Drosophila सेल लाइनों मौलिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान दोनों के लिए महत्वपूर्ण अभिकर्मकों हैं । यह लेख thawing के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है, subculturing, और आमतौर पर इस्तेमाल किया Drosophila सेल लाइनों के cryopreservation अपने अनुसंधान में इन अभिकर्मकों के उपयोग को शामिल करने में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए ।
वहां वर्तमान में १६० अलग drosophila सेल Drosophila जीनोमिक्स संसाधन केंद्र (DGRC) द्वारा वितरित लाइनों से अधिक कर रहे हैं । जीनोम इंजीनियरिंग के साथ, उपंयास सेल लाइनों की संख्या में वृद्धि की उंमीद है । DGRC को पूरक और उनके अनुसंधान एजेंडा ड्राइव करने के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में Drosophila सेल लाइनों का उपयोग कर के साथ शोधकर्ताओं परिचित करना है । अलग विशेषताओं के साथ Drosophila सेल लाइनों की एक किस्म के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं, thawing के लिए प्रोटोकॉल सहित प्रदान की जाती हैं, culturing, और cryopreserving सेल लाइनों । महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रकाशन सबसे अच्छा करने के लिए drosophila सेल लाइनों के साथ काम करने के लिए आवश्यक प्रथाओं को दर्शाता है कि अपस्थानिक सूक्ष्मजीवों या अंय सेल लाइनों से क्रासॅ के जोखिम को कम । शोधकर्ताओं ने जो इन प्रक्रियाओं से परिचित हो कई अनुप्रयोगों है कि biochemistry सहित Drosophila सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग में तल्लीन करने में सक्षम हो जाएगा, कोशिका जीव विज्ञान और कार्यात्मक जीनोमिक्स ।
Drosophila सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग vivo में पूरक आनुवंशिक विश्लेषण मक्खी और कई बुनियादी जैविक प्रश्नों1,2,3को संबोधित करने के लिए एक प्राथमिक जांच उपकरण के रूप में कार्य करता है । Drosophila सेल लाइनों अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ विभिन्न ऊतक स्रोतों से व्युत्पंन कोशिकाओं की अनूठी समरूप आबादी प्रदान करते हैं । सेल लाइनों ट्रांसजेनिक जीन अभिव्यक्ति, जीनोमिक्स, transक्रिप्टोमिक्स, proteomics, metabolomics, उच्च थ्रॉपुट आरएनए हस्तक्षेप (Rna) स्क्रीन, सेल बायोलॉजी और माइक्रोस्कोपी सहित कई अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं । महत्वपूर्ण बात, Drosophila सेल संस्कृति का उपयोग ज्ञात उत्तेजनाओं को तत्काल लौकिक प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन की सुविधा । इसके अलावा, drosophila सेल संस्कृति crispr करने के लिए उत्तरदाई है-Cas9 जीनोम संपादन, यह अपेक्षाकृत आसान बनाने के लिए विशिष्ट जीनोम संशोधनों के साथ नए सेल लाइनों बनाने के4,5,6, 7.
Drosophila जीनोमिक्स संसाधन केंद्र (DGRC) एक भंडार और drosophila सेल लाइनों के लिए वितरण केंद्र के रूप में कार्य करता है । DGRC के लक्ष्यों में से एक Drosophila सेल संस्कृति संसाधनों का उपयोग करने में अनुसंधान समुदाय के सदस्यों की सहायता करने के लिए है । यह आलेख Drosophila कक्ष रेखाओं की हैंडलिंग के लिए मूल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । यह मौजूदा संसाधनों को मदद करने के लिए शोधकर्ताओं drosophila सेल संस्कृतियों हैंडलिंग और उनके प्रयोगों में स्वतंत्रता के एक स्तर को प्राप्त करने के साथ सहज हो पूरक1,2,8,9 ,10.
सबसे अधिक इस्तेमाल किया drosophila सेल लाइनों रहे हैं: schneider लाइनों11, Kc16712, मित्सुबिशी/miyake पूर्णक डिस्क और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) लाइनों13,14, मिलनर प्रयोगशाला पूर्णक डिस्क लाइनों 15, वयस्क ओवेरियन कोशिका रेखाएं16,17, और रास रेखाएं18 (तालिका 1) । Schneider और Kc167 lines सामांय सभी प्रयोजन कोशिका लाइनों biochemistry, पुनः संयोजक ट्रांसजेनिक जीन अभिव्यक्ति, और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन में उपयोग के लिए कर रहे हैं । मित्सुबिशी/मियाके प्रयोगशाला (एमएल) लाइनों या तो लार्वा पूर्णक डिस्क या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से व्युत्पंन किया गया और वे neurosecretion, प्रतिलेखन विनियमन, और आरएनए प्रसंस्करण से संबंधित अध्ययन के लिए उपयोगी रहा है । मिल्नर (सीएमई) डिस्क लाइनें सिग्नल ट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण रही हैं । उत्परिवर्ती वयस्क अंडाशय से व्युत्पन्न एफजीएस/ओएसएस कोशिका रेखाएँ रोगाणु कोशिका अनुरक्षण और विभेद17,19में गैर-कोडिंग लघु आरएनए जीव विज्ञान के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण अभिकर्मकों के रूप में बनी रहती हैं । अंत में, रास लाइनें अद्वितीय है क्योंकि इन कोशिकाओं को भ्रूण से व्युत्पंन लाइनों ectopically रास oncogene व्यक्त कर रहे हैं । वे मांसपेशियों के अग्रदूत कोशिकाओं के transअपंग हस्ताक्षर किया है और सक्रिय पीरना मशीनरी20व्यक्त करता है । हाल ही में समीक्षा लेख और पुस्तक अध्याय अधिक विवरण2,3,9के साथ इन लोकप्रिय सेल लाइनों के अनुप्रयोगों को कवर ।
इन सभी सेल लाइनों को उपकल्पि और जम कर किया जा सकता है । वहां एक सेल लाइन बनाए रखा है और cryopreservation के लिए तैयार कैसे के लिए थोड़ा लेकिन महत्वपूर्ण अलग आवश्यकताओं हैं । उदाहरण के लिए, भिंन कक्ष रेखाओं की आवश्यकता होती है विभिंन मीडिया और पूरक (तालिका 1) । रेखाएं भी सतह पालन गुण, morphologies (चित्रा 1 और चित्रा 2), जीनोटाइप और दोहरीकरण समय (तालिका 2) में बदलती हैं । हम बुनियादी प्रोटोकॉल वर्तमान और विभिंन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया Drosophila सेल लाइनों से निपटने के लिए अद्वितीय मतभेदों को उजागर ।
Drosophila सेल संस्कृतियों उच्च थ्रॉपुट सेल-आधारित स्क्रीन के लिए प्राथमिक अभिकर्मकों हैं । उनके उपयोग भी जैव रसायन के लिए उपयुक्त कोशिकाओं की एक समरूप जनसंख्या प्रदान करके vivo आनुवंशिक अनुसंधान में पूरक, मक्खियों में इंजेक्शन से पहले ट्रांसजेनिक constructs की तेजी से परीक्षण, कोशिका जीव विज्ञान, माइक्रोस्कोपी और अधिक हाल ही में दैहिक कोशिका आनुवंशिक जीनोम संपादन1,2,3,8,9,10द्वारा जोड़तोड़ ।
स्थिर Drosophila कोशिकाओं की व्यवहार्यता और वसूली भी कम तापमान पर कठोर उतार चढ़ाव के प्रति संवेदनशील है । Dgrc (-१९६ डिग्री सेल्सियस) N2 के तरल चरण में जमे हुए सेल लाइनों भंडार और उंहें सूखी बर्फ में परिवहन (-७८.५ डिग्री सेल्सियस) । जमे हुए ampules कि सूखी बर्फ में ले जाया गया है वापस तरल N में स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए2 या एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर भंडारण के लिए । इसके बजाय, जमे हुए कोशिकाओं thawed होना चाहिए, जल्दी के रूप में आगमन पर संभव के रूप में एक उच्च कोशिका घनत्व पर reseeded (प्रोटोकॉल खंड 1) और उनके उद्देश्य प्रयोजनों (प्रोटोकॉल खंड 3) के लिए सभ्य । यदि उपयोग के लिए कक्ष रेखाएं तुरंत उपयोग नहीं की जाती हैं, तो कक्ष रेखाएं cryopreserved (प्रोटोकॉल अनुभाग 6) होनी चाहिए जब तक कि वे प्रयोग के लिए तैयार न हों ।
