Drosophila linjer er viktig reagensene både grunnleggende og biomedisinsk forskning. Denne artikkelen inneholder protokoller for tining, subculturing og kryonisk bevaring av brukte Drosophila linjer å hjelpe forskere omfatter bruk av disse reagensene i sin forskning.
Det finnes over 160 distinkte Drosophila cellelinjer distribuert av Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Med genom engineering, er antall romanen cellelinjer forventet å øke. DGRC som mål å gjøre kjent forskere bruke Drosophila linjer som en eksperimentell verktøy å utfylle og drive sin forskning agenda. Prosedyrene for å arbeide med en rekke Drosophila linjer med adskilt kjennetegnene tilbys, inkludert protokoller for tining dyrking og cryopreserving linjer. Viktigere, beskriver denne publikasjonen beste praksis nødvendig å arbeide med Drosophila linjer å minimere risikoen for forurensing fra adventivskudd mikroorganismer eller andre linjer. Forskere som blir kjent med disse prosedyrene kan i dybden de mange programmene som bruker Drosophila kultivert cellene biokjemi, cell biology og funksjonell genomforskning.
Bruk av Drosophila kultivert celler utfyller i vivo fly genetisk analyse og fungerer som en primær forespørsel verktøy for å løse mange grunnleggende biologisk spørsmål1,2,3. Drosophila cellelinjer tilbyr unike homogen bestander av cellene stammer fra ulike vev kilder med forskjellige genetisk bakgrunn. Linjer er egnet for mange søknadene inkluderer transgene genuttrykk, genomikk, transcriptomics, Proteomikk, metabolomics, høy gjennomstrømning RNA forstyrrelser (RNAi) skjermer, cellebiologi og mikroskopi. Viktigere, forenkler bruken av Drosophila cellekultur karakterisering av umiddelbar timelige svar kjent stimuli. Videre er Drosophila cellekultur mottakelig for CRISPR-Cas9 genomet redigering, gjør det relativt enkelt å opprette nye linjer med bestemte genom endringene4,5,6, 7.
Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) fungerer som et oppbevaringssted og distribusjon senter for Drosophila linjer. En av målene for DGRC er å hjelpe medlemmer av forskningen fellesskapet bruker Drosophila celle kultur ressurser. Denne artikkelen presenterer grunnleggende protokoller for håndtering av Drosophila linjer. Det utfyller eksisterende ressurser for å hjelpe forskere blir komfortable med håndtering Drosophila cellekulturer og oppnå en grad av uavhengighet i sine eksperimenter1,2,8,9 ,10.
De mest brukte Drosophila linjene er: Schneider linjer11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake imaginal plate og sentralnervesystemet (CNS) linjer13,14, Milner laboratorium imaginal plate linjer 15, voksen ovarian cellen linjer16,17og Ras linjer18 (tabell 1). Schneider og Kc167 linjene er generelt Universal cellelinjer for bruk i biokjemi, rekombinant transgene genuttrykk og omvendt genetisk skjermer. Mitsubishi/Miyake laboratorium (ML) linjene var avledet fra enten larver imaginal plater eller sentralnervesystemet (CNS) og de har vært nyttig for studier knyttet til neurosecretion, transkripsjon regulering og RNA behandling. Milner (CME) plate linjene har vært viktig for å studere signaltransduksjon. De erstattet/OSS linjene fra mutant voksen eggstokkene fortsatt viktig reagenser å studere virkningen av ikke-koding liten RNA biologi i bakterie celle vedlikehold og differensiering17,19. Til slutt, Ras linjene er unike fordi disse er cellelinjer avledet fra embryo ectopically uttrykke Ras-oncogene. De har transcriptional signatur forløper muskelceller og uttrykker aktive piRNA maskiner20. Siste review-artikler og bokkapitler dekker programmene i disse populære linjer med flere detaljer2,3,9.
Alle disse linjer kan subcultured og frosset. Det er liten, men viktig ulike krav til hvordan hver celle linje vedlikeholdes og forberedte kryonisk bevaring. For eksempel krever forskjellige cellelinjer forskjellige medier og kosttilskudd (tabell 1). Linjene også variere i overflaten tilslutning egenskaper, morphologies (figur 1 og figur 2), undersøke og dobling tid (tabell 2). Vi presenterer grunnleggende protokoller og utheve unike forskjellene for håndtering av de ulike brukte Drosophila celle linjene.
Drosophila cellekulturer er primære reagensene høy gjennomstrømning cellebasert skjermer. Deres bruk også utfyller i vivo genetisk forskning ved å tilby en homogen populasjon av celler egnet for biokjemi, rask testing av transgene konstruksjoner før injisere inn fluer, cellebiologi, mikroskopi og nylig somatisk cell genetisk manipulasjoner av genomet redigering1,,2,,3,,8,,9,,10.
Levedyktighet og utvinning av frosne Drosophila celler er følsom for drastisk svingninger ved lave temperaturer. DGRC lagrer frosne cellelinjer i flytende fase av N2 (-196 ° C) og transporterer dem i tørris (-78.5 ° C). Frosne ampuller som har vært transportert i tørris bør ikke bli overført til flytende N2 eller-80 ° C fryser for lagring. I stedet bør de frosne cellene være tint, reseeded på en høyt tetthet snarest ved ankomst (protocol del 1) og kultivert for sine tiltenkte formål (protocol avsnitt 3). Hvis cellen linjene ikke er umiddelbart brukes for eksperimenter, cryopreserved cellen linjer skal (protokollen inndelingen 6) til de er klare til bruk.
Noen linjer, som ML-BG2-c2 og Ras linjene må flere dager å gjenopprette fra virkningene av å bli gjenopplivet fra cryopreserved staten. En betydelig mengde mobilnettet rusk følger disse cellelinjer de første dagene etter tining. Venstre uforstyrret, vil cellene gjenopprette og sprer. Mange Drosophila linjer på DGRC er tilpasset å vokse i M3 basert media22. For cellelinjer som er trege til å gjenopprette fra effekter av tine, kan bruk av betinget media være nyttig. Betinget media trolig inneholde vekstfaktorer utskilles av cellene i media som kan oppmuntre utvinning og spredning av cellene etter tining.
Cellelinjer generelt følger en stereotype vekstkurve bestående av en lag fase, eksponentiell fase, platå fase og en forverring fase. Mange Drosophila cellelinjer sprer i logg-fasen av vekst når de er kultivert på en tetthet mellom 1 x 106 og 1 x 107 celler/mL på 25 ° C. Det er viktig at linjer er passaged slik at de er alltid i eksponensiell vekstfase.
Av en kultur, uttrykt som en prosentandel, beskriver vekst arealet som dekkes av celler. Cellen der en celle linje, avhengig av sin celle form og størrelse. Tydelige linjer har ulike morphologies og etterlevelse egenskaper. Som et resultat, kan forskjellige linjer på omtrent samme samløpet ha vesentlig forskjellige celle tetthet (figur 1). Kultur der kan ikke være en ideell indikator for passaging Drosophila cellekulturer fordi Drosophila cellelinjer fortsette å spre enten ved spuntveggstål oppå hverandre som foci eller i suspensjon selv etter vekst overflaten er dekket (figur 1). Men kan brukere erfaring med bestemte linjer ofte bruke samløpet som en rask visuell guide for når å subkultur.
Mens det er mulig å vokse Drosophila linjer på ambient RT mellom 19−25 ° C, anbefales det ikke fordi Omgivelses temperatur kursbevgelsene kan påvirke prisen spredning. Bruk av en dedikert 25 ° C inkubator anbefales. Inkubator for Drosophila cellekulturer trenger ikke å lette CO2 gassutveksling fordi Drosophila celle kultur medier ikke bruker CO2 for bufring. Humidity innenfor inkubator for dyrking linjer er en viktig faktor ikke kan overses når dyrking celler i plater. Avhengig inkubator og arbeidsmiljøet, kan det være nødvendig å plassere et beger sterilt vann i inkubator. For å minimere media fordampning, bruke lukket T-kolbe eller lagrer kultur plater i en tett forseglet plast container inni inkubator.
Det er viktig å utvikle en plan for subculturing Drosophila linjer. For å beregne veksten rate og skjermen konsistens, er det praktisk å subkultur på en selv geometriske ratio (dele forholdet 1:2, 1:4, 1:8). En 10 mL confluent plate av Kc167 celler på 8 x 106 celler/mL kan for eksempel deles på 1:8 forholdet å oppnå en seeding tetthet av 1 x 106 celler/mL (1,25 mL av cellen suspensjon fortynnet i 8.75 mL av fersk media). 72 h, er Kc167 kulturer ventet å spre seg til en tetthet på 8 x 106 celler/mL, gitt sin dobling tid på 24 timer. Delt forholdet derfor bestemmes å lette en praktisk subkultur rutine av opp til to ganger i uken, sikrer at cellene er alltid kultivert i deres eksponentiell Logg vekstfase. Dette gir regelmessig for subculturing cellene slik at tiden til samløpet er verken for kort eller for lang. Hvis den samløpet er for kort, er cellene subcultured på lavere celle tetthet (høyere delt ratio). Tilsvarende, hvis tid til å nå samløpet er for lang, cellene er subcultured på en høyere celle tetthet (lavere delt ratio). Det er viktig å merke seg at de fleste Drosophila linjer er svært følsomme for lav celle tettheter (< 1 x 105 celler/mL), hvilke celler knapt sprer og kan til slutt dø.
Drosophila cellelinjer varierer i vekst egenskaper og morfologi. Resultatet må cellelinjer med forskjellige egenskaper behandles annerledes. De fleste Drosophila linjer er halvt tilhenger. Ved lavere celle tetthet, de holde fast sterkere vekst overflaten og som kulturen blir confluent, cellene blir mindre tilhenger og enkelt koble. Denne gradvise endringen i cellen tilslutning muliggjør enkel subculturing av mest brukte Drosophila linjer (Schneider, Kc linjene, imaginal plate og CNS) som gjør det mulig for operatøren å bare kvitte media over cellen monolayer å fjerne dem fra vekst overflaten når kulturen er tett. For linjer som overflaten tilhenger som den kvinnelige bakterie-line stammen/ovarian somatiske skjede (erstattet/OSS) og Ras linjer, er det viktig å ruge cellene i trypsin for en kort varighet som hjelp til å koble cellene fra vekst overflaten.
Media inkluderer for de fleste Drosophila cellelinjer fosterets kalv serum (FCS). Insulin og voksen fly ekstrakt (ligger) kreves for noen bestemt linjer. Fex fil inneholder udefinert komponenter avgjørende for veksten av bestemte larver imaginal disken linjene og de voksen ovarian cellen. DGRC forbereder, og gjør tilgjengelig voksen ligger avledet fra 1 uke gamle Oregon-R-modENCODE fluer (RRID: BDSC_25211) i 2,5 mL og 10 mL dele. DGRC gir også instruksjoner for småskala ligger forberedelse på sin hjemmeside . LIGGER forberedelse, men er tidkrevende og krever en stor mengde voksen fluer.
Kryonisk bevaring av Drosophila cellelinjer sparer tid og reagenser for vedlikehold av cellelinjer ikke i bruk. Kryonisk bevaring oppnås ved sakte frysing cellene (-1 ° C/min)-80 ° c i et medium som inneholder DMSO en cryoprotective agent. Det langsomme avkjøling trinnet er avgjørende for vellykket kryonisk bevaring. I-80 ° C fryser, er ampule av celler avkjølt frekvensen av-1 ° C/min når plassert i en fryser container fylt med isopropanol. Starter på Omgivelses temperatur på 25 ° C, vil det ta opptil 2 timer for temperaturen i ampuller å nå-80 ° C. Det anbefales å forlate ampuller fryse over natten.
Frosne ampuller må deretter raskt overført i flytende fase av nitrogen for langvarig lagring. Cryovial vil oppvarmer raskt på ca 10 ° C/min omgivelsestemperatur og levedyktighet blir kompromittert på over-50 ° C23. For å holde overføring rask, håndtere ampuller i små grupper for å redusere eksponering for Omgivelses temperatur. Eventuelt plassere den frosne cryovials på tørris klargjøring for at deres overføring til væske N2. Hvis flytende nitrogen ikke er tilgjengelig, kan cellene lagres i-80 ° C fryser, selv med fare for betydelig forringelse over tid.
Cellen tetthet er avgjørende for vellykket kryonisk bevaring og etterfølgende gjenoppliving av linjer. Generelt, nye cellen linjer skal fryses for å opprette første fryse (1−3 ampuller) så snart et overskudd av celler blir tilgjengelig. Når cellen linjen har blitt ytterligere kulturperler stabilt, opprettes en frossen lager av 10−20 ampuller. Dette lager er så tint å sjekke etter fryse celle utvinning og livskraft, hvoretter det overføres for experimentations eller erstatte aksjen når antallet frosne lager ampuller faller under fem. Til slutt, er det viktig å validere at tinte cellene beholde egenskapene til sine foreldre aksjer som linjer er kjent for å utvikle3,24.
I konklusjonen, presenterer denne artikkelen en primer for å arbeide med Drosophila cellekulturer ved å gi grunnleggende informasjon på ulike linjer, beste praksis og audiovisuelle protokoller for enkel håndtering av Drosophila linjer. Denne tilgjengelig ressurs er ment å jevnt lette innføringen arbeider med kulturperler Drosophila celler og for å utfylle eksisterende guider på noen forskningslaboratorium.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker National Institutes of Health (Award NIH P40OD010949) og forskningen fellesskapet for å benytte ulike D. melanogaster DNA/vektor/mobiltelefon ressursene kuratert på DGRC.
100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |