Summary
在这里,我们介绍VirWaTest,这是一种简单、经济、便携的方法,用于在使用时从水样中集中和检测病毒。
Abstract
当这种水用于饮用、食物灌溉、洗涤等时,人类和动物排出的病毒可能会污染水源,对人类健康构成威胁。传统的粪便细菌指标并不总是检查病毒病原体是否存在,因此病毒病原体和病毒指标的检测是相关的,以便采取降低风险的措施,特别是在人道主义情况和领域水传播病毒爆发频繁。
目前,在使用点可以进行若干允许粪便指示细菌(FIB)定量的商业测试。但是,此类商业测试不适用于病毒检测。在环境水样品中检测病毒需要将几升浓缩成更小的体积。此外,病毒的检测一旦集中,就依赖于病毒基因组的核酸提取和分子检测(例如,基于PCR的聚合酶链反应[PCR]测定)等方法。
此处描述的方法允许从 10 L 水样中浓度病毒,以及在使用时使用简单和便携式设备提取病毒核酸。这允许在使用点测试水样几种病毒,在人道主义情景以及没有设备化实验室的任何情况下都很有用。或者,该方法允许浓缩水样中的病毒,并将浓缩物运送到室温下的实验室进行进一步分析。
Introduction
在任何人道主义紧急情况的第一阶段,获得清洁水供应、环境卫生和个人卫生对于受影响者的生存至关重要。因此,监测水质是预防水传播疫情的优先事项。众所周知,受污染的水往往是疾病的根源,但往往很难确定病毒爆发的来源,如E型肝炎病毒(HEV),即使有传统的实验室方法。水质控制以FIB 1、2、3、4的量化为基础。然而,据广泛记载,FIB的缺乏与病毒性水传播病原体(如轮状病毒(RoV)、诺如病毒(NoV)或HEV5、6)的存在之间没有相关性。因此,使用基于FIB的水质标准可能导致低估与水传播病毒病原体存在相关的风险。监测指标病毒,如人类腺病毒(HAdV),或特定的病原体将有助于确定对病毒病原体的接触和确定人类感染的潜在来源7,8 9、10和在验证卫生措施的功效11。
到目前为止,在这些场景中检测病毒依赖于熟练的员工和复杂的物流。VirWaTest (virwatest.org) 旨在开发一种简单、经济、便携的方法,用于在使用时从水样中浓度和随后检测病毒。
病毒浓度基于10L水样的有机絮凝原理,通过该原理,病毒在较小的体积12、13中回收。在室温下储存不超过2周时,将絮状物收集并添加到缓冲液中,以感染病毒并防止核酸降解。
核酸提取方法基于利用磁粒子,核酸被吸附到这些颗粒上。它们可以通过粒子所连接的磁移液器从一个洗涤缓冲器转移到另一个洗涤缓冲液,最后转移到洗脱缓冲液中。获得病毒核酸悬浮液可运送到参考实验室,在那里可以使用基于PCR的分子方法进行检测。对于每个核酸萃取,测试两种不同的数量,以排除样品产生的酶抑制。或者,在设备可用性最低时,PCR 测试可以在使用点运行。整个过程设计为独立于电源执行(图1)。
一种定量PCR测定,用于检测HAdV,由人类排泄,并在高浓度的废水样品中发现,现已适应在使用点运行。HAdV被用作人类粪便病毒指标。由于 MS2 在 VirWaTest 中用作过程控制,因此还采用了用于 MS2 噬菌体定量的 PCR。该方法可以自定义,以检测任何感兴趣的病毒。
开发后,在中部非洲共和国和厄瓜多尔的两种不同环境中,用户应用了VirWaTest方法,就议定书在实际情况中的应用提供了反馈。
据我们所知,这是第一个允许在使用点集中和检测病毒的程序,独立于任何电源、大型设备和冷冻/冷却条件。建议收集每个水样本的两个副本,以获得可靠的结果。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 准备和包装
注:要包装的材料/设备列于表1。使用手套处理过程控制所需的试剂、浓缩试剂、核酸提取试剂和检测试剂。戴防护眼镜处理核酸提取所需的试剂。
- 过程控制
- 按照 ISO 程序 10705-1:199514,在实验室中制备 MS2 噬菌体培养(美国类型文化收藏 [ATCC] 15597-B1)包含 1 x 1010 PFU/mL。
- 然后,将每管含有1 x 108 PFU的悬浮液的10μL等同分放入10 mL管中,让水在37°C下蒸发。每个水样使用一管。
- 此外,准备一个管,每个收集的样品含有10 mL的无菌蒸馏水。
- 浓缩试剂
- 对于预絮凝脱脂牛奶溶液 (PSM),使用以下量浓缩 5 个 10 L 水样。
- 准备一个塑料管,里面装着5克脱脂牛奶。
- 准备一个装有16.66克海盐的拉链塑料袋。
- 准备一个塑料瓶,里面装着500 mL的蒸馏水。
- 准备 pH 调节所需的试剂。使用以下量调整 PSM 和五个 10 L 水样的 pH 值。
- 在10 mL塑料管中加入5克柠檬酸1-水合物。
注意:柠檬酸在与眼睛接触时会引起严重的刺激。如果发生这种情况,请用水小心冲洗眼睛几分钟。如果刺激持续,请寻求医疗建议。 - 将2克氢氧化钠放入10mL塑料管中。
注意:氢氧化钠可引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。如果吞咽,漱口。不要引起呕吐。如果与眼睛接触,请用水小心冲洗几分钟。然后,寻求医疗建议。 - 将25 mL的无菌蒸馏水放入塑料容器中。
- 将50 mL的无菌蒸馏水放入塑料容器中。
- 在10 mL塑料管中加入5克柠檬酸1-水合物。
- 准备用于絮凝的样品调理小袋、用于保存核酸的防腐剂溶液和中和袋,以中和丢弃的水和材料。对于要测试的每个 10 L 水样,使用以下量。
- 将15克海盐和8克柠檬酸1-水合物放入拉链塑料袋中,用于调理小袋。
- 将2 mL的液化缓冲液(材料表)和0.3 mL的核酸保鲜剂(材料表)加入5 mL管中。
注意: 莱西斯缓冲液含有瓜尼丁三聚苯酯和Triton X-100。与酸接触可释放有毒气体,如果吞咽、吸入或与皮肤接触,则有害。如果吞咽,漱口。不要引起呕吐。如果与皮肤接触,请用大量的水清洗。然后,寻求医疗建议。核酸保鲜剂引起皮肤和眼睛刺激,如果吞咽,是有害的。如果与皮肤或眼睛接触,用充沛的水冲洗几分钟。在任何情况下,特别是如果吞咽和感觉不适,寻求医疗建议。 - 将40克洗涤剂粉放入四个拉链塑料袋中。
注意:粉末洗涤剂会引起眼睛刺激。如果与眼睛接触,用充沛的水冲洗几分钟。如果刺激持续或吞咽,请寻求医疗建议。
- 对于预絮凝脱脂牛奶溶液 (PSM),使用以下量浓缩 5 个 10 L 水样。
- 核酸提取试剂
- 将50μL的磁性颗粒(材料表)和1 mL的乙醇96%放入构成结合缓冲液的5 mL管中。
注意:磁性颗粒缓冲液含有钠,当与酸或重金属离子接触时,该气体形成有毒气体,如果摄入或与皮肤接触,则有毒。如果摄入或与皮肤接触,请用丰富的水冲洗口腔或皮肤,并寻求医疗建议。乙醇是一种高度易燃的液体和蒸汽,会引起严重的眼睛刺激。远离热、热表面、火花和任何其他点火源。如果与皮肤或眼睛接触,请用丰富的水冲洗。如果摄入大量水和/或吸入,则进入室外进入新鲜空气。在任何情况下,请寻求医疗建议。 - 将500μL、600μL和200μL的洗涤缓冲液分别加入三个2 mL管中(材料表)。
注意:洗涤缓冲液含有硫化甲酸酯和氯化氯二铵,如果吸入或吞咽并刺激皮肤和眼睛,则有害。与酸接触会释放出非常有毒的气体。如果它们与皮肤或眼睛接触,请用丰富的水冲洗。如果吞咽,用充沛的水冲洗口腔。不要引起呕吐。始终寻求医疗建议。 - 将120 μL的洗脱缓冲液(材料表)添加到0.5 mL管中。
- 将50μL的磁性颗粒(材料表)和1 mL的乙醇96%放入构成结合缓冲液的5 mL管中。
- HAdV 和 MS2 检测试剂
注:如果使用8井热循环器,可在每次PCR测定中同时分析两种不同的核酸提取反应。对于所有PCR测定,制备分子生物学水,并加入1.5 mL管。-
HAdV 检测
- 制备含有10μL的22.5 μM AdF正向底漆、10μL的22.5μM AdR反向底漆和5μL的11.25μM AdP探针(表2)。
- 将2.5 μL的混合物加入管条1至8管。让它在室温下干燥,关闭管子,防止光线照射。
- 将条条分成两条:管1-5和管6-8。
- 准备一次连续稀释含有扩增HAdV区域核苷酸序列的DNA悬浮液。风干 1 μL 的悬浮液,包含1 x 10 5、1 x 107和 1 x 109 GC/mL 到管 6-8。
注:保持含有底漆、探头和风干悬架的管材免受光线照射。
-
MS2 检测
- 制备含有10μL的25μM pecson-2F正向底漆,10μL的25μM pecson-2R反向底漆,以及2.5μL的25μM PecP-2探针(表2)。
- 将2.25 μL的混合物加入管条1至8管。让它在室温下干燥,关闭管子,防止光线照射。
- 将条条分成两条:管1-5和管6-8。
- 按照步骤 1.4.1.4 中执行,但改用专为 MS2 设计的标准悬架。
-
HAdV 检测
2. 病毒浓度
注意:在样品收集、试剂制备、絮凝、絮状收集以及废物处理过程中,应时刻使用手套。在试剂制备过程中佩戴防护眼镜。
- 样本收集
- 在带盖子的平底桶中收集 10 L 水样。为每个示例至少收集两个复制。
注:使用透明铲斗来可视化颗粒非常重要。如果水样含有悬浮物(如沙、藻类),让它沉淀,然后,将水上清液收集到新的水桶中。 - 为每个水样登记收集的体积以及位置和收集日期。
- 将连接到电池的磁性搅拌器放在铲斗支架下,并将装有水样本的铲斗放在支架上。
注:在新鲜的地方寻找平坦的表面,并保持装有水样的水桶免受阳光直射。
- 在带盖子的平底桶中收集 10 L 水样。为每个示例至少收集两个复制。
- 试剂制备
-
pH 调整试剂
- 将柠檬酸粉和氢氧化钠颗粒分别倒入含有25和50 mL蒸馏水的罐中。
- 轻轻握手,直到柠檬酸和氢氧化钠完全溶解。
注意:不要将水倒在氢氧化钠颗粒上。相反,将氢氧化钠颗粒倒在水面上。
-
预絮脱脂牛奶
- 将立袋放在磁性搅拌器上,倒入 500 mL 蒸馏水。将搅拌磁铁滴在袋子内,然后打开磁力搅拌器。
- 将海盐小袋和脱脂奶管中的内容倒入站立袋中,以中等速度搅拌 5 分钟以溶解。
- 使用巴斯德移液器向 PSM 溶液中加入 3 mL 柠檬酸,以确保 pH 介于 3.4 和 3.6 之间。使用 pH 指示器条测量 PSM 解决方案的 pH 值。随着pH值接近3.5,加入少量的柠檬酸和氢氧化钠。
- 关闭磁力搅拌器,确保絮状物可见。使用手电筒帮助可视化絮状物。
-
pH 调整试剂
- 絮 凝
- 将搅拌磁铁放入水中,以最大速度设置磁力搅拌器,然后将其打开。确保搅拌磁铁开始旋转。
- 将 10 mL 蒸馏水添加到过程控制管中。倒置管子几次,使病毒储存物重新水化,并将溶液倒入水中。
- 将一个样品调理袋的内容倒入水中,搅拌 5 分钟。
- 使用 pH 指示器条测量水样品的 pH 值。在水样中加入几滴柠檬酸或氢氧化钠,以确保pH值在3.4至3.6之间。随着pH值接近3.5,加入少量的柠檬酸和氢氧化钠。
- 使用 100 mL 容器添加 100 mL 的 PSM 解决方案。
- 用盖子密封铲斗,以最小速度设置磁力搅拌器,让水搅拌 8 小时。
- 关闭磁力搅拌器,让水静静至少 5 小时,让絮凝器稳定下来。
- 弗洛克收藏
- 建立一个由移液器控制器、两个移液器和一个塑料管组成的虹吸系统,吸水上清液,在絮状物上排放水。
- 将 10 mL 磁带端移液器连接到移液器控制器。然后,将移液器的尖端连接到塑料管上。
- 使用钳子拆下 10 mL 开端移液器的过滤器,并将移液器连接到塑料管上。
- 将空桶放在地板上。
- 将开端移液器的尖端浸入水中。确保它靠近水面,以免干扰浮游。吸水上清液,直到它到达胶带端移液器。
- 用末端夹住塑料管,然后将其从移液器上分离。
- 将管子放入空桶中。释放管上的压力,让水流入空桶。
- 当水位即将到达搅拌磁铁时,捏住塑料管以停止水流,并将移液器移离水桶。
- 摇动水桶,重新悬挂絮凝物,然后倒入 500 mL 的站立式塑料袋中。让絮游物再沉淀1小时。
- 使用 50 mL 移液器和手动移液器控制器小心吸水上清液,避免干扰絮状物。
- 使用 100 mL 移液器吸气浮游,并将其转移到 50 mL 分级离心管中。记下样品浓缩物的最终体积,并使用巴斯德移液器将其转移到含有防腐剂溶液的5 mL管中。
注:重要的是,离心机管是GRADUATED,以便浓缩样品的最终体积可以尽可能准确地测量和登记。 - 在现场进行核酸提取。或者,将含有病毒的防腐剂溶液储存在20-30°C长达15天,或将其运送到参考实验室作进一步分析。
- 建立一个由移液器控制器、两个移液器和一个塑料管组成的虹吸系统,吸水上清液,在絮状物上排放水。
- 废物处理和材料再利用
- 将中和剂袋的内容添加到包含废弃水的桶中。混合水,然后,保持它仍然30分钟。
- 将处理后的水作为一般废物处理。
- 将移液器和塑料管放入铲斗内。将水倒入水桶中,倒入一个中和剂小袋的内装物。
- 清洗它们至少30分钟,消毒,用丰富的清水冲洗,以去除任何剩余的中和剂。
3. 核酸提取
注意:在核酸提取过程中,使用手套并始终佩戴防护眼镜。
-
磁移液器操作
- 在执行萃取之前,熟悉磁移液器的操作。
-
核酸提取
- 从左到右,将含有提取所需的试剂的管子排列在机架中:结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。根据要分析的样本或复制的数量设置适当的管数。
- 使用一次性巴斯德移液器将1 mL样品浓缩液转移到含有结合缓冲液的管中。将管8倍反转至10倍,使溶液均质化。
- 在室温下孵育溶液10分钟,同时持续混合,使用太阳能轨道或手动。
- 使用磁性移液器和清洁尖端收集磁性颗粒,可再用于三个洗涤缓冲液。
- 将磁性颗粒释放到含有500 μL洗涤缓冲液1的管中。用30s的尖端轻轻摇动溶液,然后收集它们,然后清洗。
- 将磁性颗粒转移到含有600 μL洗涤缓冲液2的管中。用30s的尖端轻轻摇动溶液,然后收集它们,然后清洗。
- 将磁性颗粒转移到含有200 μL洗涤缓冲液3的管中。用30s的尖端轻轻摇动溶液,然后收集它们,然后清洗。
- 将磁性颗粒释放到含有洗脱缓冲液的管中,然后丢弃尖端。
- 使用太阳能轨道在室温下孵育溶液5分钟,同时持续混合。
注:在洗脱缓冲液中混合磁性颗粒是关键步骤。在缺乏轨道的情况下,在孵育期间不断用手混合。 - 用新吸管更换磁液器上的尖端,并从洗脱缓冲液中收集磁性颗粒。确保从洗脱缓冲液中完全去除磁性颗粒,因为它们会干扰分子检测方法。
- 丢弃带有粒子的尖端。继续进行 PCR 分析,将洗脱缓冲液运送到参考实验室,或将洗脱缓冲液储存在 4°C 下进行进一步分析。
4. 使用电池操作的八管实时热循环器进行病毒检测
注意:在核酸检测过程中,使用手套并始终佩戴防护眼镜。在进行新的 PCR 实验时,更换新手套,以避免交叉污染。
-
哈德维定量PCR
- 将14μL的无核酸酶水加入管2、4和5。
- 将4μL的PCR混合物加入管1-5。
- 从样品A到管1加入14μL的核酸萃取,从样品B到管3加入14μL。
- 从样品A到管2和2μL从样品B到管4加入2μL提取的核酸。关闭五管条。
- 将14μL的无核酸酶水加入管6、7和8。
- 将4μL的混合物加入管6、7和8,并关闭它们。
- 将两个条带放入热循环器并选择适当的运行(表 3)。
- 如果可能,丢弃水管并将提取的核酸保存在冷冻室中,如果可能,则保存在一个防光的新鲜地方,以防需要进行第二次测试。
- 用核酸清洁剂正确清洁微液管、机架、工作材料和所有材料,并丢弃包含用过的吸头、手套和管子的塑料袋。
注意:核酸去除剂是一种非常易燃的液体和蒸汽。请勿吸入喷雾剂,避免液体与眼睛或皮肤接触。否则,立即用充沛的水冲洗,并寻求医疗建议。 - 收集结果并分析获得的数据。
-
MS2 定量 PCR
- 将14μL的无核酸酶水加入管2、4和5。
- 在1-5管中加入4μL的PCR混合物和0.5μL的逆转录酶酶。
- 从样品A到管1加入14μL的核酸萃取,从样品B到管3加入14μL。
- 从样品A到管2和1μL从样品B到管4添加1μL的提取核酸。关闭五管条。
- 将15.5 μL的无核酸酶水加入管5、6、7和8,并关闭它们。
- 在管6、7和8中加入4μL的PCR混合物和0.5μL的逆转录酶酶。
- 将两个条带放入热循环器并选择适当的运行(表 3)。
- 按照步骤 4.1.8 到 4.1.10 中所述继续。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
方法开发
这一程序是在GenIUL和乐施会的实验室开发的。它包括三个不同的步骤。第一种是病毒颗粒浓度,是以前描述的脱脂牛奶絮凝法的改编方法。原始方法被修改为独立于电源,更简单,并且没有离心步骤。
在HAdV和MS2噬菌体尖层地下水样品中测试了VirWaTest浓度法的回收。对MS2的VirWaTest浓度和提取方法的病毒回收率估计为3.01%至18.02%,对HAdV的病毒回收率为17.52%至44.22%。这些回收是根据在开发方法期间通过定量PCR获得的值计算的,比较了水样中HAdV和MS2的初始浓度,后用这些病毒储存的已知浓度进行喷窥。
VirWaTest 磁性核酸提取与商用RNA微型试剂盒(例如,QIAamp病毒RNA迷你试剂盒)进行了比较,这是实验室使用的一种基于柱的提取方法,通过测试33个河和地下水样本,这些样品与HAdV和MS2一起加尖,并浓缩通过脱脂牛奶絮凝。比较结果表明,在23/33例中,HAdV和MS2的VirWaTest方法恢复率较高(表4)。威尔科森测试显示,HAdV 的p值为 0.0005569,MS2 为 0.02791。VirWaTest核酸提取提供明显高于商业的病毒回收率。
VirWaTest方法集中的环境水样品中HAdV的检测
为了测试该领域开发的病毒浓缩方法,乐施会水、环境卫生和个人卫生 (WASH) 团队于 2017 年 3 月从 5 口井水样本中收集并浓缩了病毒。
此外,在2016年和2017年受地震影响的Pedernales(厄瓜多尔)地区,乐施会工作组于2017年2月收集了6口井水样本,其病毒通过VirWaTest浓度方法集中。两种环境中的病毒浓缩物被送往巴塞罗那的实验室进行VirWaTest核酸提取和病毒定量。
在厄瓜多尔,在所分析的6个样本中,有6个样本检测到了自然产生的HAdV,浓度值从3.27 x 101到1.80 x 102 GC/L,而在收集的5个样本中,有1个样本被检测并集中在Banghi(RCA)中HAdV 为正,浓度为 3.46 x 102 GC/L (表 5)。
MS2 作为内部过程控制添加到所有测试样本中,在所有测试的样品中检测到,表明该方法在浓度到检测过程中都正确执行。
图 1:VirWaTest 方法。VirWaTest 方法的步骤概述。请点击此处查看此图的较大版本。
| 材料 | 浓度 | 核酸提取 | 检测 |
| 设备 | 磁敏器(2 台) 电池 (2 单位) 电池/斯特尔连接器(2 个单元) 电源适配器(2 个单元) 铲斗支持(2 个单元) 绳索 (1 单元) 搅拌磁铁 (3 单位) 钳子(1个单元) 硅管 (1 单元) 移液器控制器(1 个单元) 标记 (1 单元) |
磁性移液器(1 单元) 太阳能旋转平台(1单元) 多尺寸管架(1 个单元) 定时器(1 个单元) |
热循环器(1 个单元) 电池(1 个单元) 计算机 管架(1 个单元) 0.5 μL - 10 μL 微移液器 (1 单元) 2 μL - 20 μL 微移液器 (1 单元) |
| 消耗品和试剂(每 2 个水样/复制品) | 铲斗 (3 单位) pH 指示器条 胶带端 10 mL 移液器 (2 单元) 开式提示 10 mL 移液器 (2 单元) 胶带端 50 mL 移液器 (2 单元) 胶带端 100 mL 移液器 (2 单元) 巴斯德移液器 (4 单元) 立式塑料袋(4个单元) 带 25 mL 蒸馏水的塑料容器(1 个单元) 带 50 mL 蒸馏水的塑料容器(1 个单元) 100 mL 空容器(1 个单元) 手套 (6 对) 过程控制 (2 管) 带 10 mL 蒸馏水的管子(2 个单位) 柠檬酸 (1 管) 氢氧化钠(1管) 脱脂牛奶 (1 管) 柠檬酸袋 (1 单位) 蒸馏水(1 500 mL 瓶) 样品调节(2个袋) 防腐剂溶液(2管) 中和剂(4个囊袋) |
磁性移液器提示 (2 单元) 巴斯德移液器 (2 单元) 装订缓冲器 (2 管) 洗涤缓冲液 1 (2 管) 洗涤缓冲液 2 (2 管) 洗涤缓冲液 3 (2 管) 洗脱缓冲液(2管) 手套 (6 对) |
10 μL 微吸管尖端(1 盒) 20 μL 微吸管尖端(1 盒) DNA qPCR 混合 (1 管) RNA qPCR 混合物 (1 管) 逆转录酶 (1 管) 分子生物学水 (1 管) 带引体、探头和标准(1 个单元)的 HAdV 管条 MS2 管带,带底漆、探头和标准(1 个单元) 核酸去除剂 手套 (6 对) |
表 1:VirWaTest 内容。设备、消耗品和试剂,必须准备用于在两个水样/复制中浓度、提取和检测病毒。
| 病毒 | 引 | 根银行加入号 | 位置 | 序列 (5'\u20123') | 长度 | 参考 | ||
| 人类腺病毒 (HAdV) | Adf | J01917.1 | 18869\u201218887 | 中联部 | 19 | 赫恩罗特等人,2002年15 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | CRCGCRAAYTGCAG | 19 | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGCTCAGGTCCGGCGTT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| MS2噬菌体 (MS2) | 佩克森-2F | NC_001417.2 | 344\u2012363 | AAGGTGCCTACAGCAGT | 20 | 佩克森等人, 200916 | ||
| 佩克森-2R | 659\u2012678 | TTCGTTAGGGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG | 20 | |||||
| 佩奇-2 | 369\u2012388 | 6-FAM-ATCGGGGGTCCGG-BHQ-1 | 20 | |||||
表2:定量PCR实验的寡核苷酸。引基器和探针设计用于与HAdV和MS2的核酸序列结合。
| 温度 | 时间 | 周期 | 温度 | 时间 | 周期 |
| 95 °C | 12分钟 | 1 | 55 °C | 15分钟 | 1 |
| 95 °C | 10分钟 | 1 | |||
| 95 °C | 15 s | 40 | 95 °C | 15 s | 40 |
| 60 °C | 1 分钟 | 60 °C | 1 分钟 |
表3:定量PCR实验的热条件。用于 HAdV 和 MS2 放大的温度、时间和周期。
| QIAgen | 维尔瓦泰斯特 | QIAgen | 维尔瓦泰斯特 | ||
| 平均 | 2.53 x 103 | 2.43 x 103 | 4.74 x 104 | 5.13 x 104 | |
| 意味 着 | 1.74 x 104 | 3.12 x 104 | 4.24 x 104 | 5.97 x 104 | |
| Sd | 5.66 x 105 | 2.23 x 106 | 4.49 x 104 | 1.63 x 105 | |
| HAdV 的 p 值(威尔科森):0.0005569 | |||||
| MS2 的 p 值(威尔科森):0.02791 | |||||
| 病毒测试 | 样品测试 | QIAgen | 维尔瓦测试 | ||
| 哈德夫 | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
表4:VirWaTest核酸提取发育。在33个地下水样本中比较HAdV和MS2的Qiagen和VirWaTest提取方法时,获得中值、均值和SD值。
| 国家 | 网站 | 样品 | 哈德V GC/L |
| Rca | 索迪卡 | 1 | ND |
| 伊莱邦戈苏亚,1号村 | 2 | ND | |
| 伊莱邦戈苏亚,3号村 | 3 | ND | |
| 班吉, 普伊茨夸蒂埃·丰多 | 4 | ND | |
| 班吉, 普伊茨夸蒂尔·扬巴萨 | 5 | 3.64 x 102 | |
| 厄瓜多尔 | 孔 A | 6 | 7.96 x 101 |
| 孔 B | 7 | 1.80 x 102 | |
| 孔 C | 8 | 8.88 x 101 | |
| 井水 A | 9 | 6.06 x 101 | |
| 井水 B | 10 | 1.12 x 102 | |
| 井水 C | 11 | 3.27 x 101 |
表5:使用VirWaTest方法量化HAdV。在从RCA和厄瓜多尔采集并集中的水样中量化的HAdV定量PCR结果,以GC/升表示。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VirWaTest 方法使未经经验的用户在使用时能够从水样中浓度病毒和核酸。这是一个经济实惠,快速,简单的协议。浓度基于使用脱脂牛奶的有机絮凝原理,通过低pH值和高电导率条件使脱脂牛奶蛋白聚合成絮状物,病毒吸附到。当浮游沉积物时,很容易收集它们,从而有可能浓缩10 L的水,而传统的超离心不能处理大量的水量。
该方法经过修改,在采样点可行,无需使用任何电气设备,电池供电的磁力搅拌器除外。基于水过滤的一些其他方法已经适应了病毒的浓度,也可以在使用点进行。然而,水样中的悬浮材料经常堵塞过滤器;因此,可能集中于这些系统的小体积是一个严重的限制。
这是使用点从水样集中病毒的方法的第一个描述,无论样品的浊度如何。VirWaTest 浓度方法允许在有适当材料可用时同时处理多个样品。此外,脱脂牛奶絮凝已被证明对细菌和寄生虫浓度19有用。
准备适当的材料对于正确执行程序至关重要。考虑要分析的水样数量,并准备试剂和材料,然后再移动到需要测试的地方制备试剂和材料。如果可用适量的材料,可以同时处理多个样品。
在开始水样浓度之前,病毒库的已知浓度将用于将样品作为过程控制。该方法使用干燥的病毒储存,在使用时加入水样之前,先用蒸馏水补充水分。这对于在过程结束时排除假负结果非常有用,并指示该方法的性能。
使用VirWaTest获得的病毒浓缩物可在应用VirWaTest核酸提取和检测方法的实地进行进一步测试,或者,浓缩物可在室温下送往参考实验室。添加到浓缩物中的防腐剂溶液使病毒能够稳定长达 2 周(未公布结果)。
VirWaTest核酸提取是一种基于磁性颗粒的方法。它简单快捷,允许同时处理多个样品,与目前用于病毒核酸提取的方法相比,具有同等的恢复效率。核酸可在室温下送到参考实验室,或者,如果用户有信心进行分子检测,可以在原始水样使用点进行定量PCR测定。
此外,如果小型实验室设施可用,VirWaTest 浓度协议可与标准核酸提取试剂盒耦合,该试剂盒依赖于离心机和基于 PCR 的标准方法,这些方法需要冷冻机来维护试剂,但使用标准热循环器,比电池供电的便宜。
然而,由于电源有时不可用,我们优化了MS2噬菌体作为过程控制和HAdV作为病毒粪便指标的检测检测方法,并且该方法可以针对任何其他感兴趣的病毒(如肝炎)进行定制病毒、RoV、NoV 或其他病毒,无需冷冻机即可在现场运行,无需冷冻机来维护试剂,也不需要传统的热循环器,而只需电池供电的。一些电池供电的热循环器在市售。或者,如果电源可用,可以使用其他常规 qPCR 设备。如果使用八管热循环器,则在同一 PCR 测定中可以测试最多两个核酸萃取(两个不同的样品或同一样品中的两个复制)。对于每个核酸萃取,将测试两种不同的数量,以排除样品产生的酶抑制。该自适应基于先前通过空气干燥引材、探头和标准悬架制备的 PCR 管。存在几种冻干商业qPCR溶液,可以通过应用与此处描述相同的程序来使用。我们描述了一种我们认为易于执行的可能性。
该方法开发过程中进行的比较测定表明,VirWaTest的浓度、提取和检测方法对水样病毒的定量是有效的。
所述过程的检测(LOD)是可变的,因为浓度后收集的体积是可变的。此外,LOD 对于不同的病毒可能略有不同。如果收集约 10 L 的体积,则 HAdV 的 LOD 约为 1 x 102病毒 GC/L。因此,使用 VirWaTest 方法可以检测到相对较小的 HAdV 浓度。在Pedernales(厄瓜多尔),在测试的6个样本中,有6个样本的浓度接近LOD,浓度从3.27 x 101到1.80 x 102 GC/L不等。在邦吉(RCA),在分析的5个样本中,有1个样本检测到HAdV,浓度为3.46 x 102 GC/L。HAdV 的存在,以及 MS2 作为测试样本中的控制过程的存在,表明该方法对于从水样本中回收病毒颗粒非常有用,即使由无经验用户执行。
到目前为止获得的反馈表明,病毒浓度是一个容易执行的过程,在样品使用点应用时没有重大问题,尽管需要8小时和5小时步骤。必须指出,这些步骤是在没有任何人的援助的情况下发生的。此外,正在开发一种基于过滤的更快方法,作为非扰水的替代品。然而,到目前为止,絮凝似乎是允许高度浊度样品浓度的独特方法。然后,病毒浓缩物可在室温下送往世界各地的任何实验室,这也使得测试病毒变得更加容易,因为取样区并不总是有良好的运输服务,提供冷却条件。或者,此处提供的提取和检测协议允许在样品的使用点进行病毒检测测试。
据我们所知,这是第一个报告对在水样中检测病毒的方法有用的方法。应作出进一步努力,将这一程序应用于评估其他几个人道主义危机情景中有关人类病毒病原体的存在。此外,用户的反馈对于提供潜在实现的见解,以使过程更加友好,还需要用户的反馈。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
VirWaTest是一个研究项目,由ELHRA(加强人道主义援助的学习和研究)HIF(人道主义创新基金)方案资助。作者感谢WASH团队在这项研究中进行了友好合作。厄瓜多尔的样品分析由厄瓜多尔乐施会和美洲大学调查局资助。BRT.17.01)S.Bofill-Mas是巴塞罗那大学的塞拉-亨特研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
