Drosophila 셀 라인은 기본 및 생물 의학 연구를 위한 중요 한 시 약. 이 문서는 녹고, subculturing, 및 그들의 연구에서이 약의 사용을 통합 연구원을 지원 하기 위해 일반적으로 사용 되 초파리 셀 라인의 cryopreservation 프로토콜을 제공 합니다.
160 가지 초파리 셀 라인 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)에 의해 배포 현재 있다. 게놈 엔지니어링, 새로운 세포의 수 증가 예정 이다. DGRC 연구원은 실험 도구로 초파리 셀 라인을 사용 하 여 보완 하 고 그들의 연구 의제를 드라이브에 익숙해지도록 하는 것을 목표로. 독특한 특성을 가진 초파리 세포 라인의 다양 한 작업에 대 한 절차, 녹고, 경작, 및 cryopreserving 세포에 대 한 프로토콜을 포함 하 여 제공 됩니다. 중요 한 것은,이 게시 초파리 셀 라인 오염 우발적인 미생물 또는 다른 셀 라인에서의 위험을 최소화 하기 위해 함께 작동 하는 데 필요한 모범 사례를 보여 줍니다. 이러한 절차에 익숙해 연구팀 초파리 배양 세포 생화학, 세포 생물학 및 기능 유전체학을 포함 하 여 사용 하는 많은 응용 프로그램으로 탐구 수. 있습니다
초파리 를 사용 하 여 보완 vivo에서 유전자 분석을 비행 하 고 많은 기본적인 생물 학적 질문1,2,3을 해결 하기 위한 기본 조회 도구 역할 세포 배양. Drosophila 셀 라인 독특한 유전적 배경 가진 다른 조직 소스에서 파생 된 셀의 독특한 homogenous 인구를 제공 합니다. 셀 라인은 유전자 변형 유전자 발현 유전체학, transcriptomics, proteomics, metabolomics, 높은 처리량 RNA 간섭 (RNAi) 스크린, 세포 생물학, 현미경 등 많은 응용 프로그램에 적합 합니다. 중요 한 것은, 초파리 세포 배양의 사용 알려진된 자극에 즉시 임시 응답의 특성화를 촉진 한다. 또한, 초파리 세포 배양은 CRISPR Cas9 게놈 편집, 비교적 손쉽게 특정 게놈 수정4,,56, 새로운 셀 라인을 만들 의무가 7.
초파리 게놈 자원 센터 (DGRC) 초파리 세포 라인에 대 한 저장소 및 유통 센터 역할을 합니다. DGRC의 목표 중 하나는 구성원 들을 돕는 연구 커뮤니티의 초파리 세포 culture 리소스를 사용 하 여입니다. 이 문서는 초파리 셀 라인의 처리에 대 한 기본 프로토콜을 표시합니다. 연구팀은 초파리 세포 배양을 처리와 함께 편안 하 게 하 고 그들의 실험1,2,8,9에서에서 독립의 수준을 달성할 수 있도록 기존 자원을 보완합니다 ,10.
가장 일반적으로 사용 되 초파리 셀 라인: 슈나이더11, Kc16712, 미쓰비시/미 야 케 imaginal 디스크 고 중앙 신경 시스템 (CNS) 라인13,14, Milner 실험실 imaginal 디스크 라인 15, 성인 난소 세포 라인16,17, 그리고 Ras 라인18 (표 1). 슈나이더와 Kc167 라인은 생화학, 재조합 유전자 변형 유전자 발현, 그리고 역방향 유전 스크린에 사용 하기 위해 일반적인 다목적 셀 라인. 미쓰비시/미 야 케 실험실 (ML) 라인 애벌레 imaginal 디스크 또는 중앙 신경 시스템 (CNS)에서 파생 했다 그리고 그들은 neurosecretion, 전사, 규정과 RNA 처리에 관련 된 연구에 유용. Milner (CME) 디스크 라인 신호 변환 공부에 대 한 중요 한 되었습니다. FGS/OSS 셀 라인 돌연변이 성인 난소에서 파생 된 비 코딩 작은 RNA 생물학 생식 세포 유지와 분화17,19의 영향을 연구 하는 중요 한 시 약에 남아 있다. 마지막으로, Ras 라인 배아 Ras oncogene를 표현 하는 ectopically에서 파생 된 셀 라인 이기 때문에 유일 하다. 그들은 근육 선구자 세포의 transcriptional 서명 있고 활성 piRNA 기계20을 표현 한다. 최근 리뷰 기사 및도 서 챕터 자세한 내용은2,,39이 인기 있는 셀 라인의 애플 리 케이 션을 커버.
이러한 모든 셀 라인 subcultured 고 고정 될 수 있습니다. 각 셀 라인을 유지 하 고 cryopreservation 준비 하는 방법에 대 한 중요 하지만 약간 다른 요구 사항이 있습니다. 예를 들어 고유한 셀 라인 필요 다른 미디어와 보충 (표 1). 라인도 다 표면 부착 속성, 형태학 (그림 1 및 그림 2), 유전자 형 및 배 시간 (표 2). 우리는 기본 프로토콜을 제시 하 고 다양 한 널리 초파리 세포 라인을 처리 하기 위한 독특한 차이점을 강조.
초파리 세포 배양은 높은 처리량 셀 기반 화면에 대 한 기본 시 약. 그들의 사용 또한 세포 생화학, 급속 한 파리, 세포 생물학, 현미경 검사 법 그리고 더 최근의 체세포 유전자를 주입 하기 전에 유전자 변형 구조 테스트에 적합의 균질 성 인구를 제공 하 여 vivo에서 유전자 연구를 보완 1,2,3,8,,910을 편집 하는 게놈에 의해의 조작
생존 능력 및 냉동된 초파리 세포의 복구는 낮은 온도 에서도 급격 한 변동에 민감합니다. DGRC N2 (-196 ° C)의 액체 단계에서 냉동된 세포를 저장 하 고 드라이 아이스 (-78.5 ° C)에 그들을 전송. 드라이 아이스에 이송 되어 냉동된 ampules 액체 N2 또는 저장을 위해-80 ° C 냉장고에 다시 전송 되지 한다. 대신, 고정 된 셀 해야 해 동, 최대한 빨리 도착 (프로토콜 섹션 1) 높은 세포 조밀도에 다시 시드해야 되며 그들의 의도 된 목적 (프로토콜 섹션 3)에 대 한 교양. 셀 라인은 즉시 실험에 대 한 활용 하지, 하는 경우 셀 라인 이어야 한다 그들은 사용 하기 위해 준비가 될 때까지 (프로토콜 섹션 6) cryopreserved.
ML-BG2-c2 및 Ras 라인 등 일부 셀 라인, cryopreserved 상태에서 부활 되 고의 효과에서 회복 하기 위해 몇 가지 일을 해야 합니다. 세포질 파편 상당한 양의 함께 이러한 셀 라인 녹고 후 처음 몇 일. 그대로 왼쪽, 세포 회복 되며 증식. DGRC에서 많은 초파리 셀 라인 M3 기반 미디어22성장에 적응 되었습니다. 해빙의 효과에서 회복 하기 위해 느린 세포 라인에 대 한 바른된 미디어를 사용 하 여 유용할 수 있습니다. 바른된 미디어 가능성이 복구 녹고 후 세포의 확산을 장려 수 있는 미디어로 세포에서 분 비 하는 성장 인자를 포함 합니다.
세포는 일반적으로 지연 위상, 지 수 단계, 고원 단계 및 악화 단계 구성 된 틀에 박힌 성장 곡선을 따릅니다. 1 x 106 와 25 ° c.에서 1 x 107 셀/mL 농도에서 교양 때 많은 초파리 셀 라인 성장의 로그 단계에서 확산 그들은 항상 지 수 성장 단계는 세포 passaged는 필수적 이다.입니다.
백분율로 표시, 문화의 합류 성장 영역을 셀에 포함 된 설명 합니다. 셀 라인 셀 합류의 셀 모양과 크기에 따라 달라 집니다. 고유 셀 라인 다른 형태학 및 준수 속성 있다. 그 결과, 대략 비슷한 합류에 다른 셀 라인 훨씬 뚜렷한 세포 밀도 (그림 1)를 할 수 있습니다. 문화 합류 초파리 셀 라인 성장 표면이 되었습니다 후에 서로 말뚝 foci 또는 정지에서 하 여 증식을 계속 하기 때문에 초파리 세포 배양을 뿌리고 위한 이상적인 지표를 되지 않을 수 있습니다. (그림 1)을 적용. 그러나, 특정 셀 라인 경험 있는 사용자가 사용할 수 있습니다 자주 합류에 대 한 빠른 시각적 가이드로 subculture에 때.
19−25 ° C 사이 주위 RT에 초파리 라인 성장 수는, 하는 동안 주위 온도 변동 확산 속도 영향을 미칠 수 있기 때문에 권장 하지 않습니다. 25 ° C 전용된 인큐베이터를 사용 하 여 것이 좋습니다. 초파리 의 세포 배양에 대 한 보육 초파리 세포 배양 버퍼링에 CO2 를 사용 하지 않기 때문에 CO2 가스 교환을 촉진 하기 위하여 필요 하지 않습니다. 세포 배양을 위한 인큐베이터 내부 습도 하지 배양 접시에 셀 때 간과 하는 중요 한 요소 이다. 유형에 따라 인큐베이터와 작업 환경에, 인큐베이터 내부 살 균 물의 비 커를 필요할 수 있습니다. 미디어 증발 최소화, 닫힌된 T-플라스 크를 사용 하거나 배양 배지 인큐베이터 안에서 단단히 밀폐 된 플라스틱 컨테이너에 저장 합니다.
그것은 초파리 셀 라인 subculturing에 대 한 일정을 개발 하는 것이 중요입니다. 성장 속도 모니터 일관성 추정, (분할 비율 1:2, 1:4, 1:8)도 기하학적 비율로 subculture에 편리 하다. 예를 들어 8 x 106 셀/mL에서 Kc167 세포의 10 mL confluent 플레이트 1 x 106 셀/mL (1.25 mL 신선한 매체의 8.75 mL로 희석 세포 현 탁 액의)의 시드 밀도 달성 하기 위해 1:8 비율로 분할할 수 있습니다. 72 h, Kc167 문화에 8 x 106 셀/mL의 조밀도에 주어진 24 h의 2 배 시간으로 예상 된다. 분할 비율 따라서 편리한 하위 루틴의 일주일에 두 번, 최대 그 세포 성장의 그들의 지 수 로그 단계에 교양 항상 확보를 용이 하 게 결정 됩니다. 합류 하는 시간이 너무 짧아도 너무 오래 되도록 셀을 subculturing에 대 한 정기적인 일정에 대 한 수 있습니다. 합류 하는 시간이 너무 짧은 경우에, 세포는 더 낮은 세포 밀도 (높은 분할 비율)에 subcultured는. 마찬가지로, 합류를 도달 하는 시간이 너무 긴 경우에, 세포 높은 세포 밀도 (낮은 분할 비율)에 subcultured는. 대부분 초파리 셀 라인 낮은 세포 밀도에 아주 과민 하다는 것이 중요 하다 (< 1 x 105 셀/mL), 셀 거의 증식 하 고 결국 죽을 수도 있습니다.
Drosophila 셀 라인 성장 특성 및 형태에서 변화 한다. 그 결과, 셀 라인 고유 속성을 다르게 처리 될 수 있을 수 있습니다. 대부분 초파리 셀 라인은 반 부착. 더 낮은 세포 밀도, 그들은 더 강한 성장 표면에 및 준수 문화 confluent, 셀이 부착 되 고 고 쉽게 분리. 세포 부착에이 점차적인 변화 용이 가장 널리 초파리 셀 라인 (슈나이더, Kc 라인, imaginal 디스크 및 CNS 라인)의 쉬운 subculturing 그것은 단순히 그들을 꺼내 려 셀 단층을 통해 미디어를 분배 하는 연산자를 허용 때 문화는 조밀한 성장 표면에서 있는 표면 부착과 같은 줄에 대 한 여성 생식 선 줄기/난소 체세포 칼 집 (fGS/OSS) 및 Ras 라인, 그것 성장 표면에서 세포를 분리에서 원조 하기 위하여 짧은 기간에 대 한 트립 신에 셀을 품 어 필수적입니다.
대부분 초파리 세포 라인에 대 한 미디어 추가 송아지 태아 혈 청 (FCS) 포함 되어 있습니다. 인슐린 및 성인 비행 추출 (FEX)는 일부 특정 라인에 필요 합니다. FEX 특정 애벌레 imaginal 디스크 라인과 성인 난소 세포 라인의 성장에 필수적인 정의 되지 않은 구성 요소를 포함합니다. DGRC 준비 하 고 만들어 사용할 수 있는 성인 FEX 1 주 오래 된 오 레 곤-R-modENCODE 파리에서 파생 된 (RRID: BDSC_25211) 2.5 mL와 10 mL aliquots에. DGRC는 또한 그것의 웹사이트에 작은 규모 FEX 준비에 대 한 지침을 제공 합니다 . 그러나 FEX 준비,, 시간이 소요 되 고 성인 파리의 대량을 요구 한다.
초파리 셀 라인의 cryopreservation는 즉시 사용에서 시간과 세포의 유지 보수에 대 한 시 약을 절약할 수 있습니다. Cryopreservation은 DMSO, cryoprotective 에이전트를 포함 하는 매체에서-80 ° C를 천천히 셀 (-1 ° C/min)를 동결에 의해 이루어집니다. 느린 냉각 단계 성공적인 cryopreservation 중요 하다. -80 ° C 냉장고에서 셀의 용액은 소 프로 파 놀으로 가득 냉동 컨테이너에 배치 될 때-1 ° C/min의 속도로 냉각 된다. -80 ° c.에 도달 ampules에 온도 대 한 최대 2 시간 걸릴 것 이다 25 ° C 주변 온도에서 시작, 그것은 하룻밤 동결 ampules 떠날 것이 좋습니다.
냉동된 ampules 장기간된 보관에 대 한 질소의 액체 단계에 빠르게 전송 합니다 다음. 주위 온도에 cryovial 약 10 ° C/min에서 빠르게 데워 것 이다 하 고 생존23-50 ° C 이상에서 손상 될 것입니다. 전송, 신속한 유지 하려면 ampules 주위 온도에 노출을 최소화 하기 위해 작은 일괄에서 처리 합니다. 또는, 액체 N으로 그들의 전송을 위해 준비 하는 동안 드라이 아이스에 냉동된 cryovials을 배치2. 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 셀 비록 시간이 지남에 중요 한 악화의 위험을-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다.
셀 밀도 성공적인 cryopreservation와 셀 라인의 후속 부흥에 대 한 중요 하다. 일반적으로, 새로운 셀 초기 만들려고 라인을 동결 해야 합니다 최대한 빨리 셀의 초과 사용할 수 있게 됩니다 (1−3 ampules)를 고정 합니다. 셀 라인은 되었습니다 더 교양 안정적으로, 일단 10−20 ampules 냉동된 재고 만들어야 합니다. 이 주식은 다음의 후 동결 세포 복구 및 생존 능력, 실험에 대 한 전파 됩니다 후 확인 하거나 냉동된 재고 ampules 수가 5 개 미만으로 떨어질 때 주식을 대체 하는 해 동 됩니다. 마지막으로, 그것은 해 동된 세포에 그것의 부모의 재고 특성 유지 셀 라인3,24진화 알려져 있습니다 확인 하는 것이 중요.
결론적으로,이 문서 초파리 세포 배양 초파리 셀 라인의 기본 처리에 대 한 다양 한 선, 모범 사례 및 시청각 프로토콜에 기본 정보를 제공 하 여 작업에 대 한 입문서를 제공 합니다. 이 액세스할 수 있는 리소스는 교양된 초파리 셀 작업에 대 한 소개를 원활 하 게 쉽게 하 고 어떤 연구 실험실에서 기존 교육 가이드를 보완 하기 위해 의미입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 DGRC에서 큐레이터 다양 한 D. melanogaster DNA/벡터/셀 리소스 활용을 위한 건강의 국가 학회 (NIH P40OD010949 상) 및 연구 커뮤니티 감사 합니다.
100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |