Summary
I denna artikel presenterar vi två kompletterande metoder för att mäta specifika frekvenser av translationella fel och felaktig översättning i modellen Mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, med Gain-of-funktion reporter system. Metoderna kan användas för att mäta korrekta fel frekvenser i låg genom strömning eller relativa fel frekvenser i en mer hög genom strömning inställning.
Abstract
Översättningen av gener till proteiner är utsatt för fel. Även om den genomsnittliga frekvensen av translationella fel i modell system uppskattas till 1/10000 per kodon, den faktiska fel frekvensen varierar kraftigt, beroende på arten, miljön och kodon som studeras. Vi har tidigare visat att mykobakterier använder en två stegs väg för generering av aminoacylerade glutamin och asparagin tRNAs och att detta är särskilt förknippad med relativt höga fel frekvenser på grund av modulering av fel översättningar priser av en väsentlig del av vägen, amidotransferas GatCAB. Vi modifierade en tidigare anställd Renilla-Firefly Dual-luciferase system som hade använts för att mäta fel översättning priser i Escherichia coli för användning i mykobakterier att mäta specifika fel översättning frekvenser av glutamat på glutamin kodons och aspartat för asparaginkodon. Även om detta reporter system var lämpligt för korrekt uppskattning av specifika fel frekvenser, brist på känslighet och krav på överdriven manipulation steg gjorde det olämpligt för hög-genomflöde applikationer. Därför har vi utvecklat en andra Gain-of-funktion reporter system, med hjälp av nluc luciferas och grönt fluorescerande protein (GFP), som är mer mottagliga för medel/hög-genomflöde inställningar. Vi använde detta system för att identifiera kasugamycin som en liten molekyl som kan minska mykobakteriell fel översättning. Även om reportrar som vi beskriver här har använts för att mäta specifika typer av mykobakteriell fel översättning, kan de modifieras för att mäta andra typer av fel översättningar i ett antal modell system.
Introduction
Informations flödet inom molekylärbiologi kräver översättning av genetisk information till funktionella proteiner. Som med alla biologiska system innebär gen översättning också mätbara fel. Uppskattningar av fel frekvensen i översättningen brukar noteras som cirka 1/10000 per kodon (ses över av Ribas de Pouplana et al.1). Fel frekvensen varierar dock kraftigt, från mindre än 10-5 till mer än 0,05/Codon1,2,3,4,5. Det stora antalet fel frekvenser, som spänner över mer än tre storleksordningar, beror på det faktum att fel kan uppstå från flera steg i översättnings vägen: från stokastiska, mutationella eller stressinducerade fel i aminoacylering6, 7 för att , 8 , 9 för att , 10, fysiologisk misacylering av asparaginyl-och glutaminyl-tRNAs5, eller ribosomavkodnings fel2,3,11. Mätbart höga fel frekvenser, som representerar över 0,01/Codon, föreslog att translationella fel kan utföra fysiologiska funktioner1,12 och att fel översättning kan vara kontextspecifika13.
Vi och andra har visat att naturligt förekommande fel i gen översättningen kan vara adaptiva, särskilt under miljö belastning1,5,12,14,15,16 ,17,18. I mykobakterier, fel som genereras av två steg indirekta glutamin/asparagin tRNA aminoacylation väg19,20 resultera i en anmärknings värt ökad tolerans för första linjens antituberkulos antibiotika Rifampicin 5. därför spekulerade vi att minska mykobakteriell fel översättning med en liten molekyl kan potentiera dödande av Rifampicin. Vi screenade för och identifierade den naturligt förekommande aminoglykosid kasugamycin som en substans som kan minska mykobakteriell fel översättning, potentiera Rifampicin-medierad avlivning av mykobakterier både in vitro-och in vivo21, och begränsa uppkomsten av Rifampicin resistens21, som hotar den globala kontrollen av tuberkulos22 -världens mest dödliga patogenen.
