食子细胞系是基础和生物医学研究的重要试剂。本文提供了解冻, 亚培养, 冷冻保存常用的嗜食子细胞系, 以协助研究人员将这些试剂的使用纳入他们的研究。
目前有160多种不同的嗜酸性粒细胞系由嗜食虫体基因组学资源中心 (dgrc) 分布。有了基因组工程, 新细胞系的数量有望增加。DGRC 的目的是让研究人员熟悉如何使用嗜酸性粒细胞系作为一种实验工具来补充和推动他们的研究议程。提供了处理具有明显特征的各种嗜酸性粒细胞系的程序, 包括解冻、培养和冷冻保存细胞系的协议。重要的是, 该出版物展示了与食子细胞系合作所需的最佳做法, 以最大限度地减少来自不定微生物或其他细胞系的污染风险。熟悉这些程序的研究人员将能够深入研究使用嗜酸性粒细胞的许多应用, 包括生物化学、细胞生物学和功能基因组学。
果蝇培养细胞的使用补充体内的苍蝇遗传分析, 并作为一个主要的调查工具, 以解决许多基本的生物学问题1,2,3。嗜酸性粒细胞系提供了独特的同质细胞群, 这些细胞来自不同的组织来源, 具有不同的遗传背景。细胞系适用于许多应用, 包括转基因基因表达、基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、高通量 RNA 干扰 (RNAi) 屏幕、细胞生物学和显微镜。重要的是,使用嗜食虫细胞培养有助于描述已知刺激的直接时间反应。此外,嗜食细胞培养是适合 crispr-cas9 基因组编辑, 使它相对容易创建新的细胞系与特定的基因组修改4,5, 6,7。
德诺菲拉基因组学资源中心 (DGRC) 是控核细胞系的存储库和分发中心。DGRC 的目标之一是协助研究界成员使用戈德罗巴细胞培养资源。本文介绍了处理食子细胞系的基本协议。它补充了现有资源, 帮助研究人员对处理果蝇细胞培养物感到满意, 并在实验1、2、8、9中达到一定程度的独立性 ,10。
最常用的嗜食细胞系有: 施耐德系列11、kc16712、三石/宫克想象盘和中枢神经系统 (cns) 线13、14、milner 实验室图像盘系15、成人卵巢细胞系16、17和 ras 线18 (表 1)。施耐德和 Kc167 系是用于生物化学、重组转基因基因表达和反向基因筛选的通用细胞系。三石/宫克实验室 (ML) 系来源于幼虫想象盘或中枢神经系统 (CNS), 对神经分泌、转录调控和 RNA 处理等相关研究都很有用。米尔纳 (CME) 圆盘线对于研究信号转导具有重要意义。从突变的成人卵巢中提取的 fGS/OSS 开放源码软件细胞系仍然是研究非编码小 rna 生物学在生殖细胞维持和分化中的影响的重要试剂 17、19.最后, Ras 系是独特的, 因为这些是从外代表达 Ras 癌基因的胚胎中提取的细胞系。它们具有肌肉前体细胞的转录特征, 并表达活性 piRNA 机制20。最近的评论文章和书籍章节涵盖了这些流行的细胞系的应用, 更详细的信息2,3,9。
所有这些细胞系都可以亚培养和冷冻。对于如何维持和准备冷冻保存, 对每个细胞系有轻微但重要的不同要求。例如, 不同的细胞系需要不同的培养基和补充剂 (表 1)。这些线在表面粘附特性、形态 (图 1和图 2)、基因型和加倍时间 (表 2) 方面也各不相同。我们提出了基本的协议, 并强调了处理各种广泛使用的嗜酸性粒细胞系的独特差异。
果蝇细胞培养物是基于细胞的高通量屏幕的主要试剂。它们的使用还补充了体内的基因研究, 提供了适合生物化学的同质细胞群, 在注射到苍蝇体内之前对转基因结构进行了快速检测, 细胞生物学, 显微镜和最近的体细胞遗传通过基因组编辑1,2,3, 8,9,10进行操作.
