Summary
هنا نقدم VirWaTest، وهو طريقة بسيطة وبأسعار معقولة والمحمولة لتركيز وكشف الفيروسات من عينات المياه في نقطة الاستخدام.
Abstract
وقد تلوث الفيروسات التي يفرزها البشر والحيوانات مصادر المياه وتشكل خطرا على صحة الإنسان عندما تستخدم هذه المياه للشرب والري الغذائي والغسيل وما إلى ذلك. مؤشر البكتيريا البرازية الكلاسيكية لا يتحقق دائما من وجود مسببات الأمراض الفيروسية وبالتالي فإن الكشف عن مسببات الأمراض الفيروسية والمؤشرات الفيروسية هو ذات الصلة من أجل اعتماد تدابير التخفيف من المخاطر، وخاصة في السيناريوهات الإنسانية وفي المناطق حيث الفاشيات الفيروسية المنقولة بالمياه متكررة.
وفي الوقت الحاضر، تتوفر عدة اختبارات تجارية تسمح بالقياس الكمي لبكتيريا مؤشرات البراز (FIB) للاختبار عند نقطة الاستخدام. غير أن هذه الاختبارات التجارية غير متاحة للكشف عن الفيروسات. يتطلب الكشف عن الفيروسات في عينات المياه البيئية تركيز عدة لترات في أحجام أصغر. وعلاوة على ذلك، فإن الكشف عن الفيروسات، بمجرد تمركزه، يعتمد على أساليب مثل استخراج الأحماض النووية والكشف الجزيئي (مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ( اختبار مضاد للفيروسات الكلى) للجينوم الفيروسي.
الطريقة الموصوفة هنا تسمح بتركيز الفيروسات من عينات المياه 10 L، فضلا عن استخراج الأحماض النووية الفيروسية في نقطة الاستخدام، مع معدات بسيطة ومحمولة. ويسمح ذلك باختبار عينات المياه عند نقطة الاستخدام لعدة فيروسات وهو مفيد في السيناريوهات الإنسانية، وكذلك في أي سياق لا يتوفر فيه مختبر مجهز. وبدلاً من ذلك، تسمح هذه الطريقة بتركيز الفيروسات الموجودة في عينات المياه وشحن المركز إلى مختبر في درجة حرارة الغرفة لمزيد من التحليل.
Introduction
وخلال المراحل الأولى من أي حالة طوارئ إنسانية، فإن الحصول على إمدادات المياه النظيفة والمرافق الصحية والنظافة الصحية أمر بالغ الأهمية لبقاء المتضررين. ولذلك، فإن رصد نوعية المياه يمثل أولوية لمنع تفشي الأمراض المنقولة بالمياه. ومن المعروف جيدا أن المياه الملوثة هي في كثير من الأحيان أصل الأمراض، ولكن من الصعب في كثير من الأحيان تحديد مصادر الفاشيات الفيروسية مثل فيروس التهاب الكبد E (HEV)، حتى مع توافر الأساليب المختبرية التقليدية. ويستند التحكم في نوعية المياه على القياسالكمي لFIB 1،2،3،4. ومع ذلك، فقد تم توثيق على نطاق واسع أنه لا يوجد ارتباط بين عدم وجود FIB ووجود مسببات الأمراض الفيروسية المنقولة بالمياه مثل فيروس الروتا (RoV)، نوروفيروس (NoV)، أو HEV5،6. وبالتالي، فإن استخدام معايير نوعية المياه استناداً إلى FIB قد يؤدي إلى التقليل من تقدير المخاطر المرتبطة بوجود مسببات الأمراض الفيروسية المنقولة بالمياه. مراقبة فيروسات المؤشر، مثل الفيروسات الغدية البشرية (HAdV)، أو مسببات الأمراض المحددة ستكون مفيدة في تحديد التعرض للأمراض الفيروسية وتحديد المصدر المحتمل للعدوى البشرية7،8، 9و10 وفي التحقق من فعالية تدابير الصرف الصحي11.
وحتى الآن، كان الكشف عن الفيروسات في هذه السيناريوهات يعتمد على موظفين مهرة ولوجستيات معقدة. يهدف VirWaTest (virwatest.org) إلى تطوير طريقة بسيطة وميسورة التكلفة ومحمولة لتركيز الفيروسات من عينات المياه والكشف عنها لاحقاً عند نقطة الاستخدام.
ويستند تركيز الفيروس على مبدأ التذليل العضوي لعينات المياه 10 لتر، والتي يتم من خلالها استرداد الفيروسات في أحجام أصغر12،13. يتم جمع flocs وإضافتها إلى المخزن المؤقت الذي يتحلل الفيروسات ويمنع الأحماض النووية من التدهور عند تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع.
ويستند أسلوب استخراج الأحماض النووية على استخدام الجسيمات المغناطيسية التي تحصل على الأحماض النووية الناضسة. ويمكن نقلها من مخزن للغسيل إلى آخر وأخيرا إلى المخزن المؤقت elution باستخدام ماصة المغناطيسية التي تعلق الجسيمات. يمكن شحن تعليق الأحماض النووية الفيروسية التي تم الحصول عليها إلى مختبر مرجعي حيث يمكن إجراء الكشف باستخدام الطرق الجزيئية على أساس PCR. لكل استخراج الحمض النووي، يتم اختبار اثنين من كميات مختلفة لاستبعاد تثبيط الأنزيمية التي نشأت من قبل العينة. وبدلاً من ذلك، مع الحد الأدنى من توافر المعدات، يمكن إجراء اختبارات PCR عند نقطة الاستخدام. تم تصميم العملية برمتها ليتم تنفيذها بشكلمستقل عن إمدادات الطاقة (الشكل 1).
وقد تم تكييف فحص كمية لـ PCR للكشف عن HAdV، الذي يفرزه البشر والموجود في عينات مياه الصرف الصحي بتركيزات عالية، ليتم تشغيله عند نقطة الاستخدام. يتم استخدام HAdV كمؤشرات فيروسية البراز البشري. كما تم تكييف PCR للقياس الكمي للبكتيريا MS2 منذ استخدام MS2 في VirWaTest كمراقبة العملية. يمكن تخصيص الأسلوب للكشف عن أي فيروس ذي أهمية.
وبعد التطوير، طبق المستعملون طريقة VirWaTest في مكانين مختلفين في جمهورية أفريقيا الوسطى وإكوادور، مما يوفر تغذية مرتدة بشأن تطبيق البروتوكول في حالات حقيقية.
