Drosophila cellelinjer er vigtigt reagenser til både grundlæggende og biomedicinsk forskning. Denne artikel giver protokoller for optøning, subculturing og kryopræservering af almindeligt anvendte Drosophila cellelinjer til at hjælpe forskere med at indarbejde brugen af disse reagenser i deres forskning.
Der er i øjeblikket over 160 forskellige Drosophila cellelinjer distribueres af Drosophila genomforskning ressource Center (DGRC). Med genom engineering forventes antallet af roman cellelinjer at stige. DGRC har til formål at sætte forskere med at bruge Drosophila cellelinjer som en eksperimentel redskab til at supplere og drive deres forskningsdagsorden. Procedurer til at arbejde med en bred vifte af Drosophila cellelinjer med forskellige karakteristika er forudsat, herunder protokoller til optøning, dyrkning og cryopreserving cellelinjer. Vigtigst, viser denne publikation de bedste fremgangsmåder, der skal arbejde med Drosophila cellelinjer til at minimere risikoen for kontaminering fra utilsigtet mikroorganismer eller andre cellelinjer. Forskere, der bliver bekendt med disse procedurer vil være i stand til at dykke ned i de mange programmer, der bruger Drosophila kulturperler celler herunder biokemi, cellebiologi og funktionel genomforskning.
Brugen af Drosophila kulturperler celler supplerer in vivo flyve genetisk analyse og fungerer som en primær undersøgelse værktøj for at løse mange grundlæggende biologiske spørgsmål1,2,3. Drosophila cellelinjer tilbyder enestående homogene befolkninger af celler, der stammer fra forskellige væv kilder med forskellige genetiske baggrunde. Cellelinjer egner sig til mange applikationer, herunder transgene genekspression, genomforskning, transcriptomics, proteomics, metabolomics, høje overførselshastighed RNA interferens (RNAi) skærme, cellebiologi og mikroskopi. Vigtigere, letter brugen af Drosophila cellekultur karakterisering af de umiddelbare tidsmæssige svar til kendte stimuli. Derudover er Drosophila cellekultur indstillet til CRISPR-Cas9 genom redigering, hvilket gør det relativt nemt at oprette nye cellelinjer med specifikke genom ændringer4,5,6, 7.
Drosophila genomforskning ressource Center (DGRC) fungerer som et depot og distribution center for Drosophila cellelinjer. Et af målene for DGRC er at bistå medlemmerne af Fællesskabets forskning i at bruge Drosophila celle kultur ressourcer. Denne artikel præsenterer grundlæggende protokoller for håndtering af Drosophila cellelinjer. Det supplerer eksisterende ressourcer for at hjælpe forskere med at blive fortrolig med håndtering Drosophila cellekulturer og opnå en grad af uafhængighed i deres eksperimenter1,2,8,9 ,10.
De mest almindeligt anvendte Drosophila cellelinier er: Schneider linjer11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake fantasiens disc og centrale nervesystem (CNS) linjer13,14, Milner laboratorium fantasiens disc linjer 15, voksen æggestokkene celle linjer16,17, og Ras linjer18 (tabel 1). Linjerne Schneider og Kc167 er generelle all-purpose cellelinjer til brug i biokemi, rekombinant transgene genekspression og omvendt genetiske skærme. Mitsubishi/Miyake laboratorium (ML) linjer blev afledt fra enten larve fantasiens diske eller centralnervesystemet (CNS) og de har været nyttige for undersøgelser i forbindelse med neurosecretion, transskription regulering og RNA forarbejdning. Milner (CME) disk linjerne har været vigtigt for at studere signaltransduktion. FGS/OSS cellelinjer afledt af mutant voksen æggestokke forbliver vigtigt reagenser til at studere virkningerne af ikke-kodende små RNA biologi i kimcelle vedligeholdelse og differentiering17,19. Endelig er Ras linjer unik, fordi disse cellelinjer udvundet af embryoer ectopically udtrykker Ras onkogen. De har forløber muskelceller transcriptional underskrift og udtrykker aktive piRNA maskiner20. Seneste anmeldelse artikler og bogkapitler dække anvendelser af disse populære cellelinjer med flere detaljer2,3,9.
Alle disse cellelinjer kan podes og frosset. Der er lille, men vigtigt forskellige krav til hvordan hver cellelinje er vedligeholdt og forberedt til kryopræservering. For eksempel kræver forskellige cellelinjer forskellige medier og kosttilskud (tabel 1). Linjerne også variere i overholdelse af overflade egenskaber, morfologier (figur 1 og figur 2), genotype og fordobling tid (tabel 2). Vi præsenterer grundlæggende protokoller og fremhæve de unikke forskelle til håndtering af de forskellige anvendte Drosophila cellelinjer.
Drosophila cellekulturer er primære reagenser til høj overførselshastighed celle-baserede skærme. Deres anvendelse også supplerer in vivo genetiske forskning ved at give en homogen population af celler egnet for biokemi, hurtig test af transgene konstruktioner før indsprøjtning i fluer, cellebiologi, mikroskopi og mere nylig somatisk celle genetiske manipulationer af genom-redigering1,2,3,8,9,10.
Levedygtighed og inddrivelse af frosne Drosophila celler er følsomme over for drastiske udsving selv ved lave temperaturer. DGRC gemmer frosne cellelinjer i den flydende fase af N2 (-196 ° C) og transporterer dem i tøris (-78.5 ° C). Frosne ampuller, der er blevet transporteret i tøris bør ikke overføres tilbage til flydende N2 eller en-80 ° C fryser til opbevaring. I stedet, de frosne celler bør være optøet, tilsås med en høj celle tæthed hurtigst muligt ved ankomsten (protokollen afsnit 1) og kulturperler til deres formål (protokollen afsnit 3). Hvis cellelinier ikke udnyttes straks for eksperimenter, cellen linjer bør være befrugtede (protokoltjenesten 6) indtil de er klar til brug.
Nogle cellelinjer linjerne ML-BG2-c2 og Ras har brug for flere dage hen til genoprette fra virkningerne af at blive genoplivet fra tilstanden befrugtede. En betydelig mængde af celleaffald ledsager disse cellelinjer de første par dage efter optøning. Venstre uforstyrret, vil cellerne genoprette og formere. Mange Drosophila cellelinjer på DGRC er blevet tilpasset til at vokse i M3 baseret medier22. I cellelinjer, der er langsomme til at inddrive fra virkningerne af optøning, kan brugen af aircondition medier være nyttigt. Konditioneret media sandsynligvis indeholder vækstfaktorer udskilles af celler i de medier, som kan tilskynde opsving og spredning af cellerne efter optøning.
Cellelinjer følger generelt en stereotype vækstkurve bestående af en mellemliggende fase, eksponentiel fase, plateau fase og en forringelse af fase. Mange Drosophila cellelinjer formere sig i log-fase af vækst når de er kulturperler med en tæthed mellem 1 x 106 og 1 x 107 celler/mL ved 25 ° C. Det er vigtigt at cellelinjer er passaged sådan, at de er altid i den eksponentielle vækstfase.
Sammenløbet af en kultur, udtrykt i procent, beskriver vækst areal, der er dækket af celler. Celle sammenløbet for en cellelinje afhænger af dets celle form og størrelse. Særskilte cellelinjer har forskellige morfologier og overholdelse af egenskaber. Som et resultat, kan forskellige cellelinjer på ca lignende confluence har langt adskilte celle tæthed (figur 1). Kultur sammenløbet kan ikke være en ideel indikator for passaging Drosophila cellekulturer, fordi Drosophila cellelinjer fortsætte til at formere sig enten ved Fundering oven på hinanden som foci eller suspension, selv efter vækst overflade har været overdækket (figur 1). Brugere erfarne med specifikke cellelinjer kan dog ofte anvende sammenløbet som en hurtig visuel vejledning for når til subkultur.
Mens det er muligt at dyrke Drosophila linjer på omgivende RT mellem 19−25 ° C, anbefales det ikke, fordi omgivende temperaturudsving kan påvirke spredning sats. En dedikeret 25 ° C inkubator anbefales. Inkubator for Drosophila cellekulturer behøver ikke at lette CO2 gasudveksling fordi Drosophila celle Kulturmedier ikke brug CO2 til bufferlagring. Fugtighed i rugemaskinen for dyrkning cellelinjer er en vigtig faktor ikke at blive overset, når dyrkning af celler i plader. Afhængigt af hvilken rugemaskine og arbejdsmiljø, kan det være nødvendigt at placere et bægerglas af sterilt vand inde i rugemaskinen. For at minimere media fordampning, bruge lukkede T-kolbe eller gemme kultur plader i en tætsluttende plastikbeholder mens inde i rugemaskinen.
Det er vigtigt at udvikle en tidsplan for podning Drosophila cellelinjer. Du skal vurdere vækst sats og overvåge konsistens, er det praktisk at subkultur på en selv geometriske forhold (split forholdet 1:2, 1:4, 1:8). For eksempel, kan en 10 mL sammenflydende plade af Kc167 celler på 8 x 106 celler/mL opdeles på 1:8 forhold til at opnå en seeding tæthed af 1 x 106 celler/mL (1,25 mL cellesuspension fortyndet til 8,75 mL frisk media). I 72 h forventes Kc167 kulturer at formere sig til en tæthed på 8 x 106 celler/mL, givet sin fordobling tid på 24 timer. Delingsforholdet er derfor besluttet på at lette en bekvemt subkultur rutine i op til to gange om ugen, at sikre at cellerne er altid kulturperler i deres eksponentiel log fase af vækst. Dette giver mulighed for en regelmæssig tidsplan for subculturing celler, så den tid til sammenløbet er hverken for kort eller for lang. Hvis tid til sammenløbet er for kort, podes i celler på en lavere celle tæthed (højere delingsforholdet). Tilsvarende, hvis tid at nå frem til sammenløbet er for lang, cellerne er podes på et højere celle tæthed (lavere delingsforholdet). Det er vigtigt at bemærke, at de fleste Drosophila cellelinjer er meget følsomme over for lav celle tætheder (< 1 x 105 celler/mL), i hvilke celler næppe formere sig og kan i sidste ende dø.
Drosophila cellelinjer varierer i vækst egenskaber og morfologi. Som følge heraf kan cellelinjer med forskellige egenskaber skal håndteres forskelligt. De fleste Drosophila cellelinjer er semi-tilhænger. På nederste celle tæthed, de overholder stærkere vækst overflade og som kulturen bliver sammenflydende, cellerne bliver mindre vedhængende og nemt løsne. Denne gradvise ændring i celle tilslutning letter let subculturing af mest anvendte Drosophila cellelinjer (Schneider, Kc linjer, fantasiens disc og CNS linjer), som det lader operatøren simpelthen dispensere medier over celle éncellelag at løsne dem fra vækst overfladen når kulturen er tætte. For linjer, der er overfladen tilhænger som kvindelige kønsceller stængel/æggestokkene somatiske kappe (fGS/OSS) og Ras linjer, det er vigtigt at udruge celler i trypsin for en kort varighed til støtte i afmontering celler fra vækst overflade.
Media Tilføjelser til de fleste Drosophila cellelinjer omfatter føtalt kalveserum (FCS). Insulin og voksne flyve ekstrakt (FEX) er nødvendige for nogle specifikke linjer. FEX indeholder udefinerede elementer til vækst af bestemte larver fantasiens disc linjer og de voksne æggestokkene cellelinjer. DGRC forbereder, og gør tilgængelige voksen FEX stammer fra 1 uge gamle Oregon-R-modENCODE fluer (RRID: BDSC_25211) i 2,5 mL og 10 mL alikvoter. DGRC giver også vejledning i lille skala FEX forberedelse på sit websted . FEX forberedelse, men er tidskrævende og kræver en stor mængde af voksne fluer.
Kryopræservering af Drosophila cellelinjer sparer tid og reagenser til vedligeholdelse af cellelinjer ikke i umiddelbar hjælp. Kryopræservering opnås ved langsomt frysning celler (-1 ° C/min.) til-80 ° C i et medium, der indeholder DMSO, en cryoprotective agent. Den langsomme afkøling skridt er afgørende for vellykket kryopræservering. I et-80 ° C fryser afkøles ampule af celler med en hastighed på 1 ° C/min. når de placeres i en indefrysning container fyldt med isopropanol. Starter ved 25 ° C omgivende temperatur, vil det tage op til 2 timer for temperaturen i ampuller at nå-80 ° C. Det anbefales at lade ampuller til fryse natten over.
Frosne ampuller skal derefter overføres hurtigt ind i den flydende fase af kvælstof for længere tids opbevaring. Ved omgivelsestemperatur, cryovial vil genopvarme hurtigt på ca 10 ° C/min. og rentabilitet vil blive kompromitteret på over-50 ° C23. For at holde overførsel hurtige, håndtere ampuller i små partier at minimere eksponering for omgivelsestemperatur. Alternativt, placere den frosne cryovials på tøris mens forberedelserne til deres overførsel til flydende N2. Hvis flydende nitrogen ikke er tilgængelig, kan cellerne være gemt i en-80 ° C fryser, selv med risiko for betydelig forværring med tiden.
Celle massefylde er afgørende for vellykket kryopræservering og efterfølgende genoplivning af cellelinjer. I almindelighed, nye celle linjer bør fastfryses for at oprette indledende fryse (1−3 ampuller) så snart et overskud af celler bliver tilgængelig. Når linjen celle har været yderligere kulturperler stabilt, skal der oprettes en frossen bestand af 10−20 ampuller. Denne bestand er derefter optøet at kontrollere sin post fryse celle opsving og levedygtighed, hvorefter det er opformeret til eksperimenter eller til at erstatte bestanden, når antallet af frosne stock ampuller falder til under fem. Endelig er det vigtigt at validere, at de optøede celler bevarer kendetegn af dets avlsmateriale som cellelinjer er kendt for at udvikle sig3,24.
Til sidst, præsenterer denne artikel en primer til at arbejde med Drosophila cellekulturer ved at levere de grundlæggende oplysninger om forskellige linjer, bedste praksis og audiovisuelle protokoller for grundlæggende håndtering af Drosophila cellelinjer. Denne tilgængelig ressource er beregnet til glat lette Introduktion til arbejde med kulturperler Drosophila celler og som supplement til eksisterende uddannelse guider på enhver forskningslaboratorium.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker National Institutes of Health (Award NIH P40OD010949) og Fællesskabets forskning for at udnytte de forskellige D. melanogaster DNA/vektor/celle ressourcer kurateret på DGRC.
100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |