kanal.
      7. Autofokus (ikke brukt i dette eksempelet): Hvis det er valgt flere posisjoner (XY) , er flere forskjellige autofocusing tilgjengelige. Klikk på Alternativer knappen og velg en autofokus metode fra rullegardinlisten ved siden av lukke knappen.
      8. Sammendrag: gjennomgå dette vinduet for en oppsummering av antall tidspunkter, XY stillinger, Z skiver, kanaler, totalt antall bilder, totalt minne, skanne varighet, og oppkjøpet for å sikre den oppførte informasjonen samsvarer med forventede anskaffelses innstillinger.
      9. Lagre bilder: Kontroller at det er merket av i denne boksen for å lagre dataene som samles inn gjennom bruk av multi-dimensjonal Acquisition-verktøyet.
        1. Klikk på... -knappen ved siden av katalog roten for å velge en katalogrot der filene skal lagres. Navngi katalog roten på en måte som beskriver relevante detaljer om eksperimentet (f.eks. GCaMP luftveis glatte muskelceller).
        2. Skriv inn et navn i boksen ved siden av navne prefikset som beskriver gjeldende bilde anskaffelse (f.eks. FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Det anbefales å lage et navn prefiks som identifiserer synsfeltet og eksponeringstid, samt annen relevant informasjon som for eksempel objektet og dichroic filter brukes. Note det det for det første image stabel tatt benytter disse innfatningene ville være bevart med "_1" fulgte navnet prefiks. Alle etterfølgende stabel tatt med det likt adresseliste rot og navnet prefiks ville være bevart med "_n", i hvilket "n" er antallet av timene en stabel er blitt tatt med dette navnet inne telefonkatalog.
        3. Klikk på separate bildefiler for å sikre at bildet som genereres ved hver eksitasjon bølgelengde, lagres.
      10. Lagre som: Klikk på Lagre som... knappen nær øverst til høyre på multi-dimensjonale Acquisition verktøyet for å lagre disse oppkjøpet innstillinger for enkel fremtidig bruk. Legg merke til at katalog roten og navne prefikser også vil bli lagret.
      11. Tilegne seg: endelig, klikker du tilegne! -knappen for å begynne å hente bilder i henhold til anskaffelses innstillingene som er valgt ovenfor.

tredje Spectral respons korreksjon (valgfritt):

  1. Spectral output korreksjon kan gjøres for å kalibrere Spectral respons av systemet til en kjent standard, for eksempel en NIST-sporbar lampe eller andre NIST-sporbar standard eller instrument. Dette trinnet er spesielt viktig hvis resultatene sammenlignes med andre Spectral Imaging instrumenter, spektrometre, eller mellom ulike laboratorier. Denne prosessen er rapportert i detalj tidligere21,23.
    1. Bruk en spektrometer som er kalibrert til en NIST-sporbar lyskilde (for eksempel LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) eller annen NIST-sporbar standard for å tilegne seg den spectroradiometric kraften til belysningen målt i prøvefasen. Utfør en separat korreksjon for hver kombinasjon av lys kilde innstilling, dichroic speil og objektiv. Bruk en integrert sfære koplet til spektrometer for å måle vidvinkel belysningen nøyaktig fra målet for mikroskopet.
    2. Bruk en integrasjons metode, for eksempel trapesformet regelen, til å integrere spectroradiometric data over bølgelengder opplyst. En 40 nm båndbredde for integrering sentrert rundt midten bølgelengde er tilstrekkelig for de fleste filtre som har en nominell båndbredde på mellom 14-20 NM full bredde på halv-maksimum (FWHM). Den integrerte verdien representerer intensiteten av Spectral belysning ved hvert eksitasjon bølgelengde bånd.
    3. Plot den integrerte intensiteten av hvert bølgelengde bånd som en funksjon av eksitasjon sentrum bølgelengde for å tillate visualisering av Spectral belysning intensitet profil.
    4. Bestem bølgelengde båndet med lavest integrert intensitet.
    5. Normalisere profilen for Spectral belysnings intensitet ved å dele den laveste integrerte intensiteten med den integrerte intensiteten til hvert bølgelengde bånd for å generere en korrigerings faktor som er avhengig av bølgelengde.

4. prøveforberedelse

  1. Forbered en "blank" prøve (f.eks. Plasser et glass dekkglass i celle kammeret og tilsett 1 mL buffer). Denne bufferen er beskrevet tidligere24.
  2. Forbered en umerkede prøve for å bestemme noen prøve autofluorescence (f. eks, plassere et glass dekkglass inneholder umerkede luftveiene glatte muskelceller25,26 i celle kammeret og tilsett 1 ml buffer).
  3. Forbered et separat utvalg med én etikett for hver fluorescerende etikett som brukes i eksperimentet, på følgende måte:
    1. Legg til fortynnet mitokondrie etikett til buffer for å oppnå en 100 nM-konsentrasjon. Legg denne bufferen til dekkglass som inneholder luftveiene glatte muskelceller. Ruge for 20 min ved 20-25 ° c. Flytt dekkglass til celle kammeret og tilsett 1 mL buffer. Merk at den optimale konsentrasjonen av mitokondrie etiketten vil variere fra faktorer som produsent, tilhørende farge, og ønsket spesifisitet.
    2. Flytt en dekkglass som inneholder luftveier glatte muskelceller transfekterte med GCaMP sonde27 til celle kammeret og tilsett 1 ml buffer.
  4. Forbered ett eller flere eksperimentelle prøver som inneholder en blanding av de ønskede fluorescerende etikettene.
    1. Tilsett 1 mL buffer (100 nM konsentrasjon av mitokondrie etikett) til en dekkglass inneholdende luftveier glatte muskelceller transfekterte med GCaMP sonde og ruge i 20 min ved 20-25 ° c. Flytt dekkglass til celle kammeret og tilsett 1 mL buffer.