För att studera translationell fel, måste metoder för mätning av fel översättning användas. Det finns flera metoder som har utvecklats för mätning av fel översättning, var och en med fördelar och nack delar. Kort, precision masspektrometri-baserade metoder har flera fördelar, den viktigaste av dessa är att med nyare algoritmer för detektion av flera typer av translationella fel, en relativt opartisk mätning av felaktig översättning kan vara som utfördes18. Men masspektrometri är inte särskilt lämplig för mätning av deamidation fel översättningar händelser-just den typ av felaktig översättning som sker i mykobakterier på grund av den felbenägna indirekta tRNA aminoacylation vägen. Detta beror på hög frekvent nonenzymatisk deamidering som sker vid bearbetning av prover för masspektrometri23, vilket resulterar i en extremt hög bakgrunds signal. Därför, för att upptäcka fel i denna väg, genetisk vinst-of-funktion reportrar erbjuder distinkta fördelar. Specifikt kan lämplig vinst-av-funktion reportrar har extremt låga bakgrunds hastigheter, vilket gör att mätningen av mycket låga fel frekvenser11.
Eftersom utföra experiment med patogena Mycobacterium tuberkulos kräver specialiserade anläggningar och extra försiktighets åtgärder, utför vi de flesta experiment i nonpatogena Mycobacterium M. smegmatis- och har visat tidigare att resultaten mellan de två arterna är i stort sett jämförbara med5,21. För att mäta fel översättning frekvenser i mykobakterier som genereras av den indirekta tRNA aminoacylation vägen, modifierade vi en Renilla-Firefly Dual-luciferase system som tidigare har utvecklats för att mäta ribosomalt avkodning av felen i E. coli 11 för användning i mykobakterier. Vi gjorde tre specifika modifieringar: den ursprungliga reportern inte uttrycka effektivt i mykobakterier, och därför var sekvensen Codon-optimerad, och C-terminalen tre aminosyror av Firefly luciferase, Serine-lysin-leucin, som har Kommenterad som en människo handel signal i vissa system24, ändrades till isoleucin-alanin-valine25. Den ursprungliga reportern hade en kritisk lysin rester i Firefly luciferas muterade. I stället muterade vi antingen en kritiskt bevarade aspartat (D120) eller glutamat (E144) rester i renilla luciferas till asparagin och glutamin, respektive25 (figur 1). Reportern var subcloned i episomal tetracyklin-inducerbara Plasmid pUV-tetOR (se tabell över material). Gain-of-funktion reportrar mutera kritiskt bevarade funktionella rester i enzymer/fluorescerande proteiner som gör dem fungerar inte11,26. Translational (eller teoretiskt, transkriptionella) fel som syntetisera funktionell variant av proteinet skulle resultera i mätbara enzym aktivitet i en delmängd av översatta proteiner. För att korrigera för variation i protein överflöd, den muterade reportern är couttryckta med ett funktionellt protein som fungerar som ett riktmärke och möjliggör noggrann kvantifiering av Gain-of-funktion11. Medan renilla-Firefly Dual-luciferase reporter tillåtet för noggrann mätning av specifika mykobakteriell fel översättning priser5,25 (figur 2 och avsnitt 1 i protokollet), vi snabbt insåg att det inte är lämpligt för medelhög/hög genom strömning screening av molekyler som skulle ändra fel översättning hastighet. Detta beror främst på två skäl, nämligen a) den relativa avsaknaden av potensen av renilla luciferas innebar att minst 1 ml mykobakteriell kultur/prov krävdes för att mäta fel översättningar frekvenser, och b) kravet på LYS av cellerna före enzym aktivitet mätning krävs överdriven manuell hantering: mykobakteriella celler har en tjock och flera lager cell väggen och kuvert som är relativt resistenta mot Lys. Därför såg vi till att utveckla en ny vinst-av-funktion reporter system som skulle kunna användas med små volymer (t. ex. i en 96-well plattan system) och inte kräver cell-lysis för mätningar. Vi använde den mycket potenta nluc luciferas och identifierade en kritisk aspartatrester som, när muterade till asparagin, resulterade i 2 stockar förlust av funktion (figur 1). Dessutom, den lilla storleken på Nluc tillät det att ha en N-Terminal sekretion signal tag-från antigen 85A, ett större utsöndras antigen i mykobakterier27 -som skulle tillåta nluc att utsöndras i kultur supernatanten och kringgå kravet på och celllys. Riktmärket protein, GFP, uttryck tes från samma Promotorn som muterade Nluc, men från en integrerad vektor (se material tabell), och kan mätas i intakta celler21 (figur 3). Trots dessa fördelar, har Nluc/GFP reporter (avsnitt 2 i protokollet) också nack delar: den relativt blygsamma minskningen av Nluc aktivitet (100-faldig) med D140N mutation skulle inte tillåta mätning av extremt låg fel översättning priser, att göra reportern mer lämpad som screening verktyg än för noggranna mätningar av translationella fel. Dessutom har Nluc inga kritiska glutamatrester; Därför kan endast asparagin-till-aspartat-felnivåer mätas. De allmänna principer som beskrivs i detta arbete bör tillåta forskare att antingen använda dessa reportrar som vi har gjort eller ändra reportrar som lämpar sig för en korrekt och/eller lättsamt mätning av andra specifika translationella fel frekvenser i deras modell system för Val.
Protocol
1. Renilla-Firefly Dual-luciferase reporter
Anmärkning: För en visuell representation av denna metod, se figur 2.
- Inokulera mykobakteriella reporter stammar från-80 ° c lager med 2 mL 7H9 medium. Wild-typ Dual-luciferase, samt muterade Renilla (reporter) stammar, måste användas för att möjliggöra beräkning av fel översättning priser (se steg 1,7). Skaka vid 37 ° c i 1 till 2 dagar tills OD600 når den Station ära fasen (OD > 3).
- Alikvot och späd till OD600Nm runt 0,1-0,5. Använd tre oberoende biologiska replikationkulturer för typiska experiment. Anhydrotetracyklin (ATC), en tetracyklin analog inducerare av reporter uttryck (som styrs av en tetracyklin-inducerbara promotor) till en slutlig koncentration av 50 ng/mL.
- För att mäta effekterna av kasugamycin på fel översättning priser21, tillsätt olika doser av kasugamycin till kulturen (se figur 4 för de angivna doserna) samtidigt (vid de testade doserna, kasugamycin har ingen Antimikrobiell aktivitet). Observera att det är viktigt att inkludera minst en icke-inducerad kontroll för varje reporter. Odla-inducera kulturer för 4-6 h på 37 ° c med att skaka.
- Överför bakterie kulturerna till ett 2 mL-rör och centrifugera vid 3 220 x g i 5 min vid rums temperatur för att pressa ner bakterierna. Kassera supernatanten.
- Störa bakterierna genom att tillsätta 40 μL 1x passiv lyseringsbuffert (levereras av en dual-luciferase Kit), som har spätts (1:1) i dubbeldestillerat vatten. Överför det återsuspenderade bakterie lysatet till en vit 96-well-platta, en brunn per prov och skaka i rums temperatur i 20 min.
Var försiktig: Överinkubera inte bakterierna i lyseringsbuffert (mer än 30 min). - Tillsätt 80 μl av Firefly substrat till varje brunn, skaka i 15 s, och mät luminiscens av luminometer med 1 000 MS som integrations tid. Använd antingen en automatiserad injektor eller en multikanalpipett för att undvika pipettering av fel.
- Tillsätt 80 μL Renilla substrat till varje brunn, skaka i 15 s, och mät luminercens med luminometer med 1 000 MS som integrations tid.
- Subtrahera bakgrunds luminiscens-mätt med antingen vildtyp M. smegmatis (dvs. inte innehåller reportrar) eller icke inducerad reporter lysate-från de uppmätta värdena. Använd de korrigerade värdena för att beräkna fel översättningen för varje villkor med hjälp av följande ekvation11,25, där DN refererar till aktiviteten i den muterade reportern-stammen:
2. nluc/GFP reporter
Anmärkning: För en visuell representation av denna metod, se figur 3.
- Inokulera bakterie reporter stammen från-80 ° c lager med 2 mL 7H9 medium. Skaka vid 37 ° c i 1 till 2 dagar tills OD600 når den Station ära fasen (OD > 3).
- Subkultur till 50 mL 7H9 medium och växa till OD600 når den sena Station ära fasen (> 4).
- Innan du Ali citerar bakterierna till en 96-well plattan, tillsätt ATC vid en slutlig koncentration av 50 ng/mL och blanda väl. Induktion av bulk kulturen säkerställer att alla brunnar innehåller samma mängd inducerare och att induktion av reportern synkroniseras. Alikvot bakterierna till en klar, rund bottnad 96-well plattan, med 100 μL volym i varje brunn.
- För att avskärma för små molekyler som påverkar fel översättningar, tillsätt föreningen vid den angivna koncentrationen för att välja brunnar. Vid tillämpningen av detta protokoll, Använd kasugamycin (vid doser som anges i figur 5) som en illustration. Tillsätt olika doser av kasugamycin för att välja brunnar (varje försöks grupp bör innehålla minst två biologiska replikat).
- Skaka och framkalla proverna vid 37 ° c för 16-20 h.
Anmärkning: Det är nödvändigt att täta plattan med film. Dessutom måste alla kantbrunnar fyllas med minst 200 μL sterilt vatten för att begränsa avdunstning från testbrunnarna. - Ta 80 μL från varje brunn, Använd en flerkanalspipett och överför proverna till en svart 96-brunn-plåt (som maximerar fluorescenssignalmätningen). Mät GFP-signalen med luminometer med 20 MS som integrations tid.
- Efter mätning av GFP-signalen, Centrifugera plattan vid 3 220 x g i 10 min. överför 50 μl av supernatanten till en vit botten 96-brunn tallrik (som maximerar Luminescens signal mätning), tillsätt 50 ΜL av nluc substrat till varje brunn, blanda dem väl, luminometer med 1 000 MS som integrations tid.
- Bestäm Nluc/GFP-kvoten genom att dividera de korrigerade Nluc-luminescensvärdena med GFP-fluorescens: denna åtgärd (i godtyckliga enheter) är ett relativt mått på aspartat för asparaginfel översättning.
Representative Results
En tecknad serie som illustrerar den allmänna dispositionen av de två reporter system som används i detta arbete visas i figur 1. En översikt över avsnitt 1 i protokollet visas i figur 2 och en översikt över avsnitt 2 i figur 3. Effekten av kasugamycin på mykobakteriell fel översättning visas i figur 4, mätt med renilla-Firefly reporter system. För att Visa specificiteten hos kasugamycin-åtgärden uttryck tes reportern också i en stam av M. smegmatis där ksga togs bort (∆ ksga). KsgA är en rRNA dimetyltransferas, och ksga-borttagna stammar är relativt resistenta mot kasugamycin. Kasugamycin åtgärder på fel översättning mättes också med hjälp av Nluc/GFP reporter, som visas i figur 5.
Figur 1 : Tecknad serie som illustrerar de två vinst-av-funktion reporter system. (A) renilla-Firefly reporter system består av två luciferas enzymer uttrycks som ett fusions protein och under kontroll av en tetracyklin-inducerbara promotor. Uttryck av wild-typ dubbla enzym resulterar i hög mätbar aktivitet av både Renilla och Firefly luciferases (överst). Mutation av en kritisk aspartatrester, D120, i renilla till asparagin gör renilla enzymet (D120N) inaktiv, men Firefly luciferas är fortfarande aktiv. Fel översättning av asparagin till aspartat (i detta fall, från fysiologiskt misacylated ASP-tRNAASN tRNA5,21) resulterar i en liten del av den översatta renilla proteiner få aktivitet, som kan mätas. Jämförelse av Renilla/Firefly aktivitet av muterade reporter jämfört med vild-typ dubbla enzym gör beräkningen av asparagin till en aspartat fel översättning hastighet. Brapportörs systemet nluc/GFP fungerar enligt en liknande princip. Den muterade Nluc (D140N) genen har en N-Terminal sekretion signal härledd från antigen 85A, ett större utsöndras mykobakteriell protein. Både nluc -och GFP -generna uttrycks från identiska tetracyklininducerbara initiativtagare, för att möjliggöra användning av GFP som riktmärke för relativ uttryck. Notera avsaknaden av vild-typ Nluc kontroll stam: denna reporter används främst i screening, där mätningar av relativa fel översättningar priser är tillräckliga för den primära skärmen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Översikt över hur man mäter fel översättningen med hjälp av Renilla-Firefly reporter (avsnitt 1 i protokollet). Färska kulturer av M. smegmatis, omvandlas med en Plasmid uttrycker Dual-luciferase reportrar, odlas. Rapportörens uttryck induceras, och prövnings föreningar eller villkor testas. Efter 4-6 h reporter uttryck, är kulturerna pelleterat och lyserat och cellysater testas för Dual-luciferase aktivitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Översikt över hur man mäter fel översättningen Nluc-GFP reporter (avsnitt 2 i protokollet). En ny kultur av M. smegmatis, omvandlas med nluc och GFP reportrar, odlas till en tillräcklig volym för alla plattor som skall testas (förutsatt ~ 10 ml/96-well plattan). Omedelbart innan Pipettera bakterie kulturen i varje brunn, framkalla ett uttryck för reportrar med ATC läggas till bulk kulturen. Inkubera brunnarna genom att skaka dem över natten. För att mäta den relativa fel översättningen priser, överföra kulturer till en svart platta (för att öka känsligheten för fluorescensdetektion), mäta GFP fluorescens, och sedan, snurra plattorna ner till pellet bakterierna. Överför supernatanten till en vit platta för Nluc-aktivitetsmätning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativt resultat av att använda Renilla-Firefly reporter mäta fel översättning frekvensen i närvaro av kasugamycin i olika stammar. Fel översättning frekvenser av aspartat för asparagin i (a) vildtyp M. smegmatis och (B) en stam som tagits bort för ksga (∆ ksga) efter behandling med kasugamycin (KSG) mätt med renilla-Firefly Dual Reporter. Kulturerna behandlades med kasugamycin vid indikerade doser (i mikrogram/milliliter) för 6 h före cell lysis och mätningar. De korrigerade ren/FF-kvoterna (y-axlarna) är indikativa för aspartat vid fel översättning av asparagin. Strykningen av Ksga resulterar i en högre bas linje fel översättning hastighet, vilket är mer motstånds kraftig mot modulering av kasugamycin. Staplarna anger medelvärdena, med standard avvikelse som fel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativt resultat av att använda Nluc-GFP reporter mäta fel översättning hastighet i närvaro av kasugamycin. Relativ fel översättning frekvenser av aspartat för asparagin i vildtyp M. smegmatis mätt som nluc/GFP reporter, efter behandling med kasugamycin (KSG) över natten (16 h). Staplarna anger medelvärdena, med standard avvikelse som fel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här kan anpassas för mätning av fel översättningar frekvenser i en mängd olika organismer. Det finns ett antal överväganden som bör hållas i åtanke när man anpassar protokollet till andra system. För det första bör syftet med mätningen övervägas. För en noggrann mätning av fel översättningar med vinst-av-funktion reportrar, vad som behövs är (a) en robust avläsning assay (t. ex. enzymatisk funktion [i detta fall, luciferas aktivitet] med ett brett linjärt område). Också, leta efter (b) en förlust av funktions mutation i en kritisk rester av reportaget protein som resulterar i en mycket betydande förlust av funktion, under den förväntade frekvensen av fel översättning. Till exempel, om den förväntade fel översättning hastighet som skall mätas är cirka 10-3/kodon, förlusten av funktions mutation måste vara större än 1 000-faldig; annars kommer det lägre intervallet för fel översättningar inte att upptäckas på ett känsligt sätt. Slutligen, för korrekt mätning av fel översättning priser med vinst-of-funktion reportrar, (c) en robust benchmark reporter behövs-i detta fall, Firefly luciferas för avsnitt 1 i protokollet. Helst bör benchmark reporter fixeras till muterade enzymatiska reporter, garantera (för alla avseenden) att de båda uttrycks i ekvimolära nyckeltal. Benchmark (och primär reporter) avläsning bör vara robust för störningar i utsatta miljöer. Till exempel är fluorescens av vildtyp GFP mycket mottagliga för störningar av förändringar i pH28, vilket gör det olämpligt som riktmärke för mätning av fel översättningar frekvenser i fagocytos mykobakterier i makro Fager, som är bosatta i phagosomer som är lägre än pH 729. Å andra sidan, för tillämpningar som små molekyl screening, de viktigaste överväganden för en primär skärm kommer att reproducerbarheten av mätningarna (dvs precision, i motsats till noggrannhet), minimering av manuell hantering, och små och kultur volymerna. Noggranna mätningar av fel översättningar är mindre viktiga och kan utföras som sekundära analyser. Slutligen, det bör noteras att reportrar som beskrivs i detta protokoll, baserat på enzymatisk funktion luciferas enzymer, kommer bara att mäta medelvärdet fel översättning frekvenser av en bakterie population, men kan inte ge information om Single-cell heterogenitet skillnader i fel översättningar. Med tanke på betydelsen av encellig variation i adaptiva fenotyper30,31,32, har fluorescerande reportrar för mätning av fel översättningar utvecklats12,33 , inklusive för mätning av fel översättning i mykobakterier5.
Efter att ha övervägt kraven för mätning av fel översättning, bör det noteras att de genetiska vinst-av-funktion reportrar som beskrivs i detta protokoll kan bara mäta en typ av fel översättning (dvs. en aminosyra substitution för en Codon) per reporter. Därför krävs flera reportrar för att mäta olika fel översättningar händelser. Till exempel, för mätning av fel översättning genom ribosomalt avkodning av felen hos nära-cognate kodon av lysyl-tRNA vid ett läge, krävs minst 16 reportrar2,3,11. Hög precisions masspektrometri och bioinformatik möjliggör en potentiell identifiering av många olika typer av fel översättningar samtidigt18; men dessa metoder kommer också med förbehåll. I allmänhet är de mindre noggranna än vinst-av-funktion reportrar. Dessutom, som nämnts tidigare, de är mindre lämpade för att upptäcka vissa typer av fel översättning, nämligen de som skulle kunna flätas samman med Nonenzymatic deamidation23. Slutligen är masspektrometri olämplig som avläsning för screening med medelhög eller hög genom strömning.
För anpassning av dessa reportrar och protokoll för mätning av fel översättning i andra system, ytterligare överväganden inkluderar ett robust uttryck för reportern i det önskade modell systemet. Vi försökte initialt att använda Dual-luciferase system som utvecklats av Farabaugh och kollegor i vårt mykobakteriella systemet utan ändringar men hade ingen framgång, på grund av en brist på reporter uttryck. Omfattande fel sökning identifierade att både Codon-optimering och en smärre sekvens modifiering av reportrar krävdes för att möjliggöra robust uttryck25 (och se ovan). Det är tänkbart att liknande anpassningar av reportrarna skulle krävas för användning i andra system.
Slutligen bör man överväga vilken typ av fel översättning som skall mätas. Till exempel, om det finns ett behov av att mäta stopp-kodon genomläsning (nonsens dämpning), stopp kodon förlust av funktion mutation måste införas i en icke-kritisk region av den primära reportern protein34. Annars, endast specifika dumheter förtryck händelser som återfå kritiska rester (och därmed reporter funktion) kommer att mätas med analysen, vilket skulle kunna leda till en betydande underskattning av den sanna fel översättning priser. Det finns allt fler belägg för att translationellt fel spelar en möjlig adaptiv roll i ett stort antal organismer1,12,13,35. Dock är mätningen av fel översättningar fortfarande begränsad till en liten, om än växande antal modell arter. Anpassningen av känsliga metoder för att mäta fel översättning har potential att ytterligare öka forskarnas förståelse för översättnings felens roll i fysiologi och patologi.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis stöds av bidrag från Bill och Melinda Gates Foundation (OPP1109789), National Natural Science Foundation i Kina (31570129), och start-up medel från Tsinghua University School of Medicine till BJ BJ är en Wellcome Trust Prövaren (207487/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 | BD Difco | 271310 | |
| Anhydrotetracycline | Cayman Chemical | 10009542 | |
| Kasugamycin | sigma | K4013 | |
| Dual-luciferase reporter assay system | promega | E1960 | |
| Nano-Glo luciferase assay | promega | N1120 | |
| Fluoroskan Ascent FL luminometer | Thermo | / | |
| Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid | Costar | 3922 | |
| Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid | Costar | 3925 | |
| 96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid | Costar | 3599 | |
| Non-commercial reagents (plasmids) | |||
| pUV-TetOR-RenFF | NA | NA | episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter |
| pUV-TetOR-Ren-D120N-FF | dual-luciferase reporter with mutated Renilla | ||
| pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N | NA | NA | episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase |
| pMC1S-GFP | NA | NA | Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP |
References
- Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B.
- Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
- Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
- Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
- Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
- Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
- Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
- Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
- Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
- Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
- Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
- Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
- Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
- Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
- Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
- Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
- Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
- Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
- Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
- Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B.
- Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
- Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
- Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
- Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
- Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
- Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
- Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
- Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
- Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
- Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
- Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