على حد علمنا، هذا هو الإجراء الأول الذي يسمح بتركيز وكشف الفيروسات في نقطة الاستخدام، بغض النظر عن أي إمدادات الطاقة، والمعدات الكبيرة، وظروف التجميد / التبريد. من المستحسن جمع نسختين من كل عينة من عينات المياه من أجل الحصول على نتائج قوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد والتعبئة والتغليف
ملاحظة: ترد في الجدول 1المواد/المعدات التي يتعين تعبئتها. استخدام القفازات للتعامل مع الكواشف اللازمة للسيطرة على العملية، والكواشف التركيز، الكواشف استخراج الحمض النووي والكواشف الكشف. ارتداء نظارات واقية للتعامل مع الكواشف اللازمة لاستخراج الحمض النووي.
- التحكم في العملية
- إعداد MS2 زراعة الأرصدة البكتريولوجية (مجموعة ثقافة النوع الأمريكي [ATCC] 15597-B1) التي تحتوي على 1 × 1010 PFU /mL في المختبر باتباع إجراء ISO 10705-1:199514.
- ثم، aliquot 10 ميكرولتر من التعليق لكل أنبوب يحتوي على 1 × 108 PFU في أنابيب 10 مل والسماح للمياه تتبخر في 37 درجة مئوية. استخدام أنبوب واحد لكل عينة المياه.
- بالإضافة إلى ذلك، إعداد أنبوب واحد يحتوي على 10 مل من المياه المقطر المعقمة لكل عينة تم جمعها.
- الكواشف التركيز
- لحل الحليب منزوع الدسم preflocculated (PSM)، استخدم الكميات التالية لتركيز خمس عينات من المياه سعة 10 لتر.
- إعداد أنبوب من البلاستيك يحتوي على 5 غرام من الحليب منزوع الدسم.
- إعداد كيس من البلاستيك سستة تحتوي على 16.66 غرام من أملاح البحر.
- إعداد زجاجة بلاستيكية تحتوي على 500 مل من الماء المقطر.
- إعداد الكواشف اللازمة لتعديل الرقم الهيدروجيني. استخدم الكميات التالية لضبط درجة الحموضة في PSM وخمس عينات مياه سعة 10 لتر.
- إضافة 5 غرام من حامض الستريك 1-هيدرات إلى أنبوب من البلاستيك 10 مل.
تحذير: حمض الستريك يسبب تهيج خطير عندما يتعلق الأمر في اتصال مع العينين. إذا حدث ذلك، اشطف العين بحذر بالماء لعدة دقائق. إذا استمر التهيج، اطلب المشورة الطبية. - وضع 2 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب من البلاستيك 10 مل.
تحذير: يمكن أن يسبب هيدروكسيد الصوديوم حروق الجلد الشديدة وتلف العين. إذا ابتلع، شطف الفم. لا تحفز القيء. إذا كان يأتي في اتصال مع العينين، شطف بحذر مع الماء لعدة دقائق. ثم، اطلب المشورة الطبية. - وضع 25 مل من الماء المقطر المعقمة في وعاء من البلاستيك.
- وضع 50 مل من الماء المقطر المعقمة في وعاء من البلاستيك.
- إضافة 5 غرام من حامض الستريك 1-هيدرات إلى أنبوب من البلاستيك 10 مل.
- إعداد كيس تكييف العينة المستخدمة في التخثر، والحل الحافظة المستخدمة للحفاظ على الأحماض النووية، وكيس تحييد لتحييد المياه والمواد المهملة. استخدم الكميات التالية لكل عينة مياه سعة 10 لتر ليتم اختبارها.
- وضع 15 غرام من أملاح البحر و 8 غرام من حامض الستريك 1-هيدرات في كيس من البلاستيك سستة لكيس تكييف.
- إضافة 2 مل من العازلةlysis (جدول المواد) و 0.3 مل من حمض نووي عامل الحفاظ على (جدولالمواد)إلى أنبوب 5 مل.
تحذير: يحتوي المخزن المؤقت للليسيس على غوانيدين ثيوسيانات وتريتون X-100. الاتصال مع حمض يحرر الغاز السام، وأنها ضارة إذا ابتلع، استنشاق، أو يأتي في اتصال مع الجلد. إذا ابتلع، شطف الفم. لا تحفز القيء. إذا كان يأتي في اتصال مع الجلد، وغسل مع الكثير من الماء. ثم، اطلب المشورة الطبية. حمض نووي الحفاظ على عامل يسبب تهيج الجلد والعين وضارة إذا ابتلع. إذا كان يأتي في اتصال مع الجلد أو العينين، شطف بالماء وفيرة لعدة دقائق. على أي حال، وخاصة إذا ابتلع والشعور بعدم الارتياح، وطلب المشورة الطبية. - وضع 40 غرام من مسحوق المنظفات في أربعة أكياس بلاستيكية سستة.
تحذير: مسحوق المنظفات يسبب تهيج العين. إذا كان يأتي في اتصال مع العينين، شطف بالماء وفيرة لعدة دقائق. إذا استمر التهيج أو إذا ابتلع، اطلب المشورة الطبية.
- لحل الحليب منزوع الدسم preflocculated (PSM)، استخدم الكميات التالية لتركيز خمس عينات من المياه سعة 10 لتر.
- الكواشف استخراج الحمض النووي
- وضع 50 درجة مئوية منالجسيمات المغناطيسية (جدول المواد) و 1 مل من الإيثانول 96٪ في أنبوب 5 مل التي تشكل العازلة ملزمة.
تحذير: يحتوي المخزن المؤقت للجسيمات المغناطيسية على أزيد الصوديوم، الذي يشكل غازًا سامًا عندما يتعلق بملامسة الأحماض أو أيونات المعادن الثقيلة وهو سام إذا تم تناوله أو عندما يتعلق الأمر بملامسة الجلد. إذا تم تناولها أو في اتصال مع الجلد، شطف الفم أو الجلد بالماء الوفير والتماس المشورة الطبية. الإيثانول هو سائل قابل للاشتعال للغاية وبخار ويسبب تهيج العين خطيرة. الابتعاد عن الحرارة، والأسطح الساخنة، والشرر، وأي مصدر الإشعال الأخرى. إذا كان يأتي في اتصال مع الجلد أو العينين، شطف بالماء وفيرة. في حالة ابتلاع كميات كبيرة من الماء و / أو إذا استنشق، انتقل إلى الخارج في الهواء النقي. على أي حال، اطلب المشورة الطبية. - إضافة 500 ميكرولتر، 600 ميكرولتر، و 200 ميكرولتر من مخازن الغسيل 1 و2 و3، على التوالي (جدولالمواد)،إلى ثلاثة أنابيب 2 مل.
تحذير: تحتوي المخازن العازلة للغسيل على ثيوسيانات غوانيدينيوم وكلوريد غوانيدينيوم، وهي ضارة إذا استنشقأو ابتلع وتهيج الجلد والعينين. الاتصال مع الأحماض تطلق الغاز السام جدا. إذا كانت تأتي في اتصال مع الجلد أو العينين، شطف بالماء وفيرة. إذا ابتلع، شطف الفم بالماء الوفير. لا تحفز القيء. اطلب المشورة الطبية دائماً. - إضافة 120 درجة مئوية منالعازلة elution (جدول المواد) إلى أنبوب 0.5 مل.
- وضع 50 درجة مئوية منالجسيمات المغناطيسية (جدول المواد) و 1 مل من الإيثانول 96٪ في أنبوب 5 مل التي تشكل العازلة ملزمة.
- الكواشف الكشف عن HAdV و MS2
ملاحظة: يمكن تحليل اثنين من ردود الفعل استخراج حمض نووي مختلفة في وقت واحد في كل اختبار PCR إذا تم استخدام دراجة حرارية 8 جيدا. لجميع اختبارات PCR، وإعداد البيولوجيا الجزيئية المياه aliquoted في أنابيب 1.5 مل.-
الكشف عن HAdV
- إعداد مزيج يحتوي على 10 ميكرولتر من 22.5 ميكرومتر AdF التمهيدي إلى الأمام، 10 ميكرولتر من 22.5 μM AdRالتمهيدي العكسي، و 5 ميكرولتر من 11.25 ميكرومتر AdP التحقيق (الجدول 2).
- إضافة 2.5 درجة مئوية من المزيج إلى أنابيب 1 إلى 8 من شريط أنبوب. دعه يجف في درجة حرارة الغرفة، وإغلاق الأنابيب، والحفاظ عليها محمية من الضوء.
- قطع الشريط تقسيمه إلى شريطين: أنابيب 1-5 وأنابيب 6-8.
- إعداد تخفيف تسلسلي لتعليق الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل النيوكليوتيدات في منطقة HAdV المضخمة. الهواء الجاف 1 ميكرولتر من المعلقاتالتي تحتوي على 1 × 10 5، 1 × 107،و 1 × 109 GC / مل في أنابيب 6-8.
ملاحظة: الحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على التمهيديات، والتحقيق، وتعليق الهواء المجففة محمية من الضوء.
-
الكشف عن MS2
- إعداد مزيج يحتوي على 10 ميكرولتر من 25 ميكرومتر بكسون-2F التمهيدي إلى الأمام، 10 ميكرولتر من 25 ميكرومتر بكسون-2R التمهيديالعكسي، و 2.5 ميكرولتر من 25 ميكرومتر PecP-2 التحقيق (الجدول 2).
- إضافة 2.25 درجة مئوية من المزيج إلى أنابيب 1 إلى 8 من شريط أنبوب. دعه يجف في درجة حرارة الغرفة، وإغلاق الأنابيب، والحفاظ عليها محمية من الضوء.
- قطع الشريط تقسيمه إلى شريطين: أنابيب 1-5 وأنابيب 6-8.
- انتقل كما هو الحال في الخطوة 1.4.1.4 ولكن استخدم تعليق قياسي مصمم لMS2 بدلاً من ذلك.
-
الكشف عن HAdV
2. التركيز الفيروسي
ملاحظة: استخدم القفازات في جميع الأوقات أثناء جمع العينات، وإعداد الكاشف، وflocculation، وجمع flocs، وإجراءات التخلص من النفايات. ارتداء نظارات واقية أثناء إجراء إعداد الكاشف.
- جمع العينات
- جمع عينة المياه 10 لتر في دلو أسفل شقة مع غطاء. جمع ما لا يقل عن نسختين متماثلتين لكل عينة.
ملاحظة: من المهم استخدام دلاء واضحة لتصور بيليه. إذا كانت عينة الماء تحتوي على مواد معلقة (على سبيل المثال، والمياه والطحالب)، والسماح لها الرواسب، وبعد ذلك، جمع supernatant المياه في دلو جديد. - تسجيل حجم جمعها، فضلا عن الموقع وتاريخ جمع، لكل عينة من المياه.
- وضع النمام المغناطيسي متصلا بطارية تحت دعم دلو ووضع دلو يحتوي على عينة المياه على دعمها.
ملاحظة: ابحث عن سطح مستو في مكان جديد والحفاظ على الدلاء التي تحتوي على عينات المياه من أشعة الشمس المباشرة.
- جمع عينة المياه 10 لتر في دلو أسفل شقة مع غطاء. جمع ما لا يقل عن نسختين متماثلتين لكل عينة.
- إعداد الكواشف
-
الكواشف تعديل الرقم الهيدروجيني
- صب مسحوق حامض الستريك وكريات هيدروكسيد الصوديوم في الأواني التي تحتوي على 25 و 50 مل من الماء المقطر، على التوالي.
- مصافحة بلطف باليد حتى يذوب حمض الستريك وهيدروكسيد الصوديوم تماما.
تحذير: لا تصب الماء فوق كريات هيدروكسيد الصوديوم. بدلا من ذلك، صب الكريات هيدروكسيد الصوديوم على الماء.
-
حليب منزوع الدسم
- وضع حقيبة الوقوف على النمام المغناطيسي وصب 500 مل من الماء المقطر في ذلك. إسقاط المغناطيس التحريك داخل الحقيبة وبدوره على النمام المغناطيسي.
- صب محتويات كيس ملح البحر وأنبوب الحليب منزوع الدسم في كيس الوقوف ويحرك لمدة 5 دقائق في سرعة متوسطة لإذابتها.
- إضافة 3 مل من حامض الستريك إلى حل PSM باستخدام ماصة باستور للتأكد من أن الحموضة تقع بين 3.4 و 3.6. قياس الحموضة من الحل PSM باستخدام شرائط مؤشر الحموضة. إضافة كميات أصغر من حامض الستريك وهيدروكسيد الصوديوم كما يحصل على الحموضة أقرب إلى 3.5.
- إيقاف النمام المغناطيسي وتأكد من أن flocs مرئية. استخدام مصباح يدوي للمساعدة في تصور flocs.
-
الكواشف تعديل الرقم الهيدروجيني
- التجلط
- إسقاط المغناطيس التحريك في الماء، وتعيين النمام المغناطيسي في أقصى سرعة، وتشغيله. تأكد من أن المغناطيس التحريك يبدأ الغزل.
- إضافة 10 مل من الماء المقطر إلى أنبوب التحكم في العملية. عكس الأنبوب عدة مرات لإعادة ترطيب المخزون الفيروسي وصب الحل في الماء.
- صب محتويات كيس تكييف عينة واحدة في الماء ويحرك لمدة 5 دقائق.
- قياس درجة الحموضة من عينة المياه باستخدام شرائط مؤشر درجة الحموضة. إضافة بضع قطرات من حامض الستريك أو هيدروكسيد الصوديوم إلى عينة المياه للتأكد من أن درجة الحموضة تقع بين 3.4 و 3.6. إضافة كميات أصغر من حامض الستريك وهيدروكسيد الصوديوم كما يحصل على الحموضة أقرب إلى 3.5.
- إضافة 100 مل من حل PSM باستخدام حاوية 100 مل.
- ختم دلو مع الغطاء، وتعيين النمام المغناطيسي في الحد الأدنى من السرعة، وترك الماء التحريك لمدة 8 ساعة.
- إيقاف النمام المغناطيسي والسماح للمياه لا يزال لمدة 5 ساعة على الأقل للسماح flocs لتسوية.
- مجموعة فلوك
- بناء نظام siphoning تتألف من وحدة تحكم ماصة، واثنين من الماصات، وأنبوب من البلاستيك، لاستنشاق supernatant المياه لتفريغ المياه على flocs.
- إرفاق ماصة 10 مل نهاية الشريط إلى وحدة تحكم ماصة. ثم، إرفاق غيض من الماصة إلى أنبوب من البلاستيك.
- إزالة مرشح من 10 مل الماصة مفتوحة طرف باستخدام ملاقط وإرفاق ماصة إلى أنبوب من البلاستيك.
- ضع دلو فارغ على الأرض.
- تزج غيض من ماصة مفتوحة الطرف في الماء. تأكد من إبقائها قريبة من سطح الماء لتجنب إزعاج الفلوك. يستنشق الماء حتى يصل إلى ماصة الشريط نهاية.
- قرصة أنبوب من البلاستيك في نهاية تعلق على ماصة الشريط نهاية وفصلها من الماصة.
- ضع الأنبوب في دلو فارغ. الإفراج عن الضغط على أنبوب للسماح تدفق المياه في دلو فارغة.
- قرصة أنبوب من البلاستيك لوقف تدفق المياه عندما يكون مستوى المياه على وشك الوصول إلى المغناطيس التحريك ونقل ماصة بعيدا عن دلو.
- هز الدلو لإعادة تعليق الفلوك وصب لهم في كيس من البلاستيك 500 مل الوقوف متابعة. السماح لflocs لتسوية ل1 ساعة أكثر.
- يستنشق بعناية supernatant المياه باستخدام ماصة 50 مل ووحدة تحكم ماصة يدوية، وتجنب إزعاج flocs.
- يستنشق الفلوك باستخدام ماصة 100 مل ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تخرج. لاحظ أسفل الحجم النهائي من تركيز العينة ونقل 1 مل منه إلى أنبوب 5 مل يحتوي على الحل الحافظة، وذلك باستخدام ماصة باستور.
ملاحظة: من المهم أن يتم إخراج أنبوب الطرد المركزي بحيث يمكن قياس الحجم النهائي للعينة المركزة بأكبر قدر ممكن من الدقة وتسجيلها. - إجراء استخراج الحمض النووي في هذا المجال. بدلا ً من ذلك، قم بتخزين الحل الحافظة الذي يحتوي على الفيروسات عند درجة حرارة 20-30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 15 يومًا أو شحنها إلى مختبر مرجعي لمزيد من التحليل.
- بناء نظام siphoning تتألف من وحدة تحكم ماصة، واثنين من الماصات، وأنبوب من البلاستيك، لاستنشاق supernatant المياه لتفريغ المياه على flocs.
- التخلص من النفايات وإعادة استخدام المواد
- إضافة محتويات كيس عامل تحييد إلى دلو يحتوي على المياه المهملة. اخلط الماء، ثم اتركه لا يزال لمدة 30 دقيقة.
- التخلص من المياه المعالجة كنفايات عامة.
- ضع الماصات والأنبوب البلاستيكي داخل الدلو. ملء دلو بالماء وتصب في محتويات كيس عامل تحييد واحد.
- اغسلها لمدة 30 دقيقة على الأقل لتعقيمها وشطفها بالماء النظيف الوفير لإزالة أي عامل تحييد المتبقية.
3. استخراج الحمض النووي
ملاحظة: استخدام القفازات وارتداء دائما نظارات واقية أثناء إجراء استخراج الحمض النووي.
-
عملية الماصات المغناطيسية
- الحصول على التعرف على تشغيل الماصة المغناطيسية قبل إجراء استخراج.
-
استخراج الحمض النووي
- ترتيب الأنابيب التي تحتوي على الكواشف المطلوبة للاستخراج في رف، من اليسار إلى اليمين: المخزن المؤقت ملزمة، المخازن المؤقتة الغسيل، والمخزن المؤقت elution. تعيين العدد المناسب من الأنابيب وفقا لعدد العينات أو النسخ المتماثلة التي يجري تحليلها.
- نقل 1 مل من التركيز عينة إلى أنبوب يحتوي على العازلة ملزمة، وذلك باستخدام ماصة باستور المتاح. عكس الأنبوب 8x إلى 10x لتجانس الحل.
- احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في حين خلط باستمرار، إما باستخدام مدار بالطاقة الشمسية أو يدويا.
- جمع الجسيمات المغناطيسية باستخدام الماصة المغناطيسية وطرف نظيفة، والتي يمكن إعادة استخدامها لمخازن الغسيل الثلاثة.
- الإفراج عن الجسيمات المغناطيسية في الأنبوب الذي يحتوي على 500 درجة مئوية من الغسيل العازلة 1. غسلها عن طريق هز بلطف الحل مع غيض لمدة 30 ق وجمعها.
- نقل الجسيمات المغناطيسية إلى أنبوب يحتوي على 600 درجة مئوية من الغسيل العازلة 2. غسلها عن طريق هز بلطف الحل مع غيض لمدة 30 ق وجمعها.
- نقل الجسيمات المغناطيسية إلى أنبوب يحتوي على 200 ميكرولتر من الغسيل العازلة 3. غسلها عن طريق هز بلطف الحل مع غيض لمدة 30 ق وجمعها.
- الإفراج عن الجسيمات المغناطيسية في الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت elution وتجاهل غيض.
- احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في حين خلط باستمرار، وذلك باستخدام المدار بالطاقة الشمسية.
ملاحظة: خلط الجسيمات المغناطيسية في المخزن المؤقت elution خطوة حاسمة. في حالة عدم وجود مدار، مزيج باستمرار باليد خلال وقت الحضانة. - استبدال غيض على الماصة المغناطيسية من قبل واحد جديد وجمع الجسيمات المغناطيسية من المخزن المؤقت elution. تأكد من إزالة الجسيمات المغناطيسية بالكامل من المخزن المؤقت للإلوتيون لأنها يمكن أن تتداخل مع أساليب الكشف الجزيئي.
- تخلص من الطرف مع الجسيمات المرفقة به. تابع تحليل PCR، أو اشحن المخزن المؤقت للإلعاق إلى مختبر مرجعي، أو قم بتخزين المخزن المؤقت للإهليل في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
4. الكشف الفيروسي مع بطارية تعمل ثمانية أنبوب في الوقت الحقيقي thermocycler
ملاحظة: استخدام القفازات وارتداء دائما نظارات واقية أثناء إجراء الكشف عن الحمض النووي. استبدال القفازات لأخرى جديدة عند إجراء تجربة PCR جديدة لتجنب التلوث المتبادل.
-
HAdV PCR الكمية
- أضف 14 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل إلى الأنابيب 2 و4 و5.
- إضافة 4 ميكرولتر من مزيج PCR إلى أنابيب 1-5.
- إضافة 14 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي من العينة A إلى أنبوب 1 و 14 ميكرولتر من العينة B إلى أنبوب 3.
- إضافة 2 ميكرولتر من الأحماض النووية المستخرجة من عينة A إلى أنبوب 2 و 2 ميكرولتر من العينة B إلى أنبوب 4. أغلق الشريط ذو الإنبوب الخمسة
- أضف 14 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل إلى الأنابيب 6 و7 و8.
- إضافة 4 ميكرولتر من هذا المزيج إلى أنابيب 6 و 7 و 8، وإغلاقها.
- وضع كلا الشريطين في دراجة حرارية وحددتشغيل المناسبة (الجدول 3).
- تخلص من أنبوب الماء وحافظ على حمض النوى المستخرج في الثلاجة، إن أمكن، أو، إن لم يكن كذلك، في مكان جديد محمي من الضوء في حالة الحاجة إلى إجراء اختبار ثان.
- تنظيف micropipettes، والرف، ومواد العمل، وجميع المواد بشكل صحيح مع منظف حمض نووي، وتجاهل كيس من البلاستيك التي تحتوي على طرف المستخدمة، والقفازات، والأنابيب.
تحذير: مزيل الحمض النووي هو سائل قابل للاشتعال جدا والبخار. لا تتنفس في رذاذ رذاذ وتجنب أي اتصال من السائل مع العينين أو الجلد. خلاف ذلك، شطف على الفور بالماء وفيرة والتماس المشورة الطبية. - جمع النتائج وتحليل البيانات التي تم الحصول عليها.
-
MS2 PCR الكمية
- أضف 14 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل إلى الأنابيب 2 و4 و5.
- إضافة 4 ميكرولتر من مزيج PCR و 0.5 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي إلى أنابيب 1-5.
- إضافة 14 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي من العينة A إلى أنبوب 1 و 14 ميكرولتر من العينة B إلى أنبوب 3.
- إضافة 1 ميكرولتر من الأحماض النووية المستخرجة من عينة A إلى أنبوب 2 و 1 ميكرولتر من العينة B إلى أنبوب 4. أغلق الشريط ذو الإنبوب الخمسة
- إضافة 15.5 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل إلى الأنابيب 5 و 6 و 7 و 8، وإغلاقها.
- إضافة 4 ميكرولتر من مزيج PCR و 0.5 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي إلى الأنابيب 6 و7 و8.
- وضع كلا الشريطين في دراجة حرارية وحددتشغيل المناسبة (الجدول 3).
- المضي قدما على النحو المبين في الخطوات 4-1-8 إلى 4-1-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تطوير الأسلوب
وقد تم تطوير هذا الإجراء في مختبر الفيروسات الملوثة من المياه والغذاء بالتعاون مع GenIUL وأوكسفام Intermón. وهو يتألف من ثلاث خطوات مختلفة. أول واحد، تركيز الجسيمات الفيروسية، هو التكيف مع طريقة حليب منزوع الدسم flocculation وصفها سابقا12،17،18. تم تعديل الطريقة الأصلية لتكون مستقلة عن إمدادات الطاقة، أبسط، ودون خطوات الطرد المركزي.
وقد تم اختبار استعادة طريقة تركيز VirWaTest في عينات المياه الجوفية من نوع HAdV وMS2 التي ارتفعت بالبكتيريا. وقدر الانتعاش الفيروسي لطريقة تركيز واستخراج VirWaTest أن يكون 3.01٪ إلى 18.02٪ لMS2 و 17.52٪ إلى 44.22٪ لHAdV. وقد حُسبت هذه الاستردادات من القيم التي حصل عليها الفينول الخماسي الكلور الكمي أثناء تطوير الأسلوب مقارنة بالتركيزات الأولية للفيروس HAdV وMS2 في عينات المياه بعد أن تتجسس عليها بتركيزات معروفة من هذه المخزونات الفيروسية.
تمت مقارنة استخراج حمض نووي مغناطيسي VirWaTest بمجموعة صغيرة من الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال، QIAamp الفيروسية RNA Mini Kit)، وهي طريقة استخراج تستند إلى العمود المستخدمة في المختبر، من خلال اختبار 33 عينة من الأنهار والمياه الجوفية ارتفعت مع HAdV و MS2 وتتركز بواسطة الحليب منزوع الدسم flocculation. وأظهرت نتائج المقارنة أن استرداد طريقة VirWaTest كان أعلى في 23/33 حالات HAdV، وكذلك لMS2 (الجدول4). أظهر اختبار ويلكوكسون قيمp-0.0005569 لHAdV و 0.02791 لMS2. يوفر استخراج حمض النوى VirWaTest استرداد الفيروسية أعلى بكثير من واحد التجارية.
الكشف عن HAdV في عينات المياه البيئية التي تركزها طريقة VirWaTest
ولاختبار الطريقة المتقدمة للتركيز الفيروسي في الميدان، جمع فريق أوكسفام للمياه والصرف الصحي والنظافة الصحية، الموجود في بانغهي (RCA) في آذار/مارس 2017، الفيروسات المركزة من خمس عينات من مياه الآبار.
وفي منطقة بيدرناليس (إكوادور)، التي تضررت من الزلازل في عامي 2016 و2017، قام فريق من أوكسفام للمياه والصرف الصحي والنظافة الصحية في شباط/فبراير 2017 بجمع ست عينات من مياه الآبار، وتركزت فيروساتها بطريقة تركيز VirWaTest. تم إرسال المركزات الفيروسية من كلا الوضعين إلى المختبر في برشلونة لاستخراج حمض النوى VirWaTest والقياس الكمي الفيروسي.
وفي إكوادور، تم الكشف عن HAdV الذي يحدث بشكل طبيعي في ست عينات من أصل ست عينات تم تحليلها، مع قيم تركيز تتراوح بين 3.27 x 101 إلى 1.80 × 102 GC/L، في حين تم اختبار عينة واحدة من أصل خمس عينات تم جمعها وتركيزها في بانغهي (RCA) إيجابية لHAdV، بتركيز 3.46 × 102 GC/L (الجدول5).
تم الكشف عن MS2، التي تمت إضافتها إلى جميع العينات التي تم اختبارها كتحكم داخلي في العملية، في جميع العينات التي تم اختبارها، مما يدل على أن الأسلوب تم تنفيذه بشكل صحيح من التركيز إلى الكشف.
الشكل 1 طريقة VirWaTest. نظرة عامة على الخطوات التي يتكون منها الأسلوب VirWaTest. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المواد | تركيز | استخراج الأحماض النووية | الكشف عن |
| المعدات | النمام المغناطيسي (وحدتان) البطارية (وحدتان) موصلات البطارية/ النمام (وحدتان) محولات الطاقة (وحدتان) دلو الدعم (2 وحدات) حبل (وحدة واحدة) تحريك المغناطيس (3 وحدات) ملاقط (وحدة واحدة) أنابيب السيليكون (1 وحدة) ماصة تحكم (1 وحدة) علامة (وحدة واحدة) |
ماصة مغناطيسية (وحدة واحدة) منصة دوارة للطاقة الشمسية (وحدة واحدة) حامل أنبوب متعدد الحجم (1 وحدة) مؤقت (وحدة واحدة) |
دراجة حرارية (وحدة واحدة) البطارية (وحدة واحدة) الكمبيوتر أنبوب الرف (1 وحدة) 0.5 ميكرومازيت - 10 ميكرومازيت (وحدة واحدة) 2 ميكرومازيت - 20 ميكرومازيت (وحدة واحدة) |
| المواد الاستهلاكية والكواشف (لكل 2 عينات المياه / تكرار) | دلو (3 وحدات) شرائط مؤشر الحموضة شريط نهاية 10 مل ماصة (2 وحدات) ماصة مفتوحة الطرف 10 مل (2 وحدة) شريط نهاية 50 مل ماصة (2 وحدات) شريط نهاية 100 مل ماصة (2 وحدات) ماصة باستور (4 وحدات) حقيبة بلاستيكية واقفة (4 وحدات) حاوية بلاستيكية مع 25 مل من الماء المقطر (1 وحدة) حاوية بلاستيكية مع 50 مل من الماء المقطر (1 وحدة) حاوية فارغة سعة 100 مل (1 وحدة) قفازات (6 أزواج) التحكم في العملية (2 أنابيب) أنبوب مع 10 مل من الماء المقطر (2 وحدة) حامض الستريك (1 أنبوب) هيدروكسيد الصوديوم (1 أنبوب) الحليب منزوع الدسم (1 أنبوب) كيس حامض الستريك (1 وحدة) الماء المقطر (1 500 مل زجاجة) عينة تكييف (2 أكياس) محلول حافظة (2 أنابيب) عامل تحييد (4 أكياس) |
نصائح ماصة المغناطيسي (2 وحدة) ماصة باستور (وحدتان) العازلة ملزمة (2 أنابيب) الغسيل العازلة 1 (2 أنابيب) الغسيل العازلة 2 (2 أنابيب) الغسيل العازلة 3 (2 أنابيب) الوياون العازلة (2 أنابيب) قفازات (6 أزواج) |
10 * مايكرومازيت نصائح (1 مربع) 20 * ميكرومازيت نصائح (1 مربع) الحمض النووي qPCR ميكس (1 أنبوب) RNA qPCR ميكس (1 أنبوب) عكس الانزيم النسخ (1 أنبوب) الأحياء الجزيئية المياه (1 أنبوب) HAdV أنبوب قطاع مع التمهيديات، والتحقيق والقياسية (1 وحدة) MS2 قطاع أنبوب مع التمهيديات، والتحقيق والقياسية (1 وحدة) مزيل الحمض النووي قفازات (6 أزواج) |
الجدول 1: محتويات VirWaTest. المعدات والمواد الاستهلاكية والكواشف التي يجب إعدادها لتركيز واستخراج والكشف عن الفيروسات في عينتين من المياه/ تكرار.
| الفيروس | الاشعال | رقم انضمام بنك Genbank | موقف | التسلسل (5'\u20123') | طول | مرجع | ||
| فيروس الغدة الدرقية البشري (HAdV) | Adf | J01917.1 | 18869\u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19 سنة | هيرنروث وآخرون، 200215 | ||
| في الرّاصي | 18919\u201218937 | CRCGGGAYTGCACCAG | 19 سنة | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTCCCGAGGCCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| البكتيريا MS2 (MS2) | بكسون-2F | NC_001417.2 | 344\u2012363 | اجتكتكتاكاجاجاجتاج | 20 | Pecson et al., 200917 | ||
| بكسون-2R | 659\u2012678 | TTCGTTTAGCAAGGTAGC | 20 | |||||
| PecP-2 | 369\u2012388 | 6-FAM-ATCGTGTGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
الجدول 2: Oligonucleotides للتجارب الكمية PCR. التمهيديات ومسبار مصممة لربط تسلسل الحمض النووي من HAdV و MS2.
| درجه الحراره | الوقت | دورات | درجه الحراره | الوقت | دورات |
| 95 درجة مئوية | 12 دقيقة | 1 | 55 درجة مئوية | 15 دقيقة | 1 |
| 95 درجة مئوية | 10 دقائق | 1 | |||
| 95 درجة مئوية | 15 s | 40 | 95 درجة مئوية | 15 s | 40 |
| 60 درجة مئوية | 1 دقيقة | 60 درجة مئوية | 1 دقيقة |
الجدول 3: الظروف الحرارية للتجارب الكمية لـ PCR. درجة الحرارة والوقت والدورات المستخدمة لتضخيم HAdV و MS2.
| QIAgen | فيروناتست | QIAgen | فيروناتست | ||
| متوسط | 2.53 x 103 | 2.43 x 103 | 4.74 x 104 | 5.13 x 104 | |
| يعني | 1.74 × 104 | 3.12 x 104 | 4.24 x 104 | 5.97 × 104 | |
| Sd | 5.66 x 105 | 2.23 x 106 | 4.49 × 104 | 1.63 x 105 | |
| p-القيمة (ويلكوكسون) لHAdV: 0.0005569 | |||||
| p-value (Wilcoxon) لMS2: 0.02791 | |||||
| تم اختبار الفيروسات | العينات التي تم اختبارها | QIAgen | اختبار فيروا | ||
| HAdv | 33 | 10 سنوات | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 سنوات | 23 | ||
الجدول 4: تطوير استخراج الأحماض النووية VirWaTest. قيم الوسيط ة والمتوسط وSD التي تم الحصول عليها عند مقارنة طرق استخراج Qiagen وVirWaTest في 33 عينة من المياه الجوفية لـ HAdV وMS2.
| البلد | الموقع | عينه | HAdV GC/L |
| انديانابوليس | أو دو لا سوداكة | 1 | Nd |
| إيل بونغوسوا، القرية 1 | 2 | Nd | |
| إيل بونغوسوا، القرية 3 | 3 | Nd | |
| بانغي، بووهات كوارتير فوندو | 4 | Nd | |
| بانغي، بووهات كوارتير ياباسا | 5 | 3.64 x 102 | |
| الإكوادور | بئر A | 6 | 7.96 x 101 |
| بئر B | 7 | 1.80 x 102 | |
| بئر C | 8 | 8.88 x 101 | |
| مياه الآبار A | 9 | 6.06 x 101 | |
| مياه الآبار B | 10 سنوات | 1.12 × 102 | |
| مياه الآبار C | 11 | 3.27 x 101 |
الجدول 5: التحديد الكمي للحمض الهيدروكلوريك باستخدام طريقة VirWaTest. النتائج الكمية لـ PCR، معبراً عنها بGC/liter، بالنسبة لـ HAdV التي تم جمعها وتركيزها في عينات المياه التي تم جمعها ومركزها من RCA وEcuador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة VirWaTest تمكن من تركيز الفيروسات واستخراج الحمض النووي من عينات المياه في نقطة الاستخدام من قبل المستخدمين غير ذوي الخبرة. وهو بروتوكول بأسعار معقولة وسريعة وبسيطة. ويستند التركيز على مبدأ التفلح العضوي باستخدام الحليب منزوع الدسم، والتي من خلالها انخفاض درجة الحموضة وظروف الموصلية العالية جعل بروتينات الحليب منزوع الدسم تجميعها في flocs الفيروسات adsorb إلى. عندما الرواسب flocs، فمن السهل لجمعها، مما يجعل من الممكن التركيز 10 لتر من الماء، في حين أن ultracentrifugation التقليدية لا يمكن التعامل مع كميات كبيرة من المياه.
وقد تم تعديل هذه الطريقة لكونها عملية عند نقطة أخذ العينات دون استخدام أي معدات كهربائية باستثناء النمام المغناطيسي الذي تعمل بالبطارية. وقد تم تكييف بعض النهج الأخرى القائمة على ترشيح المياه مع تركيز الفيروسات ويمكن أيضا تنفيذها عند نقطة الاستخدام. ومع ذلك، فإن المواد المعلقة الموجودة في عينات المياه غالبا ما تسد المرشحات؛ وبالتالي، فإن الحجم الصغير الذي قد يتركز مع هذه الأنظمة هو قيد خطير.
هذا هو الوصف الأول لطريقة لتركيز الفيروسات من عينات المياه في نقطة الاستخدام، بغض النظر عن عكر العينة. تسمح طريقة تركيز VirWaTest بمعالجة العديد من العينات في وقت واحد إذا كانت المواد المناسبة متوفرة. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن التطفل على الحليب منزوع الدسم مفيد للبكتيريا وتركيز الطفيلي19.
ويعد إعداد المواد المناسبة أمرا حاسما لتنفيذ الإجراء على نحو سليم. النظر في عدد عينات المياه التي سيتم تحليلها وإعداد الكواشف والمواد قبل الانتقال إلى المكان الذي يحتاج إلى الاختبار لإعداد الكواشف والمواد. ويمكن معالجة عدة عينات في نفس الوقت إذا كان الكمية المناسبة من المواد متاحة.
قبل البدء في تركيز عينة من الماء، سيتم استخدام تركيز معروف من مخزون فيروسي لتصاعد العينة كمراقبة العملية. تستخدم هذه الطريقة مخزونًا فيروسيًا مجففًا يتم إعادة ترطيبه بالماء المقطر قبل إضافته إلى عينة الماء عند نقطة الاستخدام. وهذا مفيد لاستبعاد النتائج السلبية الخاطئة في نهاية الإجراء ويعطي مؤشراعلى أداء الأسلوب.
يمكن إجراء مزيد من الاختبارات على التركيزات الفيروسية التي تم الحصول عليها باستخدام VirWaTest في المجال الذي يطبق أساليب استخراج حمض النوى VirWaTest والكشف عنه، أو، بدلاً من ذلك، يمكن إرسال المركزات إلى مختبر مرجعي في درجة حرارة الغرفة. الحل الحافظة المضافة إلى التركيز تمكن الفيروسات من البقاء مستقرة لمدة تصل إلى 2 أسابيع (نتائج غير منشورة).
استخراج الأحماض النووية VirWaTest هو طريقة مغناطيسية تستند إلى الجسيمات. فمن السهل والسريع ويسمح العديد من العينات ليتم معالجتها في نفس الوقت ويظهر ما يعادلها وحتى أفضل كفاءة الانتعاش من الأساليب المستخدمة حاليا لاستخراج الحمض النووي الفيروسي. ويمكن إرسال الأحماض النووية إلى المختبرات المرجعية في درجة حرارة الغرفة أو، إذا كان المستخدمون واثقين من إجراء الكشف الجزيئي، يمكن إجراء فحص كمية لـ PCR عند نقطة استخدام عينة المياه الأصلية.
أيضا، إذا كان مرفق مختبر صغير متاح، قد يقترن بروتوكول تركيز VirWaTest إلى مجموعات استخراج حمض نووي القياسية التي تعتمد على الطرد المركزي والأساليب القياسية القائمة على PCR التي تتطلب الفريزر للحفاظ على الكواشف ولكن هذا الاستخدام الدراجات الحرارية القياسية، والتي هي أقل تكلفة من تلك التي تعمل بالبطارية.
ومع ذلك، بما أن إمدادات الطاقة غير متوفرة في بعض الأحيان، فقد قمنا باختبارات الكشف الأمثل عن البكتيريا MS2 كمراقبة للعملية وHAdV كمؤشر فيروسي للبراز، ويمكن تخصيص المنهجية لأي فيروس آخر مهم، مثل التهاب الكبد الفيروسات، RoV، NoV، أو غيرها، ليتم تشغيلها في الميدان دون الحاجة إلى الفريزر لصيانة الكواشف، ولا الدراجات الحرارية التقليدية ولكن فقط واحدة تعمل بالبطارية. تتوفر العديد من الدراجات الحرارية التي تعمل بالبطارية تجارياً. وبدلاً من ذلك، إذا توفرت إمدادات الطاقة، يمكن استخدام معدات qPCR التقليدية الأخرى. إذا تم استخدام دراجة حرارية ثمانية أنابيب، يمكن اختبار ما يصل إلى اثنين من استخراج الحمض النووي (عينتين مختلفتين أو اثنين من تكرار من نفس العينة) في نفس اختبار PCR. لكل استخراج الحمض النووي، سيتم اختبار اثنين من كميات مختلفة لاستبعاد تثبيط الأنزيمية التي نشأت من قبل العينة. ويستند التكيف على الإعداد السابق لأنابيب PCR عن طريق المواد التمهيدية لتجفيف الهواء، وتحقيقات، وتعليق القياسية. توجد العديد من حلول qPCR التجارية التي يمكن استخدامها عن طريق تطبيق نفس الإجراء كما هو موضح هنا. وقد وصفنا أحد الاحتمالات التي اعتبرناها سهلة الأداء.
وأظهرت اختبارات المقارنة التي أجريت أثناء تطوير الطريقة أن أساليب VirWaTest للتركيز والاستخراج والكشف فعالة في القياس الكمي للفيروسات في عينات المياه.
الحد الأقصى للكشف (LOD) من الإجراء الموصوف متغير لأن الحجم الذي تم جمعه بعد التركيز متغير. أيضاً، يمكن أن يكون LOD مختلفًا قليلاً للفيروسات المختلفة. إذا تم جمع حجم من حوالي 10 لتر، فإن LOD لHAdV يكون حوالي 1 × 102 GC/L الفيروسية. لذلك، يمكن الكشف عن تركيزات صغيرة نسبيا من HAdV بواسطة طريقة VirWaTest. وفي بيدرناليس (إكوادور)، قدمت ست عينات من أصل ست عينات تم اختبارها HAdV، بتركيزات قريبة من الـ LOD، تتراوح بين 3.27 x 101 إلى 1.80 x 102 GC/L. وفي بانغي (RCA)، تم اكتشاف HAdV في عينة واحدة من العينات الخمس التي تم تحليلها، بتركيز قدره 3.46 × 102 GC/L. وجود HAdV، فضلا عن وجود MS2 كعملية التحكم في العينات التي تم اختبارها، ويبين الأسلوب مفيد لاستعادة الجسيمات الفيروسية من عينات المياه، حتى عندما يؤديها المستخدمين غير ذوي الخبرة.
وتشير التعليقات التي تم الحصول عليها حتى الآن إلى أن التركيز الفيروسي هو إجراء سهل الأداء، مع عدم وجود مشاكل كبيرة عند تطبيقها عند نقطة استخدام العينات، على الرغم من أن هناك حاجة إلى 8 ح و 5 ح الخطوات. ومن المهم ملاحظة أن هذه الخطوات تحدث دون أي مساعدة بشرية. وعلاوة على ذلك، يجري تطوير طريقة أسرع تقوم على الترشيح كبديل للمياه غير التوربيدية. ومع ذلك، يبدو أن التبولحي، حتى الآن، الطريقة الفريدة التي تسمح بتركيز العينات التي تقدم عكر ًا عاليًا. ويمكن بعد ذلك إرسال المركزات الفيروسية إلى أي مختبر في جميع أنحاء العالم في درجة حرارة الغرفة، مما يجعل من الأسهل أيضا لاختبار الفيروسات لأن مناطق أخذ العينات ليس لديها دائما خدمات نقل جيدة توفر ظروف التبريد. وبدلاً من ذلك، تسمح بروتوكولات الاستخراج والكشف المعروضة هنا بإجراء اختبار للكشف الفيروسي عند نقطة استخدام العينات.
وعلى حد علمنا، فإن هذه هي الطريقة الأولى التي أُبلغ عن فائدتها في التركيز والاختبار لوجود فيروسات في عينات المياه في الميدان. وينبغي بذل مزيد من الجهود لتطبيق الإجراء على تقييم وجود مسببات الأمراض الفيروسية البشرية التي تهم عدة سيناريوهات أخرى للأزمات الإنسانية. أيضا، سيكون من الضروري ردود فعل المستخدم لتوفير رؤى في التنفيذ المحتمل لجعل الإجراء أكثر ودية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
كان VirWaTest مشروع بحثي ممول من برنامج صناديق الابتكار الإنساني التابع لـ ELHRA (تعزيز التعلم والبحث من أجل المساعدة الإنسانية). ويعترف المؤلفون بأفرقة المياه والصرف الصحي والنظافة الصحية التي تكرمت بالتعاون في هذه الدراسة. ومولت تحليل العينات في إكوادور منظمة أوكسفام في إكوادور وإدارة بحوث جامعة الأمريكتين. BRT.17.01. S. Bofill-Mas هو زميل سيرا هنتر في جامعة برشلونة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