5. innhenting av data:

  1. Kontroller at riktig dichroic beamsplitter (f.eks. 495 NM dichroic filter kube), objektiv (for eksempel 60x vann objektiv), og kamera (sCMOS kamera) er valgt.
  2. Legg prøven på scenen.
  3. Dobbeltklikk på boksen ved siden av eksponering [MS] og skriv "100" for å angi eksponeringstid på 100 MS. Merk at eksponeringstiden kanskje må økes eller reduseres avhengig av fluorescens intensitet.
  4. Velg 475 NM fra rullegardinmenyen i Micro-Manager hovedvinduet for første prøve visning. Merk at 475 NM kanskje ikke er den optimale bølgelengden for prøven visning eller avgjøre om oversaturation vil skje gjennom hele bildet stabelen.
  5. Klikk Live for å vise eksemplet.
    1. Klikk knappen for automatisk visningsområde for intensitet automatisk ved siden av histogrammet nederst i vinduet for å hente minimums-og maksimumsverdiene til meningsfulle visuelle områder.
  6. Bruk fokus knappene på mikroskopet til å fokusere på prøven. Det er ofte nyttig å finne kanten av prøven til hjelp i fokus. Prøven vil bli fokusert når kant funksjonene i bildet vises skarpt. Merk at det kan være nødvendig å klikke på Auto -knappen flere ganger under fokusering til hjelp i å vise fluorescens bildet. I tillegg kan det være at noen brukere synes det er enklere å fokusere på prøven hvis mikroskopet er i overføringsmodus.
    1. Hvis fokus i overføringsmodus, for sikkerhet, må du først kontrollere at Spectral lyskilde ikke sender lys til okularene før du justerer lys banen for overføring bildebehandling. Vær også oppmerksom på at det kan være små avvik mellom fokus for overføring og fluorescens bilder. Når akseptabelt fokus er oppnådd, rekonfigurere lys banen for Spectral fluorescens Imaging.
  7. Klikk på multi-D-Acq. -knappen nær toppen til venstre i vinduet for å åpne multi-dimensjonale Acquisition-verktøyet (beskrevet og konfigurert i avsnitt 2).
  8. Velg et passende Spectral-område for anskaffelse av Spectral (f.eks. 360-485 NM for 495 NM dichroic filter) ved å klikke Last inn... -knappen øverst til høyre i vinduet multi-dimensjonale Acquisition Tool og navigere til de eksitasjon innstillingene lagret tidligere (i trinn 2.1.4.10). Se diskusjonen for informasjon om egnede Spectral områder.
  9. Skaff en bakgrunn/blank bilde som ikke inneholder noen fluorescens data å bruke for bakgrunn og støy subtraksjon. Dette kan utføres ved hjelp av en tom prøve (trinn 4,1) eller ved å navigere til et tomt område av en eksperimentell prøve. Som beskrevet i trinn 5,6, er dette lettest oppnås ved å finne kanten av prøven og deretter plassere den slik at kanten er sentrert innenfor synsfeltet.
    1. Når anskaffelses innstillingene er bekreftet og en bakgrunns region er synlig, klikker du på Hent! -knappen for å hente en Spectral bildestakk som inneholder bakgrunn og støy for å bruke for subtraksjon senere. Det bør bemerkes at prøvene er sannsynlig å ha mer intense fluorescens bort fra kanten av prøven. Det kan være lurt å flytte om prøven for å finne den "lyseste" regioner og utføre flere test bilde stabler å bestemme passende oppkjøpet ganger og unngå å bli mer.
  10. Ta ett bildes stabel på en region av prøven som ser ut til å ha intense fluorescens for å sikre at ingen kombinasjon av bølgelengder og at eksponeringstider resulterer i å bli utsatt.
  11. Bruk ImageJ for å bekrefte at ingen bølgelengder inneholder overeksponert bildepunkter.
    1. I ImageJ, klikk fil ≫ importer ≫ bildesekvens og naviger til mappen som inneholder Spectral bilder tatt i trinn 5,10. Dette vil åpne et nytt vindu. Klikk i boksen ved siden av antall bilder , og skriv inn antall bølgelengder som inngår i Spectral-skanningen (f.eks. 26). Behold startbildet og Øk verdien som "1". Klikk på OK -knappen for å fortsette.
    2. Trykk M på tastaturet for å utnytte ImageJ ' s måle funksjon. Kontroller at nummeret som er oppført under Maks er ikke den øvre deteksjons grensen for kameraet (f.eks. 65 535). Gjenta for hvert bilde i Spectral Scan. Vær oppmerksom på at deteksjons grensen for kameraet avhenger av selve kameraet. Den øvre grensen vises øverst til høyre i histogrammet i hovedvinduet i MicroManager. Alternativt kan den øvre grensen bestemmes ved å åpne et bilde i ImageJ og navigere til bilde ≫ juster ≫ lysstyrke/kontrast. Klikk på Set -knappen i det resulterende popup-vinduet, Skriv inn en svært stor verdi (for eksempel 999 999) i det tomme feltet ved siden av høyeste viste verdi, og klikk OK for å fortsette. Maksimumsverdien som vises i det nye histogrammet, bør være den øvre deteksjons grensen for kameraet.
    3. Hvis noen av bildene inneholdt den øvre deteksjons grensen for kameraet (f.eks. 65 535), justerer du eksponeringstiden for Spectral-skanningen for å sikre at det maksimale signalet i hele Spectral-serien ikke overstiger kameraets dynamiske rekkevidde.
  12. Hent Spectral bildedata fra umerkede prøver for å bestemme eventuelle autofluorescence. Skaff deg skanningen etter de umerkede prøvene med identisk bølgelengdeområde og kamerainnstillinger som resten av eksperimentet (f.eks. 360-485 NM ved 100 MS per bølgelengde).
  13. Skaff deg Spectral bildedata fra enkelt merkede prøver som skal brukes som Spectral-kontroller for å bygge Spectral biblioteket. Utfør skanningen for hver etikett ved hjelp av et identisk bølgelengdeområde, eksponeringstid og kamerainnstillinger. Vær oppmerksom på at det kan være behov for lengre anskaffelsestid for enkelte prøver for å gi nøyaktig identifisering av merke spekteret med minimalt støy bidrag.
  14. Utføre målinger på en eksperimentell prøve (f. eks, menneskelige luftveier glatte muskelceller med GCaMP sonde og mitokondrie etikett).
    1. Plasser et lysbilde eller en dekkglass som inneholder den eksperimentelle prøven på mikroskopet.
    2. Velg et synsfelt med passende merkede celler av vev.
    3. Skaff deg Spectral bildedata ved hjelp av ønskede anskaffelses innstillinger, som beskrevet ovenfor.

6. bildeanalyse

  1. Korrigere bilder til en flat Spectral respons.
    1. Trekk fra bakgrunns spekteret som er oppnådd i seksjon 5,9 og multipliser med korreksjons koeffisienten fastsatt i Seksjon 3.1.5. Dette kan gjøres med en enkel MATLAB script eller ImageJ rutine. En subtraksjon/korreksjon MATLAB kode (som brukes i dette eksempelet) er tilgjengelig på University of South Alabama Bioimaging Resources nettsted.
      1. Last inn koden for subtraksjon/korrigering i MATLAB.
      2. Klikk på Kjøri kategorien editor. Dette vil åpne et nytt vindu som inneholder en bsq korreksjon knapp. Klikk bsq korrigering -knappen for å åpne et annet vindu som inneholder valg for arbeidsmappe, bakgrunns fil, korreksjonsfaktor fil og uncorrected TIFF-mappe.
        1. Bruk Bla gjennom... knappen ved siden av Working Directory for å velge filbanen der påfølgende vinduer vil åpne. Naviger til mappen som inneholder det lagrede bakgrunns spekteret (i DAT-format).
        2. Bruk Bla gjennom... knapp foruten miljøet arkiv (. dat) å åpen det adresseliste valgt inne steg 6.1.1.2.1 og foretrekker det ønsket miljøet arkiv (inne. dat formatter). Klikk Åpne-knappen for å fortsette.
        3. Bruk Bla... knappen ved siden av rettelse Factor (. dat) for å velge en korreksjon faktor. Mappen for korrigeringsfaktoren har som standardplasseringen til den overordnede MATLAB-koden. Om nødvendig navigerer du til under mappen som inneholder korrigerings faktor filen (i DAT-format). Merk den riktige korrigerings faktor filen, og klikk Åpne-knappen for å fortsette.
        4. Bruk Bla... knappen ved siden uncorrected TIFF folder å åpne katalogen valgt i trinn 6.1.1.2.1 og velg mappen for bakgrunns subtraksjon og bilde korreksjon (dette er vanligvis Pos0 mappen som umiddelbart inneholder rå Spectral bilder). Klikk på Åpne -knappen for å fortsette.
        5. Klikk på knappen Klikk for Spectral Correction . Etter at behandlingen er fullført, vil et vindu åpnes med meldingen "bsq rettelse Complete". Klikk på OK -knappen for å fortsette. Rettelsen profilen er lagret inne en ny brosjyre benevnt med det original ømt punkt Spectral image brosjyre og en i tillegg "_Corrected" (e.g., Pos0_Corrected).
  2. Generer Spectral biblioteket. Flere programvarepakker kan brukes til å trekke ut Spectral data fra bilder, inkludert ImageJ. For best resultat, normalisere hver endemannen til bølgelengde bandet med størst intensitet ved å bestemme hvilken bølgelengde bånd har den mest intense verdien og dividere målingen på hvert bølgelengde bånd med den maksimale verdien. Det bør også bemerkes at single-Label kontroller generert innen autofluorescent prøvene vil trenge ytterligere modifikasjoner28,29,30,31,32. Se trinn 6.2.4 og diskusjon for detaljer.
    1. I ImageJ klikker du fil ≫ importer ≫ bildesekvens. Dette vil åpne et nytt vindu. Naviger til mappen som inneholder de korrigerte Spectral-bildene. Dobbeltklikk en bildefil i mappen for å åpne et nytt vindu. Klikk i boksen ved siden av antall bilder , og skriv inn antall bølgelengder som inngår i Spectral-skanningen (f.eks. 26). Behold startbildet og Øk som "1". Klikk på OK -knappen for å fortsette.
    2. I hovedvinduet for ImageJ klikker du på ikonet for polygon-valg , og deretter bruker du musepekeren ved å klikke på bildet for å lage en polygon rundt et område som inneholder fluorescens data. Vær oppmerksom på at det kan være lite eller ingen fluorescens data i den innledende bølgelengden. Naviger til et annet bølgelengde bilde og/eller bruk verktøyet for lysstyrke/kontrast (bilde ≫ juster ≫ lysstyrke/kontrast ≫ Auto) for å bedre visualisere områder som inneholder fluorescens data.
    3. Med polygon tegnet, generere Z-aksen profil ved å klikke bilde ≫ stabler ≫ plot Z-akse Profile. Dette vil åpne et nytt vindu. Klikk Lagre for å lagre Spectral-dataene som en CSV-fil.
    4. Utfør en subtraksjon for å sikre en skikkelig Spectral bibliotek med rene etiketter blottet for autofluorescence forurensning. Bruk følgende ligning29 for å isolere et rent spektrum fra blandingen av en enkelt-etikett og fluorescens:
      Equation 11
      Hvor: sPure er det rene spekteret av etiketten, sblandet er målt spekteret av prøven forurenset med autofluorescence, s autoFL er målt autofluorescence spektrum, "a" er en skalerbare multiplikatoren for det autofluorescence spekteret (mellom 0 og 1, f.eks. 0,4), og "offset" er en forskyvning (vanligvis 0). Varier "a" begrepet til en nesten nullverdi er oppnådd for den tilsynelatende bidrag av autofluorescence. Ytterligere informasjon finnes i flere publikasjoner28,29,30,31,32.
  3. Unmix av Spectral bildedata. Unmixing trinnet vil generere en overflod bilde for hver fluorescerende etikett, der overflod er mengden av relative fluorescens signal i bildet fra den respektive etiketten. Flere unmixing algoritmer er tilgjengelige for bruk med ImageJ33,34,35. I tillegg er en Spectral unmixing MATLAB kode (brukt i dette eksempelet) tilgjengelig på University of South Alabama Bioimaging Resources nettsted. En mer omfattende oversikt over Spectral unmixing er tilgjengelig36.
    1. Last inn Spectral unmixing-koden i MATLAB.
    2. Rediger bølgelengde. mat og bibliotek. mat filer til å tilsvare de eksperimentelle forhold (for eksempel "bølgelengde" som 360-485 i trinn på fem).
      Merk: de tilsvarende verdiene for disse bølgelengder skal lastes inn i "Library" for hver fluorescerende etikett (og autofluorescence). Endmember_Name bør liste etikettene i samme rekkefølge som kolonneverdiene i "Library". Legg merke til at filen Library. mat skal inneholde både "Library"-og "Endmember_Name"-variabler.
    3. Klikk på Kjøri kategorien editor. Dette vil åpne et nytt vindu som tillater brukeren å velge en katalog. Naviger til mappen som inneholder Spectral-bildene som skal ublandet. En gang valgt, denne ville åpen en ny vindu.
    4. I den resulterende blanks, skriver bildet navn (f. eks HASMC med GCaMP og mito FOV1), antall bølgelengde band (f. eks 26), antall tidspunkter (f. eks 1) og om et bånd måling er ønsket (f. eks n) i sine respektive blanks. Hvis "n" er valgt for bånd, lar du begge slutt medlems feltene stå tomme. Trykk OK for å fortsette, noe som vil åpne et nytt vindu.
    5. Naviagate til mappen som inneholder filen bølgelengde. mat. En gang valgt, falle i staver åpen å fortsette, hvilke ville åpen en ny vindu.
    6. Naviger til mappen som inneholder filen Library. mat. En gang valgt, falle i staver åpen å fortsette, hvilke ville bevare det ublandet profilen inne en ny â € ublandet € brosjyre innenfor folderen inneholder det Spectral profilen.
  4. Inspiser ublandet Spectral bilder for kvalitet.
    1. Åpne hvert ublandet bilde for å visuelt inspisere fordelingen av rene komponenter.
      1. Sammenligne omfanget av feilen image å dem av det ublandet profilen (analog med steg 5,11, denne kan gjort igjennom ImageJ ' mål funksjonen). Hvis størrelsen av feil bildet er lik i størrelsesorden til ublandet overflod bilder, er det sannsynlig at det er signaler i Spectral bildedata som ikke er nøyaktig rede for av Spectral biblioteket og lineær Spectral unmixing prosessen.
      2. Sammenlign feil bildet med de ublandet bildene for å se om det finnes uidentifiserte rest strukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flere viktige skritt fra denne protokollen er nødvendig for å sikre innsamling av data som er både nøyaktig og blottet for bildebehandling og Spectral gjenstander. Hvis du hopper over disse trinnene, kan det føre til at data vises betydelig, men ikke kan verifiseres eller reproduseres med andre bildebehandlings systemer, og dermed effektivt oppheve eventuelle konklusjoner gjort med nevnte data. Chief blant disse viktige trinnene er riktig Spectral output korreksjon (del 3). Korrigeringsfaktoren kompenserer for bølgelengde avhengige variasjoner i Spectral-utgangen på det tunable eksitasjon systemet. Dette oppnås ved å skalere bølgelengder med høy effekt eksitasjon slik at den optiske belysnings kraften er sammenlignbare med bølgelengder med en lav effekt eksitasjon, oppnå en flat Spectral eksitasjon profil. Et eksempel på en upassende korrigerings faktor er en som inneholder svært lave verdier (for eksempel < 0.001) på en eller flere bølgelengder, noe som indikerer at intensiteten verdiene målt på de bølgelengder må være sterkt svekket for å oppnå en flat Spectral respons.

Kalibrering av systemet til en NIST-sporbar standard sikrer at data som samles inn med eksitasjon-skanning Spectral Imaging system kan sammenlignes med andre systemer også kalibrert til NIST-sporbare standarder. Derfor er det viktig å sikre at eventuelle korrigerings faktorer justerer de innsamlede dataene på riktig måte. Nøyaktigheten til en korrigerings faktor kan verifiseres ved bruk av en fluorescens standard, for eksempel NIST-sporbar fluorescein. Figur 1 illustrerer en hensiktsmessig og upassende korreksjonsfaktor, som er avbildet gjennom grafiske og bildedata. I dette tilfellet var den Spectral output på 340 NM tilnærmet ikke-eksisterende i forhold til resten av Spectral Range, noe som resulterer i en nesten null (< 0.001) verdi for praktisk talt hver bølgelengde. Brukt på bildes takken, resulterer dette i nesten nullverdier gjennom mesteparten av bildes takken for de fleste bildepunkter.

Som det fremgår av avsnitt 5, kan det eksitasjon området, utvalgte fluorophores og anskaffelses innstillinger skape potensialet som en eller flere eksitasjon bølgelengde bilde bånd inneholder overmettet piksler. Figur 2 illustrerer et eksempel der eksponeringstiden ble satt for lang for flere av de eksitasjon bølgelengdene, noe som førte til at de påfølgende bildene inneholdt overmettet piksler. Dette er viktig å merke fordi, som figuren viser, både individuelle bilder og falske fargede bilder kan visuelt synes å være innenfor akseptable intensitet områder.

Riktig valg av et bakgrunnsområde for subtraksjon er også viktig for data sammenligning mellom systemer, da det fjerner elementer av kameraets støy eller spredt lys før NIST-sporbar Spectral korreksjon (Figur 3). Det er ofte nyttig for påfølgende bilde prosessering og dataanalyse trinn for å generere en RGB falskt-farget bilde av Spectral bildet stabelen for å visualisere Spectral funksjoner i bildet. Figur 4 viser en RGB-farget bilde generert ved å slå sammen tre valgte bølgelengde bånd (370 NM = blå, 420 NM = grønn, 470 NM = rød).

Spectral unmixing krever kunnskap om Spectral profilen til hver enkelt fluorescens kilde. I tilfelle av eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging, dette gjøres ved å anskaffe Spectral bilde stabler for hver fluoroforen (og autofluorescence). Figur 5 er inkludert som et eksempel for å velge områder fra enkelt etikettkontroller for å generere et Spectral bibliotek. Det bør bemerkes at hver måling har blitt normalisert til sin topp bølgelengde.

Når den utføres på riktig måte, tillater Spectral unmixing-prosessen separasjon av en Spectral bilde stabel i respektive bidrag fra hver fluorescens etikett. Figur 6 viser et eksempel ublandet Spectral bilde sett, med individuelle bilder for hver av følgende signaler: luftveier glatt muskel celle autofluorescence, en GCaMP sonde, og en mitokondrie etikett. Feilen forbundet med Spectral unmixing er også vist og kan undersøkes for å sammenligne intensiteten nivåer av feilen til de av ublandet signaler. Beregning og tolkning av denne feilen har vært diskutert tidligere37. Som vist i figur 6, er det høy feil knyttet til kjernefysiske og perinukleære antinøytrofile regioner av cellene, noe som indikerer at den målte Spectra av disse regionene er ikke godt utgjorde av Spectra i Spectral biblioteket. En potensiell kilde til feil kan være at single-Label kontrollene for GCaMP og mitokondrie etiketten ble utarbeidet ved hjelp av luftveiene glatte muskelceller, som har en høy innfødt autofluorescence. Derfor kan GCaMP og mitokondrie etiketten ikke representere ren endemannen Spectra. I tillegg kan autofluorescence signalet påvirke biblioteket Spectra for de to andre etikettene på en måte som ikke var riktig sto for, noe som resulterer i en mindre nøyaktig montering enn om etikettene hadde blitt anskaffet ved hjelp av en cellelinje med liten eller ingen autofluorescence. I tillegg er eksempler inkludert for når for få eller for mange komponenter i et Spectral bibliotek er tilgjengelig, noe som resulterer i underfitting og overfitting av Spectral bildedata, henholdsvis (figur 6, figur 7, Figur 8, Figur 9og tabell 1).

Som nevnt i avsnitt 6,2 og spesielt trinn 6.2.4, "ren" Spectra samlet fra merket celler som også autofluorescent vil trolig forurense den Spectral profil for ren komponent. Som sådan, forsiktighet bør utvises for å skille de rene Spectra av etikettene av interesse fra sine autofluorescent verter. Figur 10 viser forskjellen på unmixing med "ren" Spectra forurenset med autofluorescence (blandet) versus ren Spectra beregnet av metoden beskrevet i trinn 6.2.4. Forskjellen forekommer hovedsakelig i unmixing av autofluorescence signalet. Uten riktig signal separasjon (f. eks subtraksjon av autofluorescence forurensning fra GCaMP spektrum), den autofluorescence og GCaMP biblioteket komponenter konkurrerer om de samme Spectral data i hver piksel, noe som resulterer i karakteristiske hull eller mørke flekker i det autofluorescence bildet.

Figure 1
Figur 1 : Eksempel søknader om upassende og hensiktsmessige korrigerings faktorer som brukes til å korrigere bilder til en flat Spectral respons. (A) plottet upassende og passende korreksjon faktorer. (B) et RGB-bilde generert med bruk av den upassende korrigeringsfaktoren i (A). (C) et RGB-bilde generert med samme synsfelt som (B), bortsett fra ved bruk av en passende korrigerings faktor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Eksempler som illustrerer viktigheten av riktige anskaffelses innstillinger. (A, B) RGB-bilder generert av en passende anskaffelsestid (A, 100 MS) kontra det samme synsfeltet med en mette anskaffelsestid (B, 500 MS). Det bør bemerkes at RGB-bilder vises identiske når false-farget. (C) interesseområdet som velges for å kartlegge intensitet verdier fra de mest intense regionene i (A) og (B). (D) plottet intensitet verdier per bølgelengde fra 100 MS eksponeringstid bilde (A, svart linje) og 500 MS eksponeringstid (B, rød linje). Det bør bemerkes at pixel intensitet for 500 MS eksponeringstid har nådd grensen for det dynamiske området av detektoren (65 535 AU) på 370 NM og ikke reduseres til 525 NM, noe som resulterer i Spectral gjenstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Valg av en region av interesse for bakgrunns subtraksjon. (A) en rå, bølgelengde-oppsummert intensitet bilde. (B) områder av bildet som er valgt for å bestemme bakgrunns spekteret for piksel for bakgrunns subtraksjon vist i rødt. (C) bakgrunnen-trukket, korrigert, og oppsummert intensitet bilde. (D) en RGB farging av det korrigerte bildet (C). Prosessen med å generere en RGB-bilde med USANN farge vises i Figur 4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Prosessen med å generere en RGB-bilde med USANN farge. (A-C) Tre bølgelengde bånd plassert jevnt i hele Spectral oppkjøpet området ble valgt for false-coloring (blå = 370 NM, grønn = 420 NM, rød = 470 NM). (D) den oppsummerte intensiteten bilde generert ved å legge til pixel intensitet fra alle bølgelengde band i bildet kuben. (E-G) Bildene i paneler (A-C) med sine respektive falske farge blikk opp tabeller brukt. (H) det resulterende sammenslåtte bildet av (E-G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Område utvalg av enkelt etikettkontroller for generering av Spectral bibliotek. (A) RGB falskt-farget bilde av luftveiene glatt muskel (ASM) celle autofluorescence. (B) vist i rødt, regioner av (A) valgt for den autofluorescence komponenten av Spectral biblioteket. (C) RGB falske fargede ASM celler merket med mitokondrie etiketten. (D) vist i rødt, regioner (C) valgt for den mitochondiral etiketten komponenten av Spectral biblioteket. På grunn av autofluorescence av ASM-cellene lokalisert nær kjernen, ble små områder valgt langt fra kjernene for å identifisere mitokondrie etikett spektrum. (E) RGB falske fargede ASM-celler transfekterte med GCaMP-proben. (F) områder av (E) som er valgt for GCaMP-komponenten i Spectral biblioteket, vises i rødt. I likhet med (D), områder borte fra kjernene ble valgt. (G) Spectral biblioteket innhentet fra a-F, normalisert til en verdi av enhet ved bølgelengde med det sterkeste signalet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 6
Figur 6 : Eksempel på ublandet bildedata der det kan vises ublandet relative signal bidrag fra hver biblioteks komponent. (A-D) Den ublandet overflod av GCaMP, mitokondrie etikett, autofluorescence, og feil sikt. (E-G) Bildene i paneler (A-C) med sine respektive falske farge blikk opp tabeller brukt. (H) det sammensatte, sammenslåtte bildet med falske farger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 7
Figur 7 : Ublandet relative signal bidrag, inkludert gjennomsnittlig intensitet og prosent av total fluorescens, fra et riktig definert Spectral bibliotek. (A-D) Den ublandet overflod for autofluorescence, GCaMP, mitokondrie etikett, og feil sikt. Det bør bemerkes at feil begrepet består av mindre enn 10% av det totale fluorescens signalet målt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 8
Figur 8 : Ublandet relative signal bidrag, inkludert gjennomsnittlig intensitet og prosent av total fluorescens, fra en Spectral bibliotek mangler en komponent kjent for å være inkludert i utvalget (dvs. en underdefined Spectral bibliotek). (A-C) Den ublandet overflod av autofluorescence, mitokondrie etikett, og feil sikt. Merk at unnlatelse av GCaMP fra Spectral biblioteket har økt den beregnede relative signal bidrag fra biblioteket komponenter samt feil periode, sammenlignet med figur 7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9 : Ublandet relative signal bidrag, inkludert gjennomsnittlig intensitet og prosent av total fluorescens, fra en Spectral bibliotek som inneholder en ekstra komponent kjent for å mangle i utvalget (dvs. en overdefined Spectral bibliotek). (A-E) Den ublandet overflod av autofluorescence, GCaMP, mitokondrie etikett, kjernefysisk etikett, og feil sikt. Legg merke til at tillegg av en kjernefysisk etikett til Spectral biblioteket har redusert den beregnede relative signal bidrag fra autofluorescence, sammenlignet med figur 7. Videre er feil begrepet redusert under prosent feilen angitt av riktig definert Spectral biblioteket. Denne er fordi en overdefined bibliotek ville nært alltid tillate en bedre anfall å det eksperimentelle data enn en riktig definerte bibliotek, selv om overflod signaler for komponentene kjent for å være borte fra prøven er (inne realitet) artefakter av overdefining Spectral bibliotek. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10 : Sammenligning av ublandet bilder når du bruker et bibliotek før og etter riktig autofluorescence forurensning signal subtraksjon. (A) den opprinnelige "ren" Spectra avledet fra én etikettkontroller i svært autofluorescent luftveiene glatte muskelceller før skalert subtraksjon detaljert i trinn 6.2.4. (B-D) Ublandet autofluorescence, GCaMP og kjernefysiske etikett bilder generert ved hjelp av (A) som bibliotek. (E) korrigert rene Spectra avledet fra én etikettkontroller i svært autofluorescent luftveier glatte muskelceller etter skalert subtraksjon. (F-H) Ublandet autofluorescence, GCaMP og kjernefysiske etikett bilder generert ved hjelp av (E) som biblioteket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Gjennomsnittlig intensitet (AU)
Riktig tilpasning Underfitting Overfitting
Autofluorescence 187 299 164
GCaMP 139 - 140
Mitokondrie etikett 246 318 248
Kjernefysisk Label - - 26
RMS-feil 53 126 43
Standard avvik (AU)
Riktig tilpasning Underfitting Overfitting
Autofluorescence 362 442 315
GCaMP 168 168
Mitokondrie etikett 344 388 345
Kjernefysisk Label - - 93
RMS-feil 62 126 44
Maksimal intensitet (AU)
Riktig tilpasning Underfitting Overfitting
Autofluorescence 6738 7409 6738
GCaMP 1336 - 1336
Mitokondrie etikett 5098 5194 5098
Kjernefysisk Label - - 1257
RMS-feil 1050 1286 910
% av total fluorescens
Riktig tilpasning Underfitting Overfitting
Autofluorescence 30 40 prosent 26
GCaMP 22 43 prosent 23
Mitokondrie etikett 39 prosent - 40 prosent
Kjernefysisk Label - - 4
RMS-feil 8 17 7

Tabell 1: En tabell som sammenligner gjennomsnittet, standardavviket, og maksimal ublandet overflod intensitet verdier per ublandet overflod bilde fra en skikkelig Spectral bibliotek og fra underdefined eller overdefined Spectral biblioteker, samt prosent av totale fluorescens per ublandet overflod bilde (minimum ublandet overflod intensitet for hvert bilde var alltid null). Data Hentet fra figur 7, Figur 8og figur 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den optimale bruken av et hyperspektral bildeoppsett med eksitasjon skanning begynner med byggingen av lys banen. Spesielt valg av lyskilde, filtre (tunable og dichroic), filter veksling metoden, og kameraet bestemme tilgjengelig Spectral Range, mulig skannehastighet, detektor følsomhet, og romlig prøvetaking. Mercury Arc lamper tilbyr mange eksitasjon bølgelengde topper, men gir ikke en flat Spectral output og vil kreve betydelig signal reduksjon ved utgangs toppene for å korrigere Spectral bildedata tilbake til en NIST-sporbar respons38. Alternative lyskilder, for eksempel XE Arc lamper og hvitt lys supercontinuum lasere, kan gi en mer ensartet Spectral output som er bedre egnet for eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging38,39,40. Valg av lyskilde, tunable filtre og dichroic filtre fastsetter det tilgjengelige Spectral-området. Dette området bør velges med nøye overveielse for ønsket Spectral informasjon om den eksperimentelle prøven.

I tillegg bør det tas hensyn til koblings mekanismen som brukes for tunable filtre, samt ulike kamera faktorer som Quantum effektivitet, pikselstørrelse, og tilgjengelige bildefrekvenser, da disse faktorene vil påvirke potensielle samplingsfrekvenser41 ,42,43. Imidlertid, alle annet faktorene tilværelse bestandig, utnyttelse av det eksitasjon-skanning adgang burde skaffe forhøyet følsomheten og evnen for hurtigere tenkelig, sammenlignet med høyst utstråling-skanning Spectral Imaging tilnærmelser21.

Som nevnt i innledningen, hyperspektral Imaging her refererer til sammenhengende og Spectrally overlappende natur ervervet data. Som sådan, funksjonene i systemet må være i stand til å samle inn data ved hjelp av avstand av eksitasjon senter bølgelengder mindre enn halvparten av avstanden til FWHM av filtrene. Som rapportert tidligere, en nøye utvalgt utvalg av tynn-film tunable filtre tillater datainnhenting med sentrum bølgelengder linjeavstand 5 NM hverandre, en avstand tilstrekkelig til å oversample den eksitasjon spekteret gitt filtre med FWHM på mellom 14-20 NM. En slik avstand gir liten redundans i Spectral datainnsamling med sannsynlig øker nøyaktigheten av unmixing prosessen. Vurdering av både Spectral områder og nødvendig minimum antall bølgelengde kanaler for nøyaktig unmixing har vært diskutert tidligere44,45,46. For dette formål, gitt båndbredden til disse filtrene, bør det eksitasjon området velges for å ende med en bølgelengde som er noe lavere (5-10 NM lavere) enn cut-off bølgelengde av dichroic beamsplitter. Dette vil sikre at hele båndbredden til den eksitasjon belysningen er under den dichroic beamsplitter bølgelengde (f.eks. 360-485 NM for 495 dichroic filter) for å unngå eksitasjon kryss prat.

Programvare for å uavhengig kontrollere hver komponent av maskinvaren for å oppnå høyhastighets Spectral Imaging skanninger er nødvendig. Programvaren skal kunne operere lukkeren, velger eksitasjon bølgelengder, og skaffe bilder ved tilstrekkelig høy hastighet for å møte eksperimentelle forhold (eksakt sample rate kravene vil variere eksperimentet, men et eksempel mål kan være å tilegne seg fire komplett Spectral bilde stabler per minutt). Mer kompliserte eksperimenter kan gjøre bruk av flere dichroic speil, målsettinger, eller XYZ steder. Det finnes en rekke programvarepakker tilgjengelig for datainnhenting47,48. Micro-Manager er en gratis åpen kildekode-programvare for mikroskop automatisering som tilbyr en rekke tilpasningsmuligheter. I tillegg inneholder Micro-Manager et skript panel for ytterligere tilpasning som ikke er tilgjengelig i det primære brukergrensesnittet. For eksempel er det mulig å bruke et egendefinert skript for å redusere 250 ms forsinkelse av tunable filter Switcher til 10 MS på alle eksitasjon bølgelengder unntatt bølgelengde overganger der filteret hjulet roterer til et nytt tunable filter, redusere effektiv Imaging tid ved 240 MS per bølgelengde for de fleste bølgelengder. Denne tilpasningen har tillatt oppkjøp av opptil 30 bølgelengder på under 4 s. Til slutt kan Micro-Manager betjenes sammen med andre miljøer, for eksempel MATLAB, for å tilpasse enhetens kontroll for mikroskop ytterligere.

Bestemme riktig Spectral eksitasjon rekkevidde, oppkjøps tid, og innledende bølgelengde for sample visning og påfølgende data oppkjøpet er svært viktig. Feil bruk av enkeltkomponenter i systemet kan imidlertid kreve ytterligere feilsøking. Hver komponent i den optiske banen bidrar til bildedataene som innhentes. Derfor er det viktig å verifisere Spectral respons og optisk overføring av optiske komponenter innenfor lys banen, spesielt hvis du prøver å optimalisere den generelle system respons. Lyskilder har ofte variabel intensitet innstillinger og kan ha reduksjon i kraft over levetiden til pære40. Hvis et utvalg er nedtonet, kan årsaken bli redusert effekt fra lyskilden. Den autoshutter funksjon i Micro-Manager, i vår erfaring, ikke operere 100% av tiden. Mangel på signal kan indikere en lukket lukker. Den innledende eksitasjon bølgelengden lagret i Micro-Manager ' s konfigurasjonsfilen kan standard til en bølgelengde med liten eller ingen Spectral utgang, for eksempel 340 NM eksempel vist i figur 1.

I tillegg er det ikke uvanlig å feilaktig velge en eksitasjon bølgelengde som er over avkuttet bølgelengde av Long-pass dichroic beamsplitter, noe som resulterer i ytterligere kryss-Talk og/eller eksitasjon lys som shunted direkte til kameraet som kan potensielt skade kamerasensoren. På samme måte kan justering av lys banen for overføring bildebehandling føre til tap av signal til kameraet, avhengig av konfigurasjonen av mikroskopet. Videre, som indikert i figur 2, kan valg av innledende eksitasjon bølgelengde og eksponeringstid for prøve visning vises hensiktsmessig, men faktisk resultere i overmettet piksler ved andre eksitasjon bølgelengder. Dette faktum vil ikke være synlig med mindre piksel metning er sjekket for hvert bilde, så det er ofte klokt å utføre en test bilde stabel på et område av prøven som ser ut til å inneholde de mest intense fluorescens.

Det er også verdt å merke seg at variable intensitet kan være til stede i bilder valgt for bakgrunn regioner. Det bør utvises forsiktighet for å sikre at disse regionene ikke faktisk inneholder relevante bildedata, ettersom etterfølgende data korrigerings trinn vil trekke dette signalet fra bildedataene som er ervervet i andre områder i utvalget. Noen ganger er det nødvendig å bruke overførings innstillingene og/eller drastisk øke eksponeringstiden for å kontrollere at regionen som er valgt for å måle prøven bakgrunn ikke inneholder faktisk ingen prøve. På samme måte kan ublandet bilder vises med mørke flekker eller hull i det autofluorescence bildet. Dette kan skyldes en uriktig bibliotek forårsaket av autofluorescence "forurensning" av "ren" Spectral signaler fra enkelt-merket celler. Dette er fordi noen "ren" Spectral signal samlet inn fra en prøve som inneholder autofluorescence vil alltid inneholde noen av autofluorescence Spectra selv, selv om i spormengder. Det bør utvises forsiktighet for å trekke ut autofluorescence signaler fra kontrollene med én etikett for å sikre et riktig Spectral bibliotek, som beskrevet ved flere anledninger av Mansfield et al.28,29,30, 31,32

Skjønt ikke bevist i denne gjenstand, det eksitasjon-skanning Spectral tenkelig system kanne likeledes bli brukt for tid-lapse tenkelig og tenkelig over mangfoldig XY plasseringene (eller en stor åker av utsikt på grunn av image søm) inne mangfoldig fokal plan. Hvis disse alternativene er ønsket for et enkelt eksperiment, bør man tenke nøye gjennom viktigheten av anskaffelses orden og potensielle virkninger av photobleaching. Det er også verdt å merke seg at hvis den faktiske tiden som tas overstiger den estimerte tiden (for eksempel en bildestakk tar 11 s for å erverve heller enn estimert 10 s), vil Micro-Manager fortsette å erverve det valgte antall tidspunkter og/eller posisjoner. Denne feil beregning kan sammensatte med flere tidspunkter og endre beregnet Temporal prøvetaking, potensielt forvrenger noen konklusjoner gjort fra dataene.

Dette eksempelet demonstrerer evnen til å skille tre kilder til fluorescens innenfor en 145 NM eksitasjon skanning rekkevidde. Tidligere eksperimenter ved hjelp av dette systemet har vært i stand til å skille opptil fem kilder til fluorescens innenfor samme område. Tiden som kreves for dette bildet oppkjøpet er mindre enn 1 min, noe som er betydelig raskere enn de fleste utslipp-skanning Spectral Imaging systemer. Forbedringer i lys banen, for eksempel høyere hastighet eksitasjon bølgelengde tuning, kan videre fremme denne Imaging teknologi til hastigheter som er tilstrekkelig for video-rate Spectral Imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DRS. Leavesley og Rich avslører økonomisk interesse i et oppstartsselskap, SpectraCyte LLC, grunnlagt for å kommersialisere Spectral Imaging-teknologi.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne erkjenne støtte fra NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, og Abraham Mitchell Cancer Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

Tags

Engineering hyperspektral spektroskopi eksitasjon fluorescens mikroskopi autofluorescence Imaging tunable filter tynn film
Eksitasjon-skanning hyperspektral tenkelig mikroskopi å effektivt diskriminere fluorescens signaler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deal, J., Britain, A., Rich, T.,… More

Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter