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Neuroscience

Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación de la multiplicidad sináptica funcional utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo.

Abstract

En el sistema nervioso central, un par de neuronas forman a menudo múltiples contactos sinápticos o sitios de liberación de neurotransmisor funcional (multiplicidad sináptica). Multiplicidad sináptica es de plástico y cambios a lo largo de desarrollo y en diferentes condiciones fisiológicas, siendo un factor determinante para la eficacia de la transmisión sináptica. Aquí, describimos experimentos para estimar el grado de multiplicidad de sinapsis que termina en una neurona postsináptica dada utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo. Concretamente, grabación de pinza de voltaje se utiliza para comparar la diferencia entre la amplitud de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSCs) y miniatura corrientes postsinápticas excitatorias (mEPSCs). La teoría detrás de este método es que las entradas aferentes que exhiben multiplicidad mostrará sEPSCs grande, dependiente del potencial de acción debido a la liberación sincrónica que se produce en cada contacto sináptico. Por el contrario, lanzamiento independiente del potencial de acción (que es asincrónico) generará más pequeño amplitud mEPSCs. Este artículo describe un conjunto de experimentos y análisis para caracterizar la existencia de multiplicidad de synaptic y discute los requisitos y limitaciones de la técnica. Esta técnica puede aplicarse para investigar cómo las diferentes intervenciones conductuales, farmacológicas o ambientales en vivo afectan la organización de contactos sinápticos en diversas áreas del cerebro.

Introduction

Transmisión sináptica es un mecanismo fundamental para la comunicación entre las neuronas y por lo tanto, la función del cerebro. Transmisión sináptica es también lábil y puede cambiar su eficacia de una manera dependiente de la actividad, así como en respuesta a moduladores señales1. Por lo tanto, examinar la función sináptica ha sido un foco clave de la investigación de la neurociencia. Electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras es una técnica versátil que nos permite entender, por idear diseños experimentales y análisis de datos, profundidad mecanismos biofísicos y moleculares de la transmisión sináptica. Un enfoque comúnmente utilizado, quizás debido a la simplicidad de la técnica y el concepto, es la medida de miniatura excitatoria/inhibitoria postsináptica (mE / IPSCs) bajo la tensión de la abrazadera de configuración2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuales representan el flujo de iones a través de receptores ionotrópicos postsinápticos (por ejemplo, receptores AMPA y GABAA ) en respuesta a la Unión de sus respectivos neurotransmisores liberados desde la terminal presináptica 7 . Porque la grabación se obtiene en presencia del voltaje-bloqueado Na+ canal bloqueador tetrodotoxin (TTX), el lanzamiento es independiente del potencial de acción y consiste normalmente en una sola vesícula sináptica que contiene el neurotransmisor. Partiendo de este supuesto, la amplitud media de mPSCs es ampliamente utilizada como una estimación cruda del tamaño cuántico, que representa el número y la funcionalidad de los receptores postsinápticos oponerse un sitio sencillo. Por otra parte, la frecuencia de mPSCs se considera representan una combinación del número total de sinapsis que termina en la célula postsináptica y la probabilidad de liberación promedio. Sin embargo, estos parámetros no miden otra variable-multiplicativity de sinapsis, o multiplicidad sináptica — que es importante para la eficacia de la transmisión sináptica.

Basado en la teoría cuántico de la transmisión sináptica7,8,9, la fuerza de una conexión determinada entre un par de neuronas depende de tres factores: el número de sinapsis funcionales (N), el respuesta postsináptica a la liberación de una sola vesícula sináptica (tamaño cuántico; Q) y la probabilidad de liberación de neurotransmisor (Pr). Multiplicidad de Synaptic es equivalente a N. El desarrollo de multiplicidad de synaptic o la poda de las sinapsis multiplicativas es plástico a lo largo de desarrollo y en enfermedades diferentes Estados3,4,6,10. Por ello, caracterizar multiplicidad sináptica tiene implicaciones importantes para la comprensión de la eficacia de la transmisión sináptica en salud y enfermedad. Técnicas como la microscopia electrónica pueden identificar evidencia estructural de multiplicidad sináptica mediante la detección de múltiples contactos sinápticos origina el axón mismo sobre la misma neurona postsynaptic11,12, 13,14. Sin embargo, estos multisynapses estructuralmente identificados pueden ser funcionalmente silencioso15,16. Examen funcional precisa de N requiere técnicamente difícil métodos electrofisiológicos, como pares grabaciones de celulares que pueden determinar si una conexión determinada tiene múltiples sitios de liberación funcional y mínima enfoques de estimulación que tienen como objetivo reclutar un solo axón putativo.

En este protocolo, se describe un método simple para estimar la multiplicidad sináptica mediante la adopción de un método desarrollado originalmente por Hsia et al2. Esta técnica consiste en la medición de espontánea PSC (sPSCs) y mPSCs mediante electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras, que nos permite estimar el grado de multiplicidad sináptica a través de todas las entradas a una determinada neurona.  Previamente definida, synaptic multiplicidad refleja el número de sinapsis entre la neurona pre y postsináptica dada. Si múltiples sinapsis son reclutadas en sincronía por un potencial de acción, habrá una alta probabilidad de suma temporal de PSC (es decir cuántico) individual, generando una mayor amplitud PSC.  En grabaciones de mPSC (en que los potenciales de acción son bloqueados por TTX), es baja la probabilidad de la suma temporal de los mPSCs (asíncronos). Utilizando este razonamiento, multiplicidad sináptica puede estimarse mediante la comparación de la amplitud de nacionales (con lanzamiento dependiente del potencial de acción) a la amplitud del mPSC.

Para examinar la existencia de multiplicidad Describimos cuatro experimentos y sus análisis mediante EPSCs glutamatérgica como ejemplo. Sin embargo, el mismo enfoque puede ser utilizado para la rápida transmisión de GABAergic/glycinergic (IPSCs). A continuación se describe una breve justificación para cada experimento. En primer lugar, como se explicó anteriormente, multiplicidad sináptica puede estimarse mediante la comparación de la amplitud de sEPSCs a mEPSCs. Existen dos requisitos para ello; axones 1) presinápticas deben disparar un número suficiente de potenciales de acción durante la grabación, y 2) Pr debe ser alta para que múltiples sinapsis liberan neurotransmisores a la llegada de un potencial de acción. Para cumplir estos requisitos, sEPSCs se registró por primera vez en baja Ca2 + artificial líquido cerebroespinal (aCSF) y luego grabados en presencia de una concentración baja del antagonista de canales de K+ , 4-aminopiridina (4-AP) para aumentar la acción potencial disparo y Pr. Entonces potencial de acción de la leña se bloquea por TTX y Pr disminuido por un voltaje Ca2 + bloqueador de canales de Cd2 +. La amplitud de sEPSCs (con 4AP) es comparada con la de mEPSC (con 4AP, TTX y Cd2 +). En el segundo experimento, Ca2 + se sustituye por equimolar Sr2 + en la aCSF a desincronizar la liberación de la vesícula. Como Ca2 + se requiere para la versión sincrónica de vesículas, reemplazo con Sr2 + debe eliminar la sEPSCs de gran amplitud que son indicativos de la multiplicidad. En tercer lugar, mecánico, multiplicidad puede resultar de cualquiera de los dos múltiples contactos sinápticos a la misma neurona postsináptica o liberación multivesicular (es decir, múltiples vesículas lanzadas dentro de un único contacto sináptico)17,18. Para distinguir entre los dos tipos de multiplicidad, el tercer experimento utiliza una baja afinidad, la rápida disociación antagonista competitivo de los receptores AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 para determinar si grandes sEPSC son el resultado de la suma temporal de sinapsis independiente o lanzamiento multivesicular actuando sobre una población de superposición de los receptores postsinápticos. Si los eventos de gran amplitud surgen de liberación multivesicular, γ-DGG serán menos eficaces en la inhibición de sEPSCs comparado con el más pequeño más grande, mientras que sEPSCs grandes que surgen de la suma temporal de múltiples contactos sinápticos se verán afectados de manera similar por Γ-DGG. En el cuarto experimento, un método más fisiológico se utiliza para mejorar el potencial de acción disparar, es decir, aferente estimulación sináptica. Ráfagas de actividad sináptica pueden transitorio aumento/facilitar la probabilidad de disparo y liberación de potencial de acción espontáneo de los aferentes estimuladas. Por lo tanto, este enfoque permite multiplicidad de manifestar de una manera más fisiológica.

El siguiente protocolo describe el método para realizar estos experimentos en tejido hipotalámico de ratón. Específicamente, se utilizan las neuronas de la hormona (CRH) liberando corticotropina del núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN). Describir los procedimientos para la realización de electrofisiología de celulares patch clamp y explicar los experimentos específicos para probar la multiplicidad sináptica.

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Protocol

Todos los experimentos con animales son aprobados por el Comité de cuidado Animal de la Universidad de Ontario Occidental según el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal (AUP #2014-031).

1. las soluciones

  1. Solución de corte
    1. Consulte la tabla 1 para la composición de la solución de corte.
    2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
    3. 1 x solución corte, disolver NaHCO3, glucosa y sacarosa en ddH2O y añadir el caldo de 20 x. Garantizar la osmolaridad entre los 315-320 mOsm y almacenar la solución para no más de 1 semana a 4 ° C.
    4. Llene dos vasos con 100 mL de solución de corte y tapa con parafilm. Enfríe la solución en el congelador hasta que la solución se congela parcialmente (aproximadamente 20 minutos en el congelador de-80 ° C). Usando un tubo de dispersión de gas, burbuja ambos vasos de corte solución con 95% O25% CO2 por 20 min en hielo.
Solución concentraciones (mM)
De corte ACSF normal Bajo Ca2 + aCSF ACSF Sr+ Pipeta/interno
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0.5 2.5 0.5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1.25 1.25 1.25 1.25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
Glucosa 25 10 10 10 -
Sacarosa 75 - - - -
Gluconato de K - - - - 116
Na-gluconato de - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0.3

Tabla 1: La composición de diversas soluciones.

  1. aCSF (para manutención y recuperación de la rebanada)
    1. Consulte la tabla 1 para la composición de la aCSF.
    2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
    3. Para 1 x aCSF, disolución de NaHCO3 y glucosa en ddH2O y añadir el caldo de 20 x. Asegúrese de que la osmolaridad es entre 298-300 mOsm. Usar la solución dentro de 1 día.
  2. aCSF (baja Ca2 + para la grabación)
    1. Consulte la tabla 1 para la composición de la baja Ca2 + aCSF.
    2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
    3. Para 1 x baja Ca2 + aCSF, disolver NaHCO3 y glucosa en ddH2O y añadir 20 x (CaCl2 y MgCl2 gratis) stock, CaCl2 y MgCl2 especificaron las concentraciones. Asegúrese de que la osmolaridad es entre 298-300. Usar la solución dentro de 1 día.
  3. aCSF (Sr2 + para la grabación)
    1. Consulte la tabla 1 para la composición de la Sr2 + aCSF.
    2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
    3. Para 1 x Sr2 + aCSF, disolver NaHCO3 y glucosa en ddH2O y añadir 20 x (CaCl2 y MgCl2 gratis) stock, SrCl2 y MgCl2 especificaron las concentraciones. Asegúrese de que la osmolaridad es entre 298-300. Usar la solución dentro de 1 día.
  4. Solución interna
    1. Consulte la tabla 1 para la composición de la solución de gluconato de K base interna.
    2. Para hacer 20 mL de solución interna, añadir 15 mL de agua de grado biología molecular a un tubo de 50 mL. Realice los pasos siguientes en el hielo.
    3. Preparar las siguientes soluciones antes de tiempo a 1 M stock concentraciones en biología molecular agua de calidad. Añadir (en mL): 2.32 de gluconato de K, Na-gluconato de 0,24 0,20 HEPES, 0.16 KCl, K2-EGTA 0.05, 0.04 MgCl2 al tubo de 50 mL.
    4. Añada 100 μl de 0,3 M Na3GTP.
    5. Pesar de 44,08 mg de K2ATP en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y añadir 1 mL de agua de grado biología molecular, luego añadir a tubo de 50 mL.
    6. Ajustar el pH a 7.2-7.4 con 1 M de KOH. Asegúrese de que la osmolaridad es entre 283-289 mOsm.

2. sector preparación

  1. Preparar herramientas
    1. Añadir 200 mL de aCSF a la cámara de recuperación (construida a partir de un vaso de precipitados de 250 mL con 4 pozos y red) y la cámara de recuperación en un baño de agua (35 ° C).
    2. Cubrir la cámara con una película de parafina y constantemente la burbuja la aCSF con 95% O25% CO2 utilizando un tubo de cristal de dispersión para por lo menos 20 minutos.
    3. Preparar para la disección por la configuración de las herramientas (bisturí, tijeras finas angulosas, pinzas, pincel fino, cuchara de plástico).
    4. Llene una jeringa de 60 mL con aproximadamente 15 mL de la solución de corte helado de paso 1.1.4.
    5. Preparar la plataforma de disección colocando un papel de filtro en la tapa de una placa bien.
    6. Preparar la cámara de corte colocando en la bandeja de hielo y llenar la bandeja con hielo.
    7. Configurar el vibratome asegurando una cuchilla desechable en el sujetador de la cuchilla.
    8. Hacer una pipeta por romper la punta de una pipeta Pasteur y colocar un bulbo de goma en el extremo roto.
  2. Disección de cerebro de ratón
    1. Anestesiar al animal en una cámara saturada con 4% de isoflurano hasta reflejos espinales están ausentes.
    2. Decapitar al animal con una guillotina y quitar rápidamente el cerebro.
      1. Haga una incisión de línea media con una hoja de bisturí no. 22 de rostral a caudal.
      2. Lateralmente, pelar el cuero cabelludo a cada lado de la cabeza.
      3. Uso de tijeras finas para cortar el cráneo por un lado de caudal a rostral (incluyendo el lado de los huesos frontales), con cuidado no se dañe el cerebro.
      4. Uso de fórceps para levantar el pedazo de cráneo del cerebro y enfríen rápidamente el cerebro con 15 mL de solución corte helado usando la jeringa de paso 2.1.4.
      5. Levante el cerebro fuera del cráneo.
      6. Lugar del cerebro en uno de los vasos con solución helada rebanador (de paso 1.1.4) burbujeado con 95% O25% CO2.
  3. Preparar las rebanadas de hipotálamo de ratón
    1. Bloquear el cerebro para el área de cerebro deseada y ángulo de corte (para rebanadas hipotalámicos coronales, recorte el tejido rostral al quiasma óptico y caudal para el puente de Varolio usando una hoja y asegurar el bloque caudal tiene un superficie plana perpendicular a la base del cerebro).
    2. Con una pieza cortada de papel de filtro, recoger el cerebro de la parte anterior y pegue el lado posterior de la placa de retención con pegamento instantáneo.
    3. Coloque la placa de retención en la cámara de corte y llenar la cámara con solución de corte del segundo vaso en el paso 1.1.4 rápidamente.
    4. Fije la bandeja de hielo y cámara de corte en el vibratome.
    5. Definir el área de corte (anterior y posterior del cerebro) y comenzar a cortar rebanadas coronales de 250 μm de espesor. Recomienda los parámetros: velocidad de 0.10 mm/seg, amplitud 2 mm.
    6. Recortar los cortes al tamaño apropiado para el área deseada del cerebro.
    7. Recuperar las rebanadas a 35 ° C durante 30-45 minutos. Entonces, retire la cámara de recuperación del calentamiento baño y permite las rebanadas recuperar a temperatura ambiente durante un adicional 30 minutos rodajas de mantener a temperatura ambiente durante el resto del día y continúan burbuja el baño constantemente con 95% O un25% CO2 .

3. celulares parche ClampRecording

  1. Tire de las pipetas de parche
    1. Utilizando los parámetros sugeridos para la grabación de manual del tirador de la pipeta celulares, parche de tirar pipetas de cristal grueso de pared a una resistencia de la pipeta de 3 a 5 MΩ.
    2. Utilizando una microjeringa (comercial o casera), llenar una pipeta con la solución interna filtrada. Una microjeringa, quemar la punta de una jeringa de 1 mL y permitir que la punta caiga creando un fino largo punta.
  2. Obtener la configuración de celulares
    1. Coloque la pipeta de grabación justo por encima de la pipeta de segmento y el desplazamiento actual en el modo de pinza de voltaje. Aplique una ligera presión positiva a la pipeta y cerrar la llave de paso.
    2. Seleccione una célula sana con una membrana intacta y acercarse a la celda con la pipeta. La presión positiva debe causar una alteración leve en el tejido (es decir, una onda lenta en el tejido al entrar).
    3. Poco a poco seguir traer la pipeta más cercana a la celda con un movimiento diagonal hasta que la pipeta de forma un pequeño hoyuelo en la superficie celular.
    4. Liberar el bloqueo de presión positiva. La célula comenzará a formar un sello y la resistencia aumentará por encima de 1 GΩ. En abrazadera del voltaje, mantener la célula en -68 mV.
    5. Tire ligeramente de la celda diagonalmente para eliminar el exceso de presión de la célula.
    6. Compensar la capacidad de la pipeta rápido y lento.
    7. Aplicar una breve succión a través del tubo conectado al titular de la pipeta para romperse a través de la celda y obtener configuración de célula entera.
    8. Cambie al modo de la célula en la membrana de prueba ventana en una electrofisiología adquisición de datos y software de análisis (por ejemplo, Clampex).
    9. Antes de cada abrazadera de tensión de grabación, realizar una prueba de membrana usando el mismo software y registrar los parámetros pertinentes en un libro de laboratorio (resistencia de la membrana, acceso a resistencia y capacitancia).
    10. Mantener la temperatura del baño de la grabación en 27 – 30 ° C y el caudal de 1.5 – 2.0 mL/min para experimentos posteriores.

4. multiplicidad experimentos

  1. Experimento 1: estimar la multiplicidad con la 4-AP
    1. En abrazadera del voltaje, mantener la célula en -68 mV. Usando el mismo software, grabar el sEPSCs mientras inunda el baño con bajo Ca2 + aCSF. Registro de al menos 5 minutos después del comienzo de la configuración de célula entera para una grabación de línea de base estable como la actividad sináptica puede llegar poco después de la ruptura de la membrana.
    2. Usando una micropipeta, agregar 4-AP a la aCSF y baño Aplique 30 μm 4-AP. registro sEPSCs para por lo menos 10 min obtener el efecto completo de la droga.
    3. Añadir 0,5 μm TTX y μm 10 Cd2 + a la aCSF con 4-AP y grabar mEPSCs para por lo menos 10 minutos.
    4. Para el análisis fuera de línea, utilice el pasado 1 min de base inmediatamente antes de la aplicación de la 4-AP (en baja Ca2 + aCSF), lo 10 min de aplicación AP 4 y los 10 minutos de aplicación de TTX.
  2. Experimento 2: desincronizando la liberación de la vesícula con Sr2 +
    1. Mientras que inunda el baño con normal Ca2 + aCSF (igual que el baño aCSF) registro sEPSCs para por lo menos 5 minutos.
    2. Interruptor de la Ca2 + aCSF normal y comenzar perfundiendo Sr2 + aCSF (desde el paso 1.4) y registro sEPSCs.
    3. Para el análisis fuera de línea, para determinar si las sEPSCs de gran amplitud debido a la liberación sincrónica de las vesículas, comparar el pasado 1 min de línea de base (en aCSF normal) a los 10 minutos deth de la aplicación de Sr2 + aCSF.
  3. Experimento 3: prueba de liberación multivesicular usando Γ- DGG
    1. En baja Ca2 + aCSF registro sEPSCs para por lo menos 5 minutos.
    2. Añadir 30 μm 4-AP a la aCSF a través del sistema de perfusión. SEPSCs registro de al menos 10 minutos.
    3. Añadir 200 μm γ-DGG a la aCSF con 4-AP y grabar sEPSCs para por lo menos 10 minutos.
    4. Como un experimento de control en una celda separada, realice los pasos 1-3 pero aplicar una concentración baja (125 nM) de DNQX en vez de γ-DGG.
    5. Para el análisis fuera de línea, analizar el último minuto de cada aplicación de la droga.
  4. Experimento 4: Estimular entradas aferentes para aumentar el potencial de acción de disparo.
    1. SEPSCs registro de Ca2 + aCSF normal.
    2. Estimulan aferentes utilizando un electrodo monopolar vidrio llenado con aCSF a una tasa de 20 Hz durante 2 s y repetir 10 veces con un intervalo entre ráfagas de 20 seg.
    3. Para el análisis, utilice 5.000 ms ante el primer estímulo como base y comparar al 10-300 ms después del estímulo final y luego la variación promedio de la amplitud y frecuencia durante 10 ensayos.

5. Análisis

  1. Analizar sEPSCs y mEPSCs con un programa que detecta y analiza las corrientes sinápticas (por ejemplo, software de análisis de Mini).
    1. Uso de este software, utilice los parámetros de detección sugerido para detectar EPSCs del Receptor de AMPA (o GABA Receptor EPSCs si se graba corrientes inhibitorias).
    2. Utilice la función de análisis directo para detectar EPSCs en la grabación.
    3. Analizar manualmente cada grabación para asegurar que el programa es detectar con precisión cada evento (por ejemplo, garantizar eventos no están perdidas o cuentan dos veces).
    4. Exportar los datos del evento por copiar al portapapeles y pegarlo en un software de gestión de datos (por ejemplo, Excel)
    5. Calcular la media frecuencia o amplitud para cada tratamiento y realizar los análisis estadísticos pertinentes.

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Representative Results

El anterior protocolo describe un método para el uso de electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera para examinar el grado de multiplicidad sináptica, mediante neuronas hipotalámicas de ratón como un ejemplo. Esta técnica de preparación de rebanada debe generar células viables sanas que no tienen una membrana hinchada o núcleo (figura 1). Cada paso en el protocolo es importante para la salud del tejido y la calidad de las grabaciones.

Figure 1
Figura 1: preparación la rebanada siguiente tejido sano y malsano. Cortar en rodajas preparación de electrofisiología de la PVN bajo la óptica de contraste de interferencia diferencial con 40 aumentos. Rojo puntas de flecha indican las células sanas, y puntas de flecha negras indican las células insalubres. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 2 ilustra el fundamento para identificar la multiplicidad sináptica mediante electrofisiología de la abrazadera del remiendo. Multiplicidad sináptica puede resultar de cualquiera de los dos múltiples contacto sináptico entre un par de neuronas (a laizquierda de figura 2A), o por liberación multivesicular en un determinado sitio web sináptico (figura 2A a la derecha). En ambas situaciones, un potencial de acción en la neurona presináptica provocaría una gran respuesta postsináptica (sEPSC) debido a la adición temporal de múltiples eventos sinápticos. Sin embargo, en ausencia de potenciales de acción presinápticos (por ejemplo, en presencia de TTX y Cd2 + bloquear Na+-dependiente y Ca2 +-potencial de acción dependiente de la leña), liberación de neurotransmisor vesicular es asincrónica. Como resultado, la respuesta postsináptica se convierte en más pequeño (figura 2B: AP-independiente). Si dos neuronas no exhiben la multiplicidad (es decir, tiene sólo una liberación multivesicular de contacto/no sináptica) no habrá ninguna diferencia en la respuesta postsináptica la liberación potencial de acción dependiente e independiente del potencial de acción de neurotransmisor (figura 2).

Figure 2
Figura 2: Diagrama esquemático que ilustra las consecuencias de diferentes organizaciones sinápticas en corrientes postsinápticas. (A, B) En una sinapsis con multiplicidad, un potencial de acción y la consiguiente Ca2 + afluencia desencadena síncrona fusión de múltiples vesículas sinápticas que EPSCs grandes, multiquantal. Multiplicidad sináptica puede resultar de contacto multisynapse o multivesicular liberación en una sola sinapsis (A). En presencia de TTX y Cd2 +, fusión de la vesícula independiente del potencial de acción es asincrónica y causa pequeñas uniquantal EPSCs (B). (C) en las sinapsis sin multiplicidad, tanto dependiente del potencial de acción y - independiente fusión de la vesícula da lugar a uniquantal EPSCs. Esta figura ha sido modificada desde figura 1A de nuestro anterior informe6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el experimento 1, 4-AP se aplica en el baño para aumentar el potencial de acción de disparo y liberación probabilidad. Para asegurar que 4-AP aumenta potencial de acción espontáneo de la leña, se puede comparar la frecuencia de EPSCs entre sEPSCs y mEPSCs (Figura 3A, C). Porque sEPSCs son una combinación de eventos tanto dependiente del potencial de acción y - independiente, la diferencia en la frecuencia de sEPSC y mEPSC sirve como un indicador potencial de acción espontáneo en los axones presinápticos. Utilizamos un corte arbitrario de > 15% diferencia en frecuencia entre sEPSC a mEPSC para asegurar que un número suficiente de eventos dependiente del potencial de acción se presente para el análisis de la multiplicidad. Si el EPSCs en la baja Ca2 + condición y la condición de la TTX (mEPSC) son similares en frecuencia y amplitud (es decir, no espontáneo potencial de acción en la baja condición de Ca2 + ), la diferencia entre la baja Ca2 + base sEPSC y 4 -AP también puede ser utilizado para el análisis de la multiplicidad.

En un ejemplo el resultado que se muestra en la figura 3, 4-AP aumenta la amplitud y la frecuencia de sEPSCs. Posterior aplicación de TTX y Cd2 + disminuye la amplitud y la frecuencia. Como se describió anteriormente, la diferencia en la amplitud entre sEPSCs y mEPSCs indica multiplicidad sináptica. En las neuronas hipotalámicas que examinamos aquí, la amplitud y la frecuencia de la línea base y condiciones TTX son el mismo (figura 3, D), sugiriendo que la sEPSCs de la línea de base contienen muy pocos EPSCs dependiente del potencial de acción. Por consiguiente, experimentos posteriores pueden comparar la diferencia entre la línea de base y 4-AP para medir la multiplicidad.

Figure 3
Figura 3:. 4-AP aplicación revela multiplicidad sináptica. (A) muestra las huellas de sEPSCs grabado en baja Ca2 + aCSF durante la línea de base y después de aplicación de la 4-AP (30 μM) y posterior TTX (0,5 μM) y Cd2 + (10 μM). (B) la distribución de la amplitud de la sEPSC de la grabación que se muestra en (A). (C, D) Resumen de la frecuencia media (C) y amplitud (D) entre la línea de fondo (gris), 4-AP (rojo) y TTX + Cd2 + (azul). P < 0.005, ** P < 0.01. Esta figura ha sido modificada desde la figura 2 de nuestro anterior informe6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El método descrito por encima de las estimaciones la multiplicidad promedio de sinapsis que termina en las neuronas postsinápticas: no puede detectar cambios en la multiplicidad que se producen en una pequeña proporción de sinapsis. Sin embargo, en nuestro estudio reciente, este método reveló cambios en la multiplicidad de las sinapsis del glutamato en las neuronas hipotalámicas entre normal y crónica subrayó condiciones6.

Sustitución de Ca2 + con equimolar Sr2 + en la aCSF desynchronizes dependiente del potencial de acción liberación de vesículas de neurotransmisor 19, 20. Por lo tanto, si el sEPSCs grande de la amplitud es la suma de liberación sincronizada neurotransmisor vesicular dependiente del potencial de acción (es decir, multiplicidad), sustitución de Ca2 + con Sr2 + disminuirá la amplitud de EPSCs. Como se ve en la figura 4, Sr2 + aCSF disminuye la proporción de eventos de gran amplitud (Figura 4B) y como consecuencia disminuye la amplitud promedio (figura 4). Cuando las células no presentan multiplicidad, desynchronizing lanzamiento vesícula no tendrá efecto sobre la amplitud de la EPSC.

Figure 4
Figura 4: Sr2 + desynchronizes grandes eventos multiquantal. (A) representante traza comparaciones normal Ca2 + aCSF y Sr2 + aCSF. Sr2 + aCSF desynchronizes liberación de la vesícula y disminuye la amplitud de multiquantal eventos sincrónicos como se ve en una distribución representativa de la amplitud (B) y el cambio de la amplitud de todas las células (C) * P < 0.05. Esta figura ha sido modificada desde la figura 3 de nuestro anterior informe6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Γ-DGG, un rápida disociación antagonista competitivo de los receptores AMPA, puede utilizarse para determinar si la multiplicidad es debido a la liberación multivesicular o múltiples contactos sinápticos. Multivesicular liberación actúa sobre una población de superposición de los receptores postsinápticos, la amplitud grande EPSCs que conlleva la puesta en común del glutamato en la hendidura sináptica. En otras palabras, la concentración de glutamato en la hendidura sináptica es mayor que el que resulta de la liberación de uniquantal. Por otra parte, contactos multisynaptic tendría EPSCs de uniquantal en cada sitio sináptica. Si la amplitud grande EPSCs surge de liberación multivesicular, el EPSCs más grandes se verá afectadas menos por antagonismo de la γ-DGG (debido a la mayor concentración de glutamato) en comparación con la amplitud más pequeña EPSCs (figura 5A derecha, B, D). Si la amplitud grande EPSCs son debidos a la suma de uniquantal sincrónica EPSCs (contactos multisynapse), γ-DGG afectará igualmente la amplitud de los EPSCs (figura 5 izquierda, C-e-G). En contraste con γ-DGG, DNQX que es una alta afinidad, lenta disociación antagonista de los receptores AMPA/kainato causa una disminución uniforme en toda la amplitud para grande y pequeña de todos EPSCs ()figura 5 H-J). La sensibilidad a γ-DGG y DNQX puede ser cuantificada como la relación entre la amplitud EPSC promedio dividida por el máximo (la media de las más grande 20 EPSCs) amplitud EPSC ()figura 5 K, L).

Figure 5
Figura 5: usando γ-DGG para sonda multivesicular comunicado. (A) esquemas que ilustran dos modelos de multiplicidad. Izquierda: sumación temporal de transmisión de uniquantal que se dirige a poblaciones independientes de los receptores postsinápticos. EPSCs grandes y pequeños se logran por una similar concentración de glutamato en la hendidura sináptica y, por tanto, son igualmente sensibles a γ-DGG. Derecha: transmisión multiquantal que se dirige a una población de superposición de los receptores postsinápticos. Grandes EPSCs son causados por la mayor concentración de glutamato en la hendidura de sEPSCs más pequeños y por lo tanto son menos sensibles a γ-DGG. Valores indicados en la parte inferior del modelo son las amplitudes relativas hipotéticas. (B) muestra rastros de una grabación en la que hubo un aumento en la amplitud media sEPSC después de la aplicación de la 4-AP (respondedor de la 4-AP). (C) argumento acumulativo para amplitud EPSC para la grabación que se muestra en (B). (D) terreno acumulado de amplitud normalizada de EPSC (EPSC/EPSCMAX) antes y después de la aplicación de γ-DGG de la grabación que se muestra en (B). (E) muestra rastros de una grabación donde no hubo cambios en la amplitud media sEPSC después de 4-AP aplicación (4-AP no-responder). (F) acumulado EPSC amplitud para la grabación que se muestra en (E). (G) acumulado EPSC/EPSCMAX parcela la grabación se muestra en (E). (H) muestra las huellas de una grabación de línea de base, así como después de la 4-AP y DNQX aplicación. () La EPSC acumulativa amplitud para la grabación que se muestra en la (H). (J) acumulado EPSC/EPSCMAX parcela la grabación se muestra en la (H). (K) Resumen de media EPSC/EPSCMAX después de γ-DGG (en grupos de no respondedor y respuesta de la 4-AP) o DNQX aplicación normalizada a pre-γ-DGG/DNQX (es decir, post-4-AP). (L) parcelas de post-4-AP significan amplitud EPSC (normalizada a pre-4-AP) contra el promedio del post-γ-DGG/DNQX EPSC/EPSCMAX (normalizada a post-4-AP). P < 0.005. Esta figura ha sido modificada desde la figura 4 de nuestro anterior informe6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La fuerza de la transmisión sináptica puede incrementarse transitoriamente por ráfagas de actividad sináptica. Para investigar la multiplicidad bajo condiciones fisiológicas más, estimulación aferente puede utilizarse para aumentar el potencial de acción disparar y soltar probabilidad. Si hay multiplicidad, estimulación aferente debe causar un breve incremento en la amplitud de la EPSC (figura 6A-D). Si no hay multiplicidad, actividad impulsada por aumentos en el potencial de acción de la leña no aumenta la amplitud de la EPSC.

Figure 6
Figura 6: estimulación de alta frecuencia revela multiplicidad sináptica. (A) muestra las huellas de sEPSCs antes y después de la estimulación sináptica aferente. (B) parcela de sEPSC amplitud antes y después del estímulo sináptico (20 Hz, 2 s) de la grabación se muestra en (A). (C, D) Resumen de sEPSC frecuencia (C) y cambios de amplitud (D) después del estímulo sináptico. P < 0.001, * P < 0.05. Esta figura ha sido modificada desde la figura 5 de nuestro anterior informe6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Un requisito importante para un éxito parche abrazadera electrofisiológico experimento es la obtención de rodajas/las células sanas. Nuestro protocolo descrito está optimizado para rebanadas hipotalámicas que contienen neuronas PVN. Otro cerebro áreas pueden requerir modifica soluciones y corte métodos21,22,23,24. Para la grabación, es crítica para aceptar sólo grabaciones estables controlando constantemente a propiedades de la celda tales como resistencia de membrana, resistencia capacitancia y acceso. Un aumento en la resistencia de acceso puede disminuir la amplitud de la EPSC y por lo tanto confundir medidas de amplitud. En consecuencia, se desechan las células con valores de resistencia de acceso que excedan 20 MΩ o aumentan en más del 20% durante la grabación. Del mismo modo, una disminución en (o bajo) resistencia de la membrana puede resultar en pobre abrazadera de espacio y, por lo tanto, puede disminuir la amplitud. Las neuronas en nuestro sistema objetivo (neuronas PVN de parvocellular) tienen una resistencia elevada de la membrana entre 500 MΩ y 1 GΩ, y descartamos las células con resistencias de membrana por debajo de 500 MΩ. Cortes de control de calidad deben establecerse para tipos específicos de neuronas bajo estudio. Como este protocolo se basa en la diferencia en la amplitud de antes y después de la aplicación de drogas, es importante asegurarse de que el cambio de amplitud es debido a la aplicación de la droga y no a los cambios en la resistencia de la membrana y la resistencia de acceso. Las neuronas hipotalámicas que estudiamos en este protocolo son pequeñas en tamaño (capacitancia celular es 15 pF en ratones y resistencia de la membrana es aproximadamente 1 GΩ) y K-gluconato basado solución interna funciona bien para obtener alta calidad EPSCs/IPSCs6,25 . Para las neuronas con mayor tamaño de celda y resistencia de entrada baja, solución interna cesio base puede utilizarse para garantizar un buen espacio-abrazadera2.

Uno de los requisitos específico de la utilización de este método para medir la multiplicidad es que las células del fuego un número suficiente de potenciales de acción espontáneos para comparar eventos dependiente del potencial de acción a mEPSCs. Esto puede garantizarse mediante la comparación de la diferencia en la frecuencia de EPSCs en la ausencia y presencia de TTX y Cd2 +. En rebanadas hipotalámicas que contienen el PVN, hemos encontrado que la aplicación de la 4-AP es eficaz para provocar el disparo del potencial de acción. Otro método, por el Internet de alta velocidad y colegas2, utiliza alta Ca2 + aCSF para aumentar el potencial de acción de disparo, en lugar de la 4-AP. Mientras que este método tuvo éxito en rebanadas hippocampal, encontró que los altos Ca2+ fue menos eficientes que la 4-AP facilitar el potencial de acción en sectores hipotalámicos6. De hecho, se ha demostrado que la alta, extracelular a concentración de Ca2 + disminuye la excitabilidad intrínseca de las neuronas y los axones alterando la conductancia de Na+ 26,27. Esto puede explicar por qué en algunos sectores, alta Ca2 + aCSF no es eficaz para aumentar la frecuencia de la EPSC.

Una limitación de este método, que es inherente a todos electrofisiología de abrazadera de parche de slice, es que muchas proyecciones a largo plazo a las neuronas postsinápticas son cortadas en rodaja preparación. Para observar los potenciales de acción, es probable que la presinápticas axones y cuerpos celulares deben conservarse en el segmento. Por lo tanto, la medición de la multiplicidad está sesgada a la conectividad sináptica que se conserva dentro de la rebanada. En la misma línea, la dirección de corte puede provocar ciertas poblaciones de proyecciones preservarse mientras que otros son cortadas28. Estas limitaciones tienen un efecto general de subestimar la multiplicidad de entradas aferentes.

El protocolo descrito proporciona un método para estimar el grado de multiplicidad sináptica a través de todas las entradas a una determinada neurona. Otras técnicas de electrofisiología, como grabaciones emparejadas o mínimo estímulo de un solo axón pueden determinar si una conexión determinada tiene varios contactos, pero estos experimentos son a menudo difíciles y no es posible en todos los sistemas. Además, no pueden dar una indicación general de la organización de todas las entradas a una determinada neurona como que sólo aislar a un par de neuronas. El presente Protocolo utiliza métodos de electrofisiología básica abrazadera del remiendo para evaluar el grado de multiplicidad a través de todas las entradas a una determinada neurona.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

J.S. Beca Ontario Graduate. Panamá recibió una nueva beca de investigador de investigación de Salud Mental de Canadá. Este trabajo es apoyado por subvenciones de funcionamiento para W.I de las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (06106-2015 RGPIN) y el Instituto canadiense de investigación en salud (PJT 148707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

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References

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Neurociencia número 146 electrofisiología de patch-clamp de célula entera ex vivo transmisión sináptica ganancia sináptica multiplicidad núcleo paraventricular del hipotálamo la hormona liberadora de corticotropina hipotálamo
Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares
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Sunstrum, J. K., Inoue, W.… More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

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