Summary
Her præsenterer vi VirWaTest, som er en enkel, overkommelig og bærbar metode til koncentration og påvisning af vira fra vandprøver på tidspunktet for brug.
Abstract
Vira, der udskilles af mennesker og dyr, kan forurene vandkilder og udgøre en risiko for menneskers sundhed, når dette vand bruges til drikke, vanding af fødevarer, vask osv. Den klassiske fækale bakterie indikator kontrollerer ikke altid for tilstedeværelsen af virale patogener, så påvisning af virale patogener og virale indikatorer er relevant for at vedtage foranstaltninger til risikoreduktion, især i humanitære scenarier og i områder hvor der hyppigt anvendes vandbårne virus udbrud.
På nuværende tidspunkt er flere kommercielle tests, der gør det muligt at kvantificere fækale indikatorbakterier (FIB), tilgængelige til testning på brugsstedet. Sådanne kommercielle tests er dog ikke tilgængelige til påvisning af vira. Påvisning af vira i miljømæssige vandprøver kræver at koncentrere flere liter i mindre mængder. Når det er koncentreret, er påvisning af vira desuden afhængig af metoder som nukleinsyre ekstraktion og molekylær detektion (f. eks. polymerasekæde reaktion [PCR]-baserede assays) af de virale genomer.
Den beskrevne metode gør det muligt at koncentrationen af vira fra 10 L vandprøver, samt udvinding af virale nukleinsyre på tidspunktet for brug, med enkle og bærbare udstyr. Dette gør det muligt at afprøve vandprøver på anvendelsesstedet for flere vira og er nyttige i humanitære scenarier, samt i enhver sammenhæng, hvor et udstyret laboratorium ikke er til rådighed. Alternativt, metoden tillader koncentrering vira til stede i vandprøver og forsendelse af koncentrat til et laboratorium ved stuetemperatur til yderligere analyse.
Introduction
I de første faser af en humanitær nødsituation er adgang til rent vandforsyning, sanitet og hygiejne afgørende for de berørte. Derfor er overvågning af vandkvaliteten en prioritet for at forebygge vandbårne udbrud. Det er velkendt, at forurenet vand ofte er oprindelsen af sygdomme, men det er ofte vanskeligt at bestemme kilderne til virus udbrud såsom hepatitis E virus (HEV), selv med tilgængeligheden af konventionelle laboratoriemetoder. Kontrollen af vandkvaliteten er baseret på kvantificeringen af FIB1,2,3,4. Det er imidlertid blevet udførligt dokumenteret, at der ikke er nogen sammenhæng mellem fraværet af FIB og tilstedeværelsen af virale vandbårne patogener som rotavirus (RoV), norovirus (NoV), eller HEV5,6. Anvendelse af vandkvalitets kriterierne baseret på FIB kan således resultere i en undervurdering af risiciene i forbindelse med tilstedeværelsen af vandbårne virale patogener. Overvågning af indikator vira, såsom humane adenoviruser (hadv), eller specifikke patogener ville være nyttigt til at definere eksponeringen for virale patogener og identificere den potentielle kilde til infektion med mennesker7,8, 9,10 og validering af effektiviteten af sanitets foranstaltninger11.
Indtil nu har påvisning af vira i disse scenarier været baseret på faglært personale og kompleks logistik. VirWaTest (virwatest.org) har til formål at udvikle en enkel, overkommelig og bærbar metode til koncentration og efterfølgende påvisning af vira fra vandprøver på brugsstedet.
Virus koncentrationen er baseret på princippet om organisk flokkulering af 10 L vandprøver, hvormed vira genvindes i mindre volumener12,13. Partikler er indsamlet og føjet til en buffer, der af virus og forhindrer nukleinsyre syrer fra nedbrydning, når de opbevares ved stuetemperatur i ikke mere end 2 uger.
Nukleinsyre ekstraktionsmetoden er baseret på brugen af magnetiske partikler, som nukleinsyrer får adsorbet. De kan overføres fra en vaskebuffer til en anden og endelig ind i elueringsbufferen ved hjælp af en magnetisk pipette, som partiklerne binder til. De opnåede virale nukleinsyre-suspensioner kan sendes til et referencelaboratorium, hvor detektionsmetoden kan udføres ved hjælp af molekylære metoder baseret på PCR. For hver nukleinsyre ekstraktion testes to forskellige mængder for at udelukke enzymatisk hæmning, der stammer fra prøven. Alternativt kan PCR-tests med minimal udstyrs tilgængelighed køres på brugsstedet. Hele processen er konstrueret til at blive udført uafhængigt af en strømforsyning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analyse til påvisning af HAdV, der udskilles af mennesker og findes i spildevands prøver i høje koncentrationer, er blevet tilpasset til at blive kørt på anvendelsesstedet. HAdV anvendes som humane fækale virale indikatorer. En PCR til kvantificering af MS2 bakteriophage er også blevet tilpasset, da MS2 anvendes i VirWaTest som proceskontrol. Metoden kan tilpasses til påvisning af eventuelle virus af interesse.
Efter udvikling, den VirWaTest metode er blevet anvendt af brugerne i to forskellige indstillinger i Republikken central Afrika (RCA) og Ecuador, giver feedback om anvendelsen af protokollen i reelle situationer.
Til vores viden, dette er den første procedure, der giver mulighed for koncentration og påvisning af virus på tidspunktet for brug, uafhængigt af enhver strømforsyning, stort udstyr, og frysning/køling betingelser. Det anbefales at indsamle to replikater af hver vandprøve for at opnå solide resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring og emballering
Bemærk: de materialer/det udstyr, der skal pakkes, er anført i tabel 1. Brug handsker til at håndtere de reagenser, der kræves til proceskontrol, koncentrations reagenser, nukleinsyre ekstraktions reagenser og detektionsreagenser. Bær beskyttelsesbriller til at håndtere de reagenser, der kræves til nukleinsyre ekstraktion.
- Proceskontrol
- Forbered MS2 bakteriophage bestand kultur (American type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) indeholdende 1 x 1010 PFU/ml i laboratoriet ved at følge ISO-proceduren 10705-1:199514.
- Derefter alikvot 10 μl suspension pr. rør indeholdende 1 x 108 PFU i 10 ml rør og lad vandet fordampe ved 37 °c. Brug et rør pr. vandprøve.
- Derudover forberedes en slange indeholdende 10 mL sterilt destilleret vand pr. udtaget prøve.
- Koncentrations reagenser
- For den prælokerede skummetmælks opløsning (PSM) anvendes følgende mængder til at koncentrere 5 10 L vandprøver.
- Der forberedes en plastikslange med 5 g skummetmælk.
- Forbered en lynlås plastikpose indeholdende 16,66 g havsalte.
- Forbered en plastikflaske indeholdende 500 mL destilleret vand.
- Forbered de reagenser, der kræves til justering af pH. Brug følgende beløb til at justere pH-værdien af PSM og 5 10 L vandprøver.
- Tilsæt 5 g citronsyre 1-hydrat til en 10 mL plastikslange.
Forsigtig: citronsyre forårsager alvorlig irritation, når det kommer i kontakt med øjnene. Hvis dette sker, skylles øjet forsigtigt med vand i flere minutter. Hvis irritationen fortsætter, skal du søge læge. - Sæt 2 g natriumhydroxid i et 10 mL plastrør.
Forsigtig: natriumhydroxid kan forårsage alvorlige forbrændinger af huden og øjenskader. Skyl munden, hvis den sluges. Fremkald ikke opkastning. Hvis det kommer i kontakt med øjnene, skylles forsigtigt med vand i flere minutter. Søg derefter læge. - Læg 25 mL sterilt destilleret vand i en plastikbeholder.
- Sæt 50 mL sterilt destilleret vand i en plastikbeholder.
- Tilsæt 5 g citronsyre 1-hydrat til en 10 mL plastikslange.
- Forbered prøve konditionerings brevet, der anvendes til flokkulering, den konserverings opløsning, der anvendes til at bevare nukleinsyrer, og den neutraliserende pose for at neutralisere det kasserede vand og materialer. Brug følgende beløb for hver 10 L vandprøve, der skal testes.
- Put 15 g havsalte og 8 g citronsyre 1-hydrat i en lynlås plastikpose til konditionering brev.
- Der tilsættes 2 mL lysis-buffer (tabel over materialer) og 0,3 ml nukleinsyre konserveringsmiddel (tabel over materialer) til et 5 ml rør.
Forsigtig: lysis buffer indeholder guanidin thiocyanat og Triton X-100. Kontakt med syre frigør giftig gas, og det er skadeligt, hvis det indtages, inhaleres, eller kommer i kontakt med huden. Skyl munden, hvis den sluges. Fremkald ikke opkastning. Hvis det kommer i kontakt med huden, vaskes med rigeligt vand. Søg derefter læge. Nukleinsyre konserveringsmiddel forårsager hud-og øjenirritation og er skadelig ved indtagelse. Hvis det kommer i kontakt med huden eller øjnene, skylles med rigelige vand i flere minutter. I alle tilfælde, især ved indtagelse og utilpashed, Søg lægelig rådgivning. - Sæt 40 g vaskemiddel pulver i fire lynlås plastikposer.
Forsigtig: pulver vaskemiddel forårsager øjenirritation. Hvis det kommer i kontakt med øjnene, skylles med rigelige vand i flere minutter. Hvis irritationen varer ved, eller hvis de sluges, skal de søge læge.
- For den prælokerede skummetmælks opløsning (PSM) anvendes følgende mængder til at koncentrere 5 10 L vandprøver.
- Reagenser til nukleinsyre ekstraktion
- Der sættes 50 μL magnetiske partikler (tabel over materialer) og 1 ml ethanol 96% i et 5 ml rør, som udgør bindings bufferen.
Forsigtig: de magnetiske partikler buffer indeholder natriumazid, som danner en giftig gas, når det kommer i kontakt med syrer eller tungmetaller ioner og er giftigt, hvis indtages eller når det kommer i kontakt med huden. Hvis du indtages eller er i kontakt med huden, skyl munden eller huden med rigeligt vand og Søg læge. Ethanol er en meget Brandfarlig væske og damp og forårsager alvorlig øjenirritation. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister og enhver anden antændelseskilde. Hvis det kommer i kontakt med huden eller øjnene, skylles med rigelige vand. I tilfælde af indtagelse af store mængder vand og/eller ved indånding, gå udenfor i den friske luft. Under alle omstændigheder, søge læge. - Tilsæt 500 μL, 600 μL og 200 μL vaske buffere 1, 2 og 3, henholdsvis (tabel over materialer), til tre 2 ml rør.
Forsigtig: vaske buffere indeholder guanidinium thiocyanat og guanidiniumchlorid, som er skadelige ved indånding eller indtagelse og irriterer hud og øjne. Kontakt med syrer frigiver meget giftig gas. Hvis de kommer i kontakt med huden eller øjnene, skylles med rigelige vand. Ved indtagelse skylles munden med rigeligt vand. Fremkald ikke opkastning. Søg altid lægelig rådgivning. - Der tilsættes 120 μL elueringsbuffer (tabel over materialer) til et 0,5 ml rør.
- Der sættes 50 μL magnetiske partikler (tabel over materialer) og 1 ml ethanol 96% i et 5 ml rør, som udgør bindings bufferen.
- Reagenser til påvisning af HAdV og MS2
Bemærk: to forskellige nukleinsyre ekstraktions reaktioner kan analyseres samtidigt i hver PCR-analyse, hvis der anvendes en 8-brønd termocycler. For alle PCR-assays forberedes Molekylærbiologisk vand til 1,5 mL rør.-
Påvisning af HAdV
- Der fremstilles en blanding med 10 μL 22,5 μM AdF fremad primer, 10 μL 22,5 μM AdR reverse primer og 5 μL 11,25 μM AdP-sonde (tabel 2).
- Tilsæt 2,5 μL af blandingen til rør 1 til 8 af en tube Strip. Lad det tørre ved stuetemperatur, lukke rørene, og holde dem beskyttet mod lyset.
- Skær strimlen opdele den i to strimler: rør 1-5 og rør 6-8.
- Forbered en seriel fortynding af DNA-suspensioner, der indeholder nukleotidsekvensen af den forstærkede HAdV-region. Lufttørre 1 μL suspensioner indeholdende 1 x 105, 1 x 107og 1 x 109 GC/ml i rør 6-8.
Bemærk: Opbevar rørene med primere, sonde og luft tørrede opslæmninger beskyttet mod lys.
-
MS2 registrering
- Der fremstilles en blanding med 10 μL 25 μM pecson-2F Forward primer, 10 μL 25 μM pecson-2R omvendt primer og 2,5 μL 25 μM PecP-2 sonde (tabel 2).
- Tilsæt 2,25 μL af blandingen til rør 1 til 8 af en tube Strip. Lad det tørre ved stuetemperatur, lukke rørene, og holde dem beskyttet mod lyset.
- Skær strimlen opdele den i to strimler: rør 1-5 og rør 6-8.
- Fortsæt som i trin 1.4.1.4, men brug en standard affjedring, der er designet til MS2 i stedet.
-
Påvisning af HAdV
2. viral koncentration
Bemærk: brug handsker på alle tidspunkter under prøveindsamlingen, reagens præparatet, flokkulering, partikler-opsamling og procedurer for bortskaffelse af affald. Bær beskyttelsesbriller under reagens tilberednings proceduren.
- Prøve samling
- Saml en 10 L vandprøve i en flad bund spand med et låg. Saml mindst to replikater for hver prøve.
Bemærk: det er vigtigt at bruge klare spande til at visualisere pellet. Hvis vandprøven indeholder suspenderet materiale (f. eks. sand, alger), så lad det sediment og saml derefter vand supernatanten i en ny spand. - Registrer den indsamlede mængde samt placering og indsamlingsdato for hver vandprøve.
- Sæt en magnetisk omrører tilsluttet et batteri under en spand støtte og placere spanden indeholder vandprøve på sin støtte.
Bemærk: Se efter en flad overflade på et frisk sted og hold spande, der indeholder vandprøverne fra direkte sollys.
- Saml en 10 L vandprøve i en flad bund spand med et låg. Saml mindst to replikater for hver prøve.
- Klargøring af reagenser
-
reagenser til pH-justering
- Hæld citronsyre pulveret og natriumhydroxid pellets i potterne indeholdende henholdsvis 25 og 50 mL destilleret vand.
- Ryst forsigtigt med hånden, indtil citronsyre og natriumhydroxid er helt opløst.
Forsigtig: Hæld ikke vandet over natriumhydroxid pellets. Hæld i stedet natriumhydroxid pellets over vandet.
-
Prælokeret skummetmælk
- Anbring en stand-up taske på en magnetisk omrører og hæld 500 mL destilleret vand i den. Slip en omrørings magnet inde i posen og tænd magnetomrører.
- Hæld indholdet af et brev af havsalt og et skummetmælks rør i stand-up-posen og rør i 5 min ved medium hastighed for at opløse dem.
- Der tilsættes 3 mL citronsyre til PSM-opløsningen ved hjælp af en Pasteur-pipette for at sikre, at pH-værdien ligger mellem 3,4 og 3,6. Mål pH-værdien af PSM-opløsningen ved hjælp af pH-indikator strimler. Tilsæt mindre mængder citronsyre og natriumhydroxid, da pH nærmer sig 3,5.
- Sluk for magnetomrører og sørg for, at partikler er synlige. Brug en lommelygte til at hjælpe med at visualisere flocs.
-
reagenser til pH-justering
- Flokkulering
- Slip en omrøring magnet i vandet, sæt magnetomrører ved maksimal hastighed, og tænde den. Sørg for, at omrørings magneten begynder at dreje.
- Der tilsættes 10 mL destilleret vand til et proces kontrolrør. Vend røret et par gange for at rehydrere den virale bestand og hæld opløsningen i vandet.
- Hæld indholdet af en prøve konditionerings pose i vandet og rør i 5 min.
- Mål pH-værdien af vandprøven ved hjælp af pH-indikator strimler. Tilsæt et par dråber citronsyre eller natriumhydroxid til vandprøven for at sikre, at pH-værdien ligger mellem 3,4 og 3,6. Tilsæt mindre mængder citronsyre og natriumhydroxid, da pH nærmer sig 3,5.
- Der tilsættes 100 mL PSM-opløsning ved hjælp af en 100 mL beholder.
- Forsegl spanden med låget, sæt magnetomrører med minimal hastighed, og lad vandet omrøring i 8 timer.
- Sluk for magnetomrører og lad vandet stadig i mindst 5 h at tillade partikler at bosætte sig.
- Floc kollektion
- Byg et opsugning system bestående af en pipette regulator, to pipetter og et plastik rør, for at aspirere vand supernatanten til udledning af vandet på flocs.
- Fastgør en 10 mL tape-end-pipette til pipette regulatoren. Fastgør derefter spidsen af pipetten til plastik røret.
- Fjern filteret af en 10 mL pipette med åben spids ved hjælp af en pincet og fastgør pipetten til plastik røret.
- Placer en tom spand på gulvet.
- Sænk spidsen af den åbne pipette i vandet. Sørg for at holde det tæt på vandoverfladen for at undgå at forstyrre flocs. Aspirér vand supernatanten, indtil den når tape-end-pipetten.
- Knib plastik røret ved enden, der er fastgjort til tape-end-pipetten, og frigør den fra pipetten.
- Anbring røret i en tom spand. Slip trykket på røret for at lade vandet flyde ind i den tomme spand.
- Knib plastik røret for at standse vandstrømmen, når vandstanden er ved at nå omrørings magneten, og Flyt pipetten væk fra spanden.
- Ryst spanden for at resuspendere partikler og hæld dem i en 500 ml stand-up plastikpose. Lad partikler at nøjes med 1 h mere.
- Aspirér forsigtigt vand supernatanten ved hjælp af en 50 mL pipette og en manuel pipette regulator, så du undgår at forstyrre flocs.
- Indsug partikler med en 100 ml pipette og overfør dem til et 50 ml gradueret centrifugeglas. Notér den endelige mængde prøve koncentrat, og Overfør 1 mL af den til et 5 mL rør, der indeholder konserveringsmidlet, ved hjælp af en Pasteur-pipette.
Bemærk: det er vigtigt, at centrifugeglasset er gradueret, så det endelige volumen af den koncentrerede prøve kan måles så nøjagtigt som muligt og registreres. - Udfør nukleinsyre ekstraktionen i marken. Alternativt opbevares den konserverings opløsning, der indeholder virusser ved 20-30 °C i op til 15 dage, eller sender dem til et referencelaboratorium til yderligere analyse.
- Byg et opsugning system bestående af en pipette regulator, to pipetter og et plastik rør, for at aspirere vand supernatanten til udledning af vandet på flocs.
- Bortskaffelse af affald og genbrug af materialer
- Tilsæt indholdet af et neutraliserende middel brev til spanden, der indeholder det kasserede vand. Bland vandet, og derefter, lad det stadig i 30 min.
- Bortskaf det behandlede vand som almindeligt affald.
- Placer pipetterne og plastik røret inde i spanden. Fyld spanden med vand og hæld indholdet af et neutraliserende middel i posen.
- Vask dem i mindst 30 minutter for at sterilisere dem og skyl dem med rigeligt rent vand for at fjerne eventuelle resterende neutraliserende middel.
3. nukleinsyre ekstraktion
Bemærk: brug handsker og bær altid beskyttelsesbriller under nukleinsyre ekstraktions proceduren.
-
Magnetisk pipette funktion
- Bliv fortrolig med driften af magnet pipetten, før du udfører ekstraktionen.
-
Nukleinsyre ekstraktion
- Arranger rørene med de reagenser, der kræves til ekstraktionen i et rack, fra venstre mod højre: bindings buffer, vaske buffere og elueringsbuffer. Indstil det korrekte antal rør i henhold til antallet af prøver eller replikater, der analyseres.
- 1 mL prøve koncentrat overføres til røret, der indeholder bindings bufferen, ved hjælp af en engangs-Pasteur-pipette. Vend røret 8x til 10x for at homogenisere opløsningen.
- Opløsningen inkubates ved stuetemperatur i 10 minutter, mens den kontinuerligt blandes, enten ved hjælp af en soldrevet orbital eller manuelt.
- Saml de magnetiske partikler ved hjælp af den magnetiske pipette og en ren spids, som kan genbruges til de tre vaske buffere.
- De magnetiske partikler frigives i røret, der indeholder 500 μL vaskebuffer 1. Vask dem ved forsigtigt at ryste opløsningen med spidsen for 30 s og indsamle dem.
- De magnetiske partikler overføres til røret, der indeholder 600 μL vaskebuffer 2. Vask dem ved forsigtigt at ryste opløsningen med spidsen for 30 s og indsamle dem.
- De magnetiske partikler overføres til røret, der indeholder 200 μL vaskebuffer 3. Vask dem ved forsigtigt at ryste opløsningen med spidsen for 30 s og indsamle dem.
- Frigør de magnetiske partikler i røret, der indeholder elueringsbufferen, og kassér spidsen.
- Opløsningen inkubates ved stuetemperatur i 5 minutter, mens den kontinuerligt blandes ved hjælp af den soldrevne orbital.
Bemærk: blanding af magnetiske partikler i elueringsbufferen er et afgørende skridt. I tilfælde af manglende en orbital, kontinuerligt blandes i hånden under inkubationstiden. - Udskift spidsen på magnet pipetten med en ny, og Saml de magnetiske partikler fra elueringsbufferen. Sørg for at fjerne de magnetiske partikler helt fra elueringsbufferen, da de kan forstyrre molekylære detekteringsmetoder.
- Kassér spidsen med de partikler, der er fastgjort til den. Fortsæt med PCR-analysen, Send elueringsbufferen til et referencelaboratorium, eller Opbevar elueringsbufferen i ved 4 °C for yderligere analyse.
4. viral detektion med en batteridrevet otte-tube real-time termo cycler
Bemærk: brug handsker og bær altid beskyttelsesbriller under nukleinsyre detekterings proceduren. Udskift handskerne for nye, når du udfører et nyt PCR-eksperiment for at undgå krydskontaminering.
-
HAdV kvantitativ PCR
- Tilsæt 14 μL nuklease frit vand til rør 2, 4 og 5.
- Tilsæt 4 μL PCR mix til rør 1-5.
- Der tilsættes 14 μL nukleinsyre ekstraktion fra prøve A til tube 1 og 14 μL fra prøve B til tube 3.
- Der tilsættes 2 μL ekstraherede nukleinsyre fra prøve A til tube 2 og 2 μL fra prøve B til Tube 4. Luk den femrørs strimmel.
- Tilsæt 14 μL nuklease frit vand til rør 6, 7 og 8.
- Tilsæt 4 μL af denne blanding til rør 6, 7 og 8, og luk dem.
- Sæt begge strimler i termocycleren, og vælg den relevante løbetur (tabel 3).
- Kassér vandrøret og opbevar den ekstraherede nukleinsyre i fryseren, hvis det er muligt, eller, hvis dette ikke er tilfældet, på et frisk sted beskyttet mod lys, hvis der skal udføres en anden test.
- Rengør mikropipetterne, stativet, Arbejdsmaterialet og alt materiale korrekt med en nukleinsyre renser, og kassér plastikposen med den brugte spids, handsker og rør.
Forsigtig: nukleinsyre Remover er en meget Brandfarlig væske og damp. Du må ikke trække vejret i spray tågen og undgå enhver kontakt af væsken med øjnene eller huden. Ellers skylles straks med rigeligt vand og søger lægehjælp. - Indsamle resultaterne og analysere de opnåede data.
-
MS2 kvantitativ PCR
- Tilsæt 14 μL nuklease frit vand til rør 2, 4 og 5.
- Tilsæt 4 μL PCR mix og 0,5 μL reverse transkriptase enzym til rør 1-5.
- Der tilsættes 14 μL nukleinsyre ekstraktion fra prøve A til tube 1 og 14 μL fra prøve B til tube 3.
- Der tilsættes 1 μL ekstraherede nukleinsyre fra prøve A til tube 2 og 1 μL fra prøve B til Tube 4. Luk den femrørs strimmel.
- Tilsæt 15,5 μL nuklease frit vand til rør 5, 6, 7 og 8, og luk dem.
- Tilsæt 4 μL PCR mix og 0,5 μL reverse transkriptase enzym til rør 6, 7 og 8.
- Sæt begge strimler i termocycleren, og vælg den relevante løbetur (tabel 3).
- Fortsæt som beskrevet i trin 4.1.8 til 4.1.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodeudvikling
Denne procedure er blevet udviklet i laboratoriet af vira forurenende stoffer af vand og mad med samarbejde med GenIUL og Oxfam Intermón. Det består af tre forskellige trin. Den første, viral partikelkoncentration, er en tilpasning af en skummetmælk flokkulering metode tidligere beskrevet12,17,18. Den oprindelige metode blev ændret for at være uafhængig af en strømforsyning, enklere og uden Centrifugerings trin.
Genfinding af den VirWaTest koncentrations metode blev afprøvet i prøver af HAdV og MS2 bakteriophage-spidsede grundvandsforekomster. Den virale restitution af den Virwateste koncentrations-og ekstraktionsmetode blev anslået til 3,01% til 18,02% for MS2 og 17,52% til 44,22% for HAdV. Disse inddrivelser blev beregnet ud fra de værdier, der blev opnået ved kvantitativ PCR under udviklingen af metoden sammenlignet med de oprindelige koncentrationer af HAdV og MS2 i vandprøverne efter spiking dem med kendte koncentrationer af disse virale bestande.
Den virwatest magnetiske nukleinsyre ekstraktion blev sammenlignet med en kommerciel RNA mini Kit (f. eks, qiaamp viral RNA mini Kit), en kolonne-baseret ekstraktionsmetode, der anvendes i laboratoriet, ved at teste 33 flod og grundvands prøver spidse med hadv og MS2 og koncentreret af skummetmælkflokkulering. Sammenligningsresultaterne viste, at den VirWaTest metode bedring var højere i 23/33 tilfælde for HAdV, samt for MS2 (tabel 4). En Wilcoxon-test viste p-værdier på 0,0005569 for hadv og 0,02791 for MS2. VirWaTest nukleinsyre ekstraktion giver betydeligt højere viral inddrivelser end den kommercielle en.
Påvisning af HAdV i miljømæssige vandprøver koncentreret efter den VirWaTest metode
For at teste den udviklede metode for viral koncentration i marken, Oxfam vand, sanitet og hygiejne (vask) hold, beliggende i Banghi (RCA) i marts 2017, indsamlede og koncentrerede vira fra fem brøndvand prøver.
Også i området Pedernales (Ecuador), som blev ramt af jordskælv i 2016 og 2017, seks brøndvand prøver blev indsamlet af en Oxfam vask hold i februar 2017, og dens vira var koncentreret af den VirWaTest koncentrations metode. Viral koncentrater fra begge indstillinger blev sendt til laboratoriet i Barcelona for VirWaTest nukleinsyre ekstraktion og viral kvantificering.
I Ecuador blev naturligt forekommende HAdV påvist i seks ud af de seks analyserede prøver med koncentrationsværdier fra 3,27 x 101 til 1,80 x 102 GC/L, hvorimod en ud af de fem indsamlede og koncentrerede i banghi (RCA) testede positiv for HAdV ved en koncentration på 3,46 x 102 GC/L (tabel 5).
MS2, føjet til alle testede prøver som intern proceskontrol, blev påvist i alle testede prøver, der viser, at metoden blev korrekt udført fra koncentration til detektion.
Figur 1 : Virwatest metode. Oversigt over de trin, som metoden VirWaTest består af. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Materialer | Koncentration | Nukleinsyre ekstraktion | Påvisning |
| Udstyr | Magnetomrører (2 enheder) Batteri (2 enheder) Batteri/omrører stik (2 enheder) Strømadaptere (2 enheder) Skovl støtte (2 enheder) Reb (1 enhed) Omrøring magnet (3 enheder) Tweezers (1 enhed) Silicon Tubing (1 enhed) Pipette regulator (1 enhed) Markør (1 enhed) |
Magnetisk pipette (1 enhed) Solar Rotary platform (1 enhed) Multi-size tube rack (1 enhed) Timer (1 enhed) |
Termo cycler (1 enhed) Batteri (1 enhed) Computer Rørstativ (1 enhed) 0,5 μL-10 μL mikropipette (1 enhed) 2 μL-20 μL mikropipette (1 enhed) |
| Hjælpematerialer og reagenser (for hver 2 vandprøver/replikater) | Spand (3 enheder) pH-indikator strimler Tape-end 10 mL pipette (2 enheder) 10 mL pipette med åben spids (2 enheder) Tape-end 50 mL pipette (2 enheder) Tape-end 100 mL pipette (2 enheder) Pasteur-pipette (4 enheder) Stand-up plastikpose (4 enheder) Plastikbeholder med 25 mL destilleret vand (1 enhed) Plastikbeholder med 50 mL destilleret vand (1 enhed) 100 mL tom beholder (1 enhed) Handsker (6 par) Proceskontrol (2 rør) Rør med 10 mL destilleret vand (2 enheder) Citronsyre (1 Tube) Natriumhydroxid (1 Tube) Skummetmælk (1 Tube) Citronsyre brev (1 enhed) Destilleret vand (1 500 mL flaske) Prøve konditionering (2 breve) Konserveringsmiddel opløsning (2 rør) Neutraliserende middel (4 breve) |
Magnetiske pipette spidser (2 enheder) Pasteur-pipette (2 enheder) Bindings buffer (2 rør) Vaske buffer 1 (2 rør) Vaske buffer 2 (2 rør) Vaske buffer 3 (2 rør) Elueringsbuffer (2 rør) Handsker (6 par) |
10 μL mikropipette spidser (1 boks) 20 μL mikropipette spidser (1 boks) DNA qPCR mix (1 Tube) RNA qPCR mix (1 Tube) Reverse transkriptase enzym (1 Tube) Molekylær biologi vand (1 Tube) HAdV tube Strip med Primers, Probe og standard (1 enhed) MS2 tube Strip med Primers, Probe og standard (1 enhed) Nukleinsyre Remover Handsker (6 par) |
Tabel 1: VirWaTest indhold. Udstyr, hjælpematerialer og reagenser, der skal forberedes til koncentration, ekstraktion og påvisning af vira i to vandprøver/replikater.
| Virus | Primere | Genbanks Tiltraedelsesnr. | Position | Sekvens (5 ' \u20123 ') | Længde | Reference | ||
| Human adenovirus (HAdV) | Adf | J 01917.1 | 18869\u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19 | Hernroth et al., 200215 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | CRCGGGCRAAYTGCACCAG | 19 | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| MS2 Bacteriophage (MS2) | pecson-2F | NC_001417.2 | 344 \ u2012363 | AAGGTGCCTACAAGCGAAGT | 20 | Pecson et al., 200916 | ||
| pecson-2R | 659 \ u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 | |||||
| PecP-2 | 369 \ u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
Tabel 2: oligonukleotider for kvantitative PCR-eksperimenter. Primere og sonde designet til at binde sig til nukleinsyresekvenser af HAdV og MS2.
| Temperatur | Tid | Cykler | Temperatur | Tid | Cykler |
| 95 °C | : 12 minutters | 1 | 55 °C | : 15 minutters | 1 |
| 95 °C | 10 min | 1 | |||
| 95 °C | 15 s | 40 | 95 °C | 15 s | 40 |
| 60 °C | 1 min | 60 °C | 1 min |
Tabel 3: termiske betingelser for kvantitative PCR-eksperimenter. Temperatur, tid og cyklusser, der anvendes til HAdV og MS2 amplifikation.
| QIAgen | VirWaTest | QIAgen | VirWaTest | ||
| Median | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| Mener | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| p-værdi (Wilcoxon) for HAdV: 0,0005569 | |||||
| p-værdi (Wilcoxon) for MS2:0,02791 | |||||
| Virus testet | Testede prøver | QIAgen | VirWa test | ||
| HAdv | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
Tabel 4: VirWaTest nukleinsyre udvinding udvikling. Median, middelværdi og SD-værdier opnået ved sammenligning af Qiagen og VirWaTest ekstraktionsmetoder i 33 grundvands prøver for HAdV og MS2.
| Land | Websted | Prøve | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 | Nd |
| Ile Bongossoua, Village 1 | 2 | Nd | |
| Ile Bongossoua, Village 3 | 3 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Fondo | 4 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Yambassa | 5 | 3,64 x 102 | |
| Ecuador | Borehul A | 6 | 7,96 x 101 |
| Borehole B | 7 | 1,80 x 102 | |
| Borehul C | 8 | 8,88 x 101 | |
| Godt vand A | 9 | 6,06 x 101 | |
| Well Water B | 10 | 1,12 x 102 | |
| Brøndvand C | 11 | 3,27 x 101 |
Tabel 5: kvantificering af HAdV ved anvendelse af den VirWaTest metode. Kvantitative PCR-resultater, udtrykt i GC/liter, for HAdV kvantificeret i vandprøver indsamlet og koncentreret fra RCA og Ecuador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den VirWaTest metode gør det muligt at koncentrationen af vira og nukleinsyre ekstraktion fra vandprøver på det tidspunkt, hvor de ikke-erfarne brugere bruger. Det er en overkommelig, hurtig og enkel protokol. Koncentrationen er baseret på princippet om organisk flokkulering ved hjælp af skummetmælk, hvormed de lave pH-og høje ledningsevneforhold gør skummetmælks proteiner samlet i partikler, hvor virusser adsorberer til. Når partikler sediment, er det let at samle dem, hvilket gør det muligt at koncentrere 10 L vand, hvorimod traditionelle ultracentrifugering ikke kan håndtere store vandmængder.
Metoden er blevet ændret for at være praktisk gennemførlig på prøvetagningsstedet uden brug af elektrisk udstyr, bortset fra en batteridrevet magnetomrører. Nogle andre tilgange baseret på vand filtrering er blevet tilpasset til koncentrationen af virus og kan også udføres på det punkt af brug. Men, suspenderet materiale til stede i vandprøver ofte træsko filtrene; således er den lille mængde, der kan være koncentreret med disse systemer er en alvorlig begrænsning.
Dette er den første beskrivelse af en metode til koncentrering af vira fra vandprøver på anvendelsesstedet, uanset prøvens turbiditet. Den VirWaTest koncentrations metode gør det muligt at behandle flere prøver samtidigt, hvis det relevante materiale er tilgængeligt. Desuden har det vist sig, at skummetmælk flokkulering er nyttig for bakterier og parasisite koncentration19.
Forberedelsen af det relevante materiale er afgørende for at udføre proceduren korrekt. Overvej antallet af vandprøver, der skal analyseres, og Forbered reagenserne og materialet, før de flyttes til det sted, hvor testen er nødvendig til fremstilling af reagenser og materiale. Flere prøver kan behandles på samme tid, hvis den relevante mængde materiale er til rådighed.
Før koncentrationen af en vandprøve påbegyndes, vil en kendt koncentration af en viral bestand blive anvendt til at Spike prøven som proceskontrol. Denne metode anvender en tørret viral bestand, som er rehydreret med destilleret vand, før den tilsættes til vandprøven på brugsstedet. Dette er nyttigt for at udelukke falsk-negative resultater ved afslutningen af proceduren og giver en indikation af metodens ydeevne.
Virale koncentrater opnået med de VirWaTest kan testes yderligere i marken, der anvender de VirWaTest nukleinsyre ekstraktions-og detektionsmetoder, eller alternativt kan koncentrater sendes til et referencelaboratorium ved stuetemperatur. Den konserverings opløsning, som tilsættes koncentratet, gør det muligt for virusser at forblive stabile i op til 2 uger (ikke offentliggjorte resultater).
VirWaTest nukleinsyre ekstraktion er en magnetisk partikel-baseret metode. Det er nemt og hurtigt og tillader flere prøver at blive behandlet på samme tid og viser tilsvarende og endnu bedre nyttiggørelse effektivitet end metoder, der i øjeblikket anvendes til viral nukleinsyre ekstraktioner. Nukleinsyrer kan sendes til referencelaboratorier ved stuetemperatur, eller hvis brugerne er sikre på at udføre molekylær detektion, kan der udføres en kvantitativ PCR-analyse på det sted, hvor den oprindelige vandprøve anvendes.
Også, hvis en lille laboratorium facilitet er til rådighed, den VirWaTest koncentrations protokol kan kobles til standard nukleinsyre ekstraktions kits, der afhænger af en centrifuge og standard PCR-baserede metoder, der kræver en fryser til at vedligeholde reagenserne, men at bruge standard termo cyklere, som er billigere end batteridrevne.
Men da en strømforsyning er nogle gange ikke tilgængelig, vi har optimeret påvisning assays for MS2 Bakteriofager som proceskontrol og HAdV som en viral fækal indikator, og metoden kan tilpasses til enhver anden virus af interesse, såsom hepatitis vira, RoV, NoV eller andre, der skal køres i marken uden at behøve en fryser til vedligeholdelse af reagenserne, eller konventionelle termocyclere, men kun en batteridrevet en. Flere batteridrevne termo cyclere er kommercielt tilgængelige. Alternativt kan der anvendes andet konventionelt qPCR-udstyr, hvis der er en strømforsyning til rådighed. Hvis der anvendes en otte-rørs termocycler, kan op til to nukleinsyre ekstraktioner (to forskellige prøver eller to replikater fra samme prøve) testes i samme PCR-analyse. For hver nukleinsyre ekstraktion vil to forskellige mængder blive afprøvet for at udelukke enzymatisk hæmning, der stammer fra prøven. Tilpasningen er baseret på den tidligere tilberedning af PCR-rør ved lufttørring af primere, sonder og standard suspensioner. Der findes flere lyofiliserede kommercielle qPCR-løsninger, som kan anvendes ved anvendelse af samme procedure som beskrevet her. Vi har beskrevet en mulighed, som vi anså for at være let at udføre.
Sammenlignings analyser udført under udviklingen af metoden viste, at de mest Virwateste metoder til koncentration, ekstraktion og detektion er effektive til kvantificering af vira i vandprøver.
Detektionsgrænsen (LOD) for den beskrevne procedure er variabel, da den mængde, der indsamles efter koncentrationen, er variabel. Også, den LOD kan være lidt anderledes for forskellige vira. Hvis der opsamles et volumen på ca. 10 L, vil LOