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Engineering

Microscopie d'imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation pour discriminer efficacement les signaux de fluorescence

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

L'imagerie spectrale est devenue une solution fiable pour l'identification et la séparation des signaux de fluorescence multiples dans un seul échantillon et peut facilement distinguer les signaux d'intérêt du fond ou de l'autofluorescence. L'imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation améliore cette technique en diminuant le temps d'acquisition d'image nécessaire tout en augmentant simultanément le rapport signal-bruit.

Abstract

Plusieurs techniques reposent sur la détection des signaux de fluorescence pour identifier ou étudier des phénomènes ou pour élucider les fonctions. La séparation de ces signaux de fluorescence s'est avérée lourde jusqu'à l'avènement de l'imagerie hyperspectrale, dans laquelle les sources de fluorescence peuvent être séparées les unes des autres ainsi que des signaux de fond et de l'autofluorescence (étant donné la connaissance de leurs signatures). Cependant, l'imagerie hyperspectrale traditionnelle de balayage des émissions souffre de temps d'acquisition lents et de faibles rapports signal-bruit en raison du filtrage nécessaire de l'excitation et de la lumière des émissions. Il a déjà été démontré que l'imagerie hyperspectrale de balayage d'excitation réduit le temps d'acquisition nécessaire tout en augmentant simultanément le rapport signal-bruit des données acquises. À l'aide d'équipements disponibles dans le commerce, ce protocole décrit comment assembler, calibrer et utiliser un système de microscopie d'imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation pour séparer les signaux de plusieurs sources de fluorescence dans un seul échantillon. Bien que très applicable à l'imagerie microscopique des cellules et des tissus, cette technique peut également être utile pour tout type d'expérience utilisant la fluorescence dans laquelle il est possible de varier les longueurs d'onde d'excitation, y compris, mais sans s'y limiter: l'imagerie chimique, applications environnementales, soins oculaires, sciences alimentaires, sciences médico-légales, sciences médicales et minéralogie.

Introduction

L'imagerie spectrale peut être réalisée de diverses façons et est mentionnée par plusieurs termes1,2,3,4. En général, l'imagerie spectrale désigne les données acquises dans au moins deux dimensions spatiales et une dimension spectrale. L'imagerie multispectrale et hyperspectrale se distingue le plus souvent par le nombre de bandes de longueur d'onde ou par le fait que les bandes spectrales sont contigus1. Pour cette application, les données hyperspectrales sont définies comme des données spectrales acquises avec des bandes de longueur d'onde contigus obtenues par espacement des longueurs d'onde du centre au moins la moitié de la largeur totale à la moitié maximale (FWHM) de chaque filtre de bandepass utilisé pour l'excitation (c.-à-d., 5 nm espacement de longueur d'onde centrale pour les filtres bandpass avec des bandes passantes de 14-20 nm). La nature contigue des bandes de données permet un suréchantillonnage de l'ensemble de données, en veillant à ce que les critères de Nyquist soient satisfaits lors de l'échantillonnage du domaine spectral.

L'imagerie hyperspectrale a été développée par la NASA dans les années 1970 et 1980 en conjonction avec le premier satellite Landsat5,6. La collecte de données à partir de plusieurs bandes spectrales adjacentes a permis la génération d'un spectre d'éclat de chaque pixel. L'identification et la définition du spectre d'éclat des composants individuels ont permis non seulement de détecter les matériaux de surface par leurs spectres caractéristiques, mais aussi d'éliminer les signaux intermédiaires, tels que les variations du signal conditions atmosphériques. Le concept de détection des matériaux à l'aide de leurs spectres caractéristiques a été appliqué aux systèmes biologiques en 1996, lorsque Schck et coll. ont utilisé des combinaisons de cinq fluorophores différents et de leurs spectres connus pour distinguer les chromosomes étiquetés dans un processus appelé karyotypage spectral7. Cette technique a été élaborée en 2000 par Tsurui et coll. pour l'imagerie par fluorescence d'échantillons de tissus, à l'aide de sept colorants fluorescents et d'une décomposition de la valeur singulière pour obtenir la séparation spectrale de chaque pixel en combinaisons linéaires de spectres dans la référence. bibliothèque8. Semblable à leurs homologues de télédétection, la contribution de chaque fluorophore connu peut être calculée à partir de l'image hyperspectrale, donnée des informations a priori du spectre de chaque fluorophore.

L'imagerie hyperspectrale a également été utilisée dans les domaines de l'agriculture9, astronomie10, biomédecine11, imagerie chimique12, applications environnementales13, soins oculaires14, science alimentaire15, science médico-légale16,17, science médicale18, minéralogie19, et la surveillance20. Une limitation clé des systèmes actuels d'imagerie hyperspectrale au microscope fluorescence est que la technologie d'imagerie hyperspectrale standard isole les signaux de fluorescence dans les bandes étroites par 1) filtrant d'abord la lumière d'excitation pour contrôler l'excitation de l'échantillon, puis 2) le filtrage supplémentaire émis la lumière pour séparer l'émission de fluorescence en bandes étroites qui peuvent plus tard être séparées mathématiquement21. Le filtrage de l'éclairage d'excitation et de la fluorescence émise réduit la quantité de signal disponible, ce qui abaisse le rapport signal-bruit et nécessite de longs délais d'acquisition. Le faible signal et les longs délais d'acquisition limitent l'applicabilité de l'imagerie hyperspectrale en tant qu'outil de diagnostic.

Une modalité d'imagerie a été développée qui fait usage de l'imagerie hyperspectrale mais amplifie le signal disponible, réduisant ainsi le temps d'acquisition nécessaire21,22. Cette nouvelle modalité, appelée imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation, acquiert des données d'image spectrale en variant la longueur d'onde de l'excitation et en recueillant un large éventail de lumière émise. Il a déjà été démontré que cette technique donne des ordres de grandeur augmentations du rapport signal-bruit par rapport aux techniques de balayage des émissions21,22. L'augmentation du rapport signal-bruit est en grande partie due au large passage de bande (600 nm) de lumière d'émission détecté, tandis que la spécificité est fournie en filtrant seulement la lumière d'excitation au lieu de l'émission de fluorescence. Cela permet à toute la lumière émise (pour chaque longueur d'onde d'excitation) d'atteindre le détecteur21. En outre, cette technique peut être utilisée pour distinguer l'autofluorescence des étiquettes exogènes. En outre, la capacité de réduire le temps d'acquisition en raison de l'augmentation du signal détectable réduit le risque de photoblanchiment ainsi que permet des balayages spectrals à un taux d'acquisition qui est acceptable pour l'imagerie vidéo spectrale.

L'objectif de ce protocole est de servir de guide d'acquisition de données pour la microscopie d'imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation. En outre, des descriptions sont incluses qui aident à comprendre le chemin de lumière et le matériel. On décrit également la mise en œuvre d'un logiciel open-source pour un microscope d'imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation. Enfin, des descriptions sont fournies sur la façon de calibrer le système selon une norme traçable NIST, d'ajuster les paramètres logiciels et matériels pour obtenir des résultats précis et de démélanger le signal détecté en contributions de composants individuels.

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Protocol

1. Configuration de l'appareil

  1. Source de lumière : sélectionnez une source de lumière spectrale à large bande avec une puissance élevée et une forte collimation (une lampe à arc de 300 W Xe a été utilisée pour ces études).
  2. Obturateur (facultatif) : ajoutez un obturateur à la trajectoire optique pour réduire le photoblanchiment pour l'imagerie en accéléré.
  3. Système de filtre réglable : incorporez un ensemble de réglage mécanique et un filtre réglable à couches minces (TFTF) pour permettre la plage d'excitation réglable en longueur d'onde désirée (p. ex., 360-485 nm).
  4. Microscope : utilisez un microscope à fluorescence inversée comprenant une tourelle et un contrôleur de filtre dichroique motorisé.
    1. Cube de filtre fluorescence : assemblez un cube de filtre à fluorescence à longue passe. Pour de meilleurs résultats, choisissez un miroir dichroïque et un filtre d'émission à long passage à la même longueur d'onde pour obtenir une séparation optimale de l'excitation de la lumière d'émission (par exemple, 495 nm).
    2. Objectif : utiliser un objectif apochromatique approprié pour assurer une focalisation uniforme sur la plage de longueur d'onde utilisée pour l'expérience (un objectif d'eau de 60x a été utilisé pour cette étude).
    3. Étape automatisée (facultatif) : utiliser une étape automatisée pour l'échantillonnage rapide de plusieurs champs de vision et/ou de très grands champs grâce à des coutures d'image. Calibrer la scène avec l'objectif et la caméra.
  5. Caméra : sélectionnez une caméra appropriée pour atteindre les exigences de résolution spatiale, de sensibilité et de bruit de l'expérience (ce système a utilisé une caméra sCMOS à haute sensibilité).

2. Logiciel d'acquisition

  1. Choisissez un logiciel qui permet un contrôle indépendant de chaque composant matériel, tel que Micro-Manager.
    1. Création du fichier de configuration : le fichier de configuration est un ensemble enregistré d'instruments et d'instructions que Micro-Manager chargera pour faire fonctionner le matériel du système. Pour créer un fichier de configuration, cliquez sur Outils 'gt; Hardware Configuration Wizard.
      1. Dans l'étape 1, cliquez sur Créer une nouvelle configuration 'gt; Suivant pour continuer. Notez que l'utilisateur peut choisir de modifier ou d'explorer la configuration existante si celle-ci est déjà disponible.
      2. À l'étape 2, parcourez la liste des appareils disponibles pour trouver les appareils à contrôler par micro-gestionnaire, comme le microscope, la lampe, la scène, l'obturateur et l'appareil photo. Lorsqu'il est mis en surbrillance, cliquez sur Ajouter... bouton pour ajouter l'appareil à la liste des périphériques installés. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre.
        1. Désignez l'étiquette de l'appareil dans la boîte Étiquette. (p. ex. caméra sCMOS)
        2. Sous valeur, sélectionnez le port COM approprié pour chaque appareil. Cela entraînera l'affichage d'une liste de propriétés de l'appareil au bas de la fenêtre.
        3. Laissez les propriétés de l'appareil à leurs paramètres par défaut. Notez que les valeurs personnalisées pour chaque propriété de périphérique peuvent être saisies comme vous le souhaitez.
        4. Lorsque chaque appareil est ajouté, cliquez sur le bouton Suivant pour passer à l'étape suivante. Notez que si des périphériques sont laissés de côté ou doivent être modifiés, le fichier de configuration peut être modifié ultérieurement comme décrit à l'étape 2.1.1.1.
      3. À l'étape 3, utilisez les menus déroulants pour sélectionner la caméra par défaut, l'obturateur et l'étape de mise au point. Si l'auto-shutter est souhaité, cliquez sur la case cocher ci-dessous la liste de déroulant étape de mise au point. Si la direction de mise au point de l'étape Z est connue, sélectionnez-la dans la liste de déroulantes sous les directions de mise au point de l'étape (avancée). Sinon, laissez le défaut comme Inconnu.
      4. À l'étape 4, cliquez en double sur les cases sous la rubrique Delay [ms] pour régler les retards associés aux dispositifs automatisés tels que des retards de 100 ms pour la lampe, la scène et l'obturateur, et un délai de 250 ms pour les commandes à l'assemblage de tuning mécanique pour tenir compte de la temps de commutation mécanique entre les filtres.
      5. À l'étape 5, assigner des étiquettes pour les périphériques d'état. La configuration du système de microscope à balayage d'excitation utilise des étiquettes dans le bloc de filtre pour identifier chaque cube de filtre de fluorescence (par exemple, l'état 0 correspond à l'étiquette Bright, le cube de filtre vide utilisé lors de l'imagerie du champ lumineux; l'état 3 correspond à l'étiquette 495 nm et au cube de filtre dichroic personnalisé de 495 nm utilisé pour séparer la lumière d'excitation et d'émission à 495 nm). Les étiquettes sont également utilisées dans l'assemblage de tuning mécanique pour stocker les commandes de commutation pour chaque longueur d'onde d'excitation (par exemple, l'état 0 correspond à la commande de tuning de longueur d'onde d'excitation de 340 nm pour l'assemblage de tuning mécanique).
      6. À l'étape 6, cliquez sur le bouton Parcourir à côté de la case de fichiers Configuration pour choisir un emplacement d'enregistrement et le nom du fichier pour le fichier de configuration. Cliquez sur la finition pour enregistrer le fichier de configuration.
    2. Groupes de démarrage et préréglages : Micro-Manager peut stocker différents groupes dans chaque fichier de configuration pour activer ou modifier un sous-ensemble du matériel. Par exemple, un groupe de démarrage du système et une combinaison préréglage stockent les paramètres par défaut tels que la taille de la binning et les taux de lecture de l'appareil photo.
      1. Créer un groupe (par exemple, Système) en cliquant sur la fenêtre principale de la sous-section Groupe.
      2. Vérifier toute utilisation dans le groupe? boîtes à l'intérieur du groupe qui exigeront une valeur par défaut à définir (par exemple, binning dans la caméra par défaut associée).
      3. Créez un nouveau préensemble (p. ex., "Startup") en cliquant sur la fenêtre principale de la sous-section Préset.
      4. Chaque case cochée à l'étape 2 apparaîtra comme une option pré-réglé ici. Choisissez une valeur par défaut à charger pour chaque case cochée.
    3. Groupe et préréglages pour les longueurs d'onde d'excitation : Micro-Manager traite chaque longueur d'onde d'excitation comme son propre canal avec sa propre commande de commutation de longueur d'onde ; par conséquent, chacun doit être sauvé comme son propre pré-ensemble.
      1. Créer un nouveau groupe pour contenir un ensemble de longueurs d'onde d'excitation désirées (p. ex., « 495 nm dichroic »)
      2. Vérifiez la case Utilisation en groupe? nommée Étiquette correspondant à l'appareil VF-5.
      3. Créez un nouveau préensemble nommé pour chaque longueur d'onde d'excitation (p. ex., « 340 nm »).
      4. Attribuez à chaque pré-ensemble le nom de propriété et la valeur préréglé approprié (p. ex., nom de propriété : « Étiquette »; valeur préfixée : « 340 nm »).
    4. Outil d'acquisition multidimensionnelle : cliquez surAcq Multi-D.près du haut à gauche de la fenêtre Micro-Manager pour ouvrir un outil personnalisable à utiliser pour capturer une image de l'échantillon à chaque longueur d'onde d'excitation avec le clic d'un seul bouton. Il existe plusieurs options de personnalisation pour construire l'acquisition exactement comme vous le souhaitez.
      1. Points temporels (non utilisés dans cet exemple) : pour les études sans composant time-lapse, laissez la case incontrôlée. Si des études en time-lapse sont souhaitées, cochez cette case. Si coché, entrez le nombre de fois pour effectuer le reste des paramètres d'acquisition dans la case Nombre. Définir le temps entre les acquisitions successives en entrant la durée dans la boîte D'intervalle et choisissez l'unité appropriée (millisecondes, secondes ou minutes; généralement secondes).
      2. Plusieurs positions (XY; non utilisées dans cet exemple) : pour les études d'une seule position XY, laissez la case incontrôlée. Si plusieurs positions XY sont souhaitées, cochez la case et cliquez sur le bouton Modifier le bouton liste de position pour ouvrir une fenêtre séparée. Déplacez la scène vers chaque emplacement souhaité et cliquez sur le bouton Mark pour enregistrer cette position dans le logiciel. Répétez l'opération jusqu'à ce que toutes les positions XY souhaitées soient marquées. Fermez cette fenêtre pour continuer.
      3. Z-stacks (diapositives; non utilisé dans cet exemple): pour les études d'une seule position Z, laissez la boîte non cochée. Si plusieurs positions Z sont souhaitées, cochez la case. Déplacez la scène vers la position Z de début souhaitée et cliquez sur le bouton Set à côté de la boîte Z-start. Déplacez la scène vers la position Z de fin souhaitée et cliquez sur le bouton Set à côté de la case Z-end. Entrez la taille d'étape désirée (en microns) dans la boîte Z-step.
      4. Canaux : assurez-vous que la case Chaînes est cochée. Ici, les canaux sont les noms donnés aux longueurs d'onde d'excitation individuelles. Les « canaux » disponibles correspondent aux « Groupes » décrits dans les étapes 2.1.2 et 2.1.3.
        1. Groupe : cliquez sur la liste déroulante pour sélectionner un groupe parmi lequel choisir les longueurs d'onde d'excitation disponibles (p. ex., 495 nm dichroic).
        2. Cliquez sur la boîte Keep Shutter Open pour garder l'obturateur ouvert entre les acquisitions pour chaque canal. Notez que l'obturateur se fermera toujours entre les scans spectrals successifs si cette case est cochée, en supposant que l'option d'autoshutter est également sélectionnée dans la fenêtre principale.
      5. Cliquez sur le nouveau bouton pour ajouter des canaux à la liste d'acquisition. Notez que le bouton Supprimer peut être utilisé pour supprimer tous les canaux qui ne sont plus désirés et que Up and Down peut être utilisé pour réorganiser n'importe quel canal sélectionné.
        1. Assurez-vous que la case à cocher Use? est sélectionnée pour chaque longueur d'onde désirée dans l'analyse spectrale.
        2. Configuration : cliquez sur la liste de déroulantes sous Configuration et choisissez la première longueur d'onde dans la plage spectrale souhaitée (par exemple, 340 nm).
        3. Exposition : double-cliquez sur la case sous Exposition et saisisetez le temps d'exposition souhaité pour la longueur d'onde sélectionnée (p. ex., « 100 » pour 100 ms). Consultez la section 5 (« Acquisition de données ») pour obtenir des suggestions pour sélectionner les temps d'exposition appropriés.
        4. Z-offset (non applicable dans un scan spectral) : laissez cette boîte vide (à 0) lors de l'exécution d'un balayage spectral.
        5. Z-stack : assurez-vous que cette case est cochée pour chaque longueur d'onde de la plage spectrale si vous effectuez une pile Z.
        6. Passer Fr. (non applicable dans un scan spectral): laisser cette boîte vide (à 0) lors de l'exécution d'un balayage spectral. Notez qu'il peut être utile de sauter sélectivement des cadres dans le cas où une ou quelques longueurs d'onde d'excitation sont significativement plus puissantes que d'autres ou si les longueurs d'onde d'excitation individuelles s'avèrent particulièrement phototoxiques.
        7. Couleur : laissez cette boîte vide lors de l'exécution d'un scan spectral. Notez que les couleurs peuvent être choisies pour les bandes de longueur d'onde individuelles à des fins de visualisation de données, mais la couleur est inappropriée pour le démélange spectral ultérieur.
        8. Répétez ces étapes jusqu'à ce que chaque longueur d'onde d'excitation désirée dans la plage de balayage spectrale donnée soit ajoutée.
      6. Ordre d'acquisition : cliquez sur la liste de déroulantpour pour choisir dans quel ordre les options ci-dessus (2.1.4.1-2.1.4.5) seront exécutées. Pour les scans spectrals tels que celui montré ici, l'ordre d'acquisition est tout simplement Channel. Notez que des options supplémentaires apparaissent lorsque des cases supplémentaires sont cochées dans l'outil d'acquisition multidimensionnelle [points de temps, positions multiples (XY) et Z-stacks (tranches)] et permettent le choix de la position ou du temps en premier, suivi s'il s'agit d'une tranche ou d'une chaîne.
      7. Autofocus (non utilisé dans cet exemple) : Si plusieurs positions (XY) sont sélectionnées, plusieurs styles différents d'autofocus sont disponibles. Cliquez sur le bouton Options et sélectionnez une méthode d'autofocus à partir de la liste de déroulantà à côté du bouton de fermeture.
      8. Résumé: examiner cette fenêtre pour un résumé du nombre de points de temps, positions XY, tranches Z, canaux, nombre total d'images, mémoire totale, durée de balayage, et l'ordre d'acquisition pour s'assurer que les informations énumérées correspondent aux paramètres d'acquisition attendus.
      9. Enregistrer des images : assurez-vous que cette case est cochée pour enregistrer les données collectées grâce à l'utilisation de l'outil d'acquisition multidimensionnelle.
        1. Cliquez sur le ... bouton à côté de la racine d'annuaire pour choisir une racine d'annuaire dans laquelle les fichiers seront enregistrés. Nommez la racine de l'annuaire d'une manière qui décrit les détails pertinents de l'expérience (p. ex., GCaMP Airway Smooth Muscle Cells).
        2. Entrez un nom dans la boîte à côté du préfixe Nom qui décrit l'acquisition d'image en cours (par exemple FOV1-100ms-60X-495nmDichroicFilter). Il est conseillé de créer un préfixe de nom qui identifie le champ de vision et le temps d'exposition, ainsi que d'autres informations pertinentes telles que l'objet et le filtre dichroïque utilisé. Notez que la première pile d'images prise à l'aide de ces paramètres sera enregistrée avec « 1 » suivant le préfixe de nom. Toute pile ultérieure prise avec le même préfixe d'annuaire et de nom sera enregistrée avec « n », dans lequel « n » est le nombre de fois qu'une pile a été prise avec ce nom dans le répertoire.
        3. Cliquez sur Fichiers d'image séparés pour s'assurer que l'image générée à chaque longueur d'onde d'excitation est enregistrée.
      10. Enregistrer comme: cliquez sur le bouton Enregistrer comme ... près de la droite en haut de l'outil d'acquisition multidimensionnelle pour enregistrer ces paramètres d'acquisition pour une utilisation future facile. Notez que la racine de l'annuaire et les préfixes de nom seront également sauvegardés.
      11. Acquérir: enfin, cliquez sur l'acquérir! bouton pour commencer à acquérir des images en fonction des paramètres d'acquisition choisis ci-dessus.

3. Correction de réponse spectrale (facultatif) :

  1. La correction de sortie spectrale peut être effectuée pour calibrer la réponse spectrale du système à une norme connue, comme une lampe traçable NIST ou tout autre standard ou instrument traçable NIST. Cette étape est particulièrement importante si les résultats sont comparés à d'autres instruments d'imagerie spectrale, spectromètres, ou entre différents laboratoires. Ce processus a été rapporté en détail précédemment21,23.
    1. Utilisez un spectromètre calibré à une source lumineuse traçable par le NIST (comme le LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) ou d'autres normes traçables par le NIST pour acquérir la puissance spectroradiométrique de l'éclairage mesurée au stade de l'échantillon. Effectuer une correction distincte pour chaque combinaison de réglage de source lumineuse, miroir dichroïque, et objectif. Utilisez une sphère d'intégration couplée au spectromètre pour mesurer avec précision l'éclairage grand angle à partir de l'objectif du microscope.
    2. Utilisez une méthode d'intégration, telle que la règle trapézoïdale, pour intégrer les données spectroradiométriques sur les longueurs d'onde éclairées. Une bande passante de 40 nm pour l'intégration centrée autour de la longueur d'onde centrale est suffisante pour la plupart des filtres qui ont une bande passante nominale comprise entre 14-20 nm pleine largeur à mi-maximum (FWHM). La valeur intégrée représente l'intensité de l'éclairage spectral à chaque bande de longueur d'onde d'excitation.
    3. Tracer l'intensité intégrée de chaque bande de longueur d'onde en fonction de la longueur d'onde du centre d'excitation pour permettre la visualisation du profil d'intensité de l'éclairage spectral.
    4. Déterminez la bande de longueur d'onde avec la plus faible intensité intégrée.
    5. Normaliser le profil d'intensité de l'éclairage spectral en divisant l'intensité intégrée la plus faible par l'intensité intégrée de chaque bande de longueur d'onde pour générer un facteur de correction dépendant de la longueur d'onde.

4. Préparation de l'échantillon

  1. Préparer un échantillon « vierge » (p. ex., placer un bordereau en verre dans la chambre cellulaire et ajouter 1 ml de tampon). Ce tampon a été décrit précédemment24.
  2. Préparer un échantillon non étiqueté pour déterminer toute autofluorescence de l'échantillon (p. ex., placer une feuille de verre contenant des cellules musculaires lisses non étiquetées25,26 dans la chambre cellulaire et ajouter 1 ml de tampon).
  3. Préparer un échantillon distinct à étiquette unique pour chaque étiquette fluorescente utilisée dans l'expérience comme suit :
    1. Ajouter l'étiquette mitochondriale diluée pour tamponner pour atteindre une concentration de 100 nM. Ajoutez ce tampon à la glissière contenant des cellules musculaires lisses des voies respiratoires. Incuber pendant 20 min à 20-25 oC. Déplacer la glissière de couverture vers la chambre cellulaire et ajouter 1 ml de tampon. Notez que la concentration optimale de l'étiquette mitochondriale variera selon des facteurs tels que le fabricant, la couleur associée et la spécificité souhaitée.
    2. Déplacez un bordereau contenant des cellules musculaires lisses des voies respiratoires transfectées avec la sonde GCaMP27 à la chambre cellulaire et ajoutez 1 ml de tampon.
  4. Préparer un ou plusieurs échantillons expérimentaux contenant un mélange des étiquettes fluorescentes désirées.
    1. Ajouter 1 ml de tampon (100 nM de concentration d'étiquette mitochondriale) à une cale contenant des cellules musculaires lisses des voies respiratoires transfectées avec la sonde GCaMP et incuber pendant 20 min à 20-25 oC. Déplacer la glissière de couverture vers la chambre cellulaire et ajouter 1 ml de tampon.

5. Acquisition de données :

  1. Vérifiez que le correct dichroic beamsplitter (p. ex., 495 nm dichroic filter cube), objectif (p. ex., objectif de l'eau 60x) et la caméra (caméra sCMOS) sont sélectionnés.
  2. Chargez l'échantillon sur la scène.
  3. Il suffit de cliquer en double avec la case à côté de l'exposition [ms] et du type « 100 » pour fixer le temps d'exposition à 100 ms. Notez que le temps d'exposition peut devoir être augmenté ou diminué en fonction de l'intensité de fluorescence de l'échantillon.
  4. Sélectionnez 475 nm dans le menu déroulant de la fenêtre principale Micro-Manager pour l'affichage initial de l'échantillon. Notez que 475 nm peut ne pas être la longueur d'onde optimale pour l'affichage de l'échantillon ou de déterminer si la sursaturation se produira tout au long de la pile d'image.
  5. Cliquez en direct pour voir l'échantillon.
    1. Cliquez sur le bouton de portée d'affichage d'intensité automatique Auto à côté de l'histogramme au bas de la fenêtre pour apporter les valeurs minimales et maximales dans des plages visuelles significatives.
  6. Utilisez les boutons de mise au point du microscope pour vous concentrer sur l'échantillon. Il est souvent utile de trouver le bord de l'échantillon pour aider à se concentrer. L'échantillon sera focalisé lorsque les caractéristiques de bord de l'image apparaissent nettes. Notez qu'il peut être nécessaire de cliquer sur le bouton Auto plusieurs fois pendant la mise au point pour aider à visualiser l'image de fluorescence. En outre, certains utilisateurs peuvent trouver plus facile de se concentrer sur l'échantillon si le microscope est en mode transmission.
    1. Si vous vous concentrez en mode transmission, pour des raisons de sécurité, assurez-vous d'abord que la source de lumière spectrale ne transmet pas la lumière aux oculaires avant d'ajuster le chemin de la lumière pour l'imagerie de transmission. Notez également qu'il peut y avoir de petites déviations entre le foyer des images de transmission et de fluorescence. Lorsque la mise au point acceptable a été atteinte, reconfigurez la voie de la lumière pour l'imagerie par fluorescence spectrale.
  7. Cliquez sur le Multi-D Acq. bouton près du haut à gauche de la fenêtre pour ouvrir l'outil d'acquisition multidimensionnelle (décrit et configuré dans la section 2).
  8. Choisissez une plage spectrale appropriée pour l'acquisition spectrale (p. ex., 360-485 nm pour le filtre dichroic de 495 nm) en cliquant sur le bouton Charge... en haut à droite de la fenêtre d'outil multidimensionnelle d'acquisition et en naviguant vers les paramètres d'excitation enregistré précédemment (à l'étape 2.1.4.10). Voir discussion pour obtenir de l'information sur les plages spectrales appropriées.
  9. Acquérir une image de fond/blanc qui ne contient pas de données de fluorescence à utiliser pour la soustraction de fond et de bruit. Cela peut être effectué à l'aide d'un échantillon vierge (étape 4.1) ou en naviguant vers une région vierge d'un échantillon expérimental. Comme décrit à l'étape 5.6, cela est plus facile à réaliser en trouvant le bord de l'échantillon, puis en le positionnant de sorte que le bord est centré dans le champ de vision.
    1. Une fois que les paramètres d'acquisition sont confirmés et qu'une région d'arrière-plan est visible, cliquez sur le bouton Acquire! pour acquérir une pile d'images spectrales contenant l'arrière-plan et le bruit à utiliser pour la soustraction plus tard. Il convient de noter que les échantillons sont susceptibles d'avoir une fluorescence plus intense loin du bord de l'échantillon. Il peut être conseillé de se déplacer sur l'échantillon pour trouver les régions les plus « brillantes » et effectuer plusieurs piles d'images d'essai pour déterminer les temps d'acquisition appropriés et éviter la surexposition.
  10. Prenez une seule pile d'images sur une région de l'échantillon qui semble avoir une fluorescence intense pour s'assurer qu'aucune combinaison de longueurs d'onde et que les temps d'exposition entraînent une surexposition.
  11. Utilisez ImageJ pour confirmer qu'aucune longueur d'onde ne contient de pixels surexposés.
    1. Dans ImageJ, cliquez sur Fichier 'gt; Import 'gt; Image Sequence et naviguer vers le dossier contenant les images spectrales prises à l'étape 5.10. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre. Cliquez sur la case à côté du nombre d'images et entrez le nombre de longueurs d'onde incluses dans l'analyse spectrale (p. ex., 26). Laissez l'image de départ et l'incrément comme «1». Cliquez sur le bouton OK pour continuer.
    2. Appuyez sur M sur le clavier pour utiliser la fonction mesure d'ImageJ. Assurez-vous que le numéro indiqué sous Max n'est pas la limite de détection supérieure de la caméra (p. ex., 65 535). Répétez l'opération pour chaque image de l'analyse spectrale. Notez que la limite de détection de la caméra dépend de la caméra elle-même. La limite supérieure est affichée en haut à droite de l'histogramme dans la fenêtre principale de MicroManager. Alternativement, la limite supérieure peut être déterminée en ouvrant une image dans ImageJ et en naviguant vers l'image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste. Cliquez sur le bouton Set dans la fenêtre contextrice résultante, entrez une valeur excessivement grande (par exemple, 999 999) dans le blanc à côté de la valeur affichéemaximum, et cliquez sur OK pour continuer. La valeur maximale affichée dans le nouvel histogramme doit être la limite de détection supérieure de la caméra.
    3. Si des images contenaient la limite de détection supérieure de la caméra (p. ex. 65 535), ajustez le temps d'exposition de l'analyse spectrale pour s'assurer que le signal maximal dans toute la plage spectrale ne dépasse pas la plage dynamique de la caméra.
  12. Acquérir des données d'image spectrale à partir d'échantillons non étiquetés pour déterminer toute autofluorescence. Acquérir l'analyse pour les échantillons non étiquetés en utilisant une plage de longueur d'onde identique et les paramètres de la caméra que le reste de l'expérience (par exemple, 360-485 nm à 100 ms par longueur d'onde).
  13. Acquérir des données d'image spectrale à partir d'échantillons à étiquette unique à utiliser comme commandes spectrales pour construire la bibliothèque spectrale. Effectuez l'analyse pour chaque étiquette en utilisant une plage de longueur d'onde identique, le temps d'exposition et les paramètres de la caméra. Notez qu'un délai d'acquisition plus long peut être nécessaire pour certains échantillons afin de permettre une détection précise du spectre de l'étiquette avec une contribution minimale au bruit.
  14. Effectuer des mesures sur un échantillon expérimental (p. ex., cellules musculaires lisses des voies respiratoires humaines avec sonde GCaMP et étiquette mitochondriale).
    1. Placez une glissière ou une feuille de couverture contenant l'échantillon expérimental sur le microscope.
    2. Sélectionnez un champ de vision avec des cellules de tissus correctement étiquetées.
    3. Acquérir les données d'image spectrale en utilisant les paramètres d'acquisition souhaités, tel que décrit ci-dessus.

6. Analyse d'image

  1. Corriger les images à une réponse spectrale plate.
    1. Soustrayez le spectre de fond obtenu à la section 5.9 et multipliez par le coefficient de correction déterminé à la section 3.1.5. Cela peut être fait avec un script MATLAB simple ou une routine ImageJ. Un code MATLAB de soustraction/correction (utilisé dans cet exemple) est disponible sur le site Web de l'Université de South Alabama Bioimaging Resources.
      1. Chargez le code de soustraction/correction dans MATLAB.
      2. Dans l'onglet EDITOR, cliquez sur Exécuter. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre contenant un bouton Bsq Correction. Cliquez sur le bouton Bsq Correction pour ouvrir une autre fenêtre contenant des choix pour le répertoire de travail, le fichier d'arrière-plan, le fichier facteur de correction et le dossier tiff non corrigé.
        1. Utilisez le Parcourir... bouton à côté de Working Directory pour choisir le chemin de fichier où les fenêtres suivantes s'ouvriront. Naviguez vers le dossier contenant le spectre d'arrière-plan enregistré (en format .dat).
        2. Utilisez le Parcourir... bouton à côté de Fichier d'arrière-plan (.dat) pour ouvrir le répertoire choisi à l'étape 6.1.1.2.1 et choisir le fichier d'arrière-plan souhaité (en format .dat). Cliquez sur le bouton Ouvrez pour continuer.
        3. Utilisez le bouton Parcourir... à côté du facteur de correction (.dat) pour choisir un facteur de correction. L'annuaire du facteur de correction est par défaut à l'emplacement du code MATLAB parent. Si nécessaire, naviguez vers le sous-dossier contenant le fichier facteur de correction (en format .dat). Mettez en surbrillance le fichier de facteur de correction approprié et cliquez sur le bouton Open pour continuer.
        4. Utilisez le bouton Parcourir... à côté du dossier Tiff non corrigé pour ouvrir l'annuaire choisi à l'étape 6.1.1.2.1 et choisir le dossier pour la soustraction d'arrière-plan et la correction d'image (c'est généralement le dossier Pos0 qui contient immédiatement le brut images spectrales). Cliquez sur le bouton Ouvrez pour continuer.
        5. Cliquez sur le bouton Cliquez pour le bouton Correction Spectrale. Une fois le traitement terminé, une fenêtre s'ouvrira avec le message "Bsq Correction Complete". Cliquez sur le bouton OK pour continuer. Les images de correction sont stockées dans un nouveau dossier nommé avec le dossier d'image spectrale brute d'origine et un autre « Corrigé » (p. ex., Pos0-Corrected).
  2. Générer la bibliothèque spectrale. Plusieurs progiciels peuvent être utilisés pour extraire des données spectrales à partir d'images, y compris ImageJ. Pour de meilleurs résultats, normalisez chaque membre final à la bande de longueur d'onde de la plus grande intensité en déterminant quelle bande de longueur d'onde a la valeur la plus intense et en divisant la mesure à chaque bande de longueur d'onde par cette valeur maximale. Il convient également de noter que les contrôles monolabel générés dans les échantillons autofluorescents auront besoin de modifications supplémentaires28,29,30,31,32. Voir l'étape 6.2.4 et discuter pour plus de détails.
    1. Dans ImageJ, cliquez sur Fichier 'gt; Import 'gt; Image Sequence. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre. Naviguez vers le dossier contenant les images spectrales corrigées. Double-cliquez sur n'importe quel fichier d'image dans le dossier pour ouvrir une nouvelle fenêtre. Cliquez sur la case à côté du nombre d'images et entrez le nombre de longueurs d'onde incluses dans l'analyse spectrale (p. ex., 26). Laissez l'image de départ et l'incrément comme «1». Cliquez sur le bouton OK pour continuer.
    2. Dans la fenêtre principale ImageJ, cliquez sur l'icône de sélection du polygone, puis utilisez le pointeur de souris en cliquant sur l'image pour créer un polygone autour d'une région contenant des données de fluorescence. Notez qu'il peut y avoir peu ou pas de données de fluorescence dans la longueur d'onde initiale. Naviguez vers une autre image de longueur d'onde et / ou utiliser la luminosité / outil de contraste (Image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste 'gt; Auto) pour mieux visualiser les régions contenant des données de fluorescence d'intérêt.
    3. Avec le polygone dessiné, générer le profil de l'axe Z en cliquant sur Image 'gt; Stacks 'gt; Plot Z-axis Profile. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les données spectrales comme un fichier .csv.
    4. Effectuer une soustraction pour assurer une bibliothèque spectrale appropriée avec des étiquettes pures dépourvues de contamination par l'autofluorescence. Utilisez l'équationsuivante 29 pour isoler un spectre pur du mélange d'une seule étiquette et de fluorescence :
      Equation 1(1)
      Où: Spur est le spectre pur de l'étiquette, Smixte est le spectre mesuré de l'échantillon contaminé par l'autofluorescence, S autoFL est le spectre d'autofluorescence mesurée, "a" est un scalaire multiplicateur du spectre d'autofluorescence (entre 0 et 1; p. ex. 0,4), et le « décalage » est un décalage (habituellement 0). Variez le terme « a » jusqu'à ce qu'une valeur proche de zéro soit atteinte pour la contribution apparente de l'autofluorescence. Des informations supplémentaires peuvent être trouvées dans plusieurs publications28,29,30,31,32.
  3. Démélangeles des données d'image spectrale. L'étape de démélangement générera une image d'abondance pour chaque étiquette fluorescente, où l'abondance est la quantité de signal de fluorescence relative dans l'image de l'étiquette respective. Plusieurs algorithmes de déminage sont disponibles pour une utilisation avec ImageJ33,34,35. De plus, un code MATLAB spectral de mélange (utilisé dans cet exemple) est disponible sur le site Web de l'Université de South Alabama Bioimaging Resources. Un aperçu plus complet du démélange spectral est disponible36.
    1. Chargez le code de démélangespectral dans MATLAB.
    2. Modifier les fichiers Wavelength.mat et Library.mat pour correspondre aux conditions expérimentales (p. ex., "Longueur d'onde" en 360-485 par incréments de cinq).
      REMARQUE : Les valeurs correspondantes pour ces longueurs d'onde doivent être chargées dans la « bibliothèque » pour chaque étiquette fluorescente (et l'autofluorescence). Endmember-Name doit énumérer les étiquettes dans le même ordre que les valeurs de colonne de "Bibliothèque". Notez que le fichier Library.mat doit contenir à la fois des variables « Bibliothèque » et « Nom de membre final ».
    3. Dans l'onglet EDITOR, cliquez sur Exécuter. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre permettant à l'utilisateur de choisir un répertoire. Naviguez vers le dossier contenant les images spectrales à ne pas mélanger. Une fois sélectionné, cela ouvrira une nouvelle fenêtre.
    4. Dans les blancs qui en résultent, entrez le nom de l'image (p. ex., HASMC avec GCaMP et Mito FOV1), le nombre de bandes de longueur d'onde (p. ex. 26), le nombre de points de temps (p. ex. 1) et la question de savoir si une mesure FRET est souhaitée (p. ex., n) dans leurs blancs respectifs. Si "n" est sélectionné pour FRET, laissez les deux blancs de fin de compte vides. Appuyez sur OK pour continuer, ce qui ouvrira une nouvelle fenêtre.
    5. Naviagate au dossier contenant le fichier Wavelength.mat. Une fois sélectionné, cliquez sur Ouvrir pour continuer, ce qui ouvrira une nouvelle fenêtre.
    6. Naviguez vers le dossier contenant le fichier Library.mat. Une fois sélectionné, cliquez sur Ouvrez pour continuer, ce qui enregistrera les images non mélangées dans un nouveau dossier "Non mélangé" à l'intérieur du répertoire contenant les images spectrales.
  4. Inspectez la qualité des images spectrales non mélangées.
    1. Ouvrez chaque image non mélangée pour inspecter visuellement la distribution des composants purs.
      1. Comparez l'ampleur de l'image d'erreur à celle des images non mélangées (semblable à l'étape 5.11, cela peut être fait par la fonction de mesure d'ImageJ). Si l'ampleur de l'image d'erreur est similaire en magnitude aux images d'abondance non mélangées, il est probable qu'il y ait des signaux dans les données d'image spectrale qui ne sont pas comptabilisés avec précision par la bibliothèque spectrale et le processus de démélange spectral linéaire.
      2. Comparez l'image d'erreur aux images non mélangées pour voir s'il existe des structures résiduelles non identifiées.

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Representative Results

Plusieurs étapes importantes de ce protocole sont nécessaires pour assurer la collecte de données à la fois exactes et dépourvues d'images et d'artefacts spectraux. Le fait de sauter ces étapes peut donner lieu à des données qui semblent importantes mais qui ne peuvent être vérifiées ou reproduites avec un autre système d'imagerie spectrale, annulant ainsi efficacement les conclusions tirées avec ces données. Parmi ces étapes importantes, il y a la correction de la sortie spectrale appropriée (section 3). Le facteur de correction compense les variations dépendantes de la longueur d'onde dans la sortie spectrale du système d'excitation réglable. Ceci est accompli en évoluant des longueurs d'onde avec une excitation de puissance élevée de telle sorte que la puissance d'éclairage optique est comparable aux longueurs d'onde avec une excitation de faible puissance, réalisant un profil d'excitation spectrale plat. Un exemple de facteur de correction inapproprié est un facteur qui contient des valeurs très faibles (p. ex., 0,001) à une ou plusieurs longueurs d'onde, ce qui indique que les valeurs d'intensité mesurées à ces longueurs d'onde doivent être considérablement atténuées pour obtenir une réponse spectrale plate.

L'étalonnage du système selon une norme traçable du NIST garantit que les données recueillies avec le système d'imagerie spectrale à balayage d'excitation sont comparables à d'autres systèmes également calibrés par rapport aux normes traçables du NIST. Par conséquent, il est impératif de s'assurer que tout facteur de correction ajuste les données recueillies de façon appropriée. L'exactitude d'un facteur de correction peut être vérifiée avec l'utilisation d'une norme de fluorescence, comme la fluorescéine nistable. La figure 1 illustre un facteur de correction approprié et inapproprié, visualisé à l'aide de données graphiques et d'images. Dans ce cas, la production spectrale à 340 nm était pratiquement inexistante par rapport au reste de la plage spectrale, ce qui a donné une valeur proche de zéro (-lt;0,001) pour pratiquement toutes les longueurs d'onde. Appliqué à la pile d'images, cela se traduit par des valeurs proches de zéro à travers la plupart de la pile d'images pour la plupart des pixels.

Comme indiqué à la section 5, la plage d'excitation, les fluorophores sélectionnés et les paramètres d'acquisition peuvent créer le potentiel qu'une ou plusieurs bandes d'images de longueur d'onde d'excitation contiennent des pixels sursaturés. La figure 2 illustre un exemple dans lequel le temps d'exposition a été fixé trop longtemps pour plusieurs des longueurs d'onde d'excitation, ce qui fait que les images suivantes contiennent des pixels sursaturés. Ceci est important à noter parce que, comme le montre la figure, les images individuelles et les images de fausse couleur peuvent visuellement sembler être dans les gammes d'intensité acceptables.

La sélection appropriée d'une région d'arrière-plan pour la soustraction est également importante pour la comparaison des données entre les systèmes, car elle élimine les éléments de bruit de la caméra ou de lumière parasite avant la correction spectrale traçable du NIST (figure 3). Il est souvent utile pour le traitement d'image ultérieur et les étapes d'analyse des données pour générer une image RGB fausse couleur de la pile d'images spectrales afin de visualiser les caractéristiques spectrales dans l'image. La figure 4 montre une image rGB de fausse couleur générée par la fusion de trois bandes de longueur d'onde sélectionnées (370 nm , bleu, 420 nm, vert, 470 nm et rouge).

Le démélangeage spectral exige la connaissance du profil spectral de chaque source de fluorescence individuelle. Dans le cas de l'imagerie hyperspectrale de balayage d'excitation, ceci est fait en acquérant des piles spectrales d'image pour chaque fluorophore (et autofluorescence). La figure 5 est incluse comme exemple pour choisir des régions à partir de commandes à étiquette unique pour générer une bibliothèque spectrale. Il convient de noter que chaque mesure a été normalisée à sa longueur d'onde maximale.

Lorsqu'il est exécuté correctement, le processus de démélange spectral permet la séparation d'une pile d'image spectrale en contributions respectives de chaque étiquette de fluorescence. La figure 6 montre un exemple d'image spectrale non mélangée, avec des images individuelles pour chacun des signaux suivants : autofluorescence lisse des cellules musculaires des voies respiratoires, une sonde GCaMP et une étiquette mitochondriale. L'erreur associée au démélangespectral est également montrée et peut être examinée pour comparer les niveaux d'intensité de l'erreur à ceux des signaux non mélangés. Le calcul et l'interprétation de cette erreur ont déjà été discutés37. Comme le montre la figure 6, il y a une grande erreur associée aux régions nucléaires et périnucléaires des cellules, ce qui indique que les spectres mesurés de ces régions ne sont pas bien comptabilisés par les spectres de la bibliothèque spectrale. Une source potentielle d'erreur peut être que les contrôles à étiquette unique pour GCaMP et l'étiquette mitochondriale ont été préparés à l'aide de cellules musculaires lisses des voies respiratoires, qui ont une autofluorescence indigène élevée. Par conséquent, le GCaMP et l'étiquette mitochondriale peuvent ne pas représenter les spectres purs de membre final. En outre, le signal d'autofluorescence peut influencer les spectres de la bibliothèque pour les deux autres étiquettes d'une manière qui n'a pas été correctement comptabilisée, ce qui donne un ajustement moins précis que si les étiquettes avaient été acquises à l'aide d'une ligne cellulaire avec peu ou pas l'autofluorescence. De plus, des exemples sont inclus pour les cas où trop ou trop de composants d'une bibliothèque spectrale sont disponibles, ce qui entraîne un sous-ajustement et un surajustement des données d'image spectrale, respectivement (Figure 6, Figure 7, Figure 8, Figure 9, et tableau 1).

Comme il est indiqué à la section 6.2 et plus précisément à l'étape 6.2.4, les spectres « purs » recueillis à partir de cellules étiquetées qui sont également autofluorescents contamineront probablement le profil spectral de la composante pure. En tant que tel, il convient de prendre soin de séparer les spectres purs des étiquettes d'intérêt de leurs hôtes autofluorescents. La figure 10 montre la différence de démélangeavec des spectres « purs » contaminés par l'autofluorescence (mixte) par rapport aux spectres purs calculés par la méthode décrite à l'étape 6.2.4. La différence se produit principalement dans le démélange du signal d'autofluorescence. Sans séparation adéquate du signal (p. ex., soustraction de la contamination par l'autofluorescence du spectre GCaMP), les composants de l'autofluorescence et de la bibliothèque GCaMP se disputent les mêmes données spectrales dans chaque pixel, ce qui donne des trous caractéristiques ou des taches sombres. dans l'image d'autofluorescence.

Figure 1
Figure 1 : Exemple d'applications de facteurs de correction inappropriés et appropriés utilisés pour corriger les images à une réponse spectrale plate. (A) Plotted des facteurs de correction inappropriés et appropriés. (B) Une image RGB générée avec l'utilisation du facteur de correction inapproprié dans (A). (C) Une image RGB générée avec le même champ de vision que (B), sauf avec l'utilisation d'un facteur de correction approprié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Exemples qui illustrent l'importance de paramètres d'acquisition appropriés. (A,B) Images RGB générées par un temps d'acquisition approprié (A, 100 ms) vs le même champ de vision avec un temps d'acquisition saturant (B, 500 ms). Il convient de noter que les images RGB semblent identiques lorsqu'elles sont de fausse couleur. (C) La région d'intérêt sélectionnée pour étudier les valeurs d'intensité des régions les plus intenses de (A) et (B). (D) Valeurs d'intensité tracées par longueur d'onde à partir de l'image de temps d'exposition de 100 ms (A, ligne noire) et de 500 ms de temps d'exposition (B, ligne rouge). Il convient de noter que les intensités de pixels pour le temps d'exposition de 500 ms ont atteint la limite de la plage dynamique du détecteur (65 535 UA) à 370 nm et ne diminuent pas avant 525 nm, ce qui donne un artefact spectral. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Sélection d'une région d'intérêt pour la soustraction de fond. (A) Une image d'intensité brute et d'une longueur d'onde. (B) Régions de l'image sélectionnées pour déterminer le spectre d'arrière-plan moyen pixel pour la soustraction de fond indiquée en rouge. (C) L'image d'intensité sous-traitée, corrigée et résumée en arrière-plan. (D) Une coloration RGB de l'image corrigée (C). Le processus de génération d'une image rGB de fausse couleur est montré dans la figure 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Processus de génération d'une image rGB de fausse couleur. (A-C) Trois bandes de longueur d'onde espacées uniformément tout au long de la gamme d'acquisition spectrale ont été sélectionnées pour la fausse coloration (bleu 370 nm, vert 420 nm, rouge 470 nm). (D) L'image d'intensité résumée générée par l'ajout d'intensités de pixels de toutes les bandes de longueur d'onde dans le cube d'image. (E-G) Les images en panneaux (A-C) avec leurs tables de recherche en fausse couleur respectives appliquées. (H) L'image fusionnée résultante de (E-G). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Sélection de région s'entremelle de contrôles à étiquette unique pour la génération de bibliothèques spectrales. (A) RGB image fausse-colorée de muscle lisse de voie aérienne (ASM) autofluorescence cellulaire. (B) Affiché en rouge, régions de (A) choisies pour la composante autofluorescence de la bibliothèque spectrale. (C) RGB cellules ASM de fausse couleur étiquetées avec l'étiquette mitochondriale. (D) Affiché en rouge, régions de (C) choisies pour le composant d'étiquette mitochondiral de la bibliothèque spectrale. En raison de l'autofluorescence des cellules ASM localisées près du noyau, de petites régions ont été sélectionnées loin des noyaux pour identifier le spectre de l'étiquette mitochondriale. (E) RGB cellules ASM de fausse couleur transfected avec la sonde GCaMP. (F) Les régions (E) sélectionnées pour le composant GCaMP de la bibliothèque spectrale sont affichées en rouge. Semblable à (D), des régions loin des noyaux ont été sélectionnées. (G) La bibliothèque spectrale obtenue à partir de A-F, normalisée à une valeur d'unité à la longueur d'onde avec le signal le plus fort. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 6
Figure 6 : Exemple de données d'images non mélangées dans lesquelles les contributions non mélangées de chaque composante de la bibliothèque peuvent être visualisées. (A-D) L'abondance non mélangée de GCaMP, étiquette mitochondriale, autofluorescence, et terme d'erreur. (E-G) Les images en panneaux (A-C) avec leurs tables de recherche en fausse couleur respectives appliquées. (H) L'image composite, fusionnée, fausse couleur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 7
Figure 7 : Contributions relatives non mélangées de signal, y compris l'intensité moyenne et le pourcentage de fluorescence totale, à partir d'une bibliothèque spectrale correctement définie. (A-D) L'abondance non mélangée pour l'autofluorescence, Le GCaMP, l'étiquette mitochondriale, et le terme d'erreur. Il convient de noter que le terme d'erreur représente moins de 10 % du signal total de fluorescence mesuré. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 8
Figure 8 : Contributions relatives non mélangées au signal, y compris l'intensité moyenne et le pourcentage de fluorescence totale, à partir d'une bibliothèque spectrale manquant un composant connu pour être inclus dans l'échantillon (c.-à-d., une bibliothèque spectrale sous définie). (A-C) L'abondance non mélangée de l'autofluorescence, de l'étiquette mitochondriale, et du terme d'erreur. Notez que l'omission de GCaMP de la bibliothèque spectrale a augmenté les contributions de signal relatif calculées des composants de la bibliothèque ainsi que le terme d'erreur, par rapport à la figure 7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Contributions relatives non mélangées au signal, y compris l'intensité moyenne et le pourcentage de fluorescence totale, à partir d'une bibliothèque spectrale contenant un composant supplémentaire dont on sait qu'il manque dans l'échantillon (c.-à-d. une bibliothèque spectrale surdéfinie). (A-E) L'abondance non mélangée de l'autofluorescence, du GCaMP, de l'étiquette mitochondriale, de l'étiquette nucléaire, et du terme d'erreur. Notez que l'ajout d'une étiquette nucléaire à la bibliothèque spectrale a diminué les contributions de signal relatif calculées de l'autofluorescence, par rapport à la figure 7. En outre, le terme d'erreur est diminué en dessous de l'erreur de pourcentage spécifiée par la bibliothèque spectrale correctement définie. C'est parce qu'une bibliothèque surdéfinie permettra presque toujours un meilleur ajustement aux données expérimentales qu'une bibliothèque correctement définie, même si les signaux d'abondance pour les composants connus pour être absents de l'échantillon sont (en réalité) des artefacts de la surdéfinition de la bibliothèque spectrale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10
Figure 10 : Comparaison d'images non mélangées lors de l'utilisation d'une bibliothèque avant et après la soustraction appropriée du signal de contamination par autofluorescence. (A) Les spectres « purs » originaux dérivés des commandes à étiquette unique dans les cellules musculaires lisses des voies respiratoires hautement autofluorescentes avant la soustraction à l'échelle détaillée à l'étape 6.2.4. (B-D) L'autofluorescence non mélangée, GCaMP, et les images d'étiquette nucléaire générées en utilisant (A) comme bibliothèque. (E) Les spectres purs corrigés dérivés de commandes à étiquette unique dans les cellules musculaires lisses des voies respiratoires hautement autofluorescentes après soustraction à l'échelle. (F-H) L'autofluorescence non mélangée, GCaMP, et les images d'étiquette nucléaire générées en utilisant (E) comme bibliothèque. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Intensité moyenne (AU)
Ajustement approprié Sous-aménagement Surajustement
Autofluorescence 187 299 164
GCaMP (En) 139 - 140
Étiquette mitochondriale 246 318 248
Étiquette nucléaire - - 26
Erreur RMS 53 126 43
Déviation standard (AU)
Ajustement approprié Sous-aménagement Surajustement
Autofluorescence 362 442 315
GCaMP (En) 168 168
Étiquette mitochondriale 344 388 345
Étiquette nucléaire - - 93
Erreur RMS 62 126 44
Intensité maximale (AU)
Ajustement approprié Sous-aménagement Surajustement
Autofluorescence 6738 7409 6738
GCaMP (En) 1336 - 1336
Étiquette mitochondriale 5098 5194 5098
Étiquette nucléaire - - 1257
Erreur RMS 1050 1286 910
% de fluorescence totale
Ajustement approprié Sous-aménagement Surajustement
Autofluorescence 30% 40% 26%
GCaMP (En) 22% 43% 23%
Étiquette mitochondriale 39% - 40%
Étiquette nucléaire - - 4%
Erreur RMS 8% 17% 7%

Tableau 1 : Un tableau comparant la moyenne, l'écart type et les valeurs d'intensité d'abondance maximale non mixtes par image d'abondance non mélangée d'une bibliothèque spectrale appropriée et des bibliothèques spectrales sous-définies ou surdéfinies, ainsi que le pourcentage de fluorescence totale par image d'abondance non mixte (l'intensité minimale d'abondance non mélangée pour chaque image était toujours nulle). Données tirées de la figure 7, figure 8et figure 9.

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Discussion

L'utilisation optimale d'une imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation commence par la construction du chemin lumineux. En particulier, le choix de la source lumineuse, des filtres (tunable et dichroic), de la méthode de commutation de filtre, et de la caméra déterminent la gamme spectrale disponible, la vitesse possible de balayage, la sensibilité de détecteur, et l'échantillonnage spatial. Les lampes à arc de mercure offrent de nombreux pics de longueur d'onde d'excitation, mais ne fournissent pas une sortie spectrale plate et nécessiteront une réduction significative du signal aux pics de sortie pour corriger les données d'image spectrale à une réponse traçable NIST38. Les sources de lumière alternatives, telles que les lampes d'arc de Xe et les lasers de supercontinuum de lumière blanche, peuvent fournir une sortie spectrale plus uniforme qui est mieux adaptée pour l'imagerie hyperspectrale d'excitation-balayage38,39,40. Le choix de la source lumineuse, des filtres réglables et des filtres dichroics détermine la plage spectrale disponible. Cette gamme doit être choisie avec une attention particulière pour les informations spectrales souhaitées de l'échantillon expérimental.

En outre, il convient d'examiner le mécanisme de commutation utilisé pour les filtres réglables, ainsi que divers facteurs de caméra tels que l'efficacité quantique, la taille des pixels et les taux d'images disponibles, car ces facteurs auront une incidence sur les taux d'échantillonnage potentiels41 ,42,43. Cependant, tous les autres facteurs étant constants, l'utilisation de l'approche d'excitation-balayage devrait fournir une sensibilité accrue et la capacité pour l'imagerie plus rapide, comparée à la plupart des approches spectrales d'imagerie d'émission-balayage21.

Comme indiqué dans l'introduction, l'imagerie hyperspectrale se réfère ici à la nature contigu et spectrale mentquille des données acquises. En tant que tel, les capacités du système doivent être en mesure de recueillir des données en utilisant l'espacement des longueurs d'onde du centre d'excitation moins de la moitié de la distance de la FWHM des filtres. Comme indiqué précédemment, un tableau soigneusement choisi de filtres réglables à couches minces permet l'acquisition de données avec des longueurs d'onde du centre espacées de 5 nm, une distance suffisante pour suréchantillonner le spectre d'excitation donné filtres avec FWHM entre 14-20 nm. Un tel espacement donne une légère redondance dans la collecte de données spectrales avec des augmentations probables de la précision du processus de démélange. La prise en compte des deux gammes spectrales et du nombre minimum nécessaire de canaux de longueur d'onde pour un mélange précis ont été discutés précédemment44,45,46. À cette fin, compte tenu de la bande passante de ces filtres, la plage d'excitation doit être sélectionnée pour se terminer à une longueur d'onde légèrement inférieure (5-10 nm) que la longueur d'onde coupée du beamsplitter dichroique. Cela permettra de s'assurer que toute la bande passante de l'éclairage d'excitation est en dessous de la longueur d'onde de coupure du beamsplitter dichroique (par exemple, 360-485 nm pour le filtre dichroic 495) pour éviter l'excitation-émission cross-talk.

Un logiciel pour contrôler indépendamment chaque composant du matériel pour réaliser des scans d'imagerie spectrale à haute vitesse est nécessaire. Le logiciel devrait être en mesure d'utiliser l'obturateur, sélectionner les longueurs d'onde d'excitation, et d'acquérir des images à des vitesses suffisamment élevées pour répondre à des conditions expérimentales (les exigences exactes de taux d'échantillonnage varieront l'expérience, mais un objectif d'exemple pourrait être d'acquérir quatre des piles d'images spectrales complètes par minute). Des expériences plus complexes peuvent utiliser plusieurs miroirs dichroïques, objectifs ou emplacements XYZ. Il existe un certain nombre de progiciels disponibles pour l'acquisition de données47,48. Micro-Manager est un logiciel open-source gratuit pour l'automatisation du microscope qui offre une variété d'options de personnalisation. En outre, Micro-Manager inclut un panneau de script pour une personnalisation supplémentaire qui n'est pas disponible dans l'interface utilisateur principale. Par exemple, il est possible d'utiliser un script personnalisé pour réduire le retard de 250 ms du commutateur de filtre réglable à 10 ms à toutes les longueurs d'onde d'excitation, sauf les transitions de longueur d'onde dans lesquelles la roue du filtre tourne vers un nouveau filtre réglable, réduisant l'imagerie efficace temps de 240 ms par longueur d'onde pour la plupart des longueurs d'onde. Cette personnalisation a permis l'acquisition d'un jusqu'à 30 longueurs d'onde en moins de 4 s. Enfin, Micro-Manager peut être exploité aux côtés d'autres environnements, tels que MATLAB, pour personnaliser davantage le contrôle des appareils microscope.

Il est très important de déterminer la plage d'excitation spectrale appropriée, le temps d'acquisition et la longueur d'onde initiale pour l'affichage de l'échantillon et l'acquisition de données subséquentes. Cependant, un mauvais fonctionnement des composants individuels du système peut nécessiter d'autres dépannages. Chaque composant du chemin optique contribue aux données d'image acquises. Par conséquent, il est important de vérifier la réponse spectrale et la transmission optique des composants optiques dans le chemin de la lumière, surtout si vous essayez d'optimiser la réponse globale du système. Les sources lumineuses ont souvent des réglages d'intensité variable et peuvent avoir une réduction de la puissance au cours de la durée de vie de l'ampoule40. Si un échantillon semble faible, la cause peut être réduite de sortie à partir de la source de lumière. La fonction d'autoshutter dans Micro-Manager, d'après notre expérience, ne fonctionne pas 100% du temps. L'absence de signal peut indiquer un obturateur fermé. La longueur d'onde d'excitation initiale enregistrée dans le fichier de configuration de Micro-Manager peut être par défaut à une longueur d'onde avec peu ou pas de sortie spectrale, comme l'exemple de 340 nm montré dans la figure 1.

En outre, il n'est pas rare de choisir par erreur une longueur d'onde d'excitation qui est au-dessus de la longueur d'onde de coupure du beamsplitter dichroic de long-pass, ayant pour résultat le croisement additionnel et/ou l'excitation étant shunted directement à la caméra qui peut potentiellement endommager le capteur de la caméra. De même, l'ajustement de la trajectoire de la lumière pour l'imagerie de transmission peut entraîner une perte de signal à la caméra, selon la configuration du microscope. De plus, comme l'indique la figure 2, le choix de la longueur d'onde initiale de l'excitation et du temps d'exposition pour l'affichage de l'échantillon peut sembler approprié, mais il en résulte en fait des pixels sursaturés à d'autres longueurs d'onde d'excitation. Ce fait ne sera pas apparent à moins que la saturation des pixels soit vérifiée pour chaque image, il est donc souvent prudent d'effectuer une pile d'images de test sur une zone de l'échantillon qui semble contenir la fluorescence la plus intense.

Il convient également de noter que des intensités variables peuvent être présentes dans les images choisies pour les régions de fond. Il faut veiller à ce que ces régions ne contiennent pas réellement de données d'image pertinentes, car les étapes ultérieures de correction des données soustraient ensuite ce signal des données d'image acquises dans d'autres régions de l'échantillon. Il est parfois nécessaire d'utiliser les paramètres de transmission et/ou d'augmenter considérablement le temps d'exposition pour vérifier que la région choisie pour mesurer les antécédents de l'échantillon ne contient en effet aucun échantillon. De même, des images non mélangées peuvent présenter des taches sombres ou des trous dans l'image d'autofluorescence. Cela peut être dû à une bibliothèque incorrecte causée par l'autofluorescence "contamination" des signaux spectrals "purs" à partir de cellules monolabellées. C'est parce que tout signal spectral « pur » prélevé sur un échantillon contenant de l'autofluorescence contiendra invariablement une partie des spectres d'autofluorescence lui-même, même en quantités infimes. Il faut veiller à soustraire les signaux d'autofluorescence des commandes à étiquette unique afin d'assurer une bibliothèque spectrale appropriée, tel que décrit à plusieurs reprises par Mansfield et al.28,29,30, 31,32

Bien qu'il ne soit pas démontré dans cet article, le système d'imagerie spectrale de balayage d'excitation peut également être employé pour l'imagerie et l'imagerie de time-lapse sur plusieurs emplacements de XY (ou un grand champ de vue dû à la couture d'image) dans les plans focaux multiples. Si ces options sont souhaitées pour une seule expérience, il convient de réfléchir soigneusement à l'importance de l'ordre d'acquisition et des effets potentiels du photoblanchiment. Il convient également de noter que si le temps réel pris dépasse le temps estimé (p. ex., une pile d'images prend 11 s à acquérir plutôt que les 10 s estimés), Micro-Manager continuera d'acquérir le nombre choisi de points de temps et/ou de positions. Cette erreur de calcul peut se composer avec plusieurs points de temps et modifier l'échantillonnage temporel calculé, ce qui peut fausser les conclusions tirées des données.

Cet exemple démontre la capacité de séparer trois sources de fluorescence dans une plage de balayage d'excitation de 145 nm. Des expériences antérieures utilisant ce système ont pu séparer jusqu'à cinq sources de fluorescence dans la même plage. Le temps requis pour cette acquisition d'image est inférieur à 1 min, ce qui est beaucoup plus rapide que la plupart des systèmes d'imagerie spectrale de balayage des émissions. Les améliorations apportées à la trajectoire de la lumière, comme l'adile ment de longueur d'onde d'excitation à plus grande vitesse, pourraient faire progresser cette technologie d'imagerie à des vitesses suffisantes pour l'imagerie spectrale à vitesse vidéo.

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Disclosures

Mm. Leavesley et Rich divulguent leur intérêt financier dans une entreprise en démarrage, SpectraCyte LLC, fondée pour commercialiser la technologie d'imagerie spectrale.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient reconnaître le soutien de NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, et le Abraham Cancer Mitchell Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

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Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

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