Summary
כאן אנו מציגים את VirWaTest, המהווה שיטה פשוטה, במחיר סביר ונייד לריכוז ואיתור של וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.
Abstract
וירוסים מופרשים על ידי בני אדם ובעלי חיים עלולים לזהם מקורות מים ולהוות סיכון לבריאות האדם כאשר מים זה משמש לשתייה, השקיה במזון, כביסה, וכו '. מחוון חיידקים בצואה קלאסית לא תמיד לבדוק את הנוכחות של פתוגנים ויראלי כך גילוי פתוגנים נגיפי אינדיקטורים נגיפי הוא רלוונטי כדי לאמץ מדדים של הקלה בסיכון, במיוחד בתרחישים הומניטאריים ובתחומים שבו התפרצויות ויראליות המועברות במים תכופים.
כיום, מספר בדיקות מסחריות המאפשרות כימות של חיידקים אינדיקטור צואה (פרפור) זמינים לבדיקה בנקודת השימוש. עם זאת, בדיקות מסחריות כאלה אינן זמינות לאיתור וירוסים. איתור וירוסים בדגימות מים סביבתיים דורש ריכוז של כמה ליטרים לתוך כרכים קטנים יותר. יתר על כן, לאחר מרוכז, זיהוי של וירוסים מסתמך על שיטות כגון הפקת חומצת גרעין וזיהוי מולקולרי (למשל, תגובת שרשרת פולימראז [PCR] מבוסס assays) של genomes ויראלי.
השיטה המתוארת כאן מאפשרת ריכוז של וירוסים מ 10 דגימות מים L, כמו גם את החילוץ של חומצות גרעין נגיפי בנקודת השימוש, עם ציוד פשוט ונייד. זה מאפשר בדיקות של דגימות מים בנקודת השימוש עבור מספר וירוסים והוא שימושי בתרחישים הומניטאריים, כמו גם בכל הקשר שבו מעבדה מצויד אינה זמינה. לחילופין, השיטה מאפשרת התמקדות בווירוסים המצויים בדגימות מים והובלת הריכוז למעבדה בטמפרטורת החדר לצורך ניתוח נוסף.
Introduction
במהלך השלבים הראשונים של החירום ההומניטרי, גישה לאספקת מים נקיים, תברואה והיגיינה הם קריטיים להישרדות של אלה המושפעים. לכן, הניטור איכות המים הוא בעדיפות כדי למנוע התפרצויות המועברות במים. זה ידוע כי מים מזוהמים הוא לעתים קרובות מקור המחלות, אבל לעתים קרובות קשה לקבוע את המקורות של התפרצויות ויראלי כגון וירוס הפטיטיס (הכבד), אפילו עם זמינות של שיטות מעבדה קונבנציונאלי. השליטה על איכות המים מבוססת על כימות השקר1,2,3,4. עם זאת, הוא תועד בהרחבה כי אין מתאם בין העדר פרפור ונוכחות של פתוגנים מים ויראלי כגון רוטוירוס (רוב), norovirus (NoV), או מת5,6. לכן, שימוש בקריטריון איכות המים המבוססת על פרפור עלול לגרום להערכת הסיכונים הקשורים לנוכחות של פתוגנים ויראלי מים. מעקב אחר וירוסי מחוון, כגון אדנוירוסים אנושיים (hadv), או פתוגנים ספציפיים יהיה מועיל להגדיר את החשיפה לפתוגנים נגיפי וזיהוי המקור הפוטנציאלי של זיהום אנושי7,8, 9,10 ובאימות היעילות. של אמצעי התברואה11
עד עכשיו, גילוי של וירוסים בתרחישים אלה הסתמך על צוות מיומן ולוגיסטיקה מורכבת. VirWaTest (virwatest.org) מיועדת לפיתוח של שיטה פשוטה, במחיר נוח ונייד לריכוז ואיתור בעקבות וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.
הריכוז וירוס מבוסס על העיקרון של לוקליזציה אורגנית של 10 L דגימות מים, אשר וירוסים משוחזרים בכרכים קטנים יותר12,13. Flocs נאספים והוסיף מאגר כי lyses וירוסים ומונע את חומצות גרעין מן השפלה כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת החדר עבור לא יותר מ 2 שבועות.
שיטת החילוץ חומצת גרעין מבוססת על השימוש חלקיקים מגנטיים שאליהם חומצות גרעין לקבל adsorbed. הם יכולים להיות מועברים ממאגר כביסה אחד למשנהו ולבסוף לתוך מאגר להתחמק על ידי שימוש בצנרת מגנטית אשר החלקיקים לצרף. נגיפי חומצות גרעין ויראלי שהושגו ניתן לשלוח למעבדת התייחסות שבה ניתן לבצע איתור באמצעות שיטות מולקולריות המבוססות על ה-PCR. עבור כל הפקת חומצת גרעין, שתי כמויות שונות נבדקו כדי לשלול עיכוב אנזימטי מקורו על ידי המדגם. לחילופין, עם זמינות מינימלית לציוד, ניתן להפעיל בדיקות PCR בנקודת השימוש. התהליך כולו נועד להתבצע באופן עצמאי מספק כוח (איור 1).
שיטת ה-PCR הכמותית לזיהוי האדב, המופרשת על-ידי בני אדם ונמצאה בדגימות שפכים בריכוזים גבוהים, הותאמה להפעלה בנקודת השימוש. HAdV משמשות כאינדיקטורים ויראליים אנושיים. ה-PCR לקוונפיקציה של MS2 בקטביאג כבר הותאם מאז MS2 משמש ב-VirWaTest כבקרת תהליך. ניתן להתאים אישית את השיטה לאיתור כל וירוס מעניין.
לאחר פיתוח, השיטה VirWaTest הוחלה על ידי המשתמשים בשתי הגדרות שונות ברפובליקת מרכז אפריקה (RCA) ואקוודור, מתן משוב על יישום הפרוטוקול במצבים אמיתיים.
לידיעתך, זהו הנוהל הראשון המאפשר ריכוז ואיתור של וירוסים בנקודת השימוש, ללא תלות בכל ספק כוח, ציוד גדול, ותנאי הקפאה/קירור. מומלץ לאסוף שתי משכפל של כל דגימת מים כדי להשיג תוצאות חזקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה ואריזה
הערה: החומרים/ציוד שיש לארוז מפורטים בטבלה 1. השתמש בכפפות כדי לטפל הריאגנטים הנדרש לבקרת התהליך, ריאגנטים ריכוז, חומצות גרעין החילוץ ריאגנטים וריאגנטים לזיהוי. ללבוש משקפיים הגנה כדי להתמודד עם ריאגנטים הדרושים לחילוץ חומצת גרעין.
- בקרת תהליכים
- הכנת MS2 בקטייפרג'ה תרבות המניה (אמריקאי סוג אוסף התרבות [ATCC] 15597-B1) המכיל 1 x 1010 Pfu/mL במעבדה על ידי ביצוע הליך ISO 10705-1:199514.
- אז, סדרת מחלקים 10 μl של ההשעיה לכל צינור המכיל 1 x 108 pfu לתוך 10 מ"ל צינורות ולתת המים להתאדות ב 37 ° c. השתמש בשפופרת אחת לכל אחת מדגימות המים.
- בנוסף, הכינו צינור אחד המכיל 10 מ ל של מים מזוקקים סטרילי לכל מדגם שנאסף.
- ריאגנטים לריכוז
- לקבלת תמיסת חלב (PSM), השתמש בסכומים הבאים כדי לרכז דגימות מים של 5 10 L.
- הכינו צינורית פלסטיק המכילה 5 גר' חלב.
- להכין שקית פלסטיק רוכסן המכיל 16.66 גרם של מלחי ים.
- הכינו בקבוק פלסטיק המכיל 500 מ ל של מים מזוקקים.
- הכן את הריאגנטים הנדרש להתאמת pH. השתמש בסכומים הבאים כדי לכוונן את ה-pH של PSM ו-5 10 דגימות מים L.
- מוסיפים 5 גר' חומצת לימון 1-מימה לצינור פלסטיק של 10 מ ל.
התראה: חומצת לימון גורמת לגירוי רציני כשמדובר במגע עם העיניים. אם זה קורה, לשטוף את העין בזהירות עם מים במשך כמה דקות. אם הגירוי נמשך, מבקשים ייעוץ רפואי. - שים 2 גרם של נתרן הידרוקסיד לתוך צינור פלסטיק 10 mL.
התראה: הידרוקסיד הנתרן עלולה לגרום לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים. . אם בלע, שטוף את הפה אל תגרום להקאה. אם זה בא במגע עם העיניים, לשטוף בזהירות עם מים במשך כמה דקות. . אז, תבקש עצה רפואית - שים 25 מ ל של מים מזוקקים סטרילי לתוך מיכל פלסטיק.
- שים 50 מ ל של מים מזוקקים סטרילי לתוך מיכל פלסטיק.
- מוסיפים 5 גר' חומצת לימון 1-מימה לצינור פלסטיק של 10 מ ל.
- הכינו את מיזוג המדגם המשמש להכנת החיסונים, פתרון השימור המשמש לשמירה על חומצות הגרעין, ולנטרול המים והחומרים הנמחקים. השתמש בסכומים הבאים עבור כל אחד 10 לדגום את המים כדי להיבדק.
- שים 15 גרם של מלחי ים ו 8 גר' חומצת לימון 1-מימה לתוך שקית פלסטיק רוכסן עבור התניה sachet.
- הוסף 2 מ ל של מאגר הליזה (טבלה של חומרים) ו 0.3 mL של חומצות גרעין שמירה על הסוכן (לוח חומרים) כדי צינור 5 מ ל.
התראה: מאגר הליזה מכיל guanidine thiocyanate ו טריטון X-100. מגע עם חומצה משחררת גז רעיל, והוא מזיק אם בלע, שואף, או מגיע במגע עם העור. . אם בלע, שטוף את הפה אל תגרום להקאה. אם זה בא במגע עם העור, לשטוף עם הרבה מים. . אז, תבקש עצה רפואית חומצות גרעין שימור הסוכן גורם לגירוי בעור ובעיניים והוא מזיק אם בלע. אם זה בא במגע עם העור או העיניים, לשטוף עם מים שופע במשך כמה דקות. בכל מקרה, במיוחד אם בלע ותרגיש ברע, בקש עצה רפואית. - לשים 40 גרם של אבקת כביסה לתוך ארבעה שקיות פלסטיק רוכסן.
התראה: אבקת כביסה גורמת לגירוי בעיניים. אם זה בא במגע עם העיניים, לשטוף עם מים שופע במשך כמה דקות. אם הגירוי נמשך או אם בלע, בקש עצה רפואית.
- לקבלת תמיסת חלב (PSM), השתמש בסכומים הבאים כדי לרכז דגימות מים של 5 10 L.
- חומצת גרעין ריאגנטים לחילוץ
- שים 50 μL של חלקיקים מגנטיים (טבלת חומרים) ו-1 מ ל של אתנול 96% לתוך צינור 5 מ ל המהווים את מאגר הכריכה.
התראה: מאגר החלקיקים המגנטיים מכיל נתרן עזידה, היוצר גז רעיל כאשר הוא מגיע במגע עם חומצות או יונים ממתכת כבדות, והוא רעיל אם הוא בובלע או כאשר הוא מגיע במגע עם העור. אם הוא בלע או במגע עם העור, לשטוף את הפה או את העור עם מים שופע ולבקש ייעוץ רפואי. אתנול הוא נוזל דליק מאוד אדים וגורם לגירוי בעיניים רציניות. להתרחק חום, משטחים חמים, ניצוצות, וכל מקור ההצתה אחר. אם זה בא במגע עם העור או העיניים, לשטוף עם מים שופע. במקרה של בליעה של כמויות גדולות של מים ו/או אם שאפה, צא החוצה אל האוויר הצח. . בכל מקרה, בקש עצה רפואית - הוסף 500 μL, 600 μL, ו 200 μL של מאגרי כביסה 1, 2, ו-3, בהתאמה (טבלה של חומרים), עד שלושה 2 שפופרות mL.
התראה: מאגרי כביסה מכילים את הגואנידיניום ואת הגואנידיניום וכלוריד, הפוגעים בשאיפה או בבליעה ובגירוי העור והעיניים. קשר עם חומצות משחרר גז רעיל מאוד. אם הם באים במגע עם העור או העיניים, לשטוף עם מים שופע. אם בלע, שטוף את הפה במים שופע. אל תגרום להקאה. . תמיד תבקש עצה רפואית - הוסף 120 μL של מאגר הימנעות (טבלת חומרים) לצינור 0.5 mL.
- שים 50 μL של חלקיקים מגנטיים (טבלת חומרים) ו-1 מ ל של אתנול 96% לתוך צינור 5 מ ל המהווים את מאגר הכריכה.
- האדב ו MS2 לזיהוי ריאגנטים
הערה: שני תגובות שונות להפקת חומצות גרעין ניתן לנתח בו זמנית בכל שיטת ה-PCR אם נעשה שימוש ב-8-היטב תרמוטרטרנר. עבור כל ה-PCR, להכין ביולוגיה מולקולרית מים מצוטט לתוך צינורות 1.5 mL.-
זיהוי HAdV
- להכין שילוב המכיל 10 μL של 22.5 μM-AdF לפנים, 10 μL של 22.5 μM לאחור פריימר, ו 5 μL של 11.25 μM AdP לווין (שולחן 2).
- הוסף 2.5 μL של המיקס לצינורות 1 עד 8 של רצועת צינור. תנו לו להתייבש בטמפרטורת החדר, סגרו את הצינורות ושמרו אותם מוגנים מהאור.
- חותכים את הרצועה חלוקת אותו לשתי רצועות: צינורות 1-5 וצינורות 6-8.
- הכינו דילול סדרתי של שתלים לדנ א המכילים את הרצף של הנוקלאוטיד של האזור הוגבר. אוויר יבש 1 μL של מתלים המכילים 1 x 105, 1 x 107, ו 1 x 109 GC/mL לתוך צינורות 6-8.
הערה: שמרו את הצינורות המכילים את התחל, הגשוש, ואת השעיות האוויר היבשות מוגנות מהאור.
-
זיהוי MS2
- להכין שילוב המכיל 10 μL של 25 μM פפסון-2F קדימה, 10 μL של 25 μM-2F פריימר הפוכה, ו 2.5 μL של 25 μM-2 בדיקה (שולחן 2).
- הוסף 2.25 μL של המיקס לצינורות 1 עד 8 של רצועת צינור. תנו לו להתייבש בטמפרטורת החדר, סגרו את הצינורות ושמרו אותם מוגנים מהאור.
- חותכים את הרצועה חלוקת אותו לשתי רצועות: צינורות 1-5 וצינורות 6-8.
- המשך כמו בשלב 1.4.1.4 אך השתמש בהשעיה סטנדרטית המיועדת ל-MS2 במקום זאת.
-
זיהוי HAdV
2. ריכוז נגיפי
הערה: השתמש בכפפות בכל עת במהלך איסוף המדגם, הכנה מגיב, לוקליזציה, איסוף והליכי סילוק פסולת. להרכיב משקפיים הגנה במהלך תהליך ההכנה הכימית.
- אוסף דוגמאות
- לאסוף 10 לדגום מים בדלי שטוח בתחתית עם מכסה. לאסוף מינימום של שתי משכפל עבור כל דוגמה.
הערה: חשוב להשתמש בדליים ברורים כדי להמחיש את הגלולה. אם דגימת המים מכילה חומר מושעה (למשל, חול, אצות), תנו לו לשקע ולאחר מכן אספו את המים על גבי דלי חדש. - רשום את אמצעי האחסון שנאסף, כמו גם את המיקום ואת תאריך הגבייה, עבור כל דגימת מים.
- שים מערבב מגנטי מחובר לסוללה תחת תמיכה דלי ולמקם את הדלי המכיל את דגימת המים על התמיכה שלה.
הערה: חפשו משטח שטוח במקום טרי ושמרו את הדליים המכילים את דגימות המים מאור השמש הישיר.
- לאסוף 10 לדגום מים בדלי שטוח בתחתית עם מכסה. לאסוף מינימום של שתי משכפל עבור כל דוגמה.
- הכנה לריאגנטים
-
ריאגנטים להתאמת pH
- יוצקים את אבקת חומצת לימון ואת כדורי נתרן הידרוקסיד לתוך הסירים המכילים 25 ו 50 mL של מים מזוקקים, בהתאמה.
- בעדינות ללחוץ ביד עד חומצת לימון הידרוקסיד הנתרן הם התפרקה לחלוטין.
התראה: לא לשפוך את המים על כדורי נתרן הידרוקסיד. במקום זאת, יוצקים את כדורי הנתרן הידרוקסיד מעל המים.
-
חלב לוקלוק
- מניחים שק עמידה על מערבב מגנטי ויוצקים 500 mL של מים מזוקקים בו. שחרר מגנט ערבוב בתוך השקית והפעל את הטירר המגנטי.
- יוצקים את התוכן של מלח ים מלוחים של צינור חלב לתוך שקית העמידה ומערבבים 5 דקות במהירות בינונית כדי לפזר אותם.
- הוסף 3 מ ל של חומצת לימון לפתרון PSM באמצעות הפיפטה פסטר כדי לוודא pH שקרים בין 3.4 ו 3.6. למדוד את ה-pH של הפתרון PSM באמצעות רצועות מחוון pH. הוסף כמויות קטנות יותר של חומצת לימון ו נתרן הידרוקסיד כמו ה-pH מתקרב 3.5.
- כבו את הטירר המגנטי. וודאו שה "נראים לעין השתמש בפנס כדי לעזור לדמיין את הפלוים.
-
ריאגנטים להתאמת pH
- לוקליזציה
- שחרר מגנט זע לתוך המים, הגדר את הערבוב המגנטי במהירות המירבית והפעל אותו. ודא שהמגנט הזע מתחיל להסתחרר.
- הוסיפו 10 מ ל של מים מזוקקים לצינור שליטה בתהליך. היפוך הצינור כמה פעמים כדי להשקות מחדש את המניה ולשפוך את הפתרון לתוך המים.
- יוצקים את התוכן של מיזוג לדוגמה אחד sachet לתוך המים ומערבבים עבור 5 דקות.
- למדוד את ה-pH של דגימת המים באמצעות רצועות מחוון pH. הוסיפו כמה טיפות של חומצת לימון או נתרן הידרוקסידי למדגם המים כדי לוודא pH שקרים בין 3.4 ו 3.6. הוסף כמויות קטנות יותר של חומצת לימון ו נתרן הידרוקסיד כמו ה-pH מתקרב 3.5.
- הוסף 100 mL של הפתרון PSM באמצעות מכולה 100 mL.
- חותם את הדלי עם המכסה, להגדיר את מערבב מגנטי במהירות מינימלית, ולהשאיר את המים ערבוב עבור 8 h.
- כבו את העור המגנטי והניחו למים לפחות 5 שעות כדי לאפשר לאלה להתיישב.
- אוסף floc
- בניית מערכת לשאוב מורכב מבקר פיפטה, שתי מערכות ושפופרת פלסטיק, כדי לשאוב את המים על ידי מי שיורה את המים על הפלוק.
- חברו מדבקה של 10 מ ל. לבקר הפיפטה אז, חברו את קצה הפיפטה. לצינור הפלסטיק
- הסירו את הפילטר מהפיפטה הפתוח של 10 מ"ל בעזרת מלקחיים וחברו את הפיפטה לצינור הפלסטיק.
- מניחים דלי ריק על הרצפה.
- הישאב את קצה הפיפטה הפתוח במים. הקפידו לשמור אותו קרוב למשטח המים כדי להימנע מהפרעה לגבי הפלוק. עד שהוא מגיע לפיפטה. שבקצה הקלטת
- צבוט את צינור הפלסטיק בסוף מוצמד לצינור הטייפ ולנתק אותו מן הפיפטה.
- מניחים את הצינור בתוך דלי ריק. שחררו את הלחץ על הצינורית כדי לאפשר למים לזרום לתוך הדלי הריק.
- לצבוט את צינור הפלסטיק כדי לעצור את זרימת המים כאשר רמת המים עומדת להגיע מגנט ערבוב ולהזיז את הצינורות הרחק מהדלי.
- לנער את הדלי כדי להשעות את flocs ולמזוג אותם לתוך שקית פלסטיק בעמידה 500 mL. הרשו לג להסתפק. בעוד 1 שעות
- בזהירות להשקות את supernatant מים באמצעות פיפטה 50 mL ובקר הצינורות הידני, הימנעות הפרעה flocs.
- מתיף את הפלוק באמצעות פיפטה 100 mL ומעבירים אותם לצינור הצנטריפוגה של הרכבת 50 התחתית. הערה למטה את הנפח הסופי של להתמקד לדגום ולהעביר 1 מ ל של אותו לצינור 5 מ ל המכיל את פתרון שימור, באמצעות הפיפטה פסטר.
הערה: חשוב שצינור הצנטריפוגה יהיה בוגר ולכן הנפח הסופי של המדגם המרוכז ניתן למדידה באופן מדויק ככל האפשר ורשום. - בצע את החילוץ חומצת גרעין בשדה. לחילופין, אחסן את פתרון החומר השמר המכיל את הווירוסים ב-20-30 ° צ' עד 15 יום או שלח אותם למעבדת התייחסות לניתוח נוסף.
- בניית מערכת לשאוב מורכב מבקר פיפטה, שתי מערכות ושפופרת פלסטיק, כדי לשאוב את המים על ידי מי שיורה את המים על הפלוק.
- סילוק פסולת ושימוש חוזר בחומרים
- להוסיף את התוכן של הסוכן נטרול sachet אל הדלי המכיל את המים שנמחקו. ערבב את המים, ואז, להשאיר אותו עדיין 30 דקות.
- היפטר מהמים המתייחסים כפסולת כללית.
- מניחים את הפיפטות ואת צינור הפלסטיק בתוך הדלי. ממלאים את הדלי במים ויוצקים בתוכן של סוכן נטרול אחד.
- לשטוף אותם לפחות 30 דקות כדי לעקר אותם ולשטוף אותם עם שופע מים נקיים כדי להסיר כל סוכן נטרול שנותר.
3. הפקת חומצת גרעין
הערה: כפפות להשתמש תמיד ללבוש משקפיים הגנה במהלך הליך החילוץ חומצות גרעין.
-
מבצע פיפטה מגנטי
- . לפני ביצוע החילוץ
-
חומצת גרעין מיצוי
- סדר את הצינורות המכילים את הריאגנטים הנדרש לחילוץ בארון תקשורת, משמאל לימין: מאגר מחייב, מאגרי כביסה ומאגר הימנעות. הגדר את המספר המתאים של צינורות בהתאם למספר הדגימות או הכפלת המנותח.
- העברה 1 מ ל של מדגם להתרכז הצינור המכיל את מאגר הכריכה, באמצעות מנקז חד פעמי פסטר. היפוך הצינור 8x כדי 10x כדי המגון את הפתרון.
- דגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות בזמן ערבוב ברציפות, או באמצעות מסלולית סולארית או ידני.
- לאסוף את החלקיקים המגנטיים באמצעות הצנרת המגנטית וטיפ נקי, אשר ניתן להשתמש בהם עבור שלושה מאגרי כביסה.
- שחררו את החלקיקים המגנטיים לתוך הצינור המכיל 500 μL של מאגר כביסה 1. לשטוף אותם על ידי לטלטל בעדינות את הפתרון עם העצה עבור 30 s ולאסוף אותם.
- העבר את החלקיקים המגנטיים לצינור המכיל 600 μL של מאגר כביסה 2. לשטוף אותם על ידי לטלטל בעדינות את הפתרון עם העצה עבור 30 s ולאסוף אותם.
- העבר את החלקיקים המגנטיים לצינור המכיל 200 μL של מאגר כביסה 3. לשטוף אותם על ידי לטלטל בעדינות את הפתרון עם העצה עבור 30 s ולאסוף אותם.
- שחררו את החלקיקים המגנטיים לתוך הצינורית המכילה את מאגר האלוטור ולהשליך את הקצה.
- דגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות ברציפות ערבוב, באמצעות מסלולית מופעל סולארית.
הערה: ערבוב החלקיקים המגנטיים במאגר האלוליטור הוא צעד מכריע. במקרה של חוסר מסלולית, ברציפות לערבב ידי יד בזמן הדגירה. - להחליף את הקצה על הצנרת המגנטית על ידי אחד חדש לאסוף את החלקיקים המגנטיים ממאגר להתחמק. הקפד להסיר לחלוטין את החלקיקים המגנטיים מתוך מאגר להתחמק מאז הם יכולים להפריע לשיטות זיהוי מולקולרי.
- מחק את העצה כאשר החלקיקים מחוברים אליו. המשך בניתוח ה-PCR, העבר את מאגר המידע למעבדת התייחסות, או אחסן את מאגר האלוטור ב-4 ° צ' לצורך ניתוח נוסף.
4. גילוי נגיפי עם מופעל סוללה שמונה שפופרת בזמן אמת התראטרי תרמי
הערה: כפפות להשתמש תמיד ללבוש משקפיים הגנה במהלך ההליך זיהוי חומצות גרעין. החליפו את הכפפות לחדשים בעת ביצוע ניסוי PCR חדש כדי להימנע מזיהום צולב.
-
ה-PCR הכמותי
- הוסף 14 μL של nuclease-מים ללא צינורות 2, 4, ו 5.
- הוסף 4 μL של תערובת PCR לצינורות 1-5.
- הוסף 14 μL של החילוץ חומצות גרעין ממדגם A לצינור 1 ו -14 μL ממדגם B לצינור 3.
- הוסף 2 μL של חומצות גרעין שחולצו ממדגם A לצינור 2 ו 2 μL ממדגם B לצינור 4. סגור את הרצועה החמש-שפופרת.
- הוסף 14 μL של nuclease-מים ללא צינורות 6, 7, ו 8.
- הוסף 4 μL של תערובת זו לצינורות 6, 7, ו-8, וסגור אותם.
- שים את שתי הרצועות בתוך הציקלטרנר ובחר את ההפעלה המתאימה (שולחן 3).
- להשליך את צינור המים ולשמור את חומצת הגרעין שחולצו במקפיא, אם אפשרי, או, אם לא, במקום טרי מוגן מפני אור במקרה בדיקה שנייה צריך להתבצע.
- נקה את המיקרופיפטות, את הארון, את חומר העבודה, ואת כל החומר כראוי עם מנקה חומצות גרעין, ולהשליך את שקית ניילון המכיל את הקצה המשמש, כפפות, וצינורות.
התראה: חומצות גרעין אקולוגי הוא נוזל דליק מאוד קיטור. אל תנשמו בערפל התרסיס והימנעו ממגע עם הנוזל בעיניים או בעור. אחרת, מיד לשטוף עם מים שופע ולבקש ייעוץ רפואי. - לאסוף את התוצאות ולנתח את הנתונים שהתקבלו.
-
MS2-PCR כמותי
- הוסף 14 μL של nuclease-מים ללא צינורות 2, 4, ו 5.
- הוסף 4 μL של שילוב ה-PCR ו-0.5 μL הפוך האנזים היפוך הטרנסקריפטאז לצינורות 1-5.
- הוסף 14 μL של החילוץ חומצות גרעין ממדגם A לצינור 1 ו -14 μL ממדגם B לצינור 3.
- הוסף 1 μL של חומצות גרעין שחולצו ממדגם A לצינור 2 ו-1 μL ממדגם B לצינור 4. סגור את הרצועה החמש-שפופרת.
- הוסף 15.5 μL של nuclease-מים חינם צינורות 5, 6, 7, ו 8, ולסגור אותם.
- הוסף 4 μL של שילוב ה-PCR ו-0.5 μL של אנזים היפוך הטרנססקריפט לצינורות 6, 7 ו -8.
- שים את שתי הרצועות בתוך הציקלטרנר ובחר את ההפעלה המתאימה (שולחן 3).
- המשך כמתואר בשלבים 4.1.8 to 4.1.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיתוח שיטות
הליך זה פותח במעבדה של וירוסים מזהמים של מים ומזון עם שיתוף הפעולה של המלון. הוא כולל שלושה צעדים שונים. הראשון, ריכוז החלקיקים הנגיפי, הוא עיבוד של שיטת החלב המגנב שתוארה קודם לכן12,17,18. השיטה המקורית שונתה כדי להיות בלתי תלויה באספקת חשמל, פשוטה יותר וללא שלבים צנטריפוגה.
ההתאוששות של שיטת הריכוז הויאווסט נבדקה ב-HAdV ו-MS2 בקטבאצ-דגימות מי תהום מחודדים. ההתאוששות ויראלית של הריכוז ושיטת החילוץ של VirWaTest הוערך כ3.01% עד 18.02% עבור MS2 ו 17.52% כדי 44.22% עבור HAdV. שחזורים אלה חושבו מהערכים שהושגו על ידי ה-PCR הכמותי במהלך הפיתוח של השיטה בהשוואה לריכוזים הראשוניים של HAdV ו-MS2 בדגימות המים לאחר שהוא השיג אותם בריכוזים ידועים של מניות ויראליות אלה.
החילוץ המגנטי הגרעין המווואוסט מגנטי לעומת RNA מסחרי מיני kit (g., QIAamp ויראלי RNA מיני Kit), שיטת החילוץ המבוסס על עמודה המשמש במעבדה, על ידי בדיקות 33 נהר ודגימות מי תהום מחודדים עם HAdV ו MS2 ומרוכז על ידי. חיסון חלב שגנב תוצאות ההשוואה הראו כי שחזור השיטה וירוואסט היה גבוה יותר ב 23/33 מקרים עבור HAdV, כמו גם עבור MS2 (טבלה 4). מבחן Wilcoxon הראה ערכי pשל 0.0005569 עבור hadv ו 0.02791 עבור MS2. הפקת חומצת הגרעין של וירווסט מספקת שחזורים ויראליות גבוהים באופן משמעותי מזו של הפרסומת.
זיהוי של HAdV בדגימות של מים סביבתיים המרוכזים על-ידי השיטה הויוטסט
כדי לבדוק את השיטה המפותחת לריכוז ויראלי בתחום, המים Oxfam, תברואה והיגיינה (לשטוף) צוות, הממוקם Banghi (RCA) במרץ 2017, נאסף ומרוכז וירוסים מחמש דגימות מים היטב.
כמו כן, באזור של פדרנאלס (אקוודור), שהושפע מרעידות האדמה ב-2016 ו-2017, שישה דגימות מים היטב נאספו על ידי צוות השטיפה אוקספם בפברואר 2017, והווירוסים שלה התרכזו על ידי שיטת הריכוז הווואטסט. תרכיזים ויראליים משתי ההגדרות נשלחו למעבדה בברצלונה על הפקת חומצת גרעין של ויראווסט וכימות נגיפית.
באקוודור, באופן טבעי התרחשות HAdV התגלו שש מתוך שישה דגימות שנותחו, עם ערכי ריכוז החל 3.27 x 101 כדי 1.80 x 102 GC/L, ואילו אחד מתוך חמש דגימות שנאספו מרוכז בנגי (RCA) נבדק חיובי עבור HAdV, בריכוז של 3.46 x 102 GC/L (טבלה 5).
MS2, התווסף לכל הדגימות נבדק כבקרת תהליכים פנימיים, זוהתה בכל הדגימות שנבדקו, ומראה שהשיטה בוצעה כראוי מהתרכזות לאיתור.
איור 1 : שיטה וירווטסט. מבט כולל על השלבים שבהם מורכב השיטה VirWaTest. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| חומרים | ריכוז | מיצוי חומצת גרעין | זיהוי |
| ציוד | שטירר מגנטית (2 יחידות) סוללה (2 יחידות) מחברי סוללה/שטירר (2 יחידות) מתאמי חשמל (2 יחידות) תמיכה בדלי (2 יחידות) חבל (1 יחידה) מגנט ערבוב (3 יחידות) מלקחיים (יחידה אחת) צינור סיליקון (1 יחידה) בקרי פיפטה (1 יחידה) סמן (יחידה אחת) |
פיפטה מגנטית (יחידה אחת) פלטפורמת השמש הרוטרי (1 יחידה) מתלה שפופרת רב מידות (יחידה אחת) טיימר (1 יחידה) |
ציקלונית תרמית (יחידה 1) סוללה (יחידה אחת) מחשב מתלה שפופרת (יחידה אחת) 0.5 μL-10 μL מיקרופיפטה (1 יחידה) 2 μL-20 μL מיקרופיפטה (1 יחידה) |
| מתכלים וריאגנטים (עבור כל 2 דגימות מים/משכפל) | דלי (3 יחידות) מפצלי מחוון pH מסוף קלטת 10 מ ל (2 יחידות) טיפ פתוח 10 מ ל פיפטה (2 יחידות) סרט בקצה 50 mL (2 יחידות) סרט בקצה 100 mL (2 יחידות) פסטר פיפטה (4 יחידות) שקית פלסטיק עמידה (4 יחידות) מכולה מפלסטיק עם 25 מ ל של מים מזוקקים (1 יחידה) מכולה מפלסטיק עם 50 מ ל של מים מזוקקים (1 יחידה) 100 מ"ל מכולה ריקה (יחידה אחת) כפפות (6 זוגות) בקרת תהליכים (2 מנורות) שפופרת עם 10 מ ל של מים מזוקקים (2 יחידות) חומצת לימון (1 שפופרת) נתרן הידרוקסיד (1 צינור) חלב גנב (שפופרת אחת) חומצת לימון סצ'ה (יחידה אחת) מים מזוקקים (1 500 mL בקבוק) מיזוג לדוגמה (2 שקיות) פתרון שימור (2 מנורות) נטרול סוכן (4 שקיות) |
מגנטי טיפים (2 יחידות) פסטר פיפטה (2 יחידות) מאגר כריכה (2 מנורות) מאגר כביסה 1 (2 מנורות) מאגר כביסה 2 (2 מנורות) מאגר כביסה 3 (2 מנורות) מאגר הימנעות (2 מנורות) כפפות (6 זוגות) |
10 טיפים למיקרופיפטה (1 קופסה) 20 טיפים למיקרופיפטה (קופסה אחת) מיקס דנ א (1 צינור) רנ א מערבבים (1 Tube) הפוך אנזים הטרנסקריפטאז (רכבת אחת) מים בביולוגיה מולקולרית (צינור 1) מפצל צינורות עם תחל, בדיקה ותקן (1 יחידות) MS2 רצועת צינור עם תחל, בדיקה ותקן (1 יחידה) מסיר גרעין חומצה כפפות (6 זוגות) |
טבלה 1: תוכן וירטואלי. ציוד, מתכלים, ו ריאגנטים כי צריך להיות מוכנים לריכוז, חילוץ, ואיתור של וירוסים בשני דגימות מים/משכפל.
| וירוס | Primers | הצטרפותן של גנבנק | עמדה | רצף (5 ' \u20123 ') | אורך | פניה | ||
| האדם אדנווירוס (HAdV) | AdF | 01917.1 | 18869\u201218887 | מיכל בוטקאג | 19 | Hernroth et al, 200215 | ||
| AdR | 18919\u201218937 | כורסי כמוסות | 19 | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-משפחה-מQ535 משפחתי | 27 | |||||
| MS2 בייחוחאג (MS2) | פקסון-2F | NC_001417.2 | 344 \ u2012363 | ליאת מיכאל | 20 | פקסון ואח ', 200916 | ||
| פקסון-2R | 659 \ u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 | |||||
| מיכל הפמפ 2 | 369 \ u2012388 | 6-משפחה-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
שולחן 2: מחלת הנגד המולקולארית לניסויים PCR כמותיים. התחל והבדיקה נועד לאגד רצפי חומצות גרעין של HAdV ו MS2.
| טמפרטורה | זמן | מחזורי | טמפרטורה | זמן | מחזורי |
| 95 ° c | 12 דקות | 1 | 55 ° c | 15 דקות | 1 |
| 95 ° c | 10 דקות | 1 | |||
| 95 ° c | בנות 15 | 40 | 95 ° c | בנות 15 | 40 |
| 60 ° c | 1 דקות | 60 ° c | 1 דקות |
שולחן 3: תנאים תרמיים לניסויים כמותיים של ה-PCR. טמפרטורה, זמן ומחזורי המשמשים עבור HAdV ו MS2 הגברה.
| היכל הג | וירוטסט | היכל הג | וירוטסט | ||
| חציון | 2.53 x 103 | 2.43 x 103 | 4.74 x 104 | 5.13 x 104 | |
| תכוון | 1.74 x 104 | 3.12 x 104 | 4.24 x 104 | 5.97 x 104 | |
| SD | 5.66 x 105 | 2.23 x 106 | 4.49 x 104 | 1.63 x 105 | |
| p-ערך (Wilcoxon) עבור HAdV: 0.0005569 | |||||
| p-ערך (Wilcoxon) עבור MS2:0.02791 | |||||
| וירוס נבדק | דגימות שנבדקו | היכל הג | מבחן ויריווה | ||
| היכל שייב | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
שולחן 4: ויראווסט חומצת גרעין פיתוח החילוץ. חציון, ממוצע, ואת ערכי ה-SD שהתקבלו בעת השוואת שיטות החילוץ של Qiagen ו-VirWaTest ב 33 דגימות מי תהום עבור HAdV ו MS2.
| מדינה | אתר | דוגמה | HAdV GC/L |
| RCA | או דה לה SODECA | 1 | ND |
| איל Bongossoua, כפר 1 | 2 | ND | |
| איל Bongossoua, כפר 3 | 3 | ND | |
| בנגי, הפנצ ' פונלו | 4 | ND | |
| בנגי, פושלה ויאמבאסה | מיכל 5 | 3.64 x 102 | |
| אקוודור | בוריבור א | 6 | 7.96 x 101 |
| בוריבור B | 7 | 1.80 x 102 | |
| בוריבור C | 8 | 8.88 x 101 | |
| מים בבאר A | 9 | 6.06 x 101 | |
| טוב מים B | 10 | 1.12 x 102 | |
| ובכן מים C | 11 | 3.27 x 101 |
טבלה 5: קוונפיקציה של HAdV באמצעות השיטה הויוווטסט. כמותית תוצאות ה-PCR, המתבטאת ב-GC/ליטר, עבור כימות האדב בדגימות מים שנאספו והתמקדה מ-RCA ומאקוודור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה VirWaTest מאפשרת ריכוז של וירוסים וחומצות גרעין החילוץ מדגימות מים בנקודת השימוש על ידי משתמשים לא מנוסים. זהו פרוטוקול זול, מהיר ופשוט. הריכוז מבוסס על העיקרון של החיסון האורגני באמצעות חלב, שדרכו מצבם של ה-pH הנמוכים והמוליכות הגבוהה הופכים את חלבוני החלב הניגנב לתוך הרמה הנמוכה ביותר של וירוסים ספוח. כאשר המשקע משקע, קל לאסוף אותם, מה שמאפשר להתרכז 10 L של מים, ואילו הקשר המסורתי מסורתי לא יכול להתמודד עם כמויות גדולות של מים.
השיטה שונתה להיות מעשית בנקודת הדגימה מבלי להשתמש בציוד חשמלי למעט מערבב מגנטי המופעל באמצעות סוללות. גישות אחרות המבוססות על סינון מים הותאמו לריכוז וירוסים וניתן לבצעו גם בנקודת השימוש. עם זאת, חומר מושעה נוכח בדגימות מים לעתים קרובות כפכפים המסננים; לפיכך, אמצעי האחסון הקטן שעשוי להיות מרוכז במערכות אלה הוא מגבלה רצינית.
זהו התיאור הראשון של שיטה לריכוז וירוסים מדגימות מים בנקודת השימוש, ללא קשר לעכירות של המדגם. שיטת הריכוז VirWaTest מאפשרת מספר דוגמאות לעיבוד בו זמנית אם החומר המתאים זמין. כמו-כן, הוכח שהחיסון לחלב שניתן להיות שימושי עבור חיידקים ו טפיל ריכוז19.
הכנת החומר המתאים חיונית לביצוע ההליך כראוי. שקול את מספר דגימות המים כדי להיות מנותח ולהכין את ריאגנטים ואת החומר לפני המעבר למקום שבו הבדיקה נדרשת להכנת ריאגנטים וחומרים. ניתן לעבד מספר דוגמאות בו אם כמות החומר המתאימה זמינה.
לפני תחילת הריכוז של דגימת מים, הריכוז הידוע של מניות ויראלי ישמש כדי לדרבן את המדגם כבקרת תהליך. שיטה זו משתמשת במניה ויראלית מיובש אשר מתייבש עם מים מזוקקים לפני שנוספו לדגימת המים בנקודת השימוש. אפשרות זו שימושית לשלול תוצאות שליליות מזויפות בסוף השגרה ומציינת את הביצועים של השיטה.
תרכיזים ויראליים שהושגו עם VirWaTest עשויים להיבדק בשטח החלת החילוץ ושיטות הזיהוי של חומצות גרעין של VirWaTest או, לחילופין, תרכיזים עשויים להישלח למעבדת התייחסות בטמפרטורת החדר. פתרון החומר שימור שנוסף לריכוז מאפשר לווירוסים להישאר יציבים עד 2 שבועות (תוצאות שלא פורסמו).
מיצוי חומצת הגרעין של וויאווסט הוא שיטה מגנטית לחלקיקים. זה קל ומהיר ומאפשר מספר דגימות כדי להיות מעובד באותו זמן מראה שווה ערך ואפילו יותר יעילות התאוששות מאשר שיטות המשמשות כיום עבור נגיפי חומצה גרעין ויראלי. חומצות גרעין ניתן לשלוח למעבדות התייחסות בטמפרטורת החדר או, אם משתמשים בטוחים בביצוע זיהוי מולקולרי, שיטת ה-PCR הכמותית יכולה להתבצע בנקודת השימוש של דגימת המים המקורית.
כמו כן, אם מתקן מעבדה קטן זמין, פרוטוקול הריכוז VirWaTest עשוי להיות מצמידים לתקן הגרעין חומצות החילוץ ערכות התלויות צנטריפוגה ו-PCR סטנדרטי שיטות הדורשות מקפיא לשמור על ריאגנטים, אך השימוש הציקלנים הסטנדרטיים, שהם פחות יקרים מאשר אלה המופעלים באמצעות סוללות.
עם זאת, כיוון שספק כוח הוא לפעמים לא זמין, יש לנו אופטימיזציה לזיהוי בMS2 בקטלייוגים כמו בקרת תהליך ו HAdV כמו אינדיקטור צואה ויראלי, ואת המתודולוגיה יכול להיות מותאם אישית עבור כל וירוס אחר של ריבית, כגון צהבת וירוסים, רוב, נובמבר, או אחרים, להיות מופעל בשדה מבלי להזדקק למקפיא עבור תחזוקה של הריאגנטים, או הציקלנים קונבנציונאלי, אלא רק מופעל על-ידי סוללה. כמה מהציקלונים המופעלים באמצעות סוללות זמינים באופן מסחרי. לחילופין, אם ספק כוח זמין, ניתן להשתמש בציוד qPCR אחר. אם משתמשים בצינורית תרמוטרטרנר שמונה שפופרת משמש, עד שני שימוש בחומצות גרעין (שתי דגימות שונות או שתי משכפל מאותה דוגמית) ניתן לבדוק באותה שיטת PCR. עבור כל הפקת חומצת גרעין, שתי כמויות שונות ייבדקו לשלול עיכוב אנזימטי מקורו במדגם. העיבוד מבוסס על ההכנה הקודמת של צינורות ה-PCR על ידי התחל ייבוש אוויר, בדיקה, ושתלים סטנדרטיים. מספר פתרונות qPCR מסחריים קיימים, שניתן להשתמש בהם על-ידי החלת ההליך המתואר כאן. הצלחנו לתאר אפשרות אחת שאנו מחשיב כקלות לביצוע.
השוואת השוואה שבוצעה במהלך התפתחות השיטה הראתה כי שיטות הריכוז, החילוץ והגילוי של הויאוואסט הינן יעילות עבור כימות וירוסים בדגימות מים.
מגבלת הזיהוי (לוד) של הפרוצדורה המתוארת היא משתנה מאז שאמצעי האחסון שנאסף לאחר ההתרכזות הוא משתנה. בנוסף, לוד יכול להיות מעט שונה עבור וירוסים שונים. אם כרך של כ 10 L נאסף, לוד עבור HAdV יהיה סביב 1 x 102 ויראלי GC/L. אז, ריכוזים קטנים יחסית של HAdV יכול להיות מזוהה על ידי השיטה VirWaTest. בפדרנאלס (אקוודור), שישה מתוך ששת הדגימות שנבדקו הציגו HAdV, בריכוזים קרובים ללוד, החל מ 3.27 x 101 עד 1.80 x 102 GC/L. ב Banghi (RCA), HAdV זוהו באחד מתוך חמש דגימות שנותחו, בריכוז של 3.46 x 102 GC/L. הנוכחות של HAdV, כמו גם הנוכחות של MS2 כתהליך השליטה בדגימות נבדק, מראה את השיטה היא שימושית להתאוששות חלקיקים ויראלי מדגימות מים, גם כאשר מבוצע על ידי משתמשים לא מנוסים.
המשוב התקבל עד עכשיו עולה כי ריכוז נגיפי הוא תהליך קל לבצע, ללא בעיות גדולות כאשר מיושם בנקודת השימוש של דגימות, למרות 8 h ו-5 שלבים נדרשים. חשוב לציין כי צעדים אלה מתרחשים ללא סיוע אנושי. כמו-כן, שיטה מהירה יותר המבוססת על סינון מתפתחת כחלופה למים שאינם מבוססים. עם זאת, ככל הנראה, עד היום, השיטה הייחודית המאפשרת ריכוז של דגימות המציגות עכירות גבוה. מרכזים ויראליות יכול להישלח לאחר מכן לכל מעבדה ברחבי העולם בטמפרטורת החדר, אשר גם מקל על בדיקת וירוסים מאז באזורים הדגימה לא תמיד יש שירותי תחבורה טובה מתן תנאי קירור. לחילופין, פרוטוקולי החילוץ והאיתור המוצגים כאן מאפשרים בדיקה לגילוי נגיפי בנקודת השימוש בדגימות.
עד כמה שידוע לנו, זוהי השיטה הראשונה שדווחה כשימושית לריכוז ובדיקה לנוכחות וירוסים בדגימות המים בשדה. יש לנהל מאמצים נוספים כדי להחיל את ההליך על הערכת נוכחות של פתוגנים ויראליות אנושיים של עניין בכמה תרחישים אחרים של משברים הומניטאריים. כמו כן, המשוב של המשתמש יהיה נחוץ כדי לספק תובנות ליישום הפוטנציאלי כדי להפוך את ההליך לידידותי יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
וירוטסט היה פרויקט מחקר במימון תוכנית HIF (קרנות חדשנות הומניטארית) של ELHRA (שיפור הלמידה & מחקר לסיוע הומניטארי). המחברים מכירים בצוותי השטיפה שיתפו פעולה באדיבות במחקר זה. הניתוח של דגימות באקוודור המומן על ידי אוקספם אקוודור והבימוי הטוב ביותר באוניברסיטה דה לאס אמריקאס (AMB). BRT. 17.01). S. Bofill-Mas הוא בחור סרה-צייד באוניברסיטת ברצלונה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