कुछ कक्ष रेखाओं, जैसे कि ML-BG2-c2 और Ras रेखाओं को cryopreserved स्थिति से पुनर्जीवित किए जाने के प्रभावों से पुनर्प्राप्त करने के लिए कई दिनों की आवश्यकता होती है. सेलुलर मलबे की एक महत्वपूर्ण राशि इन सेल लाइनों के पहले कुछ दिनों thawing के बाद स्वजनों । अबाधित छोड़ दिया, कोशिकाओं को ठीक हो जाएगा और proliferate । DGRC में कई Drosophila सेल लाइनों एम 3 आधारित मीडिया22में विकसित करने के लिए अनुकूलित किया गया है । Thawing के प्रभाव से उबरने के लिए धीमा कर रहे हैं कि सेल लाइनों के लिए, वातानुकूलित मीडिया का उपयोग उपयोगी हो सकता है. वातानुकूलित मीडिया की संभावना में उन कोशिकाओं द्वारा मीडिया में स्रावित वृद्धि कारक होते हैं जो गल जाने के बाद कोशिकाओं की वसूली और प्रसार को प्रोत्साहित कर सकते हैं ।
सेल लाइंस आम तौर पर एक बाहुबली विकास वक्र का पालन करते हैं जिसमें एक अंतराल चरण, घातांक चरण, पठार चरण और एक गिरावट चरण शामिल हैं । कई Drosophila सेल लाइनों में वृद्धि के लॉग-चरण में जब वे एक घनत्व में 1 x 106 और 1 x 107 कोशिकाओं के बीच में है/ यह आवश्यक है कि कोशिका रेखाएँ इस प्रकार की होती हैं कि वे हमेशा घातांक वृद्धि प्रावस्था में होती हैं ।
एक संस्कृति का संगम, एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त, विकास सतह क्षेत्र है कि कोशिकाओं द्वारा कवर किया जाता है वर्णन करता है । कोशिका रेखा के लिए कोशिका संगम उसके कोशिका आकार और आकार पर निर्भर करता है. अलग सेल लाइनों विभिंन morphologies और पालन गुण है । नतीजतन, लगभग इसी तरह के संगम पर अलग सेल लाइनों काफी अलग कोशिका घनत्व (चित्रा 1) हो सकता है । संस्कृति संगम है क्योंकि drosophila सेल लाइनों या तो फोकी के रूप में एक दूसरे के ऊपर जमा करके या निलंबन में वृद्धि की सतह के बाद भी बढ़ रहा है जारी रखने के लिए एक आदर्श संकेतक नहीं हो सकता है । ढका हुआ (चित्रा 1). हालांकि, उपयोगकर्ताओं को विशिष्ट कक्ष लाइनों के साथ अनुभव अक्सर उपसंस्कृति के लिए जब के लिए एक तेजी से दृश्य गाइड के रूप में संगम का उपयोग कर सकते हैं ।
हालांकि यह 19 − 25 ° c के बीच परिवेश RT पर Drosophila लाइनों को विकसित करने के लिए संभव है, यह अनुशंसित नहीं है क्योंकि परिवेश तापमान fluctuations प्रसार दर को प्रभावित कर सकते हैं । एक समर्पित 25 ° c इनयूबेटर के उपयोग की सिफारिश की है । Drosophila सेल संस्कृतियों के लिए इनक्यूबेटर को सीओ2 गैस एक्सचेंज की सुविधा की जरूरत नहीं है क्योंकि drosophila सेल संस्कृति मीडिया बफरिंग के लिए सह2 का उपयोग नहीं करते । संवर्धन कोशिका लाइनों के लिए इनक्यूबेटर के अंदर नमी एक महत्वपूर्ण कारक की अनदेखी नहीं की जा जब प्लेटें में कोशिकाओं संवर्धन है । इनसेबेटर और काम कर रहे पर्यावरण पर प्रकार के आधार पर, यह इनयूबेटर के अंदर बाँझ पानी की एक बीकर जगह के लिए आवश्यक हो सकता है. मीडिया वाष्पीकरण को कम करने के लिए, बंद टी flask या स्टोर संस्कृति प्लेटों एक कसकर सील प्लास्टिक कंटेनर में जबकि इनयूबेटर के अंदर का उपयोग करें ।
इसके लिए सबकल्चरल ड्रॉसोफिला सेल लाइनों के लिए शेड्यूल डेवलप करना जरूरी है । वृद्धि दर का अनुमान लगाने और निरंतरता की निगरानी करने के लिए, यह एक भी ज्यामितीय अनुपात (विभाजन अनुपात 1:2, 1:4, 1:8) पर उपसंस्कृति के लिए सुविधाजनक है । उदाहरण के लिए, 8 x 106 कोशिकाओं/एमएल में Kc167 कोशिकाओं की 10 मिलीलीटर संगामी प्लेट को 1:8 के अनुपात में विभाजित किया जा सकता है, जिससे 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल (१.२५ मिलीलीटर सेल सस्पेंशन) के सीडिंग घनत्व को नए मीडिया के ८.७५ एमएल में पतला कर दिया जाएगा । ७२ ज में, Kc167 संस्कृतियों को 8 x 106 कोशिकाओं के घनत्व को बढ़ने की संभावना है/एमएल, 24 एच के दोहरीकरण समय दिया । विभाजन अनुपात इसलिए एक सप्ताह में दो बार करने के लिए एक सुविधाजनक उपसंस्कृति दिनचर्या की सुविधा के लिए निर्धारित किया जाता है, यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को हमेशा विकास के अपने घातीय लॉग चरण में सभ्य हैं । यह कोशिकाओं को कम करने के लिए एक नियमित कार्यक्रम के लिए अनुमति देता है ताकि संगम के लिए समय न तो बहुत छोटा है और न ही बहुत लंबा है । यदि संगम के लिए समय बहुत कम है, कोशिकाओं को कम कोशिका घनत्व (उच्च विभाजन अनुपात) में subcultured हैं । इसी प्रकार, यदि संगम तक पहुंचने का समय बहुत लंबा है, तो कोशिकाएँ उच्च कोशिका घनत्व (निम्न विभाजन अनुपात) में उपकल्पि होती हैं । यह ध्यान दें कि सबसे drosophila सेल लाइनों बहुत कम सेल घनत्व के प्रति संवेदनशील है के लिए महत्वपूर्ण है (< 1 x 105 कोशिकाओं/, जिसमें कोशिकाओं को शायद ही पैदा करना और अंततः मर सकते हैं ।
ड्रोसोफिला कोशिका रेखाएँ वृद्धि विशेषताओं और आकारिकी में बदलती रहती हैं । नतीजतन, अलग गुण के साथ सेल लाइनों को अलग ढंग से संभाला जा सकता है । अधिकांश ड्रोसोफिला कोशिका रेखाएँ अर्ध-आसंन होती हैं । कम कोशिका घनत्व पर, वे विकास की सतह के लिए मजबूत पालन और के रूप में संस्कृति संगामी हो जाता है, कोशिकाओं को कम और आसंन आसानी से अलग हो जाते हैं । सेल पालन में यह क्रमिक परिवर्तन सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया drosophila सेल लाइनों (schneider, Kc लाइंस, पूर्णक डिस्क और सीएनएस लाइनों) के रूप में यह ऑपरेटर बस सेल monolayer पर मीडिया बांटना उंहें बेदखल करने के लिए अनुमति देता है की आसान subculturing सुविधा विकास की सतह से जब संस्कृति सघन है. ऐसी रेखाओं के लिए जो मादा कीटाणु-रेखा के तने/डिम्बग्रंथि दैहिक म्यान (एफजीएस/ओएसएस) और रास रेखाओं जैसी सतह का पालन करती हैं, के लिए यह आवश्यक है कि ट्रिप्सिन में कोशिकाओं को वृद्धि सतह से कोशिकाओं को अलग करने में सहायता के लिए अल्प अवधि के लिए सेने ।
सबसे Drosophila सेल लाइनों के लिए मीडिया परिवर्धन भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) शामिल हैं । कुछ विशिष्ट लाइनों के लिए इंसुलिन और वयस्क मक्खी निकालने (FEX) की आवश्यकता होती है । Fex विशिष्ट लार्वा पूर्णक डिस्क लाइनों और वयस्क ओवेरियन सेल लाइनों के विकास के लिए आवश्यक अपरिभाषित घटक शामिल हैं । DGRC तैयार करता है, और उपलब्ध बनाता है वयस्क FEX 1 सप्ताह पुरानी ओरेगन से व्युत्पंन-आर-modENCODE मक्खियों (RRID: BDSC_25211) में २.५ मिलीलीटर और 10 मिलीलीटर aliquots । DGRC भी अपनी वेबसाइट पर छोटे पैमाने पर FEX तैयारी के लिए निर्देश प्रदान करता है । FEX तैयारी, तथापि, समय लेने वाली है और वयस्क मक्खियों की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है ।
Drosophila सेल लाइनों के cryopreservation तत्काल उपयोग में नहीं सेल लाइनों के रखरखाव के लिए समय और अभिकर्मकों बचाता है । Cryopreservation एक DMSO, एक cryoprotective एजेंट से युक्त मध्यम में धीरे-2 कोशिकाओं (-1 डिग्री सेल्सियस/ धीमी गति से ठंडा कदम सफल cryopreservation के लिए महत्वपूर्ण है । A-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में, कोशिकाओं के एम्पुले-1 ° c/मिनट की दर से ठंडा है जब एक ठंड isopropanol से भरा कंटेनर में रखा । 25 ° c परिवेश तापमान पर शुरू, यह ampules में तापमान के लिए 2 एच तक पहुंचने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस तक ले जाएगा । इसे रातोंरात फ्रीज करने के लिए एम्पलों को छोड़ने की सिफारिश की जाती है ।
जमे हुए एम्पाल्स तो तेजी से लंबे समय तक भंडारण के लिए नाइट्रोजन के तरल चरण में स्थानांतरित किया जाना चाहिए. परिवेशी तापमान पर, cryovial लगभग 10 ° c/मिनट पर तेजी से गरम हो जाएगा और व्यवहार्यता ऊपर-५० डिग्री सेल्सियस23पर समझौता किया जाएगा । स्थानांतरण तेजी से रखने के लिए, परिवेश के तापमान के लिए जोखिम को कम करने के लिए छोटे बैचों में ampules संभाल । वैकल्पिक रूप से, सूखी बर्फ पर जमे हुए cryovials जगह है जबकि तरल N 2 में उनके हस्तांतरण के लिए तैयारी। यदि तरल नाइट्रोजन उपलब्ध नहीं है, कोशिकाओं को एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है, हालांकि समय के साथ महत्वपूर्ण गिरावट के जोखिम के साथ ।
सेल घनत्व सफल cryopreservation और सेल लाइनों के बाद पुनरुद्धार के लिए महत्वपूर्ण है । सामांय में, नई सेल लाइनों के लिए प्रारंभिक फ्रीज (1 − 3 ampules) बनाने के रूप में जल्द ही कोशिकाओं की एक अतिरिक्त उपलब्ध हो जाता है जम जाना चाहिए । एक बार सेल लाइन को और अधिक सुसंस्कृत कर दिया गया है, तो 10 − 20 एम्कुलों का जम स्टॉक बनाया जाना चाहिए । यह स्टॉक तो अपने बाद फ्रीज सेल वसूली और व्यवहार्यता, जिसके बाद यह प्रयोग के लिए प्रचारित किया है या शेयर की जगह जब जमे हुए शेयर ampules की संख्या पांच से नीचे गिर जाता है के लिए जांच गल है । अंत में, यह मांय है कि गल कोशिकाओं को अपने पैतृक स्टॉक की विशेषताओं को बनाए रखने के रूप में सेल लाइनों के लिए3,24विकसित करने के लिए जाना जाता है महत्वपूर्ण है ।
निष्कर्ष में, यह लेख drosophila सेल संस्कृतियों के साथ काम करने के लिए विभिंन लाइनों पर मौलिक जानकारी प्रदान करके एक किताब प्रस्तुत करता है, सर्वोत्तम प्रथाओं, और ड्रॉसोफिला सेल लाइनों के बुनियादी हैंडलिंग के लिए audiovisual प्रोटोकॉल । इस सुलभ संसाधन को सुचारू रूप से सुसंस्कृत Drosophila कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए परिचय कम करने के लिए और किसी भी अनुसंधान प्रयोगशाला में मौजूदा प्रशिक्षण गाइड के पूरक का मतलब है ।
The authors have nothing to disclose.
हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (पुरस्कार nih P40OD010949) और अनुसंधान समुदाय के विभिंन D. melanogaster डीएनए का उपयोग करने के लिए धंयवाद/वेक्टर/सेल संसाधनों dgrc पर क्यूरेट ।
100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |