הדמיה ספקטרלית הפך פתרון אמין לזיהוי והפרדה של אותות מרובים של זריחה במדגם אחד והוא יכול בקלות להבחין אותות של עניין מרקע או פלואורסצנטית אוטומטי. עירור-סריקת הדמיה hyperקטרראלית משפרת בטכניקה זו על ידי הפחתת הזמן הדרוש לרכישת תמונה תוך הגברת היחס האות לרעש.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
עירור-סריקת מיקרוסקופ היפרספקטקטרלי ביעילות אותות זריחה להפלות
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכניקות אחדות מסתמכות על גילוי אותות של קרינה פלואורסצנטית כדי לזהות או לחקור תופעות או להבהיר פונקציות. הפרדת האותות הללו בעלי קרינה פלואורסצנטית הוכחו מסורבל עד הופעתו של הדמיה היפרספקטראלית, שבו מקורות פלואורסצנטית ניתן להפריד זה מזה, כמו גם מאותות הרקע ומלא התאמה אוטומטית (נתון הידע של שלהם ספקטרלי חתימות). עם זאת, מסורתי, סריקת פליטה הדמיה hyperקטרלית סובלת מזמני רכישה איטית ויחס אות לרעש נמוך בשל הסינון הדרוש של שני עירור ואור פליטה. זה כבר הוכח כי עירור הדמיה היפרספקטקטרלית מפחית את זמן הרכישה הדרוש תוך הגברת היחס אות לרעש של נתונים שנרכשו. באמצעות ציוד מסחרי זמין, פרוטוקול זה מתאר כיצד להרכיב, לכייל ולהשתמש במערכת מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרראלית להפרדת אותות ממספר מקורות פלואורסצנטית במדגם אחד. בעוד שהיא ישימה מאוד לדימות מיקרוסקופיים של תאים ורקמות, טכניקה זו עשויה גם להיות שימושית עבור כל סוג של ניסוי ניצול הקרינה שבה ניתן לשנות את אורכי גל עירור, כולל אך לא מוגבל: הדמיה כימית, יישומים סביבתיים, טיפול בעיניים, מדעי המזון, מדע הזיהוי הפלילי, מדע הרפואה ומינרלוגיה.
מבוא
הדמיה ספקטרלית ניתן לבצע במגוון דרכים והוא מכונה על ידי כמה מונחים1,2,3,4. באופן כללי, הדמיה ספקטרלית מתייחסת לנתונים הנרכשים לפחות שני ממדים מרחביים ומימד ספקטרלי אחד. הדמיה רב ספקטראלית והיפרספקטקטרלית מאופיינת לרוב במספר הלהקות של אורך הגל או אם הלהקות הספקטרליות הן רציפות1. עבור יישום זה, נתונים היפרספקטקטרליים מוגדר נתונים ספקטרליים שנרכשו עם מסגרות גל רציפים שהושגו על ידי מרווח של אורכי גל מרכזי לא פחות ממחצית רוחב מלא על חצי מקסימום (FWHM) של כל מסנן בנדנה המשמש עירור (כלומר, 5 ננומטר מרווח אורך גל מרכזי עבור מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הגדרת התקן
- מקור אור: לבחור מקור רחב הלהקה אור ספקטרלי עם התפוקה הגבוהה החשמל ואת המקור גבוה (300 W Xe מנורת arc שימש למחקרים אלה).
- תריס (אופציונלי): להוסיף תריס על הנתיב האופטי כדי להפחית את הלבנת התמונה עבור הדמיה זמן.
- מערכת מסנן tunable: לשלב הרכבה כוונון מכני ו-סרט דק מסנן tunable (TFTF) הגדר כדי לאפשר את טווח עירור הרצוי אורך הגל (למשל, 360-485 nm).
- מיקרוסקופ: השימוש הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטית כולל דיקרואיק ממונע מסנן הצריח ובקר.
- קוביית מסנן פלואורסצנטית: להרכיב קוביית לעבור ארוך לעבור מסנן זריחה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבחור מראה דיקרואיק ומסנן פליטה ארוך לעבור באותו הגל כדי להשיג הפרדה אופטימלית של עירור מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מספר צעדים חשובים מפרוטוקול זה נחוצים כדי להבטיח את אוסף הנתונים שהוא גם מדויק ונטול הדמיה וחפצים ספקטרליות. דילוג על שלבים אלה עלול לגרום לנתונים הנראים משמעותיים אך לא ניתן לאמת או לשכפל עם כל מערכת הדמיה ספקטרלית אחרת, ובכך לבטל את כל המסקנות שנעשו עם הנתונים אמר. הראשי בין הצעדים החשובים האלה הוא תיקון הפלט ספקטרלי הנכון (סעיף 3). גורם התיקון מפצה על וריאציות תלויות אורך הגל בפלט הספקטרלי של מערכת העירור. זה מושגת על ידי שינוי אורכי גל עם עירור כוח גבוה כגון כוח התאורה האופטי הוא המקב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השימוש האופטימלי של הגדרת הדמיה היפרספקטקטרלית בסריקת עירור מתחיל בבניית הנתיב האור. בפרט, בחירה של מקור אור, מסננים (tunable ו דיקרואיק), החלפת מסנן שיטה, ומצלמה לקבוע את טווח ספקטרלי זמין, מהירות סריקה אפשרית, הרגישות גלאי, ודגימה מרחבית. מנורות מרקורי קשת מציעים רבים באורך גל הפסגות אבל לא מספקים פלט ספקטרלי שטוח ידרוש הפחתת אות משמעותית על פסגות הפלט כדי לתקן את נתוני התמונה הספקטרלית בחזרה לתגובה רופא ממעקב38. מקורות אור חלופיים, כגון מנורות Xe ארק ולייזרים אור הרצף הלבן, עשוי לספק פלט ספקטרל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ד ר Leavesley ו ריץ לחשוף את האינטרס הפיננסי בחברת סטארט-up, SpectraCyte ייט LLC, הוקמה כדי לסחור טכנולוגיה הדמיה ספקטרלית.
תודות
המחברים רוצים להכיר בתמיכה של NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, וקרן אברהם מיטשל לחקר הסרטן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאי שריר חלק בדרכי הנשימה | מחלף מחקר מחלות לאומי (NDRI) | מבודד מרקמות ריאה אנושיות המתקבלות מ- NDRI | תאים אוטופלואורסצנטיים מאוד, רגישים לסידן |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | תריס הניתן לשליטה מרחוק כדי למזער הלבנת אור |
| שלב אוטומטי | H177P1T4 מדעי קודם | שלב הניתן לשליטה מרחוק לשדה ראייה מרובה אוטומטי או איסוף תמונות תפור. | |
| בקר במה אוטומטי (XY) | קדם מדעי | Proscan III (H31XYZE-US) | לממשק שלב אוטומטי עם מחשב וג'ויסטיק |
| מאגר | תוצרת הבית | 145 מ"מ NaCl, 4 מ"מ KCl, 20 מ"מ HEPES, 10 מ"מ D-גלוקוז, 1 מ"מ MgCl2, ו-1 מ"מ CaCl2, ב-pH 7.3 | |
| תא | ThermoFisher Scientific | Attofluor, A7816 | מחזיק כיסוי המורכב מפלדת אל חלד כירורגית וטבעת O מגומי לאיטום במדיה ומניעת זיהום דגימה ו/או אובייקטיבי |
| מסנני עירור | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | טווח אורכי גל מרכזי (340-378 ננומטר), רוחב פס (מינימום 16 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | טווח אורכי גל מרכזי (360-400 ננומטר), רוחב פס (מינימום 16 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | טווח אורכי גל מרכזי (400-448.8 ננומטר), רוחב פס (מינימום 15 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | טווח אורכי גל מרכזי (448.8-501.5 ננומטר), רוחב פס (מינימום 15 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | טווח אורכי גל מרכזי (501.5-561 ננומטר), רוחב פס (מינימום 14 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.83) | |
| קוביית מסנן פלואורסצנטי מפצל קרן דיכרואי | Semrock Inc. | FF495-Di03 | מפריד בין אור עירור ופליטה ב-495 ננומטר (>98% השתקפות בין 350-488 ננומטר, >93% שידור בין 502-950 ננומטר), אינדקס אפקטיבי של מסנן (1.78) |
| קוביית מסנן פלואורסצנטי מסנן לונגפס מסנן | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | מאפשר מעבר של אור ארוך מ-496 ננומטר (>93% שידור ממוצע בין 503.2-1100 ננומטר), מקדם שבירה (1.86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; פלסמיד #22692 | מחוון סידן מקודד גנטית מבוסס GCaMP2 באורך גל יחיד |
| שילוב | אופטיקה של אוקיינוס | FOIS-1 | משמש למדידה מדויקת של תאורה בזווית רחבה |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מיקרוסקופים הפוכים | של Nikon Instruments | TE2000 | מאפשרים עירור ישיר של דגימה ללא צורך לחדור לשכבות של מדיה ו/או רקמה. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | תוויות מיטוכונדריה |
| מנורת כיול ניתנת למעקב NIST | אופטיקה אוקיינוס | LS-1-CAL-INT | מנורה עם ספקטרום ידוע לשימוש כתקן |
| NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | לאימות תגובה ספקטרלית מתאימה של המערכת |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | תוויות גרעיני תאים |
| אובייקטיבי (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | שימושי לשדות ראייה גדולים |
| אובייקטיבי (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | משמש לרוב עבור דגימות רקמות |
| אובייקטיבי (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | משמש לרוב לדגימות תאים |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | לרכישת תמונות דיגיטליות ברגישות גבוהה |
| ספקטרומטר | אופטיקה אוקיינוס | QE65000 | משמש למדידת תפוקה ספקטרלית של מערכת ספקטרלית סריקת עירור |
| מחליף מסנן מתכוונן | מכשיר סאטר | Lambda VF-5 | יחידה ממונעת לכוונון אוטומטי של מסנן עירור / החלפת |
| מנורת קשת קסנון | טכנולוגיות Sunoptic | Titan 300HP מקור | אור מקור אור עם תפוקה ספקטרלית אחידה יחסית |
מקורות
- Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
- Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements an....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
