تقييم متشابك تعدد استخدام المشبك تصحيح كامل الخلية الكهربية
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لتقييم تعدد متشابك الوظيفية باستخدام التصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك في شرائح الدماغ الحادة.
Abstract
غالباً ما تشكل زوج من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي، متشابك الاتصالات متعددة و/أو مواقع إطلاق سراح العصبي الوظيفي (تعدد متشابك). تعدد متشابك من البلاستيك، والتغيرات في التنمية وفي مختلف الظروف الفسيولوجية، محدداً هاما لفعالية انتقال متشابك. هنا، فإننا مخطط تجارب لتقدير الدرجة تعدد الاشتباكات العصبية التي تنتهي إلى خلية بوستسينابتيك معين باستخدام التصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك في شرائح الدماغ الحادة. على وجه التحديد، هو استخدام تسجيل الجهد-المشبك لمقارنة الفرق بين السعة للتيارات عفوية بوستسينابتيك ضادات (سيبسكس) والتيارات بوستسينابتيك ضادات مصغرة (ميبسكس). النظرية وراء هذا الأسلوب هو أن تظهر المدخلات الزبائ أن المعرض تعدد سيبسكس كبيرة، وتعتمد على إمكانات العمل بسبب الإفراج المتزامن الذي يحدث في كل جهة اتصال متشابك. وفي المقابل، سينشئ الإفراج عن إمكانيات العمل المستقل (وغير متزامنة) أصغر مطال ميبسكس. هذه الوثيقة الخطوط العريضة لمجموعة من التجارب والتحليلات تميز بوجود تعدد متشابك ويناقش شروط وقيود تقنية. يمكن تطبيق هذه التقنية للتحقيق كيف مختلف التدخلات السلوكية أو دوائية أو البيئية في فيفو تؤثر على تنظيم جهات الاتصال متشابك في مناطق مختلفة من الدماغ.
Introduction
انتقال متشابك هو إليه أساسية للتواصل بين الخلايا العصبية والمخ وبالتالي الدالة. أيضا انتقال متشابك مجا ويمكن تغيير فعاليته بطريقة تعتمد على النشاط، وكذلك كما هو الحال في استجابة لإشارات مودولاتوري1. وهكذا، تم دراسة الدالة متشابك نقطة تركيز رئيسية لأبحاث علم الأعصاب. تصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك هو تقنية متعددة الاستخدامات التي تمكننا من فهم، بوضع تصاميم تجريبية وتحليلات البيانات، الآليات الفيزيائية-الحيوية والجزيئية متعمقة لانتقال متشابك. اتباع نهج استخداماً، ربما نظراً لبساطة الأسلوب والمفهوم، هو قياس التيارات بوستسينابتيك ضادات/المثبطة مصغرة (لي/إيبسكس) تحت الجهد المشبك التكوين2،3، 4 , 5 , 6-مبسكس الفردية تمثل تدفق الأيونات من خلال مستقبلات إيونوتروبيك بوستسينابتيك (مثل مستقبلات امبا وغاباA ) ردا على ربط بهم العصبية منهم أطلق سراحهم من محطة بريسينابتيك 7 . لأنه يتم الحصول على التسجيل حضور الجهد عن طريق بوابة نا+ قناة مانع تيدرودوتاكسين (TTX)، الإفراج عن إمكانات العمل المستقل وينطوي عادة على حويصلة متشابك واحد يحتوي على الناقل العصبي. وبناء على هذا الافتراض، متوسط السعة من مبسكس يستخدم على نطاق واسع تقديراً تقريبيا لحجم كانتال، التي تمثل عدد ووظيفة مستقبلات بوستسينابتيك معارضة موقع إطلاق سراح واحد. من ناحية أخرى، يعتبر تواتر مبسكس وتمثل مزيجاً من مجموع عدد من الاشتباكات العصبية التي تنتهي إلى الخلية بوستسينابتيك واحتمال الإفراج عن المتوسط. ومع ذلك، لا تقيس هذه المعلمات مولتيبليكاتيفيتي متغير آخر الاشتباكات العصبية، أو تعدد متشابك – هو أمر مهم لفعالية انتقال متشابك.
استناداً إلى نظرية انتقال متشابك7،،من89قوانتال، قوة اتصال معينة بين زوج من الخلايا العصبية تعتمد على ثلاثة عوامل: عدد الاشتباكات العصبية الوظيفية (N)، بوستسينابتيك ردا على إطلاق سراح حويصلة متشابك مفردة (حجم قوانتال؛ Q) واحتمال إطلاق سراح العصبي (Pr). تعدد متشابك يساوي N. تطوير تعدد متشابك أو تشذيب نهايات المضاعف من البلاستيك في التنمية وفي المرض مختلف الدول3،4،،من610. لهذا السبب، فقد وصف تعدد متشابك آثار هامة لفهم مدى فعالية انتقال متشابك في الصحة والمرض. يمكن تحديد التقنيات، مثل الميكروسكوب الإلكتروني أدلة الهيكلية لتعدد متشابك بالكشف عن عدة جهات اتصال متشابك منشؤها إكسون نفس على نفس العصبية بوستسينابتيك11،12، 13،14. ومع ذلك، يمكن هذه مولتيسينابسيس هيكلياً المحددة وظيفيا صامت15،16. يتطلب دراسة دقيقة الوظيفية N تحديا من الناحية التقنية النهج الكهربية، مثل التسجيلات كامل الخلية المزدوجة التي يمكن تحديد ما إذا كان اتصال معين لمواقع إطلاق سراح وظيفية متعددة والحد الأدنى النهج التحفيز التي تهدف إلى توظيف إكسون المفترضة مفردة.
في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة بسيطة لتقدير تعدد متشابك باعتماد أسلوب وضعت أصلاً من قبل حاسبات وآخرون2. هذا الأسلوب ينطوي على قياس عفوية PSCs (سبسكس) ومبسكس باستخدام التصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية، مما يسمح لنا بتقدير درجة تعدد متشابك عبر جميع المدخلات إلى خلية معينة. كما يعكس تعدد المعرفة مسبقاً، ومتشابك عدد نقاط الاشتباك العصبي بين خلية معينة قبل وبوستسينابتيك. إذا نهايات متعددة جندهم بإمكانيات العمل في التزامن، سيكون هناك احتمال كبير للجمع الزماني الفردية الأمنية الخاصة (أي كانتال)، توليد سعة أكبر من PSC. في تسجيلات مبسك منخفض (في إمكانات العمل التي يتم حظرها بواسطة تتكس)، احتمال الجمع الزماني للفرد مبسكس (غير متزامن). باستخدام هذا المنطق، يمكن تقدير تعدد متشابك بمقارنة السعة sPSC (مع إمكانية العمل تعتمد على الإصدار) إلى السعة مبسك.
لفحص وجود تعدد يصف لنا أربع تجارب وتحليلاتها باستخدام ابسكس جلوتاماتيرجيك على سبيل مثال. ومع ذلك، يمكن استخدام نفس النهج للصيام انتقال جابايرجيك/جليسينيرجيك (إيبسكس). يرد أدناه وصف موجز الأساس منطقي لكل تجربة. أولاً، وكما هو موضح أعلاه، يمكن تقدير تعدد متشابك بمقارنة سعة سيبسكس إلى ميبسكس. هناك شرطين لهذا النهج؛ محاور عصبية 1) presynaptic يجب إطلاق النار عددا كافياً من إمكانات العمل أثناء التسجيل، و 2) Pr يجب أن تكون عالية حتى الإفراج عن عدة نقاط الاشتباك العصبي العصبي عند وصول بإمكانيات العمل. ولتلبية هذه المتطلبات، سيبسكس هي سجلت أول في انخفاض Ca2 + الاصطناعية النخاعي (قام)، وثم تسجيل حضور تركيز منخفض من خصم قناة ك+ ، 4-أمينوبيريديني (4-AP) لزيادة العمل إطلاق النار المحتملة و Pr. ثم حظر إمكانات عمل إطلاق النار من قبل ت وانخفض بمقدار الجهد عن طريق بوابة Ca2 + قناة مانع Cd2 +للعلاقات العامة. مقارنة السعة سيبسكس (مع 4AP) إلى ميبسك (مع 4AP، تتكس، ومؤتمر نزع السلاح2 +). في التجربة الثانية، Ca2 + محله اكويمولار ريال2 + في قام لﻻستخدام الإصدار حويصلة. كما Ca2 + مطلوب من أجل الإفراج عن حويصلات متزامن، يجب القضاء على استبدال مع ريال2 + سيبسكس السعة الكبيرة التي تدل على تعدد. ثالثا، ميتشانيستيكالي، تعدد يمكن أن يؤدي أما جهات متشابك متعددة إلى نفس الخلايا العصبية بوستسينابتيك أو الإصدار مولتيفيسيكولار (أي حويصلات متعددة إطلاق سراحهم خلال اتصال متشابك واحدة)17،18. للتمييز بين هذين النوعين من التعدد، يستخدم التجربة الثالثة لتقارب منخفضة، سرعة الناي تنافسية خصم مستقبلات امبا،،γ-د-جلوتاميلجليسيني (γ-DGG)1718 لتحديد ما إذا كانت كبيرة سيبسك هي نتيجة لمجموع الزمانية نهايات مستقلة أو الإفراج عن مولتيفيسيكولار تعمل على سكان بتداخل مستقبلات بوستسينابتيك. إذا كانت الأحداث السعة الكبيرة التي تنشأ عن إطلاق سراح مولتيفيسيكولار، γ-DGG ستكون أقل فعالية في تثبيط سيبسكس مقارنة بالاصغر حجماً أكبر، بينما سوف تتأثر بالمثل سيبسكس الكبيرة التي تنشأ من مجموع الزمانية لعدة جهات اتصال متشابك Γ-استيراد. في التجربة الرابعة، استخدمت طريقة أكثر فيزيولوجية لتعزيز إمكانات عمل إطلاق النار، وهما الزبائ التحفيز متشابك. عابر رشقات نارية باتجاه النشاط متشابك الزيادة/تيسير عفوية العمل إمكانية إطلاق النار، والإفراج عن احتمال أفيرينتس حفز. ويسمح هذا النهج لذلك، تعدد في المجاهرة بطريقة أكثر فسيولوجية.
البروتوكول التالية توضح طريقة إجراء هذه التجارب في الأنسجة طائي الماوس. وتستخدم على وجه التحديد، كورتيكوتروبين الإفراج عن هرمون (CRH) الخلايا العصبية من نواة تحت المهاد (التشفيير) بارافينتريكولار. تصف الإجراءات المتعلقة بإجراء تصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية، وشرح التجارب المحددة لاختبار لتعدد متشابك.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحد شرط هام لتجربة الكهربية المشبك تصحيح ناجح هو الحصول على شرائح/الخلايا السليمة. لدينا بروتوكول وصف هو الأمثل لطائي الشرائح التي تحتوي على الخلايا العصبية التشفيير. الدماغ الأخرى مجالات قد تتطلب تعديل الحلول و تشريح أساليب21،،،من2223<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ج. س. تلقي “المنح الدراسية العليا في أونتاريو”. W.I. تلقت “زمالة محقق جديد” من كندا “بحوث الصحة العقلية”. ويدعم هذا العمل العاملة المنح إلى W.I من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الكندي الهندسية (06106-2015 رجبين) والمعهد الكندي “البحوث الصحية” (PJT 148707).
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
References
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
- Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
- Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
- Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
- Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
- Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
- van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
- Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
- Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
- Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
- Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
- Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
- Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
- Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
- Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
- Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).
