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Engineering

Microscopia de imagem hiperespectral de detecção de excitação para discriminar sinais de fluorescência de forma eficiente

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

A imagem latente espectral transformou-se uma solução de confiança para a identificação e a separação de sinais múltiplos da fluorescência em uma única amostra e pode prontamente distinguir sinais do interesse do fundo ou do autofluorescence. A excitação-a imagem latente hiperespectrais da exploração melhora nesta técnica diminuindo o tempo necessário da aquisição da imagem ao simultaneamente aumentar a relação do sinal-à-ruído.

Abstract

Várias técnicas dependem da detecção de sinais de fluorescência para identificar ou estudar fenômenos ou para elucidar funções. A separação destes sinais da fluorescência foi provada complicada até o advento da imagem latente hiperespectrais, em que as fontes da fluorescência podem ser separadas de se e de sinais do fundo e do autofluorescence (dado o conhecimento de seu espectral assinaturas). Entretanto, a imagem latente hiperespectrais tradicional, da emissão-exploração sofre dos tempos lentos da aquisição e das baixas relações do sinal-à-ruído devido à filtração necessária da excitação e da luz da emissão. Foi mostrado previamente que a imagem latente hiperespectrais da excitação-exploração reduz o tempo necessário da aquisição ao simultaneamente aumentar a relação sinal-à-ruído de dados adquiridos. Usando equipamentos comercialmente disponíveis, este protocolo descreve como montar, calibrar e usar um sistema de microscopia de imagem hiperespectral de varredura de excitação para a separação de sinais de várias fontes de fluorescência em uma única amostra. Quando altamente aplicável à imagem latente microscópica das pilhas e dos tecidos, esta técnica pode igualmente ser útil para qualquer tipo de experiência que utiliza a fluorescência em que é possível variar comprimentos de onda da excitação, incluindo mas não limitado a: imagem latente química, aplicações ambientais, cuidados com os olhos, ciência dos alimentos, ciência forense, ciência médica e mineralogia.

Introduction

A imagem latente espectral pode ser executada em uma variedade de maneiras e é referida por diversos termos1,2,3,4. Em geral, a imagem espectral refere-se aos dados adquiridos em pelo menos duas dimensões espaciais e uma dimensão espectral. A imagem latente Multispectral e hiperespectrais é distinguida o mais frequentemente pelo número de faixas do comprimento de onda ou se as faixas espectrais são contíguas1. Para esta aplicação, os dados hiperespectrais são definidos como os dados espectrais adquiridos com as faixas contíguas do comprimento de onda conseguidas pelo afastamento de comprimentos de onda Center não menos do que a metade da largura cheia no meio máximo (FWHM) de cada filtro do bandpass usado para a excitação (isto é, 5 nanômetro espaçamento de comprimento de onda Center para filtros de banda com larguras de banda 14-20 nm). A natureza contígua das bandas de dados permite um excesso de amostragem do conjunto, assegurando que os critérios de Nyquist são satisfeitos ao amostrando o domínio espectral.

A imagem latente Hyperspectral foi desenvolvida por NASA nos 1970s e nos 1980s conjuntamente com o primeiro satélite Landsat5,6. A coleta de dados de várias bandas espectrais contíguas permitiu a geração de um espectro de radiância de cada pixel. Identificar e definir o espectro de radiância de componentes individuais permitiu não só detectar materiais de superfície por seus espectros característicos, mas também permitiu a remoção de sinais intervenientes, como variações no sinal devido à condições atmosféricas. O conceito de detecção de materiais utilizando seus espectros característicos foi aplicado em sistemas biológicos em 1996 quando Schröck et al. utilizaram combinações de cinco diferentes fluoróforos e seus espectros conhecidos para distinguir os cromossomas rotulados em um processo denominado Karyotyping espectral7. Esta técnica foi elaborada em 2000 por Tsurui et al. para a imagem latente da fluorescência de amostras do tecido, usando sete tinturas fluorescentes e a decomposição singular do valor para conseguir a separação espectral de cada pixel em combinações lineares dos espectros na referência na biblioteca8. Semelhante a seus homólogos de sensoriamento remoto, a contribuição de cada fluoróforo conhecido pode ser calculada a partir da imagem hiperespectral, dada a priori informações do espectro de cada fluoróforo.

A imagem latente de Hyperspectral foi usada igualmente nas áreas daagricultura 9,astronomia 10, biomedicina11, imagem latente química12, aplicações ambientais13, cuidado14do olho, ciência de alimento15, ciência forense16,17, ciência médica18, mineralogia19e vigilância20. Uma limitação chave de sistemas de imagem latente hiperespectrais do microscópio de fluorescência atual é que a tecnologia de imagem latente hiperespectrais padrão isola sinais da fluorescência em bandas estreitas por 1) primeiramente filtrando a luz da excitação para controlar a excitação da amostra, a seguir 2) mais adicional que filtra a luz emitida para separar a emissão da fluorescência em faixas estreitas que podem mais tarde ser separadas matematicamente21. Filtrar a iluminação da excitação e a fluorescência emitida reduzem a quantidade de sinal disponível, que abaixa a relação sinal-à-ruído e necessita tempos de aquisição longos. O sinal baixo e os tempos longos da aquisição limitam a aplicabilidade da imagem latente hiperespectrais como uma ferramenta diagnóstica.

Uma modalidade da imagem latente foi desenvolvida que empreuse da imagem latente hiperespectrais mas impulsiona o sinal disponível, reduzindo desse modo o tempo necessário da aquisição21,22. Esta modalidade nova, chamada imagem latente hiperespectrais da excitação-exploração, adquire dados espectrais da imagem variando o comprimento de onda da excitação e coletando uma escala larga da luz emitida. Tem sido demonstrado anteriormente que esta técnica produz aumentos de ordem de magnitude na relação sinal/ruído em comparação com as técnicas de digitalização de emissões21,22. O aumento na relação sinal-ruído é em grande parte devido ao bandpass largo (~ 600 nanômetro) da luz de emissão detectada, quando a especificidade for fornecida filtrando somente a luz da excitação em vez da emissão da fluorescência. Isto permite que toda a luz emitida (para cada comprimento de onda da excitação) alcangue o detetor21. Adicionalmente, esta técnica pode ser usada para discriminar a autofluorescência de rótulos exógenos. Além disso, a capacidade de reduzir o tempo de aquisição devido ao aumento do sinal detectável reduz o perigo de fotobranqueamento, bem como permite varreduras espectrais a uma taxa de aquisição que é aceitável para imagens de vídeo espectral.

O objetivo deste protocolo é servir como um guia de aquisição de dados para a microscopia de imagem hiperespectral de varredura de excitação. Além disso, as descrições são incluídas que ajudam a entender o caminho de luz e hardware. Também é descrita a implementação de software de código aberto para um microscópio de imagem hiperespectral de varredura de excitação. Por fim, são fornecidas descrições sobre como calibrar o sistema para um padrão rastreável pelo NIST, ajustar as configurações de software e hardware para obter resultados precisos e desmisturar o sinal detectado em contribuições de componentes individuais.

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Protocol

1. dispositivo de set-up

  1. Fonte luminosa: selecione uma fonte luminosa espectral da largo-faixa com saída de poder superior e colimação elevada (uma lâmpada de arco de 300 W xe foi usada para estes estudos).
  2. Obturador (opcional): Adicione um obturador ao caminho óptico para reduzir o fotobranqueamento para imagens de lapso de tempo.
  3. Sistema ajustável do filtro: incorpore um conjunto de ajustamento mecânico e um filtro sintonizável da fino-película (TFTF) ajustado para permitir a escala comprimento de onda desejada da excitação (por exemplo, 360-485 nanômetro).
  4. Microscópio: Use um microscópio de fluorescência invertido, incluindo uma torre de filtro dichroic motorizado e controlador.
    1. Cubo do filtro da fluorescência: Monte um cubo do filtro da fluorescência da longo-passagem. Para obter melhores resultados, escolha um espelho dicróico e filtro de emissão de passagem longa no mesmo comprimento de onda para obter a separação ideal da excitação da luz de emissão (por exemplo, 495 nm).
    2. Objetivo: usar um objetivo apocromático adequado para garantir o foco uniforme sobre a faixa de comprimento de onda utilizada para o experimento (um objetivo de água de 60x foi utilizado para este estudo).
    3. Estágio automatizado (opcional): Use um estágio automatizado para amostragem rápida de vários campos de visão e/ou campos muito grandes através da costura da imagem. Calibre o palco com o objetivo e a câmera.
  5. Câmera: selecione uma câmera apropriada para atingir os requisitos de resolução espacial, sensibilidade e ruído do experimento (este sistema utilizou uma câmera sCMOS de alta sensibilidade).

2. software de aquisição

  1. Escolha um pacote de software que permita o controle independente de cada componente de hardware, como o micro-gerente.
    1. Criando o arquivo de configuração: o arquivo de configuração é um conjunto de instrumentos e instruções salvos que o micro-Manager carregará para operar o hardware do sistema. Para criar um arquivo de configuração, clique em ferramentas ≫ assistente de configuração de hardware.
      1. Na etapa 1, clique em criar nova configuração ≫ avançar para continuar. Observe que o usuário pode optar por modificar ou explorar a configuração existente se um já estiver disponível.
      2. Na etapa 2, procure a lista de dispositivos disponíveis para encontrar os dispositivos para controlar através do micro-gerente, tal como o microscópio, a lâmpada, o estágio, o obturador, e a câmera. Quando realçado, clique no Add... para adicionar o dispositivo à lista de dispositivos instalados. Isso abrirá uma nova janela.
        1. Designe o rótulo do dispositivo na caixa rótulo . (por exemplo, câmera sCMOS)
        2. Em valor, selecione a porta com apropriada para cada dispositivo. Isso fará com que uma lista de propriedades do dispositivo apareça na parte inferior da janela.
        3. Deixe as propriedades do dispositivo em suas configurações padrão. Observe que os valores personalizados para cada propriedade de dispositivo podem ser inseridos conforme desejado.
        4. Quando cada dispositivo é adicionado, clique no botão Avançar para continuar para a próxima etapa. Observe que, se todos os dispositivos forem deixados de fora ou precisarem ser alterados, o arquivo de configuração poderá ser modificado posteriormente, conforme descrito na etapa 2.1.1.1.
      3. Na etapa 3, use os menus suspensas para selecionar a câmera padrão, o obturador e o estágio de foco. Se o obturador automático for desejado, clique na caixa de seleção abaixo da lista suspensa do estágio de foco. Se a direção do foco do estágio Z for conhecida, selecione-a na lista suspensa em direções de foco do estágio (avançado). Caso contrário, deixe o padrão como desconhecido.
      4. Na etapa 4, clique duas vezes nas caixas o cabeçalho delay [MS] para definir atrasos associados aos dispositivos automatizados, como atrasos de 100 ms para a lâmpada, estágio e obturador, e um atraso de 250 MS para comandos para o conjunto de ajuste mecânico para dar conta do tempo de comutação mecânica entre os filtros.
      5. Na etapa 5, atribua rótulos para os dispositivos de estado. A configuração para o sistema do microscópio da excitação-exploração usa etiquetas no bloco de filtro para identificar cada cubo do filtro da fluorescência (por exemplo, o estado 0 corresponde à etiqueta brilhante, o cubo vazio do filtro usado durante a imagem latente do brilhante-campo; enquanto Estado 3 corresponde ao rótulo 495 nm e personalizado 495 nm dichroic filtro cubo usado para separar a excitação e emissão de luz em 495 nm). As etiquetas são usadas igualmente no conjunto de ajustamento mecânico para armazenar os comandos de comutação para cada comprimento de onda da excitação (por exemplo, o estado 0 corresponde ao comando de ajustamento do comprimento de onda da excitação de 340 nanômetro para o conjunto de ajustamento mecânico).
      6. Na etapa 6, clique no botão procurar ao lado da caixa arquivo de configuração para escolher um local de salvamento e o nome do arquivo para o arquivo de configuração. Clique em concluir para salvar o arquivo de configuração.
    2. Grupos de inicialização e predefinições: o micro-Manager pode armazenar diferentes grupos dentro de cada arquivo de configuração para ativar ou alterar um subconjunto do hardware. Por exemplo, um grupo de "inicialização do sistema" e uma combinação predefinida armazenarão as configurações padrão, como o tamanho de binning e as taxas de leitura para a câmera.
      1. Crie um grupo (por exemplo, sistema) clicando em + na janela principal da subseção de grupo .
      2. Verificar qualquer uso no grupo? caixas dentro do grupo que exigirá um valor padrão a ser definido (por exemplo, binning na câmera padrão associada).
      3. Crie uma nova predefinição (por exemplo, "Startup") clicando em + na janela principal da subseção preset .
      4. Cada caixa marcada na etapa 2 aparecerá como uma opção predefinida aqui. Escolha um valor padrão a ser carregado para cada caixa marcada.
    3. Grupo e presets para comprimentos de onda de excitação: micro-Manager trata cada comprimento de onda de excitação como seu próprio canal com ele seu próprio comando de comutação de comprimento de onda; Portanto, cada um deve ser salvo como sua própria predefinição.
      1. Criar um novo grupo para conter um conjunto de comprimentos de onda de excitação desejados (por exemplo, "495 nm dichroic")
      2. Verifique o uso em grupo? Box denominado Label correspondente ao dispositivo VF-5.
      3. Crie uma nova predefinição nomeada para cada comprimento de onda de excitação (por exemplo, "340 nm").
      4. Atribua a cada predefinição o nome de propriedade apropriado e o valor predefinido (por exemplo, o nome da propriedade: "Label"; valor predefinido: "340 nm").
    4. Multi-dimensional ferramenta de aquisição: cliqueMulti-D ACQ.perto do canto superior esquerdo da janela do micro-Manager para abrir uma ferramenta personalizável para usar para capturar uma imagem da amostra em cada comprimento de onda de excitação com o clique de um único botão. Existem várias opções de personalização para construir a aquisição exatamente como desejado.
      1. Timepoints (não usados neste exemplo): para estudos sem componente de lapso de tempo, deixe a caixa desmarcada. Se os estudos de lapso de tempo forem desejados, marque esta caixa. Se marcada, insira o número de vezes para executar o restante das configurações de aquisição na caixa número . Defina o tempo entre aquisições sucessivas inserindo a duração na caixa intervalo e escolha a unidade adequada (milissegundos, segundos ou minutos; geralmente segundos).
      2. Múltiplas posições (XY; não utilizadas neste exemplo): para estudos de uma única posição XY, deixe a caixa desmarcada. Se várias posições XY forem desejadas, marque a caixa e clique no botão Editar lista de posição para abrir uma janela separada. Mova o palco para cada local desejado e clique no botão Marcar para salvar essa posição no software. Repita até que todas as posições XY desejadas estejam marcadas. Feche esta janela para continuar.
      3. Z-Stacks (slides; não usado neste exemplo): para estudos de uma única posição Z, deixe a caixa desmarcada. Se forem desejadas várias posições Z, marque a caixa. Mova o palco para a posição Z inicial desejada e clique no botão set ao lado da caixa z-Start . Mova o palco para a posição Z final desejada e clique no botão set ao lado da caixa z-end . Insira o tamanho da etapa desejada (em mícrons) na caixa Z-Step .
      4. Canais: Verifique se a caixa de canais está marcada. Aqui, os canais são os nomes dados aos comprimentos de onda individuais da excitação. Os "canais" disponíveis correspondem aos "grupos" descritos nas etapas 2.1.2 e 2.1.3.
        1. Grupo: clique na lista suspensa para selecionar um grupo do qual escolher os comprimentos de onda de excitação disponíveis (por exemplo, 495 nm dichroic).
        2. Clique na caixa manter obturador aberto para manter o obturador aberto entre aquisições para cada canal. Note que o obturador ainda vai fechar entre sucessivas varreduras espectrais se esta caixa estiver marcada, assumindo que a opção de obturador automático também é selecionada na janela principal.
      5. Clique no botão novo para adicionar canais à lista de aquisições. Tenha em atenção que o botão remover pode ser utilizado para remover quaisquer canais já não desejados e que para cima e para baixo pode ser utilizado para reordenar qualquer canal seleccionado.
        1. Assegure-se de que o uso? CheckBox esteja selecionado para cada comprimento de onda desejado na varredura espectral.
        2. Configuração: clique na lista suspensa em configuração e escolha o primeiro comprimento de onda na faixa espectral desejada (por exemplo, 340 nm).
        3. Exposição: clique duas vezes na caixa exposição e insira o tempo de exposição desejado para o comprimento de onda selecionado (por exemplo, 100 para 100 ms). Consulte a seção 5 ("aquisição de dados") para obter sugestões para selecionar os tempos de exposição apropriados.
        4. Z-offset (não aplicável em uma varredura espectral): Deixe esta caixa em branco (em 0) ao executar uma varredura espectral.
        5. Z-Stack: Assegure-se de que esta caixa esteja marcada para cada comprimento de onda na escala espectral se realizando uma Z-pilha.
        6. Skip fr. (não aplicável em uma varredura espectral): Deixe esta caixa em branco (em 0) ao realizar uma varredura espectral. Note-se que pode ser útil para pular seletivamente quadros no caso em que um ou poucos comprimentos de onda de excitação são significativamente mais poderosos do que outros ou se os comprimentos de onda de excitação individual revelar-se especialmente fototóxico.
        7. Cor: Deixe esta caixa em branco ao realizar uma varredura espectral. Observe que as cores podem ser escolhidas para faixas de comprimento de onda individuais para fins de visualização de dados, mas a cor é inadequada para unmixing espectral subsequente.
        8. Repita estas etapas até que cada comprimento de onda desejado da excitação dentro da escala espectral dada da exploração seja adicionado.
      6. Ordem de aquisição: clique na lista suspensa para escolher em qual ordem as opções acima (2.1.4.1-2.1.4.5) serão executadas. Para varreduras espectrais como a mostrada aqui, a ordem de aquisição é simplesmente Channel. Observe que as opções adicionais aparecem como caixas adicionais são verificadas dentro da ferramenta multi-dimensional Acquisition [pontos de tempo, múltiplas posições (XY) e Z-Stacks (fatias)] e permitem a escolha de qualquer posição ou tempo primeiro, seguido de uma fatia ou Canal.
      7. Autofocus (não usado neste exemplo): se várias posições (XY) estiver selecionada, vários estilos diferentes de autofocusing estão disponíveis. Clique no botão Opções e selecione um método de autofoco na lista suspensa ao lado do botão fechar .
      8. Resumo: revise esta janela para obter um resumo do número de pontos de tempo, posições XY, fatias Z, canais, número total de imagens, memória total, duração da digitalização e ordem de aquisição para garantir que as informações listadas coincida com as configurações de aquisição esperadas.
      9. Salvar imagens: Assegure-se de que esta caixa esteja marcada para salvar os dados coletados por meio da ferramenta multi-dimensional Acquisition.
        1. Clique no... botão ao lado da raiz do diretório para escolher uma raiz de diretório na qual os arquivos serão salvos. Nomeie a raiz do diretório de forma que descreva detalhes relevantes da experiência (por exemplo, células musculares lisas da via aérea GCaMP).
        2. Insira um nome na caixa ao lado de prefixo de nome que descreve a aquisição de imagem atual (por exemplo, FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). É aconselhável criar um prefixo de nome que identifique o campo de visão e o tempo de exposição, bem como outras informações relevantes, como o objeto e o filtro dicróico usado. Observe que a primeira pilha de imagem tirada usando essas configurações será salva com "_ 1" após o prefixo de nome. Qualquer pilha subseqüente tomada com o mesmo diretório raiz e prefixo de nome será salvo com "_ n", no qual "n" é o número de vezes que uma pilha foi tomada com esse nome no diretório.
        3. Clique em separar arquivos de imagem para garantir que a imagem gerada em cada comprimento de onda de excitação seja salva.
      10. Salvar como: clique no botão salvar como... perto do canto superior direito da ferramenta multi-dimensional Acquisition para salvar essas configurações de aquisição para uso futuro fácil. Observe que os prefixos de raiz e nome do diretório também serão salvos.
      11. Adquira: finalmente, clique no adquirir! para começar a adquirir imagens de acordo com as configurações de aquisição escolhidas acima.

3. correção de resposta espectral (opcional):

  1. A correção da saída espectral pode ser executada para calibrar a resposta espectral do sistema a um padrão conhecido, tal como uma lâmpada NIST-traceable ou o outro padrão ou instrumento NIST-traceable. Esta etapa é especialmente importante se os resultados são comparados com outros instrumentos de imagem espectral, espectrómetros, ou entre diferentes laboratórios. Este processo foi relatado em detalhe anteriormente21,23.
    1. Use um espectrómetro calibrado para uma fonte de luz rastreável pelo NIST (como LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) ou outro padrão NIST-traceable para adquirir o poder espectrorradiométrico da iluminação, conforme medido na fase de amostragem. Realize uma correção separada para cada combinação de configuração de fonte de luz, espelho dicróico e objetivo. Use uma esfera de integração acoplada ao espectrómetro para medir exatamente a iluminação do grande-ângulo do objetivo do microscópio.
    2. Use um método de integração, tal como a régua trapezoidal, para integrar os dados spectroradiometric sobre comprimentos de onda iluminados. Uma largura de banda de 40 nm para integração centrada em torno do comprimento de onda Center é suficiente para a maioria dos filtros que têm uma largura de banda nominal entre 14-20 nm de largura total ao meio-máximo (FWHM). O valor integrado representa a intensidade da iluminação espectral em cada faixa do comprimento de onda da excitação.
    3. Plotar a intensidade integrada de cada faixa de comprimento de onda como uma função de comprimento de onda centro de excitação para permitir a visualização do perfil de intensidade de iluminação espectral.
    4. Determine a faixa de comprimento de onda com a menor intensidade integrada.
    5. Normalize o perfil de intensidade da iluminação espectral dividindo a intensidade integrada mais baixa pela intensidade integrada de cada faixa de comprimento de onda para gerar um fator de correção dependente do comprimento de onda.

4. preparação da amostra

  1. Prepare uma amostra "em branco" (por exemplo, coloque uma lamínula de vidro na câmara celular e adicione 1 mL de tampão). Esse buffer foi descrito anteriormente24.
  2. Prepare uma amostra sem rótulo para determinar qualquer autofluorescência de amostra (por exemplo, coloque uma lamínula de vidro contendo células musculares lisas de vias aéreas sem rótulo25,26 na câmara celular e adicione 1 ml de tampão).
  3. Prepare uma amostra separada e com rótulo único para cada rótulo fluorescente usado no experimento da seguinte maneira:
    1. Adicione a etiqueta mitochondrial diluída ao amortecedor para conseguir uma concentração de 100 nanômetro. Adicione este tampão ao lamela que contem pilhas de músculo lisas da via aérea. Incubar por 20 min a 20-25 ° c. Mova a lamínula para a câmara da célula e adicione 1 mL de tampão. Observe que a concentração ideal de rótulo mitocondrial variará por fatores como fabricante, cor associada e especificidade desejada.
    2. Mova uma lamínula contendo células musculares lisas das vias aéreas transfectadas com a sonda GCaMP27 para a câmara celular e adicione 1 ml de tampão.
  4. Prepare uma ou mais amostras experimentais contendo uma mistura das etiquetas fluorescentes desejadas.
    1. Adicionar 1 mL de tampão (concentração de 100 nM de rótulo mitocondrial) a uma lamínula contendo células musculares lisas das vias aéreas transfectadas com a sonda GCaMP e incubar por 20 min a 20-25 ° c. Mova a lamínula para a câmara da célula e adicione 1 mL de tampão.

5. aquisição de dados:

  1. Verifique se o divisor de refletores dicróico adequado (por exemplo, cubo de filtro dichroic 495 nm), objetivo (por exemplo, objetivo de água 60x) e câmera (câmera scmos) são selecionados.
  2. Carregue a amostra no palco.
  3. Clique duas vezes na caixa ao lado de Exposure [MS] e digite "100" para definir o tempo de exposição em 100 ms. Observe que o tempo de exposição pode precisar ser aumentado ou diminuído dependendo da intensidade da fluorescência da amostra.
  4. Selecione 475 nm no menu suspenso da janela principal do micro-Manager para visualizar a amostra inicial. Observe que 475 nm pode não ser o comprimento de onda ideal para visualização de amostra ou determinar se a sobresaturação ocorrerá em toda a pilha de imagens.
  5. Clique em Live para ver o exemplo.
    1. Clique no botão automático da faixa de visualização de intensidade automática ao lado do histograma na parte inferior da janela para trazer os valores mínimos e máximos para intervalos visuais significativos.
  6. Use os botões de foco do microscópio para focar na amostra. Muitas vezes é útil encontrar a borda da amostra para ajudar na focagem. O exemplo será focado quando os recursos de aresta na imagem pareceram nítidos. Note que pode ser necessário clicar no botão automático várias vezes durante a focagem para ajudar na visualização da imagem de fluorescência. Além disso, alguns usuários podem achar mais fácil se concentrar na amostra se o microscópio estiver no modo de transmissão.
    1. Se se concentrar no modo de transmissão, para a segurança, primeiro assegure-se de que a fonte luminosa espectral não esteja transmitindo a luz às oculares antes de ajustar o trajeto claro para a imagem latente da transmissão. Observe também que pode haver pequenos desvios entre o foco das imagens de transmissão e fluorescência. Quando o foco aceitável foi conseguido, reconfigure o trajeto claro para a imagem latente espectral da fluorescência.
  7. Clique no ACQ multi-D. próximo à parte superior esquerda da janela para abrir a ferramenta multi-dimensional Acquisition (descrita e configurada na seção 2).
  8. Escolha um intervalo espectral apropriado para aquisição espectral (por exemplo, 360-485 nm para o filtro dichroic 495 nm) clicando no botão Load... no canto superior direito da janela da ferramenta multi-dimensional Acquisition e navegando até as configurações de excitação salvos anteriormente (na etapa 2.1.4.10). Veja a discussão para a informação a respeito das escalas espectrais apropriadas.
  9. Adquira um fundo/imagem em branco que não contenha dados de fluorescência a serem usado para a subtração de fundo e ruído. Isso pode ser executado usando um exemplo em branco (etapa 4,1) ou navegando para uma região em branco de uma amostra experimental. Conforme descrito na etapa 5,6, isso é mais facilmente conseguido encontrando a borda da amostra, em seguida, posicionando-a para que a aresta seja centralizada dentro do campo de visão.
    1. Uma vez que as configurações de aquisição são confirmadas e uma região de fundo é visível, clique no botão adquirir! para adquirir uma pilha de imagens espectrais contendo fundo e ruído para usar para subtração mais tarde. Deve notar-se que as amostras são susceptíveis de ter fluorescência mais intensa longe da borda da amostra. Pode ser aconselhável mover-se sobre a amostra para encontrar as regiões "mais brilhantes" e executar várias pilhas de imagens de teste para determinar os tempos de aquisição apropriados e evitar a superexposição.
  10. Pegue uma única pilha de imagem em uma região da amostra que parece ter fluorescência intensa para garantir que nenhuma combinação de comprimentos de onda e que os tempos de exposição resultam em superexposição.
  11. Use o ImageJ para confirmar que nenhum comprimento de onda contenha pixels superexpostos.
    1. No ImageJ, clique em arquivo ≫ importar ≫ sequência de imagem e navegue até a pasta que contém as imagens espectrais tiradas na etapa 5,10. Isso abrirá uma nova janela. Clique na caixa ao lado do número de imagens e insira o número de comprimentos de onda incluídos na varredura espectral (por exemplo, 26). Deixar a imagem inicial e incrementar como "1". Clique no botão OK para continuar.
    2. Pressione M no teclado para utilizar a função de medida do ImageJ. Assegure-se de que o número listado em máx não seja o limite de detecção superior da câmera (por exemplo, 65.535). Repita para cada imagem na varredura espectral. Observe que o limite de detecção da câmera depende da própria câmera. O limite superior é exibido na parte superior direita do histograma na janela principal do MicroManager. Alternativamente, o limite superior pode ser determinado abrindo uma imagem no ImageJ e navegando até image ≫ ajustar ≫ brilho/contraste. Clique no botão definir na janela pop-up resultante, insira um valor excessivamente grande (por exemplo, 999.999) no espaço em branco ao lado do valor máximo exibidoe clique em OK para continuar. O valor máximo exibido no novo histograma deve ser o limite de detecção superior da câmera.
    3. Se todas as imagens continham o limite superior de detecção da câmera (por exemplo, 65.535), ajuste o tempo de exposição da varredura espectral para garantir que o sinal máximo em toda a faixa espectral não exceda o alcance dinâmico da câmera.
  12. Adquira dados de imagens espectrais de amostras não rotuladas para determinar qualquer autofluorescência. Adquira a verificação para as amostras sem rótulo usando uma faixa de comprimento de onda idêntica e as configurações da câmera como o restante do experimento (por exemplo, 360-485 nm em 100 ms por comprimento de onda).
  13. Adquira dados de imagens espectrais de amostras com rótulo único para usar como controles espectrais para construir a biblioteca espectral. Realize a verificação para cada etiqueta usando uma faixa de comprimento de onda idêntica, tempo de exposição e configurações da câmera. Note que um tempo de aquisição mais longo pode ser necessário para algumas amostras para permitir a deteção exata do espectro da etiqueta com contribuição mínima do ruído.
  14. Realize medições em uma amostra experimental (por exemplo, células musculares lisas das vias aéreas humanas com sonda GCaMP e rótulo mitocondrial).
    1. Coloque um slide ou uma lamínula contendo a amostra experimental no microscópio.
    2. Selecione um campo de visão com células de tecidos apropriadamente rotuladas.
    3. Adquira os dados da imagem espectral usando as configurações de aquisição desejadas, conforme descrito acima.

6. análise de imagem

  1. Corrija as imagens para uma resposta espectral plana.
    1. Subtrair o espectro de fundo obtido na seção 5,9 e multiplicar pelo coeficiente de correção determinado na seção 3.1.5. Isso pode ser feito com um script MATLAB simples ou uma rotina ImageJ. Um código MATLAB de subtração/correção (usado neste exemplo) está disponível no site da University of South Alabama BioImaging Resources.
      1. Carregue o código de subtração/correção no MATLAB.
      2. Na guia EDITOR, clique em executar. Isso abrirá uma nova janela contendo um botão de correção BSQ . Clique no botão correção de BSQ para abrir outra janela que contenha opções para o diretório de trabalho, arquivo de fundo, arquivo de fator de correção e pasta TIFF não corrigida.
        1. Use o Browse... botão ao lado de diretório de trabalho para escolher o caminho do arquivo onde as janelas subseqüentes serão abertas. Navegue até a pasta que contém o espectro de plano de fundo salvo (no formato. dat).
        2. Use o Browse... botão ao lado de arquivo de fundo (. dat) para abrir o diretório escolhido na etapa 6.1.1.2.1 e escolher o arquivo de fundo desejado (no formato. dat). Clique no botão abrir para continuar.
        3. Use o botão Browse... ao lado de fator de correção (. dat) para escolher um fator de correção. O diretório para o fator de correção assume como padrão o local do código MATLAB pai. Se necessário, navegue até a subpasta que contém o arquivo de fator de correção (no formato. dat). Realce o arquivo de fator de correção adequado e clique no botão abrir para continuar.
        4. Use o botão Browse... ao lado da pasta TIFF não corrigida para abrir o diretório escolhido na etapa 6.1.1.2.1 e escolha a pasta para a subtração de fundo e correção de imagem (esta é geralmente a pasta Pos0 que contém imediatamente o RAW imagens espectrais). Clique no botão abrir para continuar.
        5. Clique no botão clique para correção espectral . Após a conclusão do processamento, uma janela será aberta com a mensagem "BSQ Correction Complete". Clique no botão OK para continuar. As imagens de correção são armazenadas em uma nova pasta com o nome da pasta de imagens espectrais RAW original e um adicional "_ corrigido" (por exemplo, Pos0_Corrected).
  2. Gere a biblioteca espectral. Vários pacotes de software podem ser usados para extrair dados espectrais de imagens, incluindo o ImageJ. Para obter melhores resultados, normalizar cada EndMember para a faixa de comprimento de onda de maior intensidade, determinando qual faixa de comprimento de onda tem o valor mais intenso e dividindo a medição em cada faixa de comprimento de onda por esse valor máximo. Também deve ser notado que os controles de rótulo único gerados dentro de amostras autofluorescentes precisarão de modificações adicionais28,29,30,31,32. Consulte a etapa 6.2.4 e discussão para obter detalhes.
    1. No ImageJ, clique em arquivo ≫ importar ≫ sequência de imagens. Isso abrirá uma nova janela. Navegue até a pasta que contém as imagens espectrais corrigidas. Clique duas vezes em qualquer arquivo de imagem na pasta para abrir uma nova janela. Clique na caixa ao lado do número de imagens e insira o número de comprimentos de onda incluídos na varredura espectral (por exemplo, 26). Deixe a imagem inicial e incrementar como "1". Clique no botão OK para continuar.
    2. Na janela principal do ImageJ, clique no ícone de seleções de polígono e, em seguida, use o ponteiro do mouse clicando na imagem para criar um polígono ao redor de uma região que contenha dados de fluorescência. Note que pode haver pouco ou nenhum dados de fluorescência no comprimento de onda inicial. Navegue até outra imagem de comprimento de onda e/ou use a ferramenta de brilho/contraste (imagem ≫ ajustar ≫ brilho/contraste ≫ auto) para visualizar melhor as regiões que contêm dados de fluorescência de interesse.
    3. Com o polígono desenhado, gere o perfil do eixo Z clicando em imagem ≫ Stacks ≫ traçar o perfil do eixo z. Isso abrirá uma nova janela. Clique em salvar para salvar os dados espectrais como um arquivo. csv.
    4. Realize uma subtração para garantir uma biblioteca espectral adequada com rótulos puros desprovidos de contaminação por autofluorescência. Use a seguinte equação29 para isolar um espectro puro da mistura de um único rótulo e fluorescência:
      Equation 11
      Onde: spuro é o espectro puro da etiqueta, smisturado é o espectro medido da amostra contaminada com autofluorescência, s autofl é o espectro de autofluorescência medido, "a" é um escalar multiplicador do espectro de autofluorescência (entre 0 e 1; por exemplo, 0,4), e "offset" é um offset (geralmente 0). Varie o termo "a" até que um valor próximo de zero seja atingido para a contribuição aparente da autofluorescência. Informações adicionais podem ser encontradas em várias publicações28, 29,30,31,32.
  3. Desmisture os dados da imagem espectral. A etapa de separação gerará uma imagem da abundância para cada etiqueta fluorescente, onde a abundância é a quantidade de sinal relativo da fluorescência na imagem da etiqueta respectiva. Vários algoritmos de separação estão disponíveis para uso com ImageJ33,34,35. Além disso, um código MATLAB de separação espectral (usado neste exemplo) está disponível no site da University of South Alabama BioImaging Resources. Uma visão geral mais abrangente de separação espectral está disponível36.
    1. Carregue o código de separação espectral no MATLAB.
    2. Edite os arquivos de comprimento de onda. Mat e library. Mat para corresponder às condições experimentais (por exemplo, "comprimento de onda" como 360-485 em incrementos de cinco).
      Nota: os valores correspondentes para esses comprimentos de onda devem ser carregados em "biblioteca" para cada rótulo fluorescente (e autofluorescência). Endmember_Name deve listar os rótulos na mesma ordem que os valores de coluna de "biblioteca". Observe que o arquivo library. Mat deve conter as variáveis "library" e "Endmember_Name".
    3. Na guia EDITOR, clique em executar. Isso abrirá uma nova janela permitindo que o usuário escolha um diretório. Navegue até a pasta que contém as imagens espectrais para ser Unmixed. Uma vez selecionado, isso abrirá uma nova janela.
    4. Nos espaços em branco resultantes, insira o nome da imagem (por exemplo, HASMC com GCaMP e mito FOV1), número de faixas de comprimento de onda (por exemplo, 26), número de pontos temporais (por exemplo, 1) e se uma medida FRET é desejada (por exemplo, n) em seus respectivos espaços em branco. Se "n" for selecionado para FRET, deixe ambos os espaços em branco do membro final vazios. Pressione OK para continuar, que abrirá uma nova janela.
    5. Naviagate para a pasta que contém o arquivo de comprimento de onda. Mat. Uma vez selecionado, clique em abrir para continuar, que abrirá uma nova janela.
    6. Navegue até a pasta que contém o arquivo library. Mat. Uma vez selecionado, clique em abrir para continuar, que salvará as imagens não misturadas em uma nova pasta "Unmixed" dentro do diretório que contém as imagens espectrais.
  4. Inspecione as imagens espectrais não misturadas para a qualidade.
    1. Abra cada imagem não misturada para inspecionar visualmente a distribuição de componentes puros.
      1. Compare a magnitude da imagem de erro com as imagens não misturadas (semelhante à etapa 5,11, isso pode ser feito através da função Measure do ImageJ). Se a magnitude da imagem de erro for semelhante em magnitude às imagens de abundância não misturadas, é provável que existam sinais nos dados de imagem espectral que não são contabilizados com precisão pela biblioteca espectral e pelo processo de separação espectral linear.
      2. Compare a imagem de erro com as imagens não misturadas para ver se existem estruturas residuais não identificadas.

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Representative Results

Várias etapas importantes deste protocolo são necessárias para garantir a coleta de dados que são precisos e desprovidos de imagens e artefatos espectrais. Pular essas etapas pode resultar em dados que parecem significativos, mas não podem ser verificados ou reproduzidos com qualquer outro sistema de imagens espectrais, anulando assim efetivamente quaisquer conclusões feitas com esses dados. O chefe entre estas etapas importantes é a correção de saída espectral adequada (seção 3). O fator de correção compensa as variações dependentes de comprimento de onda na saída espectral do sistema de excitação sintonável. Isto é conseguido escalando comprimentos de onda com excitação do poder superior tais que o poder ótico da iluminação é comparável aos comprimentos de onda com uma excitação da baixa potência, conseguindo um perfil espectral liso da excitação. Um exemplo de um fator de correção inadequado é aquele que contém valores muito baixos (por exemplo, < 0,001) em um ou mais comprimentos de onda, indicando que os valores de intensidade medidos nesses comprimentos de onda devem ser grandemente atenuados para atingir uma resposta espectral plana.

A calibração do sistema a um padrão NIST-traceable assegura-se de que os dados recolhidos com o sistema espectral da imagem latente da excitação-exploração sejam comparáveis a outros sistemas calibrados igualmente aos padrões NIST-traceable. Portanto, é imperativo garantir que qualquer fator de correção ajusta os dados coletados apropriadamente. A exatidão de um fator da correção pode ser verificada com o uso de um padrão da fluorescência, tal como o NIST-traceable Fluorescein. A Figura 1 ilustra um fator de correção apropriado e inadequado, visualizado por meio de dados gráficos e de imagem. Neste caso, a saída espectral em 340 nanômetro era virtualmente inexistente comparada ao descanso da escala espectral, tendo por resultado um valor Near-zero (< 0.001) para virtualmente cada comprimento de onda. Aplicado à pilha de imagens, isso resulta em valores de near-zero por meio da maioria da pilha de imagens para a maioria dos pixels.

Conforme indicado na seção 5, a faixa de excitação, os fluoróforos selecionados e as configurações de aquisição podem criar o potencial que uma ou muitas bandas de imagem de comprimento de onda de excitação contenham pixels saturados. A Figura 2 ilustra um exemplo no qual o tempo de exposição foi definido por muito tempo para vários dos comprimentos de onda de excitação, fazendo com que as imagens subsequentes contenham pixels saturados. Isso é importante notar porque, como mostra a figura, tanto as imagens individuais e as imagens de cor falsa podem visualmente parecem estar dentro de intervalos de intensidade aceitáveis.

A seleção apropriada de uma região de fundo para subtração também é importante para comparação de dados entre sistemas, pois remove elementos de ruído da câmera ou luz perdida antes da correção espectral rastreável pelo NIST (Figura 3). Muitas vezes, é útil para o processamento de imagem subseqüente e etapas de análise de dados para gerar uma imagem de cor falsa RGB da pilha de imagens espectrais, a fim de visualizar as características espectrais dentro da imagem. A Figura 4 mostra uma imagem de cor falsa RGB gerada pela mesclagem de três faixas de comprimento de onda selecionadas (370 nm = azul, 420 nm = verde, 470 nm = vermelho).

A separação espectral exige o conhecimento do perfil espectral de cada fonte de fluorescência individual. No caso de imagem hiperespectral de excitação-digitalização, isso é feito através da aquisição de pilhas de imagens de espectro para cada fluoróforo (e autofluorescência). A Figura 5 é incluída como um exemplo para escolher regiões de controles de rótulo único para gerar uma biblioteca espectral. Deve-se notar que cada medição foi normalizada para o seu pico de comprimento de onda.

Quando executado corretamente, o processo de separação espectral permite a separação de uma pilha espectral da imagem em contribuições respectivas de cada etiqueta da fluorescência. A Figura 6 mostra um exemplo de imagem espectral não misturada, com imagens individuais para cada um dos seguintes sinais: autofluorescência das células musculares lisas das vias aéreas, uma sonda gcamp e uma etiqueta mitocondrial. O erro associado à separação espectral também é mostrado e pode ser examinado para comparar os níveis de intensidade do erro com os dos sinais não misturados. O cálculo e a interpretação deste erro foram discutidos previamente37. Como mostrado na Figura 6, há um alto erro associado às regiões nuclear e perinuclear das células, indicando que os espectros medidos dessas regiões não são bem contabilizados pelos espectros da biblioteca espectral. Uma potencial fonte de erro pode ser que os controles de rótulo único para GCaMP e o rótulo mitocondrial foram preparados usando células musculares lisas das vias aéreas, que têm uma autofluorescência nativa alta. Daqui, o GCaMP e a etiqueta mitochondrial não podem representar espectros puros do EndMember. Além disso, o sinal de autofluorescência pode influenciar os espectros de biblioteca para os outros dois rótulos de uma forma que não foi devidamente contabilizada, resultando em um encaixe menos preciso do que se os rótulos tivessem sido adquiridos usando uma linha celular com pouco ou nenhum autofluorescence. Além disso, exemplos são incluídos para quando muito poucos ou muitos componentes de uma biblioteca espectral estão disponíveis, resultando em underfitting e overfitting dos dados da imagem espectral, respectivamente (Figura 6, figura 7, Figura 8, Figura 9e tabela 1).

Como observado na seção 6,2 e especificamente passo 6.2.4, espectros "puros" recolhidos a partir de células rotuladas que também são autofluorescentes provavelmente irá contaminar o perfil espectral para o componente puro. Como tal, deve-se tomar cuidado para separar os espectros puros dos rótulos de interesse de seus hospedeiros autofluorescentes. A Figura 10 mostra a diferença de separação com espectros "puros" contaminados com autofluorescência (mista) versus espectros puros calculados pelo método descrito na etapa 6.2.4. A diferença ocorre principalmente na desmistura do sinal de autofluorescência. Sem a separação apropriada do sinal (por exemplo, subtração da contaminação do autofluorescence do espectro de GCaMP), os componentes da biblioteca do autofluorescence e do GCaMP competem para os mesmos dados espectrais em cada pixel, tendo por resultado furos característicos ou manchas escuras na imagem de autofluorescência.

Figure 1
Figura 1 : Exemplos de aplicações de fatores de correção inadequados e apropriados usados para corrigir imagens para uma resposta espectral plana. (A) fatores de correção inadequados e apropriados plotados. (B) uma imagem RGB gerada com o uso do fator de correção inadequado em (a). (C) uma imagem RGB gerada com o mesmo campo de visão que (B), excepto com a utilização de um factor de correcção adequado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Exemplos que ilustram a importância das configurações de aquisição apropriadas. (A, B) Imagens RGB geradas por um tempo de aquisição apropriado (A, 100 ms) versus o mesmo campo de visão com um tempo de aquisição saturante (B, 500 MS). Deve-se notar que as imagens RGB aparecem idênticas quando de cor falsa. (C) a região de interesse selecionada para levantamento de valores de intensidade das regiões mais intensas de (a) e (B). (D) valores de intensidade plotados por comprimento de onda da imagem do tempo de exposição de 100 ms (a, linha preta) e tempo de exposição de 500 MS (B, linha vermelha). Deve-se notar que intensidades de pixel para o tempo de exposição de 500 MS atingiram o limite da faixa dinâmica do detector (65.535 UA) em 370 nm e não diminuem até 525 nm, resultando em artefato espectral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Seleção de uma região de interesse para subtração de fundo. (A) uma imagem de intensidade de comprimento de onda, crua e somada. (B) regiões da imagem selecionada para determinar o espectro de fundo com média de pixel para a subtração de fundo mostrada em vermelho. (C) a imagem de intensidade de fundo-subtraída, corrigida e somada. (D) uma coloração RGB da imagem corrigida (C). O processo de geração de uma imagem de cor falsa RGB é mostrado na Figura 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Processo de geração de uma imagem de cor falsa RGB. (A-C) Três faixas de comprimento de onda espaçadas uniformemente ao longo da faixa de aquisição espectral foram selecionadas para coloração falsa (azul = 370 nm, verde = 420 nm, vermelho = 470 nm). (D) a imagem de intensidade somada gerada pela adição de intensidades de pixel de todas as faixas de comprimento de onda no cubo de imagem. (E-G) As imagens em painéis (A-C) com suas respectivas tabelas de look-up de falsa cor aplicadas. (H) a imagem resultante mesclada de (E-G). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Seleção de região de controles de rótulo único para geração de biblioteca espectral. (A) imagem de cor falsa RGB da autofluorescência celular do músculo liso das vias aéreas (ASM). (B) mostrado em vermelho, regiões de (a) escolhidas para o componente de autofluorescência da biblioteca espectral. (C) células ASM de cor falsa RGB rotuladas com o rótulo mitocondrial. (D) mostrado em vermelho, regiões de (C) escolhidas para o componente de rótulo mitodircal da biblioteca espectral. Devido ao autofluorescence das pilhas de ASM localizadas perto do núcleo, as regiões pequenas foram selecionadas longe dos núcleos para identificar o espectro mitochondrial da etiqueta. (E) células ASM de cor falsa RGB transfectadas com a sonda gcamp. (F) as regiões de (E) selecionadas para o componente gcamp da biblioteca espectral são mostradas em vermelho. Similar a (D), as regiões afastaram-se dos núcleos foram selecionadas. (G) a biblioteca espectral Obtida de a-F, normalizada para um valor de unidade no comprimento de onda com o sinal mais forte. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 6
Figura 6 : Exemplo de dados de imagem não misturados em que as contribuições de sinal relativo não misturados de cada componente de biblioteca podem ser visualizadas. (A-D) A abundância Unmixed de GCaMP, de etiqueta mitochondrial, de autofluorescence, e de termo do erro. (E-G) As imagens em painéis (A-C) com suas respectivas tabelas de look-up de falsa cor aplicadas. (H) a imagem composta, mesclada, de cor falsa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 7
Figura 7 : Contribuições do sinal relativo não misturado, incluindo a intensidade média e a porcentagem da fluorescência total, de uma biblioteca espectral corretamente definida. (A-D) A abundância Unmixed para o autofluorescence, o GCaMP, a etiqueta mitochondrial, e o termo do erro. Deve-se notar que o termo de erro compreende menos de 10% do sinal de fluorescência total medido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 8
Figura 8 : Contribuições do sinal relativo não misturado, incluindo a intensidade média e a porcentagem da fluorescência total, de uma biblioteca espectral que falta um componente sabido para ser incluído na amostra (isto é, uma biblioteca espectral underdefined). (A-C) A abundância Unmixed do autofluorescence, da etiqueta mitochondrial, e do termo do erro. Note-se que a omissão do GCaMP da biblioteca espectral aumentou as contribuições do sinal relativo calculado a partir dos componentes da biblioteca, bem como o termo de erro, quando comparado com a Figura 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9 : Contribuições do sinal relativo não misturado, incluindo a intensidade média e a porcentagem da fluorescência total, de uma biblioteca espectral que contem um componente adicional sabido faltar na amostra (isto é, uma biblioteca espectral condições). (A-E) A abundância Unmixed do autofluorescence, do GCaMP, da etiqueta mitochondrial, da etiqueta nuclear, e do termo do erro. Note-se que a adição de um rótulo nuclear à biblioteca espectral diminuiu as contribuições do sinal relativo calculado da autofluorescência, quando comparado com a Figura 7. Além disso, o termo de erro é diminuído abaixo do erro de porcentagem especificado pela biblioteca espectral definida corretamente. Isso porque uma biblioteca superdefinida quase sempre permitirá um melhor ajuste aos dados experimentais do que uma biblioteca definida corretamente, mesmo que os sinais de abundância para componentes conhecidos por estarem ausentes da amostra sejam (na realidade) artefatos de superdefinindo o biblioteca espectral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10 : Comparação de imagens não misturadas ao usar uma biblioteca antes e depois da subtração adequada do sinal de contaminação por autofluorescência. (A) os espectros "puros" originais derivados dos controles Single-label em pilhas de músculo liso da via aérea altamente autofluorescent antes da subtração escalada detalhada na etapa 6.2.4. (B-D) A autofluorescência não misturada, GCaMP, e as imagens de etiquetas nucleares geradas usando (A) como a biblioteca. (E) os espectros puros corrigidos derivados de controles de rótulo único em células musculares lisas de vias aéreas altamente autofluorescentes após subtração escalonada. (F-H) A autofluorescência não misturada, GCaMP, e imagens de etiquetas nucleares geradas usando (E) como a biblioteca. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Intensidade média (AU)
Encaixe apropriado Underfitting Overfitting
Autofluorescence 187 299 164
Gouveia 139 - 140
Rótulo mitocondrial 246 318 248
Etiqueta nuclear - - 26
Erro do RMS 53 126 43
Desvio padrão (AU)
Encaixe apropriado Underfitting Overfitting
Autofluorescence 362 442 315
Gouveia 168 168
Rótulo mitocondrial 344 388 345
Etiqueta nuclear - - 93
Erro do RMS 62 126 44
Intensidade máxima (AU)
Encaixe apropriado Underfitting Overfitting
Autofluorescence 6738 7409 6738
Gouveia 1336 - 1336
Rótulo mitocondrial 5098 5194 5098
Etiqueta nuclear - - 1257
Erro do RMS 1050 1286 910
% de fluorescência total
Encaixe apropriado Underfitting Overfitting
Autofluorescence 30 40% de 26
Gouveia 22 43% de 23
Rótulo mitocondrial 39% de - 40% de
Etiqueta nuclear - - 4
Erro do RMS 8 17 7

Tabela 1: Uma tabela que compara a média, o desvio padrão e os valores máximos de intensidade de abundância não misturada por imagem de abundância não misturada de uma biblioteca espectral adequada e de bibliotecas espectrais subdefinidas ou superdefinidas, bem como a percentagem de fluorescência total por imagem de abundância não misturada (a intensidade mínima de abundância não misturada para cada imagem era sempre zero). Dados retirados da figura 7, Figura 8e Figura 9.

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Discussion

O uso ideal de uma configuração de imagem hiperespectral de excitação-digitalização começa com a construção do caminho de luz. Em particular, a escolha da fonte luminosa, dos filtros (ajustáveis e dichroic), do método do interruptor do filtro, e da câmera determina a escala espectral disponível, a velocidade possível da varredura, a sensibilidade do detector, e a amostragem espacial. As lâmpadas de arco de mercúrio oferecem muitos picos de comprimento de onda de excitação, mas não fornecem uma saída espectral plana e exigirá redução significativa de sinal nos picos de saída para corrigir os dados de imagem espectral de volta a uma resposta rastreável pelo NIST38. Fontes de luz alternativas, tais como lâmpadas de arco xe e lasers de supercontinuum de luz branca, podem fornecer uma saída espectral mais uniforme que é mais adequada para a excitação-digitalização hiperespectrais Imaging38,39,40. A escolha da fonte luminosa, dos filtros ajustáveis, e dos filtros dichroic determinam a escala espectral disponível. Esta escala deve ser escolhida com consideração cuidadosa para a informação espectral desejada da amostra experimental.

Adicionalmente, a consideração deve ser dada ao mecanismo de comutação usado para os filtros ajustáveis, assim como vários fatores da câmera tais como a eficiência quântica, o tamanho do pixel, e as taxas de frame disponíveis, porque estes fatores afetarão taxas de amostragem potenciais41 ,42,43. Entretanto, todos os outros fatores que são constantes, utilização da aproximação da excitação-exploração devem fornecer a sensibilidade aumentada e a habilidade para uma imagem latente mais rápida, comparado a a maioria de imagem espectral da emissão-varredura aproxima21.

Como observado na introdução, a imagem latente hiperespectrais aqui refere a natureza contígua e espectralmente de sobreposição dos dados adquiridos. Como tal, as capacidades do sistema precisam de poder coletar dados usando o afastamento de comprimentos de onda do centro da excitação menos do que a metade da distância do FWHM dos filtros. Como relatado previamente, uma disposição cuidadosamente escolhida de filtros ajustáveis da fino-película permite a aquisição de dados com comprimentos de onda Center espaçados 5 nanômetro distante, uma distância suficiente para sobreamostrar o espectro da excitação dado filtros com FWHM de entre 14-20 nanômetro. Tal espaçamento dá ligeira redundância na coleta de dados espectrais com provável aumenta a precisão do processo de separação. A consideração de ambas as escalas espectrais e o número mínimo necessário de canaletas do comprimento de onda para separação exato foram discutidos previamente44,45,46. Para este fim, dada a largura de banda destes filtros, o intervalo de excitação deve ser selecionado para terminar em um comprimento de onda que é um pouco menor (5-10 Nm menor) do que o comprimento de onda de corte do beamsplitter dichroic. Isto assegurará que a largura de banda inteira da iluminação da excitação esteja abaixo do comprimento de onda do corte do refletores dichroic (por exemplo, 360-485 nanômetro para o filtro dichroic 495) para evitar o cross-talk da excitação-emissão.

O software para controlar independentemente cada componente do hardware para conseguir varreduras de imagem espectral de alta velocidade é exigido. O software deve ser capaz de operar o obturador, selecionar comprimentos de onda de excitação, e adquirir imagens em velocidades suficientemente elevadas para atender às condições experimentais (requisitos de taxa de amostragem exata variará experimento, mas um objetivo de exemplo pode ser adquirir quatro as pilhas de imagens espectrais completas por minuto). Experimentos mais complexos podem fazer uso de vários espelhos dichroic, objetivos ou locais XYZ. Há uma série de pacotes de software disponíveis para aquisição de dados47,48. Micro-Manager é um software livre de código aberto para automação de microscópio que oferece uma variedade de opções de personalização. Além disso, o micro-Manager inclui um painel de script para personalização adicional não disponível dentro da interface do usuário principal. Por exemplo, é possível usar um script personalizado para reduzir o atraso de 250 MS do alternador de filtro sintonizado para 10 ms em todos os comprimentos de onda de excitação, exceto as transições de comprimento de onda em que a roda de filtro gira para um novo filtro ajustável, reduzindo a imagem efetiva tempo por 240 MS por comprimento de onda para a maioria dos comprimentos de onda. Esta personalização permitiu a aquisição de até 30 comprimentos de onda em menos de 4 s. Finalmente, o micro-Manager pode ser operado juntamente com outros ambientes, como o MATLAB, para personalizar ainda mais o controle do dispositivo de microscópio.

Determinar a escala de excitação espectral apropriada, o tempo da aquisição, e o comprimento de onda inicial para a visualização da amostra e a aquisição de dados subseqüente são muito importantes. No entanto, a operação incorreta de componentes individuais do sistema pode exigir mais solução de problemas. Cada componente do caminho óptico contribui para os dados de imagem adquiridos. Portanto, é importante verificar a resposta espectral e transmissão óptica de componentes ópticos dentro do caminho de luz, especialmente se tentar otimizar a resposta geral do sistema. As fontes luminosas têm frequentemente ajustes variáveis da intensidade e podem ter a redução no poder sobre a vida do bulbo40. Se um exemplo aparece Dim, a causa pode ser reduzida saída da fonte de luz. A função do obturador automático no micro-gerente, em nossa experiência, não opera 100% do tempo. A falta de sinal pode indicar um obturador fechado. O comprimento de onda inicial da excitação conservado dentro do arquivo de configuração do micro-gerente pode padrão a um comprimento de onda com pouca ou nenhuma saída espectral, tal como o exemplo do 340 nanômetro mostrado em Figura 1.

Adicionalmente, não é raro escolher equivocadamente um comprimento de onda da excitação que esteja acima do comprimento de onda do corte do beamsplitter Dichroic da longo-passagem, tendo por resultado a Cruz-conversa adicional e/ou a luz da excitação que está sendo desviada diretamente à câmera que pode potencialmente danificar o sensor da câmara. Similarmente, ajustar o trajeto claro para a imagem latente da transmissão pode conduzir à perda de sinal à câmera, dependendo da configuração do microscópio. Além disso, como indicado na Figura 2, a escolha do comprimento de onda inicial da excitação e o tempo de exposição para a visualização da amostra podem parecer apropriadas mas resultam realmente em pixéis oversaturados em outros comprimentos de onda da excitação. Esse fato não será aparente a menos que a saturação de pixel seja verificada para cada imagem, portanto, geralmente é prudente executar uma pilha de imagens de teste em uma área da amostra que parece conter a fluorescência mais intensa.

Também vale ressaltar que intensidades variáveis podem estar presentes em imagens escolhidas para regiões de fundo. Deve-se tomar cuidado para garantir que essas regiões não contenham dados de imagem relevantes, pois as etapas subsequentes de correção de dados subtrairão esse sinal dos dados de imagem adquiridos em outras regiões da amostra. Às vezes é necessário usar as configurações de transmissão e/ou aumentar drasticamente o tempo de exposição para verificar se a região selecionada para medir o fundo da amostra realmente não contém nenhuma amostra. Da mesma forma, imagens não misturadas podem apresentar manchas escuras ou buracos na imagem de autofluorescência. Isso pode ser devido a uma biblioteca inadequada causada por autofluorescência "contaminação" dos sinais espectrais "puros" de células de rótulo único. Isso porque qualquer sinal espectral "puro" coletado de uma amostra contendo autofluorescência invariavelmente conterá alguns dos espectros de autofluorescência propriamente dito, mesmo que em quantidades de traços. Deve-se tomar cuidado para subtrair os sinais de autofluorescência dos controles single-rotulados para garantir uma biblioteca espectral adequada, como descrito em várias ocasiões por Mansfield et al.28,29,30, 31,32

Embora não demonstrado neste artigo, o sistema espectral da excitação-exploração da imagem latente pode igualmente ser usado para a imagem latente e a imagem latente do tempo-lapso sobre posições XY múltiplas (ou um grande campo de visão devido à costura da imagem) em aviões focais múltiplos. Se essas opções forem desejadas para um único experimento, deve-se ter cuidado com a importância da ordem de aquisição e dos efeitos potenciais do fotobranqueamento. Também vale a pena notar que, se o tempo real tomado excede o tempo estimado (por exemplo, uma pilha de imagens leva 11 s para adquirir em vez de 10 s estimados), micro-Manager continuará a adquirir o número selecionado de pontos temporais e/ou posições. Este erro de cálculo pode ser composto com vários pontos de tempo e alterar a amostragem temporal calculada, potencialmente distorcê-los quaisquer conclusões feitas a partir dos dados.

Este exemplo demonstra a capacidade de separar três fontes de fluorescência dentro de uma faixa de varredura de excitação de 145 nm. Experimentos anteriores usando este sistema foram capazes de separar até cinco fontes de fluorescência dentro da mesma faixa. O tempo exigido para esta aquisição da imagem é menos de 1 minuto, que é significativamente mais rápido do que a maioria de sistemas espectrais da imagem latente da emissão-exploração. As melhorias no trajeto claro, tais como o ajuste mais elevado do comprimento de onda da excitação da velocidade, podem mais avançar esta tecnologia da imagem latente às velocidades que são suficientes para a imagem latente espectral da taxa de vídeo.

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Disclosures

Drs. Leavesley e Rich divulgam juros financeiros em uma empresa start-up, SpectraCyte LLC, fundada para comercializar tecnologia de imagem espectral.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer o apoio da NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, e o fundo de pesquisa de câncer de Abraham Mitchell.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

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References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

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Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

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