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Engineering

Microscopia di imaging iperspettrale di eccitazione-scanning per discriminare in modo efficiente i segnali di fluorescenza

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

L'imaging spettrale è diventata una soluzione affidabile per l'identificazione e la separazione di più segnali di fluorescenza in un singolo campione e può facilmente distinguere i segnali di interesse dallo sfondo o dall'autofluorescenza. L'imaging iperspettrale a scansione dell'eccitazione migliora questa tecnica diminuendo il tempo necessario di acquisizione dell'immagine aumentando contemporaneamente il rapporto segnale-rumore.

Abstract

Diverse tecniche si basano sul rilevamento di segnali di fluorescenza per identificare o studiare fenomeni o per chiarire le funzioni. La separazione di questi segnali di fluorescenza è stata dimostrata ingombrante fino all'avvento dell'imaging iperspettrale, in cui le fonti di fluorescenza possono essere separate l'una dall'altra, nonché dai segnali di fondo e dall'autofluorescenza (data la conoscenza del loro spettro spettrale firme). Tuttavia, l'imaging iperspettrale tradizionale a scansione delle emissioni soffre di tempi di acquisizione lenti e bassi rapporti segnale-rumore a causa del necessario filtraggio sia della luce di eccitazione che di emissione. È stato dimostrato in precedenza che l'imaging iperspettrale a scansione eccitazione riduce il tempo di acquisizione necessario aumentando contemporaneamente il rapporto segnale-rumore dei dati acquisiti. Utilizzando apparecchiature disponibili in commercio, questo protocollo descrive come assemblare, calibrare e utilizzare un sistema di microscopia di imaging iperspettrale a scansione di eccitazione per la separazione dei segnali provenienti da diverse sorgenti di fluorescenza in un singolo campione. Sebbene sia altamente applicabile all'imaging microscopico di cellule e tessuti, questa tecnica può essere utile anche per qualsiasi tipo di esperimento che utilizza la fluorescenza in cui è possibile variare le lunghezze d'onda di eccitazione, compresa ma non limitata a: imaging chimico, applicazioni ambientali, cure oculistiche, scienze alimentari, scienze forensi, scienze mediche e mineralogia.

Introduction

L'imaging spettrale può essere eseguito in vari modi ed è indicato da diversi termini1,2,3,4. In generale, l'imaging spettrale si riferisce ai dati acquisiti in almeno due dimensioni spaziali e in una dimensione spettrale. L'imaging multispettrale e iperspettrale si distingue più spesso per il numero di bande di lunghezza d'onda o per il fatto che le bande spettrali siano contigue1. Per questa applicazione, i dati iperspettrali sono definiti come dati spettrali acquisiti con bande di lunghezza d'onda contigue ottenute mediante spaziatura delle lunghezze d'onda centrale non meno della metà dell'intera larghezza a metà massima (FWHM) di ogni filtro passabanda utilizzato per l'eccitazione (cioè 5 nm spaziatura della lunghezza d'onda centrale per i filtri passabanda con larghezze di banda 14-20 nm). La natura contigua delle bande di dati consente un sovracampionamento del set di dati, assicurando che i criteri Nyquist siano soddisfatti durante il campionamento del dominio spettrale.

L'imaging iperspettrale è stato sviluppato dalla NASA negli anni '70 e '80 in collaborazione con il primo satellite Landsat5,6. La raccolta di dati da diverse bande spettrali contigue ha permesso la generazione di uno spettro di luminosità di ogni pixel. L'identificazione e la definizione dello spettro di luminosità dei singoli componenti ha permesso non solo di rilevare i materiali di superficie dai loro spettri caratteristici, ma ha anche permesso la rimozione dei segnali intermedi, come le variazioni nel segnale dovute condizioni atmosferiche. Il concetto di rilevare i materiali che utilizzano i loro spettri caratteristici è stato applicato ai sistemi biologici nel 1996, quando Schrock et al. cariotipizzazione spettrale7. Questa tecnica è stata elaborata nel 2000 da Tsurui et al. per l'imaging a fluorescenza di campioni di tessuto, utilizzando sette coloranti fluorescenti e decomposizione del valore singolare per ottenere la separazione spettrale di ogni pixel in combinazioni lineari di spettri nel riferimento libreria8. Simile alle loro controparti di telerilevamento, il contributo di ogni fluoroforo noto può essere calcolato dall'immagine iperspettrale, date a priori informazioni dello spettro di ogni fluoroforo.

L'imaging iperspettrale è stato utilizzato anche nei settori dell'agricoltura9, astronomia10, biomedicina11, imaging chimico12, applicazioni ambientali13, cura degli occhi14, scienza alimentare15, scienza forense16,17, scienza medica18, mineralogia19, e sorveglianza20. Una limitazione fondamentale degli attuali sistemi di imaging iperspettrale al microscopio a fluorescenza è che la tecnologia di imaging iperspettrale standard isola i segnali di fluorescenza in bande strette di 1) filtrando prima la luce di eccitazione per controllare l'eccitazione del campione, quindi 2) ulteriore filtraggio emesso luce per separare l'emissione di fluorescenza in bande strette che possono poi essere separate matematicamente21. Filtrare sia l'illuminazione di eccitazione che la fluorescenza emessa riduce la quantità di segnale disponibile, che riduce il rapporto segnale-rumore e richiede lunghi tempi di acquisizione. Il segnale basso e i lunghi tempi di acquisizione limitano l'applicabilità dell'imaging iperspettrale come strumento diagnostico.

È stata sviluppata una modalità di imaging che fa uso di imaging iperspettrale ma aumenta il segnale disponibile, riducendo così il tempo di acquisizione necessario21,22. Questa nuova modalità, chiamata imaging iperspettrale a scansione eccitazione, acquisisce dati di immagine spettrale variando la lunghezza d'onda dell'eccitazione e raccogliendo un'ampia gamma di luce emessa. È stato dimostrato in precedenza che questa tecnica produce ordini di grandezza in aumento del rapporto segnale-rumore rispetto alle tecniche di scansione delle emissioni21,22. L'aumento del rapporto segnale-rumore è in gran parte dovuto all'ampio passaggio a banda (600 nm) della luce di emissione rilevata, mentre la specificità è fornita filtrando solo la luce di eccitazione invece dell'emissione di fluorescenza. Questo permette a tutta la luce emessa (per ogni lunghezza d'onda di eccitazione) di raggiungere il rivelatore21. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per discriminare l'autofluorescenza dalle etichette esogene. Inoltre, la capacità di ridurre il tempo di acquisizione dovuto a un maggiore segnale rilevabile riduce il pericolo di fotosbiancamento e consente scansioni spettrali a un tasso di acquisizione accettabile per l'imaging video spettrale.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fungere da guida all'acquisizione dei dati per la microscopia dell'imaging iperspettrale a scansione di eccitazione. Inoltre, sono incluse descrizioni che aiutano a comprendere il percorso della luce e l'hardware. Viene inoltre descritta l'implementazione di software open source per un microscopio di imaging iperspettrale a scansione di eccitazione. Infine, vengono fornite descrizioni su come calibrare il sistema a uno standard tracciabile dal NIST, regolare le impostazioni software e hardware per ottenere risultati accurati e annullare il mixdelo del segnale rilevato in contributi da singoli componenti.

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Protocol

1. Configurazione del dispositivo

  1. Sorgente luminosa: selezionare una fonte di luce spettrale a banda larga con potenza elevata e collisione elevata (una lampada ad arco Xe da 300 W è stata utilizzata per questi studi).
  2. Otturatore (opzionale): aggiungere un otturatore al percorso ottico per ridurre il fotosbleaching per l'imaging time-lapse.
  3. Sistema di filtro regolabile: incorporare un gruppo di accordatura meccanica e un filtro regolabile a pellicola sottile (TFTF) impostato per consentire l'intervallo di eccitazione regolabile a lunghezza d'onda desiderato (ad esempio, 360-485 nm).
  4. Microscopio: utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita che includa una torretta e un controller a filtro dicroico motorizzati.
    1. Cubo filtro di fluorescenza: assemblare un cubo di filtro a fluorescenza a passa lungo. Per ottenere i migliori risultati, scegliere uno specchio dicroico e un filtro di emissione a passaggio prolungato alla stessa lunghezza d'onda per ottenere una separazione ottimale dell'eccitazione dalla luce di emissione (ad esempio, 495 nm).
    2. Obiettivo: utilizzare un obiettivo apocromatico appropriato per garantire un'attenzione uniforme sulla gamma di lunghezze d'onda utilizzata per l'esperimento (per questo studio è stato utilizzato un obiettivo acqua 60x).
    3. Fase automatica (opzionale): utilizzare una fase automatizzata per il campionamento rapido di più campi di visualizzazione e/o campi molto grandi tramite l'analisi delle immagini. Calibrare il palco con l'obiettivo e la fotocamera.
  5. Fotocamera: selezionare una telecamera appropriata per ottenere i requisiti di risoluzione spaziale, sensibilità e rumore dell'esperimento (questo sistema utilizzava una fotocamera sCMOS ad alta sensibilità).

2. Software di acquisizione

  1. Scegliere un pacchetto software che consenta il controllo indipendente di ogni componente hardware, ad esempio Micro-Manager.
    1. Creazione del file di configurazione: il file di configurazione è un insieme salvato di strumenti e istruzioni che Micro-Manager caricherà per far funzionare l'hardware del sistema. Per creare un file di configurazione, fare clic su Strumenti > Configurazione guidata hardware.
      1. Nel passaggio 1 fare clic su Crea nuova configurazione > Avanti per continuare. Si noti che l'utente può scegliere di modificare o esplorare la configurazione esistente, se già disponibile.
      2. Nel passaggio 2, sfogliare l'elenco Dispositivi disponibili per trovare i dispositivi da controllare tramite Micro-Manager, ad esempio il microscopio, la lampada, lo stage, l'otturatore e la fotocamera. Quando viene evidenziato, fare clic sul pulsante Aggiungi... per aggiungere il dispositivo all'elenco dei dispositivi installati. Si aprirà una nuova finestra.
        1. Specificare l'etichetta del dispositivo nella casella Etichetta. (ad es. fotocamera sCMOS)
        2. In Valoreselezionare la porta COM appropriata per ogni dispositivo. In questo modo verrà visualizzato un elenco delle proprietà del dispositivo nella parte inferiore della finestra.
        3. Lasciare le proprietà del dispositivo alle impostazioni predefinite. Si noti che i valori personalizzati per ogni proprietà del dispositivo possono essere immessi come desiderato.
        4. Quando viene aggiunto ogni dispositivo, fare clic sul pulsante Avanti per continuare con il passaggio successivo. Si noti che se i dispositivi vengono ostriati o devono essere modificati, il file di configurazione può essere modificato in un secondo momento, come descritto nel passaggio 2.1.1.1.Note that if any devices are left out or need to be changed, the configuration file can be modified later as described in step 2.1.1.1.
      3. Nel passaggio 3, utilizzare i menu a discesa per selezionare la fotocamera, l'otturatore e lo stage di messa a fuoco predefiniti. Se si desidera l'otturatore automatico, fare clic sulla casella di controllo sotto l'elenco a discesa della fase di messa a fuoco. Se la direzione di messa a fuoco dello stage z è nota, selezionarla dall'elenco a discesa in Direzioni dello stato attivo dello stage (avanzate). In caso contrario, lasciare il valore predefinito sconosciuto.
      4. Nel passaggio 4, fare doppio clic sulle caselle sotto l'intestazione Ritardo [ms] per impostare i ritardi associati ai dispositivi automatizzati, ad esempio ritardi di 100 ms per la lampada, lo stage e l'otturatore e un ritardo di 250 ms per i comandi all'assieme di sintonizzazione meccanica per tenere conto tempo di commutazione meccanico tra i filtri.
      5. Nel passaggio 5 assegnare le etichette per i dispositivi di stato. La configurazione per il sistema di microscopio a scansione eccitazione utilizza etichette nel blocco filtro per identificare ogni cubo del filtro a fluorescenza (ad esempio, lo stato 0 corrisponde all'etichetta Luminoso, il cubo del filtro vuoto utilizzato durante l'imaging del campo luminoso; mentre stato 3 corrisponde all'etichetta 495 nm e al cubo del filtro dicroico personalizzato 495 nm utilizzato per separare la luce di eccitazione ed emissione a 495 nm). Le etichette vengono utilizzate anche nell'assieme di accordatura meccanica per memorizzare i comandi di commutazione per ogni lunghezza d'onda di eccitazione (ad esempio, lo stato 0 corrisponde al comando di regolazione della lunghezza d'onda dell'eccitazione di 340 nm per l'assieme di regolazione meccanica).
      6. Nel passaggio 6 fare clic sul pulsante Sfoglia accanto alla casella File di configurazione per scegliere un percorso di salvataggio e un nome file per il file di configurazione. Fare clic su Fine per salvare il file di configurazione.
    2. Gruppi di avvio e predefiniti: Micro-Manager può memorizzare gruppi diversi all'interno di ogni file di configurazione per attivare o modificare un sottoinsieme dell'hardware. Ad esempio, un gruppo di "avvio del sistema" e una combinazione preimpostata memorizzeranno le impostazioni predefinite, ad esempio le dimensioni del raccoglitore e le velocità di lettura per la fotocamera.
      1. Creare un gruppo (ad esempio, System) facendo clic sul segno più nella finestra principale della sottosezione Gruppo.
      2. Controllare qualsiasi uso nel gruppo? caselle all'interno del gruppo che richiedono l'impostazione di un valore predefinito (ad esempio, la binning nella fotocamera predefinita associata).
      3. Create un nuovo predefinito (ad esempio, "Startup") facendo clic sul segno più nella finestra principale della sottosezione Preset.
      4. Ogni casella selezionata nel passaggio 2 apparirà come opzione preimpostata qui. Scegliere un valore predefinito da caricare per ogni casella selezionata.
    3. Gruppo e preset per lunghezze d'onda di eccitazione: Micro-Manager tratta ogni lunghezza d'onda di eccitazione come il proprio canale con il proprio comando di commutazione della lunghezza d'onda; pertanto, ognuno deve essere salvato come proprio preset.
      1. Creare un nuovo gruppo per contenere una serie di lunghezze d'onda di eccitazione desiderate (ad esempio, "495 nm dichroic")
      2. Selezionare la casella Usa nel gruppo? denominata Etichetta corrispondente al dispositivo VF-5.
      3. Creare un nuovo predefinito denominato per ogni lunghezza d'onda dell'eccitazione (ad esempio, "340 nm").
      4. Assegnate a ogni predefinito il nome della proprietà e il valore preimpostato appropriati (ad esempio, il nome della proprietà: "Etichetta"; valore preimpostato: "340 nm").
    4. Strumento di acquisizione multidimensionale: fare clicMultid Acq.nella parte superiore sinistra della finestra Micro-Manager per aprire uno strumento personalizzabile da utilizzare per catturare un'immagine del campione ad ogni lunghezza d'onda di eccitazione con un clic di un singolo pulsante. Ci sono diverse opzioni di personalizzazione per costruire l'acquisizione esattamente come desiderato.
      1. Timepoint (non utilizzato in questo esempio): per gli studi senza componente time-lapse, lasciare la casella deselezionata. Se si desiderano studi time-lapse, selezionare questa casella. Se selezionata, immettere il numero di volte in cui eseguire le altre impostazioni di acquisizione nella casella Numero. Impostare il tempo tra le acquisizioni successive immettendo la durata nella casella Intervallo e scegliere l'unità appropriata (millisecondi, secondi o minuti; in genere secondi).
      2. Posizioni multiple (XY; non utilizzate in questo esempio): per gli studi di una singola posizione XY, lasciare la casella deselezionata. Se si desiderano più posizioni XY, selezionare la casella e fare clic sul pulsante Modifica elenco posizioni per aprire una finestra separata. Spostare la stage in ogni posizione desiderata e fare clic sul pulsante Contrassegna per salvare tale posizione nel software. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le posizioni XY desiderate non sono contrassegnate. Chiudere questa finestra per continuare.
      3. (diapositive; non utilizzate in questo esempio): per gli studi di una singola posizione, lasciare la casella deselezionata. Se si desiderano più posizioni, selezionare la casella. Spostare lo stage nella posizione iniziale desiderata e fare clic sul pulsante Imposta accanto alla casella di avvio a z. Spostare lo stage nella posizione finale desiderata e fare clic sul pulsante Imposta accanto alla casella Fine. Immettere la dimensione del gradino desiderata (in micron) nella casella del passo z.
      4. Canali: verificare che la casella Canali sia selezionata. Qui, i canali sono i nomi dati alle singole lunghezze d'onda di eccitazione. I "Canali" disponibili corrispondono ai "Gruppi" descritti nei passaggi 2.1.2 e 2.1.3.
        1. Gruppo: fare clic sull'elenco a discesa per selezionare un gruppo da cui scegliere le lunghezze d'onda di eccitazione disponibili (ad esempio, dichroic di 495 nm).
        2. Fare clic sulla casella Mantieni otturatore aperto per mantenere l'otturatore aperto tra le acquisizioni per ciascun canale. Si noti che l'otturatore si chiuderà comunque tra le scansioni spettrali successive se questa casella è selezionata, supponendo che l'opzione autoshutter sia selezionata anche nella finestra principale.
      5. Fare clic sul pulsante Nuovo per aggiungere canali all'elenco delle acquisizioni. Si noti che il pulsante Rimuovi può essere utilizzato per rimuovere tutti i canali non più desiderati e che Su e Giù possono essere utilizzati per riordinare qualsiasi canale selezionato.
        1. Assicurarsi che la casella di controllo Usa? sia selezionata per ogni lunghezza d'onda desiderata nella scansione spettrale.
        2. Configurazione: fare clic sull'elenco a discesa in Configurazione e scegliere la prima lunghezza d'onda nell'intervallo spettrale desiderato (ad esempio, 340 nm).
        3. Esposizione: fare doppio clic sulla casella sotto Esposizione e immettere il tempo di esposizione desiderato per la lunghezza d'onda selezionata (ad esempio, "100" per 100 ms). Vedere la sezione 5 ("Acquisizione dati") per suggerimenti per selezionare i tempi di esposizione appropriati.
        4. Offset z (non applicabile in una scansione spettrale): lasciare vuota questa casella (a 0) quando si esegue una scansione spettrale.
        5. Stack z: assicurarsi che questa casella sia selezionata per ogni lunghezza d'onda nell'intervallo spettrale se si esegue uno stack z.
        6. Salta Fr. (non applicabile in una scansione spettrale): lasciare vuota questa casella (a 0) quando si esegue una scansione spettrale. Si noti che può essere utile saltare selettivamente i fotogrammi nel caso in cui una o poche lunghezze d'onda di eccitazione siano significativamente più potenti di altre o se singole lunghezze d'onda di eccitazione si rivelino particolarmente fototossiche.
        7. Colore: lasciare vuota questa casella quando si esegue una scansione spettrale. Si noti che i colori possono essere scelti per singole bande di lunghezza d'onda per la visualizzazione dei dati, ma il colore non è appropriato per la successiva dismix spettrale.
        8. Ripetere questi passaggi fino a quando non viene aggiunta ogni lunghezza d'onda di eccitazione desiderata all'interno dell'intervallo di scansione spettrale specificato.
      6. Ordine di acquisizione: fare clic sull'elenco a discesa per scegliere in quale ordine verranno eseguite le opzioni precedenti (2.1.4.1-2.1.4.5). Per le scansioni spettrali come quella mostrata qui, l'ordine di acquisizione è semplicemente Canale. Si noti che le opzioni aggiuntive vengono visualizzate come caselle aggiuntive vengono selezionate all'interno dello strumento Acquisizione multidimensionale [Timepoint, Multiple Positions (XY) e zo-stacks (slices)] e consentono la scelta di una delle due posizioni o del tempo per prima, seguita da canale.
      7. Messa a fuoco automatica (non utilizzata in questo esempio): se è selezionata l'opzione Più posizioni (XY), sono disponibili diversi stili di messa a fuoco automatica. Fare clic sul pulsante Opzioni e selezionare un metodo di messa a fuoco automatica dall'elenco a discesa accanto al pulsante di chiusura.
      8. Riepilogo: esamina questa finestra per un riepilogo del numero di timepoint, delle posizioni XY, delle sezioni , dei canali, del numero totale di immagini, della memoria totale, della durata della scansione e dell'ordine di acquisizione per assicurarti che le informazioni elencate corrispondano alle impostazioni di acquisizione previste.
      9. Salva immagini: assicurati che questa casella sia selezionata per salvare i dati raccolti tramite l'uso dello strumento Acquisizione multidimensionale.
        1. Fare clic sul pulsante ... accanto a Directory root per scegliere una directory principale in cui salvare i file. Denominare la radice della directory in un modo che descriva i dettagli rilevanti dell'esperimento (ad esempio, GCaMP Airway Smooth Muscle Cells).
        2. Immettere un nome nella casella accanto a Prefisso nome che descriva l'acquisizione dell'immagine corrente (ad esempio FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Si consiglia di creare un prefisso del nome che identifichi il campo di visualizzazione e il tempo di esposizione, nonché altre informazioni rilevanti come l'oggetto e il filtro dicroico utilizzato. Si noti che la prima pila di immagini scattata utilizzando queste impostazioni verrà salvata con "_1" dopo il prefisso del nome. Qualsiasi stack successivo preso con la stessa radice di directory e prefisso nome verrà salvato con "_n", in cui "n" è il numero di volte in cui uno stack è stato preso con questo nome nella directory.
        3. Fare clic su Separa file di immagine per garantire che l'immagine generata ad ogni lunghezza d'onda dell'eccitazione venga salvata.
      10. Salva con nome: fai clic sul pulsante Salva con nome... in alto a destra dello strumento Di acquisizione multidimensionale per salvare queste impostazioni di acquisizione per un facile utilizzo futuro. Si noti che verranno salvati anche i prefissi radice e nome della directory.
      11. Acquisire: infine, fare clic su Acquisisci! per iniziare ad acquisire le immagini in base alle impostazioni di acquisizione scelte in precedenza.

3. Correzione della risposta spettrale (opzionale):

  1. La correzione dell'uscita spettrale può essere eseguita per calibrare la risposta spettrale del sistema a uno standard noto, ad esempio una lampada tracciabile del NIST o un altro standard o strumento tracciabile dal NIST. Questo passaggio è particolarmente importante se i risultati vengono confrontati con altri strumenti di imaging spettrale, spettrometri o tra laboratori diversi. Questo processo è stato riportato in dettaglio in precedenza21,23.
    1. Utilizzare uno spettrometro calibrato su una fonte di luce tracciabile del NIST (come LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) o un altro standard tracciabile del NIST per acquisire la potenza spettroradiometrica dell'illuminazione misurata nella fase del campione. Eseguire una correzione separata per ogni combinazione di impostazione della sorgente luminosa, specchio dicroico e obiettivo. Utilizzare una sfera di integrazione accoppiata allo spettrometro per misurare con precisione l'illuminazione grandangolare dall'obiettivo del microscopio.
    2. Utilizzare un metodo di integrazione, come la regola trapezoidale, per integrare i dati spettroradiometrici su lunghezze d'onda illuminate. Una larghezza di banda di 40 nm per l'integrazione incentrata sulla lunghezza d'onda centrale è sufficiente per la maggior parte dei filtri con una larghezza di banda nominale compresa tra 14-20 nm a larghezza intera al valore non massimo (FWHM). Il valore integrato rappresenta l'intensità dell'illuminazione spettrale in ogni banda di lunghezza d'onda di eccitazione.
    3. Tracciare l'intensità integrata di ogni banda di lunghezza d'onda in funzione della lunghezza d'onda centrale dell'eccitazione per consentire la visualizzazione del profilo di intensità di illuminazione spettrale.
    4. Determinare la banda della lunghezza d'onda con l'intensità integrata più bassa.
    5. Normalizzare il profilo di intensità di illuminazione spettrale dividendo l'intensità integrata più bassa per l'intensità integrata di ogni banda di lunghezza d'onda per generare un fattore di correzione dipendente dalla lunghezza d'onda.

4. Preparazione del campione

  1. Preparare un campione "vuoto" (ad esempio, posizionare un coperchio di vetro nella camera cellulare e aggiungere 1 mL di buffer). Questo buffer è stato descritto in precedenza24.
  2. Preparare un campione senza etichetta per determinare qualsiasi campione di autofluorescenza (ad esempio, posizionare un coperchio di vetro contenente le cellule muscolari lisce senza etichetta25,26 nella camera cellulare e aggiungere 1 mL di buffer).
  3. Preparare un campione separato con etichetta singola per ogni etichetta fluorescente utilizzata nell'esperimento come segue:
    1. Aggiungere l'etichetta mitocondriale diluita al tampone per ottenere una concentrazione di 100 nM. Aggiungere questo buffer al coverslip contenente le cellule muscolari lisce delle vie aeree. Incubare per 20 min a 20-25 gradi centigradi. Spostare il coverslip nella camera cellulare e aggiungere 1 mL di buffer. Si noti che la concentrazione ottimale dell'etichetta mitocondriale varia in base a fattori quali il produttore, il colore associato e la specificità desiderata.
    2. Spostare un coverslip contenente le cellule muscolari lisce delle vie aeree trascate con la sonda GCaMP27 alla camera cellulare e aggiungere 1 mL di buffer.
  4. Preparare uno o più campioni sperimentali contenenti una combinazione delle etichette fluorescenti desiderate.
    1. Aggiungere 1 mL di tampone (100 nM di concentrazione di etichetta mitocondriale) a un coperchio contenente le cellule muscolari lisce trasinfettate con la sonda GCaMP e incubare per 20 min a 20-25 gradi centigradi. Spostare il coverslip nella camera cellulare e aggiungere 1 mL di buffer.

5. Acquisizione dati:

  1. Verificare che siano selezionati il beamsplitter dicromatico corretto (ad esempio, cubo del filtro dicrotonico di 495 nm), l'obiettivo (ad esempio, l'obiettivo acqua 60x) e la fotocamera (fotocamera sCMOS).
  2. Caricare il campione sullo stage.
  3. Fare doppio clic sulla casella accanto a Esposizione [ms] e digitare "100" per impostare il tempo di esposizione a 100 ms.
  4. Selezionare 475 nm dal menu a discesa della finestra principale di Micro-Manager per la visualizzazione iniziale del campione. Si noti che 475 nm potrebbero non essere la lunghezza d'onda ottimale per la visualizzazione dei campioni o determinare se si verificherà una sovrasaturazione in tutto lo stack di immagini.
  5. Fate clic su Live per visualizzare l'esempio.
    1. Fare clic sul pulsante dell'intervallo di visualizzazione automatico Auto accanto all'istogramma nella parte inferiore della finestra per inserire i valori minimo e massimo in intervalli visivi significativi.
  6. Utilizzare le manopole di messa a fuoco del microscopio per concentrarsi sul campione. Spesso è utile trovare il bordo del campione per aiutare a mettere a fuoco. Il campione sarà attivo quando le feature bordo nell'immagine appaiono nitide. Si noti che potrebbe essere necessario fare clic più volte sul pulsante Auto durante la messa a fuoco per facilitare la visualizzazione dell'immagine a fluorescenza. Inoltre, alcuni utenti potrebbero trovare più facile concentrarsi sul campione se il microscopio è in modalità di trasmissione.
    1. Se si sta concentrando in modalità di trasmissione, per motivi di sicurezza, assicurarsi innanzitutto che la sorgente di luce spettrale non trasmetta la luce agli oculari prima di regolare il percorso della luce per l'imaging di trasmissione. Si noti inoltre che ci possono essere piccole deviazioni tra il fuoco delle immagini di trasmissione e fluorescenza. Una volta raggiunta la messa a fuoco accettabile, riconfigurare il percorso di luce per l'imaging a fluorescenza spettrale.
  7. Fare clic sul pulsante Acq multid. pulsante in alto a sinistra della finestra per aprire lo strumento di acquisizione multidimensionale (descritto e configurato nella sezione 2).
  8. Scegliere un intervallo spettrale appropriato per l'acquisizione spettrale (ad esempio, 360-485 nm per il filtro dicroico 495 nm) facendo clic sul pulsante Carica... in alto a destra nella finestra dello strumento Acquisizione multidimensionale e passando alle impostazioni di eccitazione salvati in precedenza (nel passaggio 2.1.4.10). Per informazioni sulle gamme spettrali appropriate, vedere discussione per informazioni sugli intervalli spettrali appropriati.
  9. Acquisire un'immagine di sfondo/vuota che non contiene dati di fluorescenza da utilizzare per la sottrazione di sfondo e rumore. Questa operazione può essere eseguita utilizzando un campione vuoto (passaggio 4.1) o passando a un'area vuota di un campione sperimentale. Come descritto nel passaggio 5.6, questo risultapiù è più facile individuando il bordo del campione e quindi posizionandolo in modo che il bordo sia centrato all'interno del campo visivo.
    1. Una volta confermate le impostazioni di acquisizione e visibile un'area di sfondo, fare clic sul pulsante Acquisisci! per acquisire una pila di immagini spettrali contenente lo sfondo e il disturbo da utilizzare per la sottrazione in un secondo momento. Va notato che è probabile che i campioni abbiano una fluorescenza più intensa lontano dal bordo del campione. Può essere consigliabile spostarsi sul campione per trovare le regioni "più luminose" ed eseguire diversi stack di immagini di prova per determinare i tempi di acquisizione appropriati ed evitare la sovraesposizione.
  10. Prendere una singola pila di immagini su una regione del campione che sembra avere una fluorescenza intensa per garantire che nessuna combinazione di lunghezze d'onda e che i tempi di esposizione provochino sovraesposizione.
  11. Usate ImageJ per confermare che nessuna lunghezza d'onda contiene pixel sovraesposti.
    1. In ImageJ, fate clic su File > Importa > Sequenza immagini e individuate la cartella contenente le immagini spettrali scattate nel passaggio 5.10. Si aprirà una nuova finestra. Fare clic sulla casella accanto a Numero di immagini e immettere il numero di lunghezze d'onda incluse nella scansione spettrale (ad esempio, 26). Lasciare Immagine iniziale e Incrementa come "1". Fare clic sul pulsante OK per continuare.
    2. Premere M sulla tastiera per utilizzare la funzione di misura di ImageJ. Assicurarsi che il numero elencato sotto Max non sia il limite superiore di rilevamento della fotocamera (ad esempio, 65.535). Ripetere l'operazione per ogni immagine nella scansione spettrale. Si noti che il limite di rilevamento della fotocamera dipende dalla fotocamera stessa. Il limite superiore viene visualizzato nella parte superiore destra dell'istogramma nella finestra principale di MicroManager. In alternativa, è possibile determinare il limite superiore aprendo un'immagine in ImageJ e passando a Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto. Fare clic sul pulsante Imposta nella finestra popup risultante, immettere un valore eccessivamente grande (ad esempio, 999.999) nello spazio vuoto accanto a Valore massimo visualizzatoe fare clic su OK per continuare. Il valore massimo visualizzato nel nuovo istogramma deve essere il limite di rilevamento superiore della fotocamera.
    3. Se le immagini contenevano il limite superiore di rilevamento della fotocamera (ad esempio, 65.535), regolate il tempo di esposizione della scansione spettrale per garantire che il segnale massimo in tutta la gamma spettrale non superi la gamma dinamica della telecamera.
  12. Acquisire dati di immagini spettrali da campioni senza etichetta per determinare qualsiasi autofluorescenza. Acquisire la scansione per i campioni senza etichetta utilizzando un intervallo di lunghezza d'onda identico e le impostazioni della fotocamera come il resto dell'esperimento (ad esempio, 360-485 nm a 100 ms per lunghezza d'onda).
  13. Acquisire dati di immagini spettrali da campioni con etichetta singola da utilizzare come controlli spettrali per creare la libreria spettrale. Eseguire la scansione per ogni etichetta utilizzando un intervallo di lunghezza d'onda identico, il tempo di esposizione e le impostazioni della fotocamera. Si noti che per alcuni campioni può essere necessario un tempo di acquisizione più lungo per consentire un rilevamento accurato dello spettro delle etichette con il contributo minimo al rumore.
  14. Eseguire misurazioni su un campione sperimentale (ad esempio, cellule muscolari lisce delle vie aeree umane con sonda GCaMP e etichetta mitocondriale).
    1. Posizionare un vetrino o un coperchio contenente il campione sperimentale al microscopio.
    2. Selezionare un campo visivo con celle di tessuti etichettate in modo appropriato.
    3. Acquisire i dati dell'immagine spettrale utilizzando le impostazioni di acquisizione desiderate, come descritto in precedenza.

6. Analisi dell'immagine

  1. Correggere le immagini in una risposta spettrale piatta.
    1. Sottrarre lo spettro di sfondo ottenuto nella sezione 5.9 e moltiplicare per il coefficiente di correzione determinato nella sezione 3.1.5. Questo può essere fatto con un semplice script MATLAB o routine ImageJ. Un codice MATLAB di sottrazione/correzione (utilizzato in questo esempio) è disponibile sul sito Web dell'Università dell'Alabama meridionale Bioimaging Resources.
      1. Caricare il codice di sottrazione/correzione in MATLAB.
      2. Nella scheda EDITOR fare clic su Esegui. Si aprirà una nuova finestra contenente un pulsante correzione Bsq. Fare clic sul pulsante Correzione Bsq per aprire un'altra finestra contenente le opzioni per la directory di lavoro, il file di sfondo, il file del fattore di correzione e la cartella tiff non corretta.
        1. Utilizzare il pulsante Sfoglia... accanto a Directory di lavoro per scegliere il percorso del file in cui si apriranno le finestre successive. Passare alla cartella contenente lo spettro di sfondo salvato (in formato .dat).
        2. Utilizzare il pulsante Sfoglia... accanto a File di sfondo (.dat) per aprire la directory scelta nel passaggio 6.1.1.2.1 e scegliere il file di sfondo desiderato (in formato .dat). Fare clic sul pulsante Apri per continuare.
        3. Utilizzare il pulsante Sfoglia... accanto a Fattore di correzione (.dat) per scegliere un fattore di correzione. Il valore predefinito della directory per il fattore di correzione è il percorso del codice MATLAB padre. Se necessario, passare alla sottocartella contenente il file del fattore di correzione (in formato .dat). Evidenziare il file del fattore di correzione appropriato e fare clic sul pulsante Apri per continuare.
        4. Utilizzare il pulsante Sfoglia... accanto alla cartella Tiff non corretta per aprire la directory scelta nel passaggio 6.1.1.2.1 e scegliere la cartella per la sottrazione dello sfondo e la correzione dell'immagine (di solito si tratta della cartella Pos0 che contiene immediatamente il grezzo immagini spettrali). Fare clic sul pulsante Apri per continuare.
        5. Fare clic sul pulsante Fare clic per correzione spettrale. Al termine dell'elaborazione, si aprirà una finestra con il messaggio "Bsq Correction Complete". Fare clic sul pulsante OK per continuare. Le immagini di correzione vengono memorizzate in una nuova cartella denominata con la cartella originale dell'immagine spettrale grezza e un'ulteriore "_Corrected" (ad esempio, Pos0_Corrected).
  2. Generare la libreria spettrale. Diversi pacchetti software possono essere utilizzati per estrarre dati spettrali dalle immagini, tra cui ImageJ. Per ottenere risultati ottimali, normalizzare ogni membro finale alla banda di lunghezza d'onda di massima intensità determinando quale banda di lunghezza d'onda ha il valore più intenso e dividendo la misurazione in ogni banda di lunghezza d'onda per quel valore massimo. Va inoltre notato che i controlli a etichetta singola generati all'interno di campioni autofluorescenti avranno bisogno di ulteriori modifiche28,29,30,31,32. Vedere il passaggio 6.2.4 e la discussione per i dettagli.
    1. In ImageJ fare clic su File > Importa > Sequenzaimmagini. Si aprirà una nuova finestra. Passare alla cartella contenente le immagini spettrali corrette. Fare doppio clic su un file di immagine nella cartella per aprire una nuova finestra. Fare clic sulla casella accanto a Numero di immagini e immettere il numero di lunghezze d'onda incluse nella scansione spettrale (ad esempio, 26). Lasciare Immagine iniziale e Incrementa come "1". Fare clic sul pulsante OK per continuare.
    2. Nella finestra principale di ImageJ, fare clic sull'icona Selezioni poligono, quindi utilizzare il puntatore del mouse facendo clic sull'immagine per creare un poligono intorno a una regione contenente i dati di fluorescenza. Si noti che ci possono essere pochi o nessun dato di fluorescenza nella lunghezza d'onda iniziale. Passare a un'altra immagine a lunghezza d'onda e/o utilizzare lo strumento Luminosità/contrasto (Immagine> Regola > Luminosità/Contrasto > Auto) per visualizzare meglio le regioni contenenti dati di fluorescenza di interesse.
    3. Una volta disegnato il poligono, generare il profilo dell'asse z facendo clic su Immagine > Stack > Traccia profilo assez . Si aprirà una nuova finestra. Fare clic su Salva per salvare i dati spettrali come file CSV.
    4. Eseguire una sottrazione per garantire una corretta libreria spettrale con etichette pure prive di contaminazione da autofluorescenza. Utilizzare la seguente equazione29 per isolare uno spettro puro dalla miscela di una singola etichetta e fluorescenza:
      Equation 1(1)
      Dove: Spuro è lo spettro puro dell'etichetta, Smisto è lo spettro misurato del campione contaminato con autofluorescenza, S autoFL è lo spettro di autofluorescenza misurato, "a" è scalare moltiplicatore dello spettro di autofluorescenza (tra 0 e 1; ad esempio, 0,4) e "offset" è un offset (di solito 0). Variare il termine "a" fino a ottenere un valore prossimo allo zero per l'apparente contributo dell'autofluorescenza. Ulteriori informazioni sono disponibili in diverse pubblicazioni28,29,30,31,32.
  3. Annullare la combinazione dei dati dell'immagine spettrale. Il passo di disinsistimento genererà un'immagine in abbondanza per ogni etichetta fluorescente, dove l'abbondanza è la quantità di segnale di fluorescenza relativa nell'immagine dalla rispettiva etichetta. Diversi algoritmi di disinfestazione sono disponibili per l'uso con ImageJ33,34,35. Inoltre, un codice MATLAB di scissione spettrale (utilizzato in questo esempio) è disponibile sul sito Web dell'Università dell'Alabama meridionale Bioimaging Resources. Una panoramica più completa dello smistare spettrale è disponibile36.
    1. Caricare il codice di dismissivo spettrale in MATLAB.
    2. Modificare i file Wavelength.mat e Library.mat in modo che corrispondano alle condizioni sperimentali (ad esempio, "Wavelength" come 360-485 con incrementi di cinque).
      NOTA: i valori corrispondenti per tali lunghezze d'onda devono essere caricati in "Libreria" per ogni etichetta fluorescente (e autofluorescenza). Endmember_Name deve elencare le etichette nello stesso ordine dei valori di colonna di "Library". Si noti che il file Library.mat deve contenere entrambe le variabili "Library" e "Endmember_Name".
    3. Nella scheda EDITOR fare clic su Esegui. Si aprirà una nuova finestra che consente all'utente di scegliere una directory. Passare alla cartella contenente le immagini spettrali da non miscelare. Una volta selezionato, si aprirà una nuova finestra.
    4. Negli spazi vuoti risultanti, immettere il nome dell'immagine (ad esempio, HASMC con GCaMP e Mito FOV1), il numero di bande di lunghezza d'onda (ad esempio, 26), il numero di punti temporali (ad esempio, 1) e se è desiderata una misura FRET (ad esempio, n) nei rispettivi spazi vuoti. Se per FRET è selezionata l'opzione "n", lasciare vuoti entrambi i membri finali. Premere OK per continuare, per aprire una nuova finestra.
    5. Naviagate alla cartella contenente il file Wavelength.mat. Una volta selezionato, fare clic su Apri per continuare, che aprirà una nuova finestra.
    6. Passare alla cartella contenente il file Library.mat. Una volta selezionato, fare clic su Apri per continuare, per salvare le immagini non mescolate in una nuova cartella "Unmixed" all'interno della directory contenente le immagini spettrali.
  4. Ispezionare le immagini spettrali non miscelate per verificarne la qualità.
    1. Aprire ogni immagine non mista per ispezionare visivamente la distribuzione dei componenti puri.
      1. Confrontare la grandezza dell'immagine di errore con quelle delle immagini non mescolate (simile al passaggio 5.11, questo può essere fatto attraverso la funzione di misura di ImageJ). Se la grandezza dell'immagine di errore è simile in grandezza alle immagini di abbondanza non mescolate, è probabile che ci siano segnali nei dati spettrali dell'immagine che non sono accuratamente contabilizzati dalla libreria spettrale e dal processo di insitazione spettrale lineare.
      2. Confrontare l'immagine di errore con le immagini non miste per vedere se sono presenti strutture residue non identificate.

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Representative Results

Diversi passaggi importanti da questo protocollo sono necessari per garantire la raccolta di dati accurati e privi di artefatti di imaging e spettrali. Se si ignorano questi passaggi, è possibile che i dati che appaiono significativi ma non possano essere verificati o riprodotti con qualsiasi altro sistema di imaging spettrale, annullando in modo efficace tutte le conclusioni fatte con tali dati. Principale tra questi importanti passi è la corretta correzione dell'uscita spettrale (sezione 3). Il fattore di correzione compensa le variazioni dipendenti dalla lunghezza d'onda nell'uscita spettrale del sistema di eccitazione regolabile. Ciò si ottiene scalando le lunghezze d'onda con eccitazione ad alta potenza in modo che la potenza di illuminazione ottica sia paragonabile alle lunghezze d'onda con un'eccitazione a bassa potenza, ottenendo un profilo di eccitazione spettrale piatta. Un esempio di fattore di correzione non appropriato è quello che contiene valori molto bassi (ad esempio, <0.001) a una o più lunghezze d'onda, che indica che i valori di intensità misurati a tali lunghezze d'onda devono essere notevolmente attenuati per ottenere una risposta spettrale piatta.

La calibrazione del sistema a uno standard tracciabile dal NIST garantisce che i dati raccolti con il sistema di imaging spettrale a scansione dell'eccitazione siano paragonabili ad altri sistemi anch'essi calibrati secondo gli standard tracciabili del NIST. Pertanto, è imperativo garantire che qualsiasi fattore di correzione regoli i dati raccolti in modo appropriato. L'accuratezza di un fattore di correzione può essere verificata con l'uso di uno standard di fluorescenza, come la fluoresceina tracciabile del NIST. Figura 1 illustra un fattore di correzione appropriato e inappropriato, visualizzato tramite dati grafici e immagine. In questo caso, l'output spettrale a 340 nm era praticamente inesistente rispetto al resto dell'intervallo spettrale, ottenendo un valore vicino allo zero (<0.001) per praticamente ogni lunghezza d'onda. Applicato allo stack di immagini, questo si traduce in valori vicini allo zero attraverso la maggior parte dello stack di immagini per la maggior parte dei pixel.

Come indicato nella sezione 5, l'intervallo di eccitazione, i fluorofori selezionati e le impostazioni di acquisizione possono creare il potenziale che una o più bande di immagini di lunghezza d'onda di eccitazione contengono pixel sovrasaturi. Figura 2 illustra un esempio in cui il tempo di esposizione è stato impostato troppo lungo per molte delle lunghezze d'onda di eccitazione, causando le immagini successive per contenere i pixel sovrasaturi. Questo è importante da notare perché, come mostra la figura, sia le singole immagini che le immagini di falsi colori possono apparire visivamente all'interno di intervalli di intensità accettabili.

L'appropriata selezione di un'area di sfondo per la sottrazione è importante anche per il confronto dei dati tra i sistemi, in quanto rimuove gli elementi di rumore della telecamera o di luce vagante prima della correzione spettrale tracciabile dal NIST (Figura 3). Spesso è utile per la successiva elaborazione delle immagini e le fasi di analisi dei dati generare un'immagine RGB falsamente colorata dello stack di immagini spettrali per visualizzare le caratteristiche spettrali all'interno dell'immagine. Nella figura 4 è illustrata un'immagine RGB di falsi colori generata mediante l'unione di tre bande di lunghezza d'onda selezionate (370 nm - blu, 420 nm , verde, 470 nm e rosso).

Lo scolo spettrale richiede la conoscenza del profilo spettrale di ogni singola fonte di fluorescenza. Nel caso dell'imaging iperspettrale a scansione eccitazione, questo viene fatto acquisendo pile di immagini spettrali per ogni fluoroforo (e autofluorescenza). Figura 5 è incluso come esempio per la scelta di aree da controlli a etichetta singola per generare una libreria spettrale. Va notato che ogni misura è stata normalizzata alla sua lunghezza d'onda di picco.

Se eseguito correttamente, il processo di disinsitazione spettrale consente la separazione di una pila di immagini spettrali in rispettivi contributi da ogni etichetta di fluorescenza. La figura 6 mostra un esempio di set di immagini spettrali non miscelate, con singole immagini per ciascuno dei seguenti segnali: autofluorescenza delle cellule muscolari lisce delle vie aeree, una sonda GCaMP e un'etichetta mitocondriale. Viene inoltre mostrato l'errore associato allo smistale smista e può essere esaminato per confrontare i livelli di intensità dell'errore con quelli dei segnali non miscelati. Il calcolo e l'interpretazione di questo errore è stato discusso in precedenza37. Come mostrato nella Figura 6, vi è un errore elevato associato alle regioni nucleari e perinucleari delle cellule, che indica che gli spettri misurati di tali regioni non sono ben contabilizzati dagli spettri nella biblioteca spettrale. Una potenziale fonte di errore può essere che i controlli monomarca per GCaMP e l'etichetta mitocondriale sono stati preparati utilizzando cellule muscolari lisce delle vie aeree, che hanno un'elevata autofluorescenza nativa. Di conseguenza, il GCaMP e l'etichetta mitocondriale non possono rappresentare spettri di puro membro finale. Inoltre, il segnale di autofluorescenza può influenzare gli spettri della libreria per le altre due etichette in un modo che non è stato adeguatamente considerato, risultando in un raccordo meno preciso rispetto a se le etichette fossero state acquisite utilizzando una linea cellulare con poco o nessun autofluorescenza. Inoltre, sono inclusi esempi per quando sono disponibili troppi o troppi componenti di una libreria spettrale, con conseguente insalto e insovramento dei dati immagine spettrali, rispettivamente (Figura 6, Figura 7, Figura 8, Figura 9e Tabella 1).

Come indicato nella sezione 6.2 e in particolare nel passaggio 6.2.4, gli spettri "puri" raccolti da cellule etichettate che sono anche autofluorescenti probabilmente contaminano il profilo spettrale per la componente pura. Come tale, bisogna fare attenzione a separare gli spettri puri delle etichette di interesse dai loro ospiti autofluorescenti. La figura 10 mostra la differenza di disinscimento con spettri "puri" contaminati da autofluorescenza (mista) rispetto agli spettri puri calcolati dal metodo descritto al passaggio 6.2.4. La differenza si verifica principalmente nello smiscelare il segnale di autofluorescenza. Senza un'adeguata separazione del segnale (ad esempio, sottrazione della contaminazione dell'autofluorescenza dallo spettro GCaMP), i componenti dell'autofluorescenza e della libreria GCaMP competono per gli stessi dati spettrali in ogni pixel, con conseguenti fori caratteristici o macchie scure nell'immagine di autofluorescenza.

Figure 1
Figura 1 : esempi di applicazioni di fattori di correzione inappropriati e appropriati utilizzati per correggere le immagini in una risposta spettrale piatta. (A) Tracciato fattori di correzione inappropriati e appropriati. (B) Un'immagine RGB generata con l'uso del fattore di correzione inappropriato in (A). (C) Un'immagine RGB generata con lo stesso campo visivo di (B), eccetto con l'uso di un fattore di correzione appropriato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Esempi che illustrano l'importanza delle impostazioni di acquisizione appropriate. (A,B) Immagini RGB generate da un tempo di acquisizione appropriato (A, 100 ms) rispetto allo stesso campo visivo con un tempo di acquisizione saturante (B, 500 ms). Va notato che le immagini RGB appaiono identiche quando di colore falso. (C) La regione di interesse selezionata per esaminare i valori di intensità delle regioni più intense di (A) e (B). (D) Valori di intensità tracciati per lunghezza d'onda dall'immagine del tempo di esposizione di 100 ms (A, linea nera) e 500 ms tempo di esposizione (B, linea rossa). Va notato che le intensità dei pixel per il tempo di esposizione di 500 ms hanno raggiunto il limite dell'intervallo dinamico del rivelatore (65.535 UA) a 370 nm e non diminuiscono fino a 525 nm, con conseguente artefatto spettrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Selezione di una regione di interesse per la sottrazione dello sfondo. (A) Immagine di intensità grezza, sommata a lunghezza d'onda. (B) Regioni dell'immagine selezionate per determinare lo spettro di sfondo media topixel per la sottrazione dello sfondo mostrata in rosso. (C) L'immagine di intensità sommata allo sfondo, corretta e sommata. (D) Colorazione RGB dell'immagine corretta (C). Il processo di generazione di un'immagine RGB di falsi colori è illustrato nella Figura 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : processo di generazione di un'immagine RGB di falsi colori. (A-C) Sono state selezionate tre bande di lunghezza d'onda distanziate uniformemente in tutta la gamma di acquisizione spettrale per la colorazione falsa (blu : 370 nm, verde e 420 nm, rosso e 470 nm). (D) L'immagine di intensità sommata generata dall'aggiunta di intensità di pixel da tutte le bande di lunghezza d'onda nel cubo dell'immagine. (E-G) Le immagini in pannelli (A-C) con le rispettive tabelle di ricerca a colori falsi applicati. (H) L'immagine risultante unita di (E-G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Selezione dell'area dei controlli con etichetta singola per la generazione di librerie spettrali. (A) Immagine RGB falsa colorata dell'autofluorescenza della cellula liscia delle vie aeree (ASM). (B) Mostrato in rosso, regioni di (A) scelte per la componente autofluorescenza della libreria spettrale. (C) Cellule ASM RGB false colorate etichettate con l'etichetta mitocondriale. (D) Mostrato in rosso, le regioni di (C) scelte per la componente etichetta mitochondiral della libreria spettrale. A causa dell'autofluorescenza delle cellule ASM localizzate vicino al nucleo, sono state selezionate piccole regioni lontano dai nuclei per identificare lo spettro dell'etichetta mitocondriale. (E) Cellule ASM rgb-false colorate trascate con la sonda GCaMP. (F) Le regioni di (E) selezionate per il componente GCaMP della libreria spettrale sono visualizzate in rosso. Simile a (D), sono state selezionate regioni lontane dai nuclei. (G) La libreria spettrale ottenuta da A-F, normalizzata ad un valore di unità alla lunghezza d'onda con il segnale più forte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 6
Figura 6 : Esempio di dati di immagine non misti in cui è possibile visualizzare i contributi di segnale relativi non misti da ogni componente della libreria. (A-D) L'abbondanza non mista di GCaMP, etichetta mitocondriale, autofluorescenza e termine di errore. (E-G) Le immagini in pannelli (A-C) con le rispettive tabelle di ricerca a colori falsi applicati. (H) L'immagine composita, unita, di falsi colori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 7
Figura 7 : Contributi di segnale relativo non mescolati, tra cui intensità media e percentuale di fluorescenza totale, da una libreria spettrale correttamente definita. (A-D) L'abbondanza non mista per l'autofluorescenza, GCaMP, etichetta mitocondriale, e termine di errore. Va notato che il termine di errore comprende meno del 10% del segnale di fluorescenza totale misurato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 8
Figura 8 : contributi di segnale relativo non miscelati, tra cui l'intensità media e la percentuale di fluorescenza totale, da una libreria spettrale che manca un componente noto per essere incluso nel campione (cioè una libreria spettrale sottodefinita). (A-C) L'abbondanza non mista di autofluorescenza, etichetta mitocondriale e termine di errore. Si noti che l'omissione di GCaMP dalla libreria spettrale ha aumentato i contributi del segnale relativo calcolati dai componenti della libreria, nonché il termine di errore, rispetto alla figura 7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9 : contributi di segnale relativo non miscelati, tra cui intensità media e percentuale di fluorescenza totale, da una libreria spettrale contenente un componente aggiuntivo noto per mancare nel campione (cioè una libreria spettrale sovradefinita). (A-E) L'abbondanza non mista di autofluorescenza, GCaMP, etichetta mitocondriale, etichetta nucleare e termine di errore. Si noti che l'aggiunta di un'etichetta nucleare alla libreria spettrale ha diminuito i contributi del segnale relativo calcolati dall'autofluorescenza, rispetto alla figura 7. Inoltre, il termine di errore viene diminuito al di sotto dell'errore percentuale specificato dalla libreria spettrale correttamente definita. Questo perché una libreria sovradefinita permetterà quasi sempre una migliore vestibilità ai dati sperimentali rispetto a una libreria correttamente definita, anche se i segnali di abbondanza per i componenti noti per essere assenti dal campione sono (in realtà) artefatti di sovradefinire il libreria spettrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10 : Confronto di immagini non miste quando si utilizza una libreria prima e dopo una corretta sottrazione del segnale di contaminazione dell'autofluorescenza. (A) Gli spettri "puri" originali derivati dai controlli "puri" derivati dai controlli a etichetta singola nelle cellule muscolari lisce delle vie aeree altamente autofluorescenti prima della sottrazione in scala descritta al punto 6.2.4. (B-D) Le immagini non mescolate di autofluorescenza, GCaMP e etichette nucleari generate utilizzando (A) come libreria. (E) Gli spettri puri corretti derivati dai controlli a etichetta singola nelle cellule muscolari lisce delle vie aeree altamente autofluorescenti dopo la sottrazione in scala. (F-H) Le immagini non mescolate di autofluorescenza, GCaMP e etichette nucleari generate utilizzando (E) come libreria. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Intensità media (AU)
Adeguato montaggio Underfitting Overfitting
Autofluorescenza 187 299 164
GCaMP 139 - 140
Etichetta mitocondriale 246 318 248
Etichetta nucleare - - 26
Errore RMS 53 126 43
Deviazione standard (AU)
Adeguato montaggio Underfitting Overfitting
Autofluorescenza 362 442 315
GCaMP 168 168
Etichetta mitocondriale 344 388 345
Etichetta nucleare - - 93
Errore RMS 62 126 44
Intensità massima (AU)
Adeguato montaggio Underfitting Overfitting
Autofluorescenza 6738 7409 6738
GCaMP 1336 - 1336
Etichetta mitocondriale 5098 5194 5098
Etichetta nucleare - - 1257
Errore RMS 1050 1286 910
% di fluorescenza totale
Adeguato montaggio Underfitting Overfitting
Autofluorescenza 30% 40% 26%
GCaMP 22% 43% 23%
Etichetta mitocondriale 39% - 40%
Etichetta nucleare - - 4%
Errore RMS 8% 17% 7%

Tabella 1: Una tabella che confronta la media, la deviazione standard e i valori massimi di intensità non mista per immagine di abbondanza non mista da una libreria spettrale adeguata e da librerie spettrali sottodefinite o sovradefinite, nonché la percentuale di fluorescenza totale per unmixed abbondanza immagine (l'intensità minima abbondanza non mescolata per ogni immagine era sempre zero). Dati tratti da Figura 7, Figura 8e Figura 9.

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Discussion

L'uso ottimale di un set-up di imaging iperspettrale a scansione eccitazione inizia con la costruzione del percorso luminoso. In particolare, la scelta della sorgente luminosa, i filtri (regolabili e dicroscopici), il metodo di commutazione dei filtri e la fotocamera determinano la gamma spettrale disponibile, la possibile velocità di scansione, la sensibilità del rivelatore e il campionamento spaziale. Le lampade ad arco Mercury offrono molti picchi di lunghezza d'onda di eccitazione, ma non forniscono un'uscita spettrale piatta e richiederanno una significativa riduzione del segnale ai picchi di uscita per correggere i dati dell'immagine spettrale a una risposta tracciabile del NIST38. Sorgenti luminose alternative, come le lampade ad arco Xe e i laser a luce bianca supercontinuum, possono fornire un'uscita spettrale più uniforme che è più adatta per l'imaging iperspettrale a scansione eccitazione38,39,40. La scelta della sorgente luminosa, i filtri regolabili e i filtri dicromatici determinano la gamma spettrale disponibile. Questa gamma deve essere scelta con attenzione per le informazioni spettrali desiderate del campione sperimentale.

Inoltre, si dovrebbe prendere in considerazione il meccanismo di commutazione utilizzato per i filtri regolabili, nonché vari fattori della fotocamera come l'efficienza quantistica, le dimensioni dei pixel e la frequenza dei fotogrammi disponibili, poiché questi fattori influenzeranno i potenziali tassi di campionamento41 ,42,43. Tuttavia, tutti gli altri fattori costanti, l'utilizzo dell'approccio di scansione delle eccitazioni dovrebbe fornire una maggiore sensibilità e la capacità di imaging più veloce, rispetto alla maggior parte delle immagini spettrali a scansione delle emissioni si avvicina a21.

Come osservato nell'introduzione, l'imaging iperspettrale si riferisce alla natura contigua e spettrosalmente sovrapposta dei dati acquisiti. Di conseguenza, le capacità del sistema devono essere in grado di raccogliere dati utilizzando la spaziatura delle lunghezze d'onda del centro di eccitazione meno della metà della distanza dell'FWHM dei filtri. Come riportato in precedenza, una serie accuratamente scelta di filtri regolabili a film sottile consente l'acquisizione di dati con lunghezze d'onda di centrami distanziate di 5 nm, una distanza sufficiente per sovracampionare lo spettro di eccitazione dato filtri con FWHM compreso tra 14-20 nm. Tale spaziatura fornisce una leggera ridondanza nella raccolta dei dati spettrali con probabilmente aumenta l'accuratezza del processo di disinfestazione. La considerazione di entrambe le gamme spettrali e il numero minimo necessario di canali di lunghezza d'onda per unmienza accurata sono stati discussi in precedenza44,45,46. A tal fine, data la larghezza di banda di questi filtri, l'intervallo di eccitazione deve essere selezionato per terminare a una lunghezza d'onda leggermente inferiore (5-10 nm inferiore) rispetto alla lunghezza d'onda cut-off del beamsplitter dicroic. Ciò garantirà che l'intera larghezza di banda dell'illuminazione dell'eccitazione sia al di sotto della lunghezza d'onda di taglio del beamsplitter dicroico (ad esempio, 360-485 nm per il filtro dicroroico 495) per evitare il cross-talk di eccitazione-emissione.

È necessario un software per controllare in modo indipendente ogni componente dell'hardware per ottenere scansioni di imaging spettrale ad alta velocità. Il software dovrebbe essere in grado di azionare l'otturatore, selezionare lunghezze d'onda di eccitazione e acquisire immagini a velocità sufficientemente elevate per soddisfare le condizioni sperimentali (i requisiti di frequenza di campionamento esatti varieranno l'esperimento, ma un esempio di obiettivo potrebbe essere quello di acquisire quattro pile di immagini spettrali complete al minuto). Esperimenti più complessi possono fare uso di più specchi dicrotice, obiettivi o posizioni XY. Ci sono una serie di pacchetti software disponibili per l'acquisizione di dati47,48. Micro-Manager è un software open source gratuito per l'automazione del microscopio che offre una varietà di opzioni di personalizzazione. Inoltre, Micro-Manager include un pannello di scripting per una personalizzazione aggiuntiva non disponibile all'interno dell'interfaccia utente principale. Ad esempio, è possibile utilizzare uno script personalizzato per ridurre il ritardo di 250 ms dello switcher di filtro regolabile a 10 ms in tutte le lunghezze d'onda di eccitazione ad eccezione delle transizioni di lunghezza d'onda in cui la rotellina del filtro ruota a un nuovo filtro regolabile, riducendo l'imaging efficace di imaging tempo di 240 ms per lunghezza d'onda per la maggior parte delle lunghezze d'onda. Questa personalizzazione ha permesso l'acquisizione di fino a 30 lunghezze d'onda in meno di 4 s. Infine, Micro-Manager può essere utilizzato insieme ad altri ambienti, come MATLAB, per personalizzare ulteriormente il controllo del dispositivo al microscopio.

Determinare l'intervallo di eccitazione spettrale corretto, il tempo di acquisizione e la lunghezza d'onda iniziale per la visualizzazione dei campioni e la successiva acquisizione dei dati è molto importante. Tuttavia, il funzionamento non corretto dei singoli componenti del sistema può richiedere un'ulteriore risoluzione dei problemi. Ogni componente del percorso ottico contribuisce ai dati dell'immagine acquisiti. Pertanto, è importante verificare la risposta spettrale e la trasmissione ottica dei componenti ottici all'interno del percorso di luce, soprattutto se si cerca di ottimizzare la risposta complessiva del sistema. Le sorgenti luminose hanno spesso impostazioni di intensità variabile e possono avere una riduzione della potenza nel corso della durata della lampadina40. Se un campione appare dim, la causa può essere ridotta uscita dalla sorgente luminosa. La funzione autoshutter in Micro-Manager, nella nostra esperienza, non funziona al 100% del tempo. La mancanza di segnale può indicare un otturatore chiuso. La lunghezza d'onda di eccitazione iniziale salvata nel file di configurazione di Micro-Manager può avere come impostazione predefinita una lunghezza d'onda con poco o nessun output spettrale, ad esempio l'esempio di 340 nm illustrato nella Figura 1.

Inoltre, non è raro scegliere erroneamente una lunghezza d'onda di eccitazione che si trova al di sopra della lunghezza d'onda tagliata del beamsplitter dichroic a passo lungo, con conseguente ulteriore cross-talk e/o luce di eccitazione essere evitato direttamente alla fotocamera che può potenzialmente danneggiare il sensore della fotocamera. Allo stesso modo, la regolazione del percorso della luce per l'imaging di trasmissione può comportare la perdita di segnale alla telecamera, a seconda della configurazione del microscopio. Inoltre, come indicato nella Figura 2, la scelta della lunghezza d'onda di eccitazione iniziale e del tempo di esposizione per la visualizzazione del campione può apparire appropriata, ma in realtà si traducono in pixel sovrasaturi ad altre lunghezze d'onda di eccitazione. Questo fatto non sarà evidente a meno che non venga controllata la saturazione dei pixel per ogni immagine, quindi è spesso prudente eseguire una pila di immagini di prova su un'area del campione che sembra contenere la fluorescenza più intensa.

Vale anche la pena notare che intensità variabili possono essere presenti nelle immagini scelte per le regioni di sfondo. Occorre prestare attenzione a garantire che queste regioni non contengano effettivamente dati di immagine rilevanti, poiché le successive misure di correzione dei dati sottrarranno questo segnale dai dati dell'immagine acquisiti in altre regioni del campione. A volte è necessario utilizzare le impostazioni di trasmissione e/o aumentare drasticamente il tempo di esposizione per verificare che la regione selezionata per la misurazione dello sfondo del campione non contenga effettivamente alcun campione. Allo stesso modo, le immagini non mescolate possono presentare macchie scure o fori nell'immagine autofluorescenza. Ciò può essere dovuto a una libreria impropria causata dall'autofluorescenza "contaminazione" dei segnali spettrali "puri" provenienti da cellule monoetichettate. Questo perché qualsiasi segnale spettrale "puro" raccolto da un campione contenente autofluorescenza conterrà invariabilmente alcuni degli spettri di autofluorescenza stessa, anche se in quantità di tracce. Occorre prestare attenzione a sottrarre i segnali di autofluorescenza dai controlli con etichetta singola per garantire una corretta libreria spettrale, come descritto in diverse occasioni da Mansfield et al.28,29,30, 31,32

Anche se non è dimostrato in questo articolo, il sistema di imaging spettrale di scansione delle esposizioni può essere utilizzato anche per l'imaging time-lapse e l'imaging su più posizioni XY (o un grande campo visivo a causa delle cuciture dell'immagine) in più piani focali. Se queste opzioni sono desiderate per un singolo esperimento, si dovrebbe prestare attenzione all'importanza dell'ordine di acquisizione e ai potenziali effetti del fotosbiancamento. Vale anche la pena notare che se il tempo effettivo impiegato supera il tempo stimato (ad esempio, uno stack di immagini richiede 11 s per acquisire piuttosto che i 10 s stimati), Micro-Manager continuerà ad acquisire il numero selezionato di timepoint e/o posizioni. Questo errore di calcolo può combinarsi con più punti temporali e alterare il campionamento temporale calcolato, alterando potenzialmente qualsiasi conclusione fatta dai dati.

In questo esempio viene illustrata la possibilità di separare tre fonti di fluorescenza all'interno di un intervallo di scansione di eccitazione di 145 nm. Esperimenti precedenti che utilizzano questo sistema sono stati in grado di separare fino a cinque fonti di fluorescenza all'interno dello stesso intervallo. Il tempo necessario per l'acquisizione dell'immagine è inferiore a 1 min, che è significativamente più veloce rispetto alla maggior parte dei sistemi di imaging spettrale a scansione delle emissioni. I miglioramenti nel percorso della luce, come l'ottimizzazione della lunghezza d'onda dell'eccitazione ad alta velocità, potrebbero far avanzare ulteriormente questa tecnologia di imaging a velocità sufficienti per l'imaging spettrale video-rate.

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Disclosures

Drs. Leavesley e Rich rivelano interesse finanziario in una start-up, SpectraCyte LLC, fondata per commercializzare la tecnologia di imaging spettrale.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto di NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18334060163, e il Fondo Di Abraham Mitchell.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

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Ingegneria Numero 150 iperspettrale spettroscopia eccitazione fluorescenza microscopia autofluorescenza imaging filtro regolabile pellicola sottile
Microscopia di imaging iperspettrale di eccitazione-scanning per discriminare in modo efficiente i segnali di fluorescenza
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Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

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