冷冻嗜酸性粒细胞的活力和恢复对剧烈波动敏感, 即使在低温下也是如此。DGRC 将冷冻细胞系储存在n2 (-196°c) 的液相中, 并将其运输到干冰 (-705°c) 中。在干冰中运输的冷冻小管不应转移回 n2 液体或- 80°c 的冷冻冷冻室储存。相反, 冷冻细胞应解冻, 抵达后尽快以高细胞密度重新播种 (协议第1节), 并为预定目的进行培养 (协议第3节)。如果细胞系没有立即用于实验, 细胞系应该被冷冻保存 (协议第6节), 直到它们准备好使用。
一些细胞系, 如 MLA-BG2-1/2 和 Ras 系, 需要几天的时间才能从从冷冻保存状态中恢复的影响中恢复。在解冻后的头几天, 大量的细胞碎片伴随着这些细胞系。如果不受干扰, 细胞就会恢复和增殖。DGRC 的许多戈罗迪拉细胞系已被改造为在基于 m3 的培养基22中生长。对于从解冻的影响中恢复缓慢的细胞系来说, 使用有条件的媒体可能是有用的。有条件的培养基可能含有细胞分泌到培养基中的生长因子, 这可能会鼓励细胞解冻后的恢复和增殖。
细胞系通常遵循陈规定型的生长曲线, 包括滞后阶段、指数阶段、高原阶段和恶化阶段。许多嗜铬细胞系在生长的逻辑阶段增殖, 当它们在25°c 的密度在 1 x 10 6 和 1 x 10 7 细胞之间时。细胞系的传代是至关重要的, 这样它们总是处于指数增长阶段。
培养物的融合, 以百分比表示, 描述细胞所覆盖的生长表面积。细胞系的细胞融合取决于其细胞形状和大小。不同的细胞系具有不同的形态和粘附特性。因此, 大约相似的汇合处的不同细胞系可能具有截然不同的细胞密度 (图 1)。培养融合可能不是通过果蝇细胞培养的理想指标, 因为果蝇细胞系继续增殖, 要么在生长表面形成后, 将彼此堆积如山作为病灶, 要么在悬浮状态下。(图 1)。然而, 有特定细胞系经验的用户可能经常使用汇合作为何时亚培养的快速视觉指南。
虽然可以在19-25°c 的环境 RT 上生长嗜德维拉线, 但不建议这样做, 因为环境温度波动可能会影响增殖速度。建议使用专用的25°c 孵化器。果蝇细胞培养的孵化器不需要促进co2气体交换, 因为果蝇细胞培养基不使用 co2 进行缓冲.培养细胞系的孵化器内的湿度是在钢板中培养细胞时不可忽视的一个重要因素。根据孵化器的类型和工作环境的不同, 可能需要在孵化器内放置无菌水烧杯。为了最大限度地减少介质蒸发, 请使用密闭的 t 烧瓶或将培养板存放在密封的塑料容器中, 同时将其存放在孵化器内。
重要的是要制定一个时间表, 为嗜酸性粒细胞系的亚培养。为了估计增长率和显示器的一致性, 可以方便地亚培养在一个均匀的几何比例 (分裂比例 1: 2, 1: 4, 1:2)。例如, 在 8 x10 6 cellss\ Ml 的 Kc167 细胞的 10 ml 融合板可以按1:8 的比例分裂, 以达到 1 x10 6 cellsll 的播种密度 (1.25 毫升的细胞悬浮液稀释成 8.75 ml 的新鲜介质)。在72小时内, Kc167 培养物预计将扩散到 8 x10 6 cellsls·ml 的密度, 因为它的翻倍时间为24小时。因此, 分裂率被确定为促进一个方便的亚培养例程, 每周最多两次, 确保细胞总是在其指数日志阶段的生长培养。这样就有了一个定期的细胞亚培养时间表, 这样融合的时间既不是太短, 也不是太长。如果融合时间太短, 细胞在较低的细胞密度 (较高的分裂比) 下培养。同样, 如果达到融合的时间太长, 细胞在较高的细胞密度 (较低的分裂比) 下培养。需要注意的是, 大多数嗜酸性粒细胞系对低细胞密度 (lt;1 x10细胞细胞) 非常敏感, 在这些细胞中, 细胞几乎不增殖, 最终可能死亡。
嗜酸性粒细胞系在生长特征和形态上各不相同。因此, 可能需要以不同的方式处理具有不同属性的细胞系。大多数嗜酸性粒细胞系都是半粘附的。在细胞密度较低的情况下, 它们对生长表面的粘附力更强, 当培养物融合时, 细胞就会变得不那么粘附, 很容易分离。这种细胞粘附力的逐渐变化促进了最广泛使用的戈德罗斯拉细胞系 (施耐德、kc 系、图像盘和中枢神经系统) 的容易亚培养, 因为它允许操作人员简单地在细胞单层上分配介质将其移出当培养致密时, 从生长表面。对于表面粘附的线, 如女性胚系茎-卵巢体细胞鞘 (fgssoss) 和 Ras 系, 必须在胰蛋白酶中孵育细胞, 时间较短, 以帮助细胞脱离生长表面。
大多数嗜食细胞系的培养基添加包括胎儿小牛血清 (fcs)。胰岛素和成人苍蝇提取物 (FEX) 是一些特定的线路所必需的。FEX 包含对特定幼虫想象体线和成体卵巢细胞系的生长至关重要的未定义成分。DGRC 准备并提供来自1周龄的俄勒冈州-r-moentcode 苍蝇 (RRID:BDSC_25211) 的成人 FEX, 价格为 2.5 mL 和10毫升。DGRC 还在其网站上提供了小规模 FEX 准备的说明 。然而, FEX 的准备工作非常耗时, 需要大量的成年苍蝇。
对嗜食子细胞系的冷冻保存节省了时间, 并为维持不立即使用的细胞系提供了试剂。低温保存是通过在含有低温保护剂 DMSO 的介质中将细胞 (-1°cp/min) 冷冻到-80°c 来实现的。缓慢冷却步骤是成功冷冻保存的关键。在-80°c 的冰柜中, 将细胞的安培以-1°cmmin 的速度冷却, 当放置在一个装满异丙醇的冷冻容器中时。从25°c 环境温度开始, 在压子中的温度需要高达2小时才能达到-80°c。建议让小管在一夜之间冻结。
然后, 冷冻的小泡必须迅速转移到氮气的液相中, 以便长期储存。在环境温度下, 低温恒温器将在约10°cmin 时快速再加热, 在-50°c 23 时, 其活力将受到影响。为了保持快速传输, 以小批量处理小管, 以最大限度地减少暴露在环境温度下。或者, 将冷冻冰液放在干冰上, 同时准备将其转移到液体n2.如果没有液氮, 细胞可能会储存在-80°c 的冰柜中, 尽管随着时间的推移有明显恶化的危险。
细胞密度对于成功的冷冻保存和随后细胞系的恢复至关重要。一般情况下, 一旦有过量的细胞出现, 就应该冻结新的细胞系, 以产生最初的冷冻 (1-3 个小管)。一旦细胞系得到进一步稳定的培养, 应创建10-20 个小管的冷冻库存。然后, 该股票被解冻, 以检查其冷冻后细胞的恢复和活力, 之后它被传播进行实验, 或更换股票时, 冷冻股票壶的数量下降到5。最后, 重要的是要验证解冻的细胞是否保留其亲本种群的特征, 因为已知细胞系会进化3,24.
总之, 本文通过提供有关果蝇细胞系基本处理的各种方面、最佳做法和视听协议的基本信息, 为研究果蝇细胞培养物提供了入门知识。这种可获得的资源旨在顺利简化与培养的嗜酸性粒细胞合作的介绍, 并补充任何研究实验室的现有培训指南。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢国家卫生研究院 (NIH P40OD010949 奖) 和研究界利用在 DGRC 策划的各种d. insogaster Dname/vector/细胞资源。
100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |