Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

עירור-סריקת מיקרוסקופ היפרספקטקטרלי ביעילות אותות זריחה להפלות

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

הדמיה ספקטרלית הפך פתרון אמין לזיהוי והפרדה של אותות מרובים של זריחה במדגם אחד והוא יכול בקלות להבחין אותות של עניין מרקע או פלואורסצנטית אוטומטי. עירור-סריקת הדמיה hyperקטרראלית משפרת בטכניקה זו על ידי הפחתת הזמן הדרוש לרכישת תמונה תוך הגברת היחס האות לרעש.

Abstract

טכניקות אחדות מסתמכות על גילוי אותות של קרינה פלואורסצנטית כדי לזהות או לחקור תופעות או להבהיר פונקציות. הפרדת האותות הללו בעלי קרינה פלואורסצנטית הוכחו מסורבל עד הופעתו של הדמיה היפרספקטראלית, שבו מקורות פלואורסצנטית ניתן להפריד זה מזה, כמו גם מאותות הרקע ומלא התאמה אוטומטית (נתון הידע של שלהם ספקטרלי חתימות). עם זאת, מסורתי, סריקת פליטה הדמיה hyperקטרלית סובלת מזמני רכישה איטית ויחס אות לרעש נמוך בשל הסינון הדרוש של שני עירור ואור פליטה. זה כבר הוכח כי עירור הדמיה היפרספקטקטרלית מפחית את זמן הרכישה הדרוש תוך הגברת היחס אות לרעש של נתונים שנרכשו. באמצעות ציוד מסחרי זמין, פרוטוקול זה מתאר כיצד להרכיב, לכייל ולהשתמש במערכת מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרראלית להפרדת אותות ממספר מקורות פלואורסצנטית במדגם אחד. בעוד שהיא ישימה מאוד לדימות מיקרוסקופיים של תאים ורקמות, טכניקה זו עשויה גם להיות שימושית עבור כל סוג של ניסוי ניצול הקרינה שבה ניתן לשנות את אורכי גל עירור, כולל אך לא מוגבל: הדמיה כימית, יישומים סביבתיים, טיפול בעיניים, מדעי המזון, מדע הזיהוי הפלילי, מדע הרפואה ומינרלוגיה.

Introduction

הדמיה ספקטרלית ניתן לבצע במגוון דרכים והוא מכונה על ידי כמה מונחים1,2,3,4. באופן כללי, הדמיה ספקטרלית מתייחסת לנתונים הנרכשים לפחות שני ממדים מרחביים ומימד ספקטרלי אחד. הדמיה רב ספקטראלית והיפרספקטקטרלית מאופיינת לרוב במספר הלהקות של אורך הגל או אם הלהקות הספקטרליות הן רציפות1. עבור יישום זה, נתונים היפרספקטקטרליים מוגדר נתונים ספקטרליים שנרכשו עם מסגרות גל רציפים שהושגו על ידי מרווח של אורכי גל מרכזי לא פחות ממחצית רוחב מלא על חצי מקסימום (FWHM) של כל מסנן בנדנה המשמש עירור (כלומר, 5 ננומטר מרווח אורך גל מרכזי עבור מסנני bandpass עם 14-20 ננומטר רוחב פס). הטבע הרציף של להקות הנתונים מאפשר דגימת יתר של ערכת המידע, ומבטיח שקריטריוני נייקוויסט יהיו מרוצים בעת דגימת התחום הספקטרלי.

הדמיה היפרספקטראלית פותחה על ידי נאס א בשנות ה-70 וה-1980 בשילוב עם לווין הראשון של landsat5,6. איסוף נתונים מכמה להקות ספקטרליות רציפות מותר לדור של ספקטרום זוהר של כל פיקסל. זיהוי והגדרה של ספקטרום הזוהר של רכיבים בודדים איפשר לא רק לזהות את חומרי השטח על ידי הספקטרום האופייני שלהם, אבל זה גם מותר להסרת אותות בהתערבות, כגון וריאציות באות בשל תנאים אטמוספריים. הרעיון של זיהוי חומרים באמצעות ספקטרום האופייני שלהם הוחל על מערכות ביולוגיות ב 1996 כאשר שרדינגר et al. בשימוש שילובים של חמישה fluorophores שונים ואת הספקטרום הידוע שלהם כדי להבדיל כרומוזומים המסומנים בתהליך כינה מקלדת ספקטרלית7. טכניקה זו פירט על ידי Tsurui ואח 2000 ' עבור הדמיה פלואורסצנטית של דגימות רקמה, באמצעות שבעה צבעי פלורסנט והתפרקות ערך יחיד כדי להשיג הפרדה ספקטרלית של כל פיקסל לתוך צירופים ליניאריים של ספקטרום בהפניה . ספריה8 בדומה עמיתיהם חישה מרחוק שלהם, את התרומה של כל fluorophore ידוע ניתן לחשב מן התמונה היפרספקטראלית, נתון מידע של הספקטרום של כל fluorophore.

הדמיה היפרקטרלית בשימוש גם בתחומי החקלאות9, אסטרונומיה10, ביודינין11, הדמיה כימית12, יישומים סביבתיים13, טיפול עיניים14, מזון מדע15, המדע המשפטי16,17, מדעי הרפואה18, מינרלוגיה19, ומעקבים20. מגבלה מרכזית של הנוכחי מיקרוסקופ היפרספקטקטרליות מערכות הדמיה היא כי טכנולוגיית ההדמיה הסטנדרטית היפרקטרלית מבודד אותות זריחה להקות צר ידי 1) סינון ראשוני של אור עירור כדי לשלוט עירור המדגם, אז 2) מסנן את האור הנפלט כדי להפריד את פליטת הזריחה ללהקות צרות שיכולות להיות מופרדות מאוחר יותר21מתמטית. סינון הן התאורה העירור והזריחה הנפלטת מפחית את כמות האות הזמינה, המורידה את היחס בין האות לרעש ומחייבת זמני רכישה ארוכים. האות הנמוך וזמני הרכישה הארוכים מגבילים את הישימות של הדמיה היפרספקטראלית ככלי אבחון.

מודאליות הדמיה פותחה שעושה שימוש בהדמיה היפרקטרלית אבל מגביר את האות הזמין, ובכך לצמצם את זמן הרכישה הדרוש21,22. זה חדש מודאליות, שנקרא עירור-סריקה היפרספקטקטרלית, רוכשת נתונים התמונה ספקטרלית על ידי שינוי אורך הגל ואיסוף מגוון רחב של אור נפלט. זה כבר הוכח כי טכניקה זו מניבה הזמנות של עליות גודל ביחס אות לרעש בהשוואה לטכניקות סריקה פליטה21,22. הגידול ביחס אות לרעש הוא במידה רבה בשל המעבר ברוחב (~ 600 nm) של אור פליטה זוהה, בעוד הספציפיות מסופק על ידי סינון רק אור עירור במקום פליטת הזריחה. זה מאפשר את כל האור הנפלט (עבור כל גל עירור) כדי להגיע לגלאי21. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להפלות את הקרינה האוטומטית מתוויות אקסוגני. יתר על כן, את היכולת להפחית את זמן הרכישה בשל האות מוגבר לגילוי מפחית את הסכנה של הלבנת, כמו גם מאפשר סריקות ספקטרליות בקצב הרכישה מקובל עבור דימות וידאו ספקטרלי.

המטרה של פרוטוקול זה היא לשמש כמדריך לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרלית סריקה. בנוסף, כלולים תיאורים המסייעים להבנת הנתיב האור והחומרה. תואר גם הוא יישום של תוכנה מקור פתוח עבור מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרלית סריקה. לבסוף, התיאורים מסופקים לאופן הכיול של המערכת לתקן הניתן למעקב נשים, להתאים הגדרות תוכנה וחומרה לקבלת תוצאות מדויקות ולבטל את הערבול של האות המזוהה לתרומות מרכיבים בודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הגדרת התקן

  1. מקור אור: לבחור מקור רחב הלהקה אור ספקטרלי עם התפוקה הגבוהה החשמל ואת המקור גבוה (300 W Xe מנורת arc שימש למחקרים אלה).
  2. תריס (אופציונלי): להוסיף תריס על הנתיב האופטי כדי להפחית את הלבנת התמונה עבור הדמיה זמן.
  3. מערכת מסנן tunable: לשלב הרכבה כוונון מכני ו-סרט דק מסנן tunable (TFTF) הגדר כדי לאפשר את טווח עירור הרצוי אורך הגל (למשל, 360-485 nm).
  4. מיקרוסקופ: השימוש הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטית כולל דיקרואיק ממונע מסנן הצריח ובקר.
    1. קוביית מסנן פלואורסצנטית: להרכיב קוביית לעבור ארוך לעבור מסנן זריחה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבחור מראה דיקרואיק ומסנן פליטה ארוך לעבור באותו הגל כדי להשיג הפרדה אופטימלית של עירור מאור פליטה (למשל, 495 nm).
    2. המטרה: להשתמש במטרה האפורומטית המתאים כדי להבטיח מיקוד אחיד על טווח אורך הגל המשמש לניסוי (מטרת המים 60x שימש למחקר זה).
    3. השלב האוטומטי (אופציונלי): השתמש בשלב אוטומטי לדגימה מהירה של שדות מרובים של תצוגה ו/או שדות גדולים מאוד באמצעות תפירת תמונות. כיילו את הבמה עם המטרה והמצלמה.
  5. מצלמה: בחר מצלמה מתאימה כדי להשיג את הרזולוציה המרחבית, רגישות, ואת דרישות הרעש של הניסוי (מערכת זו מנוצל מצלמה sCMOS רגישות גבוהה).

2. תוכנת רכישה

  1. בחר חבילת תוכנה המאפשרת שליטה בלתי תלויה בכל אחד מרכיבי החומרה, כגון מיקרו-מנהל.
    1. יצירת קובץ התצורה: קובץ התצורה הוא ערכה שנשמרה של מכשירים והוראות שמיקרו-מנהל ייטען כדי להפעיל את חומרת המערכת. כדי ליצור קובץ תצורה, לחץ על כלים ≫ אשף קביעת תצורת החומרה.
      1. בשלב 1, לחץ על צור תצורה חדשה ≫ הבא כדי להמשיך. שים לב שהמשתמש יכול לבחור לשנות או לחקור תצורה קיימת אם קיים כבר זמין.
      2. בשלב 2, עיין ברשימת ההתקנים הזמינים כדי למצוא את ההתקנים ששולטים באמצעות מיקרו-מנהל, כגון מיקרוסקופ, מנורה, שלב, תריס ומצלמה. כאשר מודגש, לחץ על הוסף. .. כדי להוסיף את ההתקן לרשימת ההתקנים המותקנים. . זה יפתח חלון חדש
        1. ציין את תווית ההתקן בתיבה תווית . (למשל, מצלמת sCMOS)
        2. תחת ערך, בחר את יציאת ה-COM המתאימה עבור כל התקן. פעולה זו תגרום להופעת רשימה של מאפייני התקנים בתחתית החלון.
        3. השאר את מאפייני ההתקן בהגדרות ברירת המחדל. שים לב שערכים מותאמים אישית עבור כל מאפיין התקן עשויים להיות מוזנים כרצונך.
        4. לאחר הוספת כל התקן, לחץ על הלחצן הבא כדי להמשיך לשלב הבא. שים לב שבעת השארת התקנים שנותרו או שאין צורך לשנותם, ניתן לשנות את קובץ התצורה מאוחר יותר כמתואר בשלב 2.1.1.1.
      3. בשלב 3, השתמש בתפריטים הנפתחים כדי לבחור את מצלמת ברירת המחדל, התריס והמוקד בשלב. אם רצוי שתריס אוטומטי, לחץ על תיבת הסימון מתחת לרשימה הנפתחת של שלב המיקוד. אם כיוון המיקוד של השלב Z מוכר, בחר אותו מתוך הרשימה הנפתחת תחת כיווני מיקוד שלב (מתקדם). אחרת, השאר את ברירת המחדל כבלתי ידועה.
      4. בשלב 4, לחץ פעמיים על התיבות תחת הכותרת עיכוב [ms] להגדיר עיכובים המשויכים התקנים אוטומטיים כגון עיכובים של 100 ms עבור המנורה, הבמה, תריס, ו 250 ms עיכוב עבור פקודות למכלול כוונון מכני לחשבון עבור זמן מיתוג מכני בין מסננים.
      5. בשלב 5, הקצה תוויות עבור התקני המצב. קביעת התצורה של מערכת מיקרוסקופ עירור-סריקה משתמשת בתוויות בבלוק המסנן כדי לזהות כל קוביית מסנן פלואורסצנטית (לדוגמה , מצב 0 מתאים לתווית בהיר, קוביית המסנן הריקה המשמשת בהדמיית שדה בהיר; בעוד ש מצב 3 מתאים התווית 495 ננומטר ומותאם אישית 495 nm דיקרואיק פילטר הקוביה המשמש להפרדת עירור ואור פליטה ב 495 nm). תוויות משמשות גם במכלול כוונון מכני כדי לאחסן את הפקודות המעבר עבור כל אורך גל (g., מצב 0 מתאים ל340 ננומטר באורך גל כוונון הפקודה מכני כוונון).
      6. בשלב 6, לחץ על לחצן עיון לצד תיבת קובץ התצורה כדי לבחור מיקום שמירה ושם קובץ עבור קובץ התצורה. לחץ על ' סיום ' כדי לשמור את קובץ התצורה.
    2. קבוצות אתחול והגדרות קבועות מראש: מיקרו-מנהל יכול לאחסן קבוצות שונות בתוך כל קובץ תצורה כדי להפעיל או לשנות קבוצת משנה של החומרה. לדוגמה, קבוצת ' אתחול מערכת ' ושילוב מוגדר מראש יאחסנו הגדרות ברירת מחדל כגון גודל ביננינג וקצבי בדיקה עבור המצלמה.
      1. צור קבוצה (לדוגמה, מערכת) על-ידי לחיצה על + בחלון הראשי בסעיף הקטן של הקבוצה.
      2. האם לבדוק שימוש כלשהו בקבוצה? בתוך הקבוצה שתדרוש ערך ברירת מחדל להגדרה (לדוגמה, במצלמת ברירת המחדל המשויכת).
      3. צור הגדרה מראש חדשה (לדוגמה, "Startup") על-ידי לחיצה על + בחלון הראשי בסעיף הקטן הקבוע מראש.
      4. כל תיבה שהוכנסה בשלב 2 תופיע כאפשרות מוגדרת מראש כאן. בחר ערך ברירת מחדל שייטען עבור כל אחת מהתיבות שסומנו.
    3. קבוצה והגדרות קבועות מראש עבור אורכי גל עירור: מיקרו מנהל מתייחסת לכל עירור גל כערוץ משלו עם זה הפקודה מיתוג אורך הגל שלה; לכן, יש לשמור כל אחד מהם כקביעה מוגדרת מראש.
      1. צור קבוצה חדשה כדי להכיל קבוצה של אורכי גל עירור הרצוי (למשל, "495 nm דיקרואיק")
      2. האם לבדוק את השימוש ב-Group? box בשם ' תווית ' המתאימה להתקן vf-5.
      3. צור מוגדרת מראש חדשה בשם עבור כל אורך הגל (למשל, "340 nm").
      4. הקצה לכל אחד מקביעות שם המאפיין המתאים והערך הקבוע מראש (לדוגמה, שם מאפיין: "תווית"; ערך מוגדר מראש: "340 nm").
    4. כלי רכישה רב מימדי: לחץ עלAcq רב-ממדי.ליד החלק העליון השמאלי של החלון מיקרו מנהל לפתוח כלי להתאמה אישית להשתמש עבור לכידת תמונה של המדגם בכל גל עירור עם לחיצה של לחצן יחיד. ישנן מספר אפשרויות התאמה אישית כדי לבנות את הרכישה בדיוק כפי שנדרש.
      1. נקודות זמן (לא נעשה בהן שימוש בדוגמה זו): ללימודים ללא רכיב השגות בזמן, השאר את התיבה לא מסומנת. , אם יש צורך במחקרים בזמן. תבדקו את התיבה הזאת אם מסומנת, הזן את מספר הפעמים שיש לבצע את שאר הגדרות הרכישה בתיבה מספר . הגדר את הזמן בין רכישות עוקבות על-ידי הזנת המשך בתיבה מרווח ובחירת היחידה המתאימה (אלפיות שניה, שניות או דקות; בדרך כלל שניות).
      2. מספר תפקידים (XY; לא בשימוש בדוגמה זו): למחקרים של מיקום XY בודד, השאר את התיבה לא מסומנת. אם רצוי מספר מיקומי XY, בדקו את התיבה ולחצו על הלחצן ' עריכת רשימת מיקומים ' כדי לפתוח חלון נפרד. הזז את השלב לכל מיקום רצוי ולחץ על לחצן סמן כדי לשמור את המיקום בתוכנה. חזור על הפעולה עד שכל מיקומי XY הרצויים יסומנו. סגור חלון זה כדי להמשיך.
      3. Z-ערימות (שקופיות; לא בשימוש בדוגמה זו): למחקרים של מיקום Z בודד, להשאיר את התיבה לא מסומנת. אם מספר מיקומי Z רצוי, בדוק את התיבה. הזיזו את השלב לתנוחת Z הרצויה ולחצו על הלחצן ' קבע ' שליד תיבת ההתחלה Z . הזז את השלב לתנוחת הסיום הרצויה של Z ולחץ על לחצן קבע לצד תיבת Z-end . הזן את גודל השלב הרצוי (במייקרון) בתיבה Z-step .
      4. ערוצים: ודא שהתיבה ערוצים מסומנת. כאן, ערוצים הם השמות הניתנים לאורכי גל עירור הפרט. זמין "ערוצים" מתאימים "קבוצות" המתוארים בשלבים 2.1.2 ו 2.1.3.
        1. קבוצה: לחץ על הרשימה הנפתחת כדי לבחור קבוצה ממנה ניתן לבחור אורכי גל עירור (לדוגמה, 495 nm דיקרואיק).
        2. לחץ על התיבה לשמור על תריס פתוח כדי לשמור על התריס פתוח בין רכישות עבור כל ערוץ. לתשומת לבך, התריס ייסגר בין סריקות ספקטרליות עוקבות אם תיבה זו מסומנת, בהנחה שהאפשרות ' תריס אוטומטי ' נבחרה גם היא בחלון הראשי.
      5. לחץ על הלחצן החדש כדי להוסיף ערוצים לרשימת הרכישות. שים לב שניתן להשתמש בלחצן Remove כדי להסיר ערוצים שאינם רצויים עוד ושניתן להשתמש באפשרות ' למעלה ולמטה ' כדי לסדר מחדש את כל הערוצים שנבחרו.
        1. האם לוודא כי השימוש? תיבת סימון נבחרה עבור כל אורך גל רצוי בסריקה ספקטרלית.
        2. קביעת תצורה: לחץ על הרשימה הנפתחת תחת קביעת התצורה ובחר את הגל הראשון בטווח הספקטרלי הרצוי (למשל, 340 nm).
        3. חשיפה: לחץ פעמיים על התיבה תחת חשיפה וקלט את זמן החשיפה הרצוי עבור אורך הגל הנבחר (למשל, "100" עבור 100 ms). ראה סעיף 5 ("רכישת נתונים") להצעות לבחירת זמני חשיפה מתאימים.
        4. היסט Z (לא ישים בסריקה ספקטרלית): השאר תיבה זו ריקה (ב -0) בעת ביצוע סריקה ספקטרלית.
        5. Z-מחסנית: להבטיח כי תיבה זו מסומנת עבור כל אורך גל בטווח ספקטרלי אם ביצוע מחסנית Z.
        6. סקיפ Fr. (לא ישים בסריקה ספקטרלית): השאר תיבה זו ריקה (ב -0) בעת ביצוע סריקה ספקטרלית. שים לב כי זה עשוי להיות שימושי באופן סלקטיבי לדלג על מסגרות במקרה אחד או כמה אורכי גל עירור משמעותית יותר מאשר אחרים או אם אורכי גל של עירור הפרט להיות פוטורעילים במיוחד.
        7. צבע: להשאיר את התיבה הזאת ריקה בעת ביצוע סריקה ספקטרלית. לתשומת לבך, ניתן לבחור צבעים לרצועות בודדות של אורך הגל למטרות ויזואליזציה של נתונים, אך הצבע אינו מתאים לערבוב הרפאים העוקב.
        8. חזור על השלבים הבאים עד להוספת כל אורך הגל הרצוי בטווח הסריקה הספקטרלי הנתון.
      6. הזמנת רכישה: לחץ על הרשימה הנפתחת כדי לבחור את הסדר שלעיל (2.1.4.1-2.1.4.5) תתבצע. לסריקות ספקטרליות כמו זה שמוצג כאן, סדר הרכישה הוא פשוט ערוץ. שים לב שאפשרויות נוספות מופיעות כתיבות נוספות נבדקות בתוך כלי הרכישה הרב-מימדי [נקודות זמן, מיקומים מרובים (XY) ו-Z-ערימות (פרוסות)) ומאפשרות לבחור את המיקום או הזמן הראשון, ואחריו פרוסה או ערוץ.
      7. פוקוס אוטומטי (לא נעשה שימוש בדוגמה זו): אם נבחר מספר תפקידים (XY) , כמה סגנונות שונים של התמקדות אוטומטית זמינים. לחץ על לחצן אפשרויות ובחר שיטה פוקוס אוטומטי מתוך הרשימה הנפתחת לצד לחצן סגור .
      8. תקציר: סקור חלון זה לסיכום של מספר נקודות הזמן, מיקומי XY, פרוסות Z, ערוצים, מספר כולל של תמונות, זיכרון מוחלט, משך סריקה והזמנת רכש כדי להבטיח שהמידע המפורט יתאים להגדרות הרכישה הצפויות.
      9. שמור תמונות: ודא שהתיבה זו מסומנת כדי לשמור את הנתונים שנאספו באמצעות הכלי ' רכישה מרובת מימדים '.
        1. לחץ על... ליד ספריית הבסיס לספריה כדי לבחור ספריית בסיס לספריה שבה יישמרו הקבצים. נקוב בספריית הבסיס באופן שמתאר את הפרטים הרלוונטיים של הניסוי (לדוגמה, GCaMP שריר האוויר החלק תאים שרירים).
        2. הזן שם בתיבה לצד קידומת שם המתארת את רכישת התמונה הנוכחית (לדוגמה FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). מומלץ ליצור קידומת שם המזהה את שדה התצוגה ואת זמן החשיפה, כמו גם מידע רלבנטי אחר כגון האובייקט והמסנן דיקרואיק שבשימוש. שים לב שערימת התמונות הראשונה שצולמה באמצעות הגדרות אלה תישמר עם "_ 1" בעקבות קידומת השם. כל המחסנית הבאה שצולמה באמצעות שורש ספריה זהה וקידומת שם תישמר עם "_ n", שבה "n" הוא מספר הפעמים שבהן מחסנית צולמה עם שם זה בספריה.
        3. לחצו על ' הפרד קובצי תמונה ' כדי לוודא שהתמונה שנוצרת בכל אחד מהעירור של הגל נשמרת.
      10. שמירה בשם: לחץ על לחצן שמור כ..., ליד הימנית העליונה של כלי הרכישה הרב-מימדי כדי לשמור את הגדרות הרכישה הללו לשימוש עתידי קל. שים לב כי גם הקידומות של ספריית הבסיס והשמות של הספריות יישמרו.
      11. לרכוש: לבסוף, לחץ על לרכוש! כדי להתחיל ברכישת תמונות בהתאם להגדרות הרכישה שנבחרו לעיל.

3. תיקון התגובה ספקטרלי (אופציונלי):

  1. ניתן לבצע תיקון הפלט הספקטרלי כדי לכייל את התגובה הספקטרלית של המערכת לתקן ידוע, כגון מנורה שניתן לטפל בהם או מכשיר אחר למעקב אחר נשים. שלב זה חשוב במיוחד אם התוצאות מושוות עם כלי דימות ספקטרלים אחרים, ספקטרומטרים, או בין מעבדות שונות. תהליך זה דווח בפירוט בעבר21,23.
    1. השתמש בספקטרומטר ספקטרומטרי למקור אור הנמצא על-ידי רופא (כגון LS-1-CAL-INT, אופטויית האוקינוס) או תקן אחר למעקב אחר לרכישת הכוח הספקטרומטר של התאורה כפי שנמדד בשלב המדגם. בצע תיקון נפרד עבור כל שילוב של הגדרת מקור אור, דיקרואיק mirror ואובייקטיבי. השתמש כדור שילוב ביחד את ספקטרומטר כדי למדוד במדויק תאורה רחבת זווית מתוך מטרת המיקרוסקופ.
    2. השתמש בשיטת שילוב, כגון כלל הטרפז, כדי לשלב את הנתונים הספקטרומטרים מעל אורכי גל מוארים. רוחב פס של 40 ננומטר לאינטגרציה המרוכז סביב אורך הגל המרכזי מספיק עבור רוב המסננים בעלי רוחב פס נומינלי של בין 14-20 ננומטר ברוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM). הערך המשולב מייצג את עוצמת ההארה הספקטרלית בכל להקה באורך גל עירור.
    3. להתוות את העוצמה המשולבת של כל להקה באורך הגל כפונקציה של מרכז עירור של הגל כדי לאפשר ויזואליזציה של הפרופיל עוצמת התאורה ספקטרלית.
    4. קבע את פס אורך הגל עם העוצמה המשולבת הנמוכה ביותר.
    5. לנרמל את פרופיל עוצמת התאורה ספקטרלי על ידי חלוקת העוצמה המשולבת הנמוכה ביותר על ידי העוצמה המשולבת של כל פס אורך הגל כדי ליצור גורם תיקון תלוי אורך הגל.

4. הכנה לדוגמא

  1. הכן דגם "ריק" (לדוגמה, הציבו שמיכות זכוכית בתא התא והוסיפו 1 מ ל של מאגר). מאגר זה תואר בעבר24.
  2. הכן מדגם ללא תווית כדי לקבוע את המדגם האוטומטי לדוגמה (למשל, מניחים שמיכות זכוכית המכילות תאים שריר בלתי מסומן בדרכי הנשימה החלקה25,26 בתא התא ולהוסיף 1 מ ל של מאגר).
  3. הכן דוגמה נפרדת המסומנת בתווית אחת עבור כל תווית פלורסנט המשמשת בניסוי באופן הבא:
    1. הוסף תווית מיטוכונדריאלי מדולל למאגר כדי להשיג ריכוז 100 ננומטר. הוסף את המאגר הזה לcoverslip המכיל תאים השריר חלקה הנשימה. דגירה של 20 דקות ב 20-25 ° c. העבר את הכיסויים לתא התא והוסף 1 מ ל של מאגר. שים לב כי הריכוז האופטימלי של תווית מיטוכונדריאלי ישתנה על-ידי גורמים כגון יצרן, צבע משויך וספציפיות.
    2. להעביר שמיכות המכיל את דרכי הנשימה תאים השריר חלקה מזוהמים עם בדיקה GCaMP27 לחדר התא ולהוסיף 1 מ ל של מאגר.
  4. הכן דוגמית ניסיונית אחת או יותר המכילה תערובת של תוויות הפלורסנט הרצויות.
    1. להוסיף 1 מ ל של מאגר (100 nM הריכוז של התווית מיטוכונדריאלי) כדי coverslip המכיל תאים השריר החלקה דרכי הנשימה מזוהמים עם בדיקה GCaMP ו דגירה עבור 20 דקות ב 20-25 ° c. העבר את הכיסויים לתא התא והוסף 1 מ ל של מאגר.

5. רכישת נתונים:

  1. בדוק כי דיקרואיק beamsplitter נאותה (למשל, 495 ננומטר דיקרואיק מסנן קוביית), המטרה (למשל, 60x מטרת המים), ומצלמה (sCMOS מצלמה) נבחרו.
  2. . העמיסו את הדגימה על הבמה
  3. לחץ פעמיים על התיבה הסמוכה לחשיפה [ms] והקלד "100" כדי לקבוע את זמן החשיפה ב-100 Ms. שים לב שייתכן שיהיה צורך להגדיל או להקטין את זמן החשיפה בהתאם לעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של המדגם.
  4. בחר 475 ננומטר מהתפריט הנפתח של החלון הראשי של מיקרו-מנהל עבור הצגה ראשונית של המדגם. שים לב כי 475 ננומטר לא יכול להיות אורך הגל האופטימלי עבור צפייה לדוגמה או קביעה אם הרוויה תתרחש ברחבי מחסנית תמונה.
  5. לחץ על Live כדי להציג את הדוגמה.
    1. לחץ על לחצן טווח הצפייה בעוצמה אוטומטית ליד ההיסטוגרמה בתחתית החלון כדי להביא את הערכים המינימליים והמרביים לטווחים חזותיים משמעותיים.
  6. השתמש בידיות המיקוד של המיקרוסקופ כדי להתמקד במדגם. לעתים קרובות שימושי למצוא את הקצה של המדגם כדי לסייע בהתמקדות. הדוגמה תהיה ממוקדת כאשר תכונות הקצה בתמונה מופיעות בחדות. שים לב כי ייתכן שיהיה צורך ללחוץ על כפתור אוטומטי מספר פעמים במהלך התמקדות לסייע בהצגת התמונה הפלואורסצנטית. בנוסף, משתמשים מסוימים עשויים למצוא את זה קל יותר להתמקד במדגם אם המיקרוסקופ הוא במצב שידור.
    1. אם התמקדות במצב שידור, לצורך בטיחות, תחילה ודא כי מקור האור הספקטרלי אינו משדר אור לעיניים לפני התאמת נתיב האור לדימות השידור. כמו כן, שים לב שייתכנו סטיות קטנות בין מוקד השידור לבין תמונות הקרינה הפלואורסצנטית. כאשר ההתמקדות המקובלת הושגה, הגדר את הנתיב האור עבור הדמיה פלואורסצנטית ספקטרלי.
  7. לחץ על ה- Acq הרב-ממדי. בסמוך לקצה השמאלי העליון של החלון כדי לפתוח את כלי הרכישה הרב-מימדי (המתואר והוגדר בסעיף 2).
  8. בחר טווח ספקטרלי מתאים לרכישת ספקטרלי (למשל, 360-485 nm עבור 495 nm דיקרואיק פילטר) על ידי לחיצה על הלחצן טען. ...... בפינה הימנית העליונה של חלון כלי הרכישה רב-מימדי וניווט להגדרות עירור נשמר בעבר (בשלב 2.1.4.10). עיין בדיון לקבלת מידע בנוגע לטווחים ספקטרלי מתאימים.
  9. לרכוש תמונה ברקע/ריק שאינה מכילה נתונים בעלי קרינה לשימוש ברקע ובחיסור רעש. ניתן לבצע זאת באמצעות מדגם ריק (שלב 4.1) או על-ידי ניווט לאזור ריק של דגימה ניסיונית. כפי שמתואר בשלב 5.6, זה מושגת בקלות ביותר על ידי מציאת קצה המדגם ולאחר מכן מיקום אותו כך את הקצה ממורכז בתוך שדה התצוגה.
    1. לאחר שהגדרות הרכישה מאושרות ואזור רקע גלוי, לחץ על הלחצן לרכוש כדי לרכוש מחסנית תמונה ספקטרלית המכילה רקע ורעש לשימוש עבור חיסור מאוחר יותר. יש לציין כי הדגימות עשויות להיות במרחק של יותר פלואורסצנטית אינטנסיבי יותר מקצה המדגם. ייתכן שיהיה מומלץ לעבור לדוגמה כדי למצוא את האזורים "המבריקים" ולבצע מספר ערימות של תמונות בדיקה כדי לקבוע את זמני הרכישה המתאימים ולהימנע מחשיפה יתר.
  10. קח מחסנית תמונה בודדת על אזור של המדגם שנראה שיש לו פלואורסצנטית אינטנסיבי כדי להבטיח שאין שילוב של אורכי גל ושעות החשיפה האלה יגרמו לחשיפת יתר.
  11. השתמש ב-ImageJ כדי לוודא שאורכי גל אינם מכילים פיקסלים שנחשפו ביתר.
    1. ב-ImageJ, לחץ על קובץ ≫ ייבוא ≫ רצף התמונות ונווט לתיקייה המכילה את התמונות הספקטרליות שצולמו בשלב 5.10. . זה יפתח חלון חדש לחץ על התיבה הסמוכה למספר התמונות והזן את מספר אורכי הגל הנכללים בסריקה הספקטרלית (לדוגמה, 26). השאר את התמונה מתחילה וגדל בתור "1". לחץ על אישור לחצן כדי להמשיך.
    2. לחץ על המקלדת כדי להשתמש בפונקציה מדידה של imagej. ודא שהמספר המפורט תחת מקסימום אינו מגבלת הזיהוי העליון של המצלמה (לדוגמה, 65,535). חזור על כל תמונה. בסריקה הספקטרלית שים לב כי מגבלת הזיהוי של המצלמה תלויה במצלמה עצמה. הגבול העליון מוצג בחלק הימני העליון של ההיסטוגרמה בחלון הראשי של MicroManager. לחלופין, ניתן לקבוע את המגבלה העליונה על-ידי פתיחת תמונה ב-ImageJ וניווט לתמונה > התאם > בהירות/ניגודיות. לחץ על לחצן Set בחלון המוקפץ המתקבל, הזן ערך גדול מדי (לדוגמה, 999,999) בפריט הריק שליד הערך המירבי המוצגולחץ על אישור כדי להמשיך. הערך המירבי המוצג בהיסטוגרמה החדשה צריך להיות מגבלת הזיהוי העליון של המצלמה.
    3. אם כל התמונות הכילו את מגבלת הזיהוי העליון של המצלמה (למשל, 65,535), להתאים את זמן החשיפה של הסריקה ספקטרלי כדי להבטיח כי האות המקסימלי ברחבי טווח ספקטרלי לא יעלה על הטווח הדינמי של המצלמה.
  12. לרכוש נתוני תמונה ספקטרלי מדגימות ללא תווית כדי לקבוע כל פלואורסצנטית אוטומטי. לרכוש את הסריקה עבור דגימות ללא תווית באמצעות טווח גל זהה הגדרות המצלמה כמו שאר הניסוי (למשל, 360-485 nm ב 100 ms לאורך גל).
  13. לרכוש נתונים ספקטרלי תמונה מדגימות חד התווית להשתמש כפקדים ספקטרלי לבנות את הספרייה ספקטרלית. בצע את הסריקה עבור כל תווית באמצעות טווח אורך-גל זהה, זמן חשיפה והגדרות מצלמה. שים לב לכך שזמן רכישה ארוך יותר עשוי להיות נחוץ עבור דגימות מסוימות כדי לאפשר זיהוי מדויק של ספקטרום תוויות עם תרומת רעש מינימלי.
  14. לבצע מדידות על מדגם ניסיוני (למשל, האדם החלקה בדרכי הנשימה תאים שרירים עם בדיקה GCaMP התווית מיטוכונדריאלי).
    1. מקם שקופית או כיסוי המכיל את המדגם הניסיוני במיקרוסקופ.
    2. בחר שדה תצוגה עם תאים בעלי תוויות כראוי של רקמות.
    3. לרכוש את נתוני התמונה ספקטרלי באמצעות הגדרות הרכישה הרצויה, כפי שמתואר לעיל.

6. ניתוח תמונה

  1. לתקן את התמונות לתגובה ספקטרלית שטוחה.
    1. הפחת את ספקטרום הרקע שהושג בסעיף 5.9 והכפל על-ידי מקדם התיקון שנקבע בסעיף 3.1.5. ניתן לעשות זאת באמצעות script פשוט של MATLAB או שגרת ImageJ. חיסור/תיקון קוד MATLAB (בשימוש בדוגמה זו) זמין באתר האינטרנט של אוניברסיטת דרום אלבמה Bioimaging משאבים.
      1. טען את קוד החיסור/תיקון ב-MATLAB.
      2. בכרטיסיה עורך, לחץ על הפעלה. פעולה זו תפתח חלון חדש המכיל לחצן תיקון Bsq . לחץ על הלחצן b תיקון רבוע כדי לפתוח חלון אחר המכיל אפשרויות לעבודה בספריה, קובץ רקע, קובץ פקטור תיקון ותיקיית tiff שלא תוקנה.
        1. השתמש בעיון. .. ליד ' ספריית עבודה ' כדי לבחור את נתיב הקובץ שבו ייפתחו החלונות הבאים. נווט אל התיקיה המכילה את קשת הרקע השמורה (בתבנית. dat).
        2. השתמש בעיון. .. ליד קובץ רקע (. dat) כדי לפתוח את הספריה שנבחרה בשלב 6.1.1.2.1 ולבחור את קובץ הרקע הרצוי (בתבנית. dat). לחץ על לחצן פתח כדי להמשיך.
        3. השתמש בלחצן עיון.. ., ליד פקטור תיקון (. dat) כדי לבחור פקטור תיקון. הספריה עבור ברירות המחדל של פקטור התיקון למיקום של קוד האב MATLAB. במקרה הצורך, נווטו לתיקיית המשנה המכילה את קובץ פקטור התיקון (בתבנית. dat). סמן את קובץ פקטור התיקון המתאים ולחץ על הלחצן פתח (Open) כדי להמשיך.
        4. השתמש בלחצן עיון ..., ליד תיקיית Tiff לא מתוקנת כדי לפתוח את הספריה שנבחרה בשלב 6.1.1.2.1 ולבחור את התיקייה לחיסור רקע ותיקון תמונה (זו בדרך כלל התיקיה Pos0 המכילה מיד את החומר הגולמי תמונות ספקטרליות). לחץ על לחצן פתח כדי להמשיך.
        5. לחצו על הלחצן ' לחץ לתיקון ספקטרלי '. לאחר השלמת העיבוד, נפתח חלון עם ההודעה "תיקון Bsq הושלם". לחץ על אישור לחצן כדי להמשיך. תמונות תיקון מאוחסנות בתיקיה חדשה בשם עם התיקייה המקורית raw התמונה, ועוד "_ מתוקן" (למשל, Pos0_Corrected).
  2. . צור את הספרייה הספקטרלית ניתן להשתמש במספר חבילות תוכנה כדי לחלץ נתונים ספקטרלי מתמונות, כולל ImageJ. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לנרמל כל endmember לרצועת אורך הגל של העוצמה הגדולה ביותר על ידי קביעת הלהקה באורך הגל יש את הערך האינטנסיבי ביותר וחלוקת המדידה בכל פס אורך הגל לפי ערך מרבי זה. יש לציין שפקדים בעלי תווית אחת שנוצרו באמצעות דוגמיות פלורסנט יזדקקו לשינויים נוספים28,29,30,31,32. ראה שלב 6.2.4 ודיון לקבלת פרטים.
    1. ב-ImageJ, לחץ על קובץ ≫ ייבוא ≫ רצף תמונות. . זה יפתח חלון חדש נווטו לתיקייה המכילה את התמונות הספקטרליות המתוקן. לחץ פעמיים על קובץ תמונה כלשהו בתיקיה כדי לפתוח חלון חדש. לחץ על התיבה הסמוכה למספר התמונות והזן את מספר אורכי הגל הנכללים בסריקה הספקטרלית (לדוגמה, 26). השאר את התמונה והגדל אותו כ-"1". לחץ על אישור לחצן כדי להמשיך.
    2. בחלון הראשי ImageJ, לחץ על סמל בחירת המצולע ולאחר מכן השתמש במצביע העכבר על-ידי לחיצה על התמונה כדי ליצור מצולע סביב אזור המכיל נתונים בעלי קרינה פלואורסצנטית. שים לב שייתכן שאין מידע מועט ביותר באורך הגל ההתחלתי. נווט לתמונה באורך גל אחר ו/או השתמש בכלי בהירות/ניגודיות (תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות ≫ אוטומטי) כדי להמחיש בצורה טובה יותר אזורים המכילים נתונים בעלי התעניינות בקרינה.
    3. כאשר המצולע מצויר, צור את הפרופיל של ציר Z על-ידי לחיצה על תמונה ≫ ערימות > מתווה z-פרופיל ציר. . זה יפתח חלון חדש לחץ על ' שמור ' כדי לשמור את הנתונים הספקטרלי כקובץ csv.
    4. לבצע חיסור כדי להבטיח ספרייה ספקטרלית נכונה עם תוויות טהור נטול זיהום באמצעות הקרינה האוטומטית. השתמש במשוואה הבאה29 כדי לבודד ספקטרום טהור מערבוב של תווית אחת וקרינה פלואורסצנטית:
      Equation 11
      כאשר: sטהור הוא הספקטרום הטהור של התווית, s מעורב הוא הספקטרום נמדד של המדגם מזוהם עם פלואורסצנטית אוטומטי, s אוטופל הוא הספקטרום של אור הזריחה נמדד, "a" הוא שיטתי מכפיל של ספקטרום הקרינה האוטומטית (בין 0 ל-1; לדוגמה, 0.4) ו-"היסט" הוא היסט (בדרך כלל 0). שנה את המונח "a" עד שערך כמעט אפס מושגת עבור התרומה הנראית לעין של פלואורסצנטית אוטומטי. מידע נוסף ניתן למצוא במספר פרסומים28,29,30,31,32.
  3. הסרת מיקס של נתוני התמונה הספקטרלית. שלב ללא ערבוב יפיק תמונה שפע עבור כל תווית פלורסנט, שבו שפע הוא כמות האות הניאון היחסי בתמונה מתווית בהתאמה. מספר אלגוריתמים שאינם מתערבבים זמינים לשימוש עם imagej33,34,35. בנוסף, קוד MATLAB ספקטרלי בלתי מתערבב (בשימוש בדוגמה זו) זמין באתר האינטרנט של אוניברסיטת דרום אלבמה Bioimaging משאבים. סקירה מקיפה יותר של unmixing ספקטרלי זמין36.
    1. העמיסו את קוד הערבוב. הספקטרלי בMATLAB
    2. ערוך את אורך הגל. mat וספריה. mat קבצים כדי להתאים את התנאים הניסיוניים (למשל, "אורך הגל" כמו 360-485 בהפרשים של חמישה).
      הערה: יש לטעון את הערכים המתאימים לאורכי גל אלה לתוך "ספריה" עבור כל תווית פלורסנט (וללא התאמה אוטומטית). Endmember_Name צריך לפרט את התוויות בסדר זהה לזה של ערכי העמודות של "Library". שים לב שהקובץ Library. mat אמור לכלול גם משתני "ספריה" ו-"Endmember_Name".
    3. בכרטיסיה עורך, לחץ על הפעלה. פעולה זו תפתח חלון חדש המאפשר למשתמש לבחור בספריה. נווטו לתיקייה המכילה את התמונות הספקטרליות שאינן מעורבות. לאחר שנבחר, פעולה זו תפתח חלון חדש.
    4. במקומות הריקים התוצאות, הזן את שם התמונה (לדוגמה, HASMC עם GCaMP ו-Mito FOV1), מספר הלהקות של אורך הגל (לדוגמה, 26), מספר נקודות הזמן (לדוגמה, 1) והאם הצורך במדידה מדידה (לדוגמה, n) במקומות הריקים שלהם. אם נבחר "n" עבור הפונקציה, השאר את שני הריקים ריקים. לחץ על אישור כדי להמשיך, אשר יפתח חלון חדש.
    5. Naviagate לתיקיה המכילה את הקובץ אורך הגל. mat. לאחר שנבחרו, לחצו על ' פתח להמשך ', שיפתח חלון חדש.
    6. נווט אל התיקיה המכילה את הקובץ Library. mat. לאחר שנבחר, לחץ על פתח כדי להמשיך, אשר לשמור את התמונות ללא מעורבות בתיקייה חדשה "unmixed עורב" בתוך הספרייה המכילה את התמונות ספקטרליות.
  4. בדקו את התמונות הספקטרליות הבלתי מעורבבות לאיכות.
    1. פתח כל תמונה שאינה מעורבת כדי לבדוק חזותית את התפלגות הרכיבים הטהורים.
      1. השווה את גודל תמונת השגיאה לאלה של התמונות הבלתי מעורבות (בדומה לשלב 5.11, ניתן לעשות זאת באמצעות הפונקציה מדידה של imagej). אם הגודל של תמונת השגיאה דומה בסדר גודל לתמונות שפע שאינו מעורב, סביר להניח כי יש אותות נתוני התמונה ספקטרלים שאינם מתומחרים במדויק על ידי הספרייה ספקטרלית ואת תהליך הערבוב ספקטרלי ליניארי.
      2. השווה את תמונת השגיאה לתמונות שלא התערבבו כדי לראות אם קיימים מבנים שיורית לא מזוהים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מספר צעדים חשובים מפרוטוקול זה נחוצים כדי להבטיח את אוסף הנתונים שהוא גם מדויק ונטול הדמיה וחפצים ספקטרליות. דילוג על שלבים אלה עלול לגרום לנתונים הנראים משמעותיים אך לא ניתן לאמת או לשכפל עם כל מערכת הדמיה ספקטרלית אחרת, ובכך לבטל את כל המסקנות שנעשו עם הנתונים אמר. הראשי בין הצעדים החשובים האלה הוא תיקון הפלט ספקטרלי הנכון (סעיף 3). גורם התיקון מפצה על וריאציות תלויות אורך הגל בפלט הספקטרלי של מערכת העירור. זה מושגת על ידי שינוי אורכי גל עם עירור כוח גבוה כגון כוח התאורה האופטי הוא המקבילה אורכי גל עם עירור כוח נמוך, השגת פרופיל הריגוש ספקטרלי שטוח. דוגמה לפקטור תיקון בלתי הולם הוא אחד המכיל ערכים נמוכים מאוד (לדוגמה, < 0.001) באורכי גל אחד או יותר, המציינים כי ערכי העוצמה הנמדדים באורכי הגל האלה חייבים להחליש מאוד כדי להשיג תגובה ספקטרלית שטוחה.

כיוונון המערכת לתקן הניתן למעקב אחר מבטיח שהנתונים הנאספים באמצעות מערכת הדימות הספקטרלית לסריקת העירור, הינם דומים למערכות אחרות, מכוילים גם לסטנדרטים הנמצאים במעקב. לכן, חיוני לוודא שכל גורם תיקון מתאים את הנתונים שנאספו בהתאם. ניתן לאמת את הדיוק של מקדם תיקון עם שימוש בתקן של הזריחה, כגון פלואורוסקופים. איור 1 ממחיש גורם תיקון מתאים ובלתי הולם, מדמיין באמצעות נתוני גרפיקה ותמונה. במקרה זה, הפלט ספקטרלי ב 340 ננומטר כמעט לא קיים בהשוואה לשאר טווח ספקטרלי, והתוצאה היא ערך קרוב אפס (< 0.001) עבור כמעט כל אורך הגל. מוחל על מחסנית התמונה, התוצאה היא כמעט אפס ערכים ברוב מחסנית התמונה עבור רוב הפיקסלים.

כפי שצוין בסעיף 5, את טווח עירור, fluorophores שנבחרו, והגדרות הרכישה עשוי ליצור את הפוטנציאל כי אחד או רבים להקות תמונה באורך הגל מכילות פיקסלים רווי יתר. איור 2 ממחיש דוגמה שבה זמן החשיפה נקבע זמן רב מדי עבור מספר אורכי גל עירור, דבר הגורם לתמונות העוקבות להכיל פיקסלים רוויים. חשוב לציין כי כפי שמראה האיור, הן התמונות הבודדות והן התמונות הצבועות בצבע שווא עשויות להופיע באופן חזותי בטווח של טווחי עוצמה מקובלים.

הבחירה המתאימה של אזור הרקע לחיסור חשוב גם עבור השוואת נתונים בין מערכות, כפי שהיא מסירה אלמנטים של רעש מצלמה או אור תועה לפני תיקון ספקטרלי למעקב הרופא (איור 3). הוא מועיל לעתים קרובות עבור עיבוד תמונה בעקבות ושלבים ניתוח נתונים כדי ליצור תמונת RGB בצבע שווא של מחסנית התמונה ספקטרלי על מנת להמחיש תכונות ספקטרליות בתוך התמונה. איור 4 מראה תמונה בצבע שווא RGB שנוצר על ידי מיזוג שלושה שנבחרו אורך הגל (370 ננומטר = כחול, 420 ננומטר = ירוק, 470 nm = אדום).

הפרופיל הספקטרלי של כל. מקור הזריחה הבודד במקרה של עירור-סריקת הדמיה היפרספקטקטרלית, זה נעשה על ידי רכישת ערימות תמונה ספקטרליות עבור כל fluorophore (ו-פלואורסצנטית אוטומטי). איור 5 נכלל כדוגמה לבחירת אזורים מפקדי תווית יחידה כדי ליצור ספריה ספקטרלית. יש לציין כי כל מדידה מנורמלת עד לשיא אורך הגל.

כאשר מבוצעת בצורה נכונה, התהליך הבלתי-מתערבב מאפשר הפרדה של מחסנית תמונה ספקטרלית לתרומות המתאימות מכל תווית פלואורסצנטית. איור 6 מציג דוגמה להגדיר מערכת התמונה ספקטרלית, עם תמונות בודדות עבור כל אחד האותות הבאים: תא האוויר החלקה השריר החלק האוטומטי, בדיקה gcamp, ותווית מיטוכונדריאלי. השגיאה המשויכת לערבוב ספקטרלי מוצג גם ניתן לבחון כדי להשוות את רמות העוצמה של השגיאה לאלה של האותות הבלתי מעורבים. החישוב והפרשנות של שגיאה זו נדונו בעבר37. כפי שמוצג באיור 6, קיימת שגיאה גבוהה המשויכת לאזורים הגרעיניים והברורים של התאים, ומציינים כי הספקטרום הנמדד של אזורים אלה לא מזוהה היטב על-ידי הספקטרום בספרייה הספקטרלית. אחד המקור הפוטנציאלי של שגיאה יכול להיות כי בקרת תווית אחת עבור GCaMP ואת התווית מיטוכונדריאלי היו מוכנים באמצעות התאים השריר החלקה בדרכי הנשימה, אשר יש גבוהה מקורית של שריר אוטומטי. מכאן, GCaMP ותווית מיטוכונדריאלי עשויים לא לייצג ספקטרום endmember טהור. בנוסף, אות הזריחה האוטומטית עשויה להשפיע על ספקטרום הספרייה עבור שתי התוויות האחרות באופן שלא הוכנס כראוי, וכתוצאה מכך התאמה פחות מדויקת מאשר אם התוויות נרכשו באמצעות קו תא עם מעט לא . פלואורסצנטית אוטומטי בנוסף, דוגמאות כלולות כאשר מעטים מדי או יותר מדי מרכיבים של ספריה ספקטרלית זמינים, וכתוצאה מכך התאמה והתאמת יתר של נתוני התמונה ספקטרלי, בהתאמה (איור 6, איור 7, איור 8, איור 9ושולחן 1.

כפי שצוין בסעיף 6.2 ובמיוחד שלב 6.2.4, ספקטרום "טהור" שנאסף מתאים בתווית כי הם גם פלורסנט אוטומטית צפוי לזהם את הפרופיל הספקטרלי עבור המרכיב הטהור. ככזה, הטיפול צריך להילקח כדי להפריד את הספקטרום הטהור של תוויות העניין ממארחים פלורסנט האוטומטי שלהם. איור 10 מראה את ההפרש של חוסר ערבוב עם ספקטרום "טהור" מזוהם עם פלואורסצנטית אוטומטי (מעורב) לעומת ספקטרום טהור מחושב על ידי השיטה המתוארת בשלב 6.2.4. ההבדל מתרחש בעיקר בביטול ערבוב האות autoפלואורסצנטית. ללא הפרדת האות המתאימה (למשל, חיסור של זיהום הקרינה האוטומטית מן הספקטרום של GCaMP), את הרכיבים האוטומטיים האוטומטי ואת רכיבי הספרייה GCaMP להתחרות על נתונים ספקטרלי אותו בכל פיקסל, וכתוצאה מכך חורים אופייניים או כתמים כהים בתמונה עם הזריחה האוטומטית.

Figure 1
איור 1 : יישומים לדוגמה של גורמי תיקון הולמים והולמים המשמשים לתיקון תמונות לתגובה ספקטרלית שטוחה. (א) התווה גורמי תיקון הולמים והולמים. (ב) תמונת RGB שנוצרה עם שימוש בפקטור התיקון הבלתי הולם ב-(א). (ג) תמונת RGB שנוצרה עם אותו שדה תצוגה כמו (ב), למעט עם שימוש בפקטור תיקון מתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : דוגמאות הממחישים את החשיבות של הגדרות רכישה מתאימות. (א, ב) תמונות RGB שנוצרו על-ידי זמן רכישה מתאים (A, 100 ms) לעומת אותו שדה תצוגה עם זמן רכישה משתנה (B, 500 ms). יש לציין שתמונות RGB נראות זהות כאשר בצבע שגוי. (ג) אזור הריבית שנבחר לערכי עוצמת הסקר מהאזורים העזים ביותר של (א) ו-(ב). (ד) ערכי עוצמה מותווים לאורך גל מתמונת זמן החשיפה 100 Ms (A, קו שחור) ו 500 ms זמן חשיפה (ב, הקו האדום). יצוין כי עוצמות פיקסל עבור 500 ms זמן חשיפה הגיעו למגבלה של טווח דינמי של הגלאי (65,535 AU) ב 370 nm ולא להקטין עד 525 ננומטר, וכתוצאה מכך חפץ ספקטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : בחירת אזור מעניין לחיסור רקע. (א) תמונת עוצמה גולמית, מסוכמת גל. (ב) אזורי התמונה שנבחרו כדי לקבוע את ספקטרום הרקע של פיקסל בממוצע לחיסור הרקע המוצג באדום. (ג) תמונת העוצמה המופחת ברקע, תוקנה ומסוכמת. (ד) צבע RGB של התמונה המתוקנת (C). תהליך יצירת תמונה בצבע שווא של RGB מוצג באיור 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : תהליך יצירת תמונה בצבע שווא של RGB. (A-C) להקות שלוש אורכי גל מרווחים באופן שווה לאורך טווח הרכישה ספקטרליות נבחרו עבור שווא-צביעה (כחול = 370 nm, ירוק = 420 nm, אדום = 470 nm). (ד) תמונת העוצמה המופמנת שנוצרה על ידי הוספת עוצמות הפיקסלים מכל אורך הגל בקוביית התמונה. (E-G) התמונות בחלוניות (A-C) עם שולחנות המבט שלהם בצבע שווא שהוחלו עליהם. (ח) התמונה הממוזגת של התוצאה (E-G). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : בחירת אזור של פקדים בעלי תווית אחת עבור יצירת ספריות ספקטרליות. (א) RGB תמונה בצבע שווא של השריר החלק דרכי הנשימה (הבית) של תאים פלואורסצנטית אוטומטי. (ב) המוצג באדום, אזורים של (א) נבחר עבור המרכיב האוטומטי של הספרייה הספקטראלית. (ג) RGB תאים בצבע שווא המסומנים בתווית מיטוכונדריאלי. (ד) המוצג באדום, מחוזות (ג) שנבחרו לרכיב התווית המיאודרקל של הספרייה הספקטרלית. בשל האור האוטומטי של התאים הסמוכים המקומית בסמוך לגרעין, אזורים קטנים נבחרו הרחק מן הגרעין כדי לזהות את ספקטרום התוויות מיטוכונדריאלי. (ה) RGB תאים שקריים בצבע בהיר שעברו במחקר של gcamp. (ו) אזורי (ה) שנבחרו עבור רכיב gcamp של הספרייה הספקטרלית מוצגים באדום. בדומה ל (ד), האזורים הרחוקים מהגרעינים נבחרו. (G) הספרייה הספקטראלית שהושגה מ-A-F, מנורמלת לערך אחדות באורך הגל עם האות החזק ביותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Figure 6
איור 6 : דוגמה לנתוני תמונה שאינם מעורבים, שבהם ניתן לדמיין את התרומה הבלתי מעורבת של כל אחד מרכיבי הספריה. (A-D) השפע הבלתי מעורב של GCaMP, תווית מיטוכונדריאלי, התאמה אוטומטית ותקופת שגיאה. (E-G) התמונות בחלוניות (A-C) עם שולחנות המבט שלהם בצבע שווא שהוחלו עליהם. (ח) התמונה המורכבת, הממוזגת, בצבע שווא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Figure 7
איור 7 : תרומות אותות יחסית שאינן מעורבות, כולל עוצמה ואחוז ממוצע של פלואורסצנטית מוחלט, מספרייה ספקטרלית מוגדרת כראוי. (A-D) השפע הבלתי מעורב עבור פלואורסצנטית אוטומטי, GCaMP, תווית מיטוכונדריאלי, ומונח שגיאה. יצוין כי מונח השגיאה מורכב פחות מ 10% מהאות הכולל של הזריחה נמדד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Figure 8
איור 8 : תרומות אותות יחסיים מעורבים, כולל עוצמה ואחוז ממוצע של הזריחה הכוללת, מספרייה ספקטרלית חסרה רכיב ידוע שייכלל במדגם (כלומר, ספרייה ספקטרלית מוגדרת מראש). (A-C) השפע הבלתי מעורב של הקרינה האוטומטית, תווית מיטוכונדריאלי ומונח שגיאה. שים לב כי השמטה של GCaMP מהספריה ספקטרלית הגדילה את תרומות האות היחסי מחושב מתוך רכיבי הספרייה, כמו גם את תקופת השגיאה, כאשר לעומת איור 7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9 : תרומות אות יחסית ללא מעורבות, כולל עוצמה ואחוז ממוצע של הזריחה הכוללת, מספרייה ספקטרלית המכילה רכיב נוסף הידוע כחסר במדגם (כלומר, ספרייה ספקטרלית מוגדרת יתר). (A-E) השפע הבלתי מעורב של פלואורסצנטית אוטומטי, GCaMP, תווית מיטוכונדריאלי, תווית גרעינית, ומונח שגיאה. שימו לב כי התוספת של תווית גרעינית לספרייה ספקטרלית הפכה את התרומות היחסיות של האותות היחסיים מהקרינה האוטומטית, בהשוואה לאיור 7. יתרה מזאת, מונח השגיאה מצטמצם מתחת לאחוזי השגיאה שצוינה על-ידי הספריה הספקטראלית המוגדרת כראוי. הסיבה לכך היא שספרייה מוגדרת יתר כמעט תמיד תאפשר התאמה טובה יותר לנתונים הניסיוניים מאשר ספריה מוגדרת כראוי, אף על פי ששפע אותות עבור רכיבים הידועים כנעדרים מן המדגם הם (במציאות) ממצאים של הגדרת יתר . ספריה ספקטרלית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10 : השוואה של תמונות שאינן מעורבות בעת שימוש בספריה לפני ואחרי המתאים התיקון האוטומטי של האות זיהום. (א) המקורי "טהור" ספקטרום נגזר בקרת תווית אחת בתאי הנשימה autofluorescent מאוד שרירים תאים לפני חיסור מוקטן מפורט בשלב 6.2.4. (B-D) שנוצרו באמצעות (א) כספרייה, התמונות האוטומטיות שאינן מעורבות, GCaMP ותוויות גרעיניות. (ה) הספקטרום הטהור מתוקן שנגזר מפקדים בעלי תווית אחת בתאי שריר בצורה אוטומטית מאוד פלורסנט לאחר שינוי קנה מידה של החיסור. (F-H) שנוצרו באמצעות (E) כספרייה, התמונות האוטומטיות שאינן מעורבות, GCaMP ותוויות גרעיניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

עוצמה מרושעת (AU)
התאמה מתאימה מתאים לחסר התאמת יתר
זריחה אוטומטית 187 299 164
GCaMP 139 - 140
תוית מיטוכונדריאלי 246 318 248
מותג גרעיני - - 26
שגיאת RMS 53 126 43
סטיית תקן (AU)
התאמה מתאימה מתאים לחסר התאמת יתר
זריחה אוטומטית 362 442 315
GCaMP 168 168
תוית מיטוכונדריאלי 344 388 345
מותג גרעיני - - 93
שגיאת RMS 62 126 44
עוצמה מרבית (AU)
התאמה מתאימה מתאים לחסר התאמת יתר
זריחה אוטומטית 6738 7409 6738
GCaMP 1336 - 1336
תוית מיטוכונדריאלי 5098 5194 5098
מותג גרעיני - - 1257
שגיאת RMS 1050 1286 910
% מכלל הקרינה הפלואורסצנטית
התאמה מתאימה מתאים לחסר התאמת יתר
זריחה אוטומטית 30 40% 26
GCaMP 22 43% 23
תוית מיטוכונדריאלי 39% - 40%
מותג גרעיני - - 4
שגיאת RMS 8 17 7

טבלה 1: טבלה המשווה את הממוצע, סטיית התקן, וערכי עוצמה מקסימלית שאינו מעורב בתמונת שפע מתוך ספרייה ספקטראלית נכונה ומספריות ספקטרליות או מוגדרות מראש, כמו גם אחוז הזריחה הכוללת לכל התמונה שפע לא מעורב (המינימום מידת השפע מעורב עבור כל תמונה היה תמיד אפס). נתונים שנלקחו מאיור 7, איור 8 ואיור 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש האופטימלי של הגדרת הדמיה היפרספקטקטרלית בסריקת עירור מתחיל בבניית הנתיב האור. בפרט, בחירה של מקור אור, מסננים (tunable ו דיקרואיק), החלפת מסנן שיטה, ומצלמה לקבוע את טווח ספקטרלי זמין, מהירות סריקה אפשרית, הרגישות גלאי, ודגימה מרחבית. מנורות מרקורי קשת מציעים רבים באורך גל הפסגות אבל לא מספקים פלט ספקטרלי שטוח ידרוש הפחתת אות משמעותית על פסגות הפלט כדי לתקן את נתוני התמונה הספקטרלית בחזרה לתגובה רופא ממעקב38. מקורות אור חלופיים, כגון מנורות Xe ארק ולייזרים אור הרצף הלבן, עשוי לספק פלט ספקטרלי יותר אחיד כי הוא מתאים יותר לדימות עירור היפרספקטקטרלית38,39,40. בחירה של מקור אור, מסנני מדיקרואיק ומסנני מסננים קובעים את טווח הספקטרלי הזמין. טווח זה יש לבחור עם התחשבות זהירה עבור מידע ספקטרלי הרצוי של המדגם ניסיוני.

בנוסף, יש להתחשב במנגנון המיתוג המשמש למסננים הניתנים לשימוש, כמו גם גורמי מצלמה שונים כגון: יעילות קוונטית, גודל פיקסלים וקצבי מסגרת זמינים, מאחר שגורמים אלה ישפיעו על תעריפי הדגימה הפוטנציאליים41 ,42,43. עם זאת, כל הגורמים האחרים להיות קבועים, ניצול של גישה לסריקת עירור צריך לספק רגישות מוגברת ואת היכולת הדמיה מהירה יותר, לעומת רוב הפליטה, סריקת הדמיה ספקטרלית גישות21.

כאמור במבוא, הדמיה היפרקטרלית כאן מתייחסת לאופי הרציף והחופף של הנתונים הנרכשים. ככזה, היכולות של המערכת צריך להיות מסוגל לאסוף נתונים באמצעות מרווח של אורכי גל מרכז עירור פחות ממחצית המרחק של FWHM של המסננים. כפי שדווח קודם לכן, מערך נבחר בקפידה של סרט דק מסננים מסוגל מאפשר רכישת נתונים עם מרכז אורכי גל רווחים 5 ננומטר בנפרד, מרחק מספיק כדי לדגום את ספקטרום עירור נתון מסננים עם FWHM של בין 14-20 nm. מרווח כזה נותן יתירות קלה איסוף נתונים ספקטרלי כנראה מגביר את הדיוק של תהליך ביטול ערבוב. התחשבות של שני טווחים ספקטרלי והמספר המינימלי הנדרש של ערוצי גל עבור מדויק unmixing נדונו בעבר44,45,46. לשם כך, בהתחשב רוחב הפס של מסננים אלה, טווח עירור יש לבחור כדי לסיים באורך הגל כי הוא נמוך במקצת (5-10 ננומטר נמוך) מאשר אורך הגל של דיקרואיק beamsplitter. זה יבטיח את רוחב הפס כולו של התאורה עירור הוא מתחת אורך הגל של דיקרואיק beamsplitter (g., 360-485 nm עבור 495 דיקרואיק מסנן) כדי למנוע עירור-פליטת החוצה-לדבר.

תוכנה לשלוט באופן עצמאי כל רכיב של החומרה כדי להשיג סריקות הדמיה ספקטרלית במהירות גבוהה נדרש. התוכנה צריכה להיות מסוגל להפעיל את התריס, בחירת אורכי גל עירור, ולרכוש תמונות במהירויות גבוהות מספיק כדי לעמוד בתנאים ניסיוניים (מדויק לדוגמה דרישות המדגם ישתנה להתנסות, אבל המטרה לדוגמה יכול להיות לרכוש ארבעה ערימות תמונה ספקטרליות לחלוטין לדקה). ניסויים מורכבים יותר עשויים לעשות שימוש במראות דיקרואיק מרובים, מטרות, או XYZ מיקומים. קיימות מספר חבילות תוכנה הזמינות עבור רכישת נתונים47,48. מיקרו מנהל היא תוכנה חופשית קוד פתוח עבור מיקרוסקופ אוטומציה המציעה מגוון אפשרויות התאמה אישית. יתרה מזאת, מיקרו-מנהל כולל פאנל scripting עבור התאמה אישית נוספת אינה זמינה בתוך ממשק המשתמש הראשי. לדוגמה, ניתן להשתמש ב-script מותאם אישית כדי להפחית את ההשהיה 250 ms של מחליף מסנן מנהרה ל 10 ms בכל אורכי גל עירור למעט מעברים אורך הגל שבו גלגל הסינון מסתובב לסנן tunable חדש, הפחתת ההדמיה האפקטיבית זמן על ידי 240 ms לפי אורך גל עבור רוב אורכי גל. התאמה אישית זו אפשרה רכישה של עד 30 אורכי גל בפחות מ 4 s. בסופו של דבר, מיקרו-מנהל ניתן להפעיל לצד סביבות אחרות, כגון MATLAB, כדי להתאים אישית יותר בקרת התקן מיקרוסקופ.

קביעת מגוון העירור הספקטרלי הנכון, זמן הרכישה, ואורך הגל ההתחלתי לצפייה במדגם ורכישת הנתונים הבאים חשוב מאוד. עם זאת, ייתכן שפעולה שגויה של רכיבים בודדים של המערכת תדרוש פתרון בעיות נוסף. כל רכיב בנתיב האופטי תורם לנתוני התמונה הנרכשים. מכאן, חשוב לאמת את התגובה ספקטרלית ושידור אופטי של רכיבים אופטיים בתוך שביל האור, במיוחד אם מנסה לייעל את תגובת המערכת הכוללת. מקורות אור לעתים קרובות יש הגדרות אינטנסיביות משתנה יכול להיות ירידה בכוח על פני החיים של הנורה40. אם מופיעה דוגמה עמומה, ייתכן שהגורם מופחת בפלט ממקור האור. הפונקציה התריס autoshutter מיקרו מנהל, בניסיון שלנו, לא פועל 100% מהזמן. מחסור באותות עשוי להצביע על סגירה סגורה. את הגל הראשוני עירור שנשמרו בתוך קובץ התצורה של מיקרו-מנהל יכול להיות ברירת מחדל לאורך הגל עם הפלט כמעט או לא ספקטרלי, כגון 340 ננומטר דוגמה המוצגת באיור 1.

בנוסף, זה לא נדיר לבחור בטעות את אורך הגל כי הוא מעל אורך הגל של לעבור ארוך-pass דיקרואיק beamsplitter, וכתוצאה מכך החוצה לדבר נוסף ו/או העירור אור להיות שונטד ישירות למצלמה אשר עשוי עלולים לגרום נזק לחיישן המצלמה. באופן דומה, התאמת נתיב האור להדמיית שידור עלולה לגרום לאבדן אותות למצלמה, בהתאם לתצורת המיקרוסקופ. יתר על כן, כפי שצוין באיור 2, בחירת אורך הגל הראשוני ואת זמן החשיפה עבור הצפייה במדגם עשוי להיראות מתאים, אבל בעצם התוצאה פיקסלים רוויים באורכי גל עירור אחרים. עובדה זו לא תהיה ברורה אלא אם רוויית פיקסלים מסומנת עבור כל תמונה, כך שלעתים קרובות שקול לבצע מחסנית תמונה בדיקה על אזור של המדגם שנראה להכיל את הזריחה האינטנסיבית ביותר.

כמו כן, ראוי לציין כי עוצמות משתנה עשויות להופיע בתמונות שנבחרו לאזורי רקע. יש לנקוט את הטיפול כדי לוודא שאזורים אלה אינם מכילים בפועל נתוני תמונה רלוונטיים, מאחר ששלבי תיקון הנתונים הבאים יחסרים אות זה מנתוני התמונה שנרכשו באזורים אחרים במדגם. לעיתים יש צורך להשתמש בהגדרות השידור ו/או להגדיל באופן דרסטי את זמן החשיפה כדי לבדוק שהאזור שנבחר למדידת רקע לדוגמה אינו מכיל מדגם. באופן דומה, תמונות לא מעורבות עשויות להופיע עם כתמים או חורים כהים בתמונה בעלת הקרינה האוטומטית. זה יכול להיות בגלל הספרייה הפסולה שנגרמת על ידי "זיהום" האוטומטי "טהור" אותות ספקטרלים בעלי תווית אחת. הסיבה לכך היא כל "טהור" האות ספקטרלי שנאסף ממדגם המכיל פלואורסצנטית אוטומטי יהיה תמיד להכיל כמה ספקטרום של הקרינה האוטומטית עצמה, גם אם בכמויות מעקב. יש לנקוט כדי להפחית את האותות האוטומטיים של בקרה באמצעות שליטה בעלת התווית היחידה כדי להבטיח ספריה ספקטרלית נכונה, כפי שמתואר בהזדמנויות שונות על-ידי מנספילד et al.28,29,30, 31,32

למרות שלא הפגינו במאמר זה, עירור-סריקת מערכת הדמיה ספקטרלית יכול לשמש גם עבור הדמיה זמן והדמיה על פני מספר מיקומים XY (או שדה גדול של השקפה בשל תפרים תמונה) במטוסי מיקוד מרובים. אם אפשרויות אלה רצויות עבור ניסוי אחד, מחשבה זהירה צריך להינתן לחשיבות של סדר הרכישה ואפקטים פוטנציאליים של הלבנת. כמו כן, ראוי לציין כי אם הזמן בפועל נלקח הזמן המשוער (למשל, מחסנית תמונה לוקח 11 s לרכוש ולא המשוער 10 s), מיקרו-מנהל ימשיכו לרכוש את המספר הנבחר של נקודות זמן ו/או עמדות. שינוי מוטעה זה יכול להיות מורכב עם נקודות זמן מרובות ולשנות דגימה מחושבת הזמני, הטיית כל המסקנות שנעשו מהנתונים.

דוגמה זו ממחישה את היכולת להפריד בין שלושה מקורות של קרינה פלואורסצנטית בטווח הסריקה של 145 ננומטר. ניסויים קודמים שימוש במערכת זו הצליחו להפריד עד חמישה מקורות של זריחה בתוך אותו טווח. הזמן הנדרש עבור רכישת תמונה זו הוא פחות מ 1 דקות, אשר מהירה באופן משמעותי יותר מאשר רוב מערכות הדמיה ספקטרלית סריקת הפליטה. שיפורים בנתיב האור, כגון מהירות גבוהה עירור גל כוונון, עשוי לקדם את טכנולוגיית הדמיה זו מהירויות מספיקות עבור הדמיה ספקטרלית בקצב וידאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד ר Leavesley ו ריץ לחשוף את האינטרס הפיננסי בחברת סטארט-up, SpectraCyte ייט LLC, הוקמה כדי לסחור טכנולוגיה הדמיה ספקטרלית.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר בתמיכה של NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, וקרן אברהם מיטשל לחקר הסרטן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

Tags

הנדסה סוגיה 150 היפרספקטקטרלית ספקטרוסקופיה עירור זריחה מיקרוסקופיה מיקרוסקופ אוטומטי הדמיה מסנן טונלי סרט דק
עירור-סריקת מיקרוסקופ היפרספקטקטרלי ביעילות אותות זריחה להפלות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deal, J., Britain, A., Rich, T.,… More

Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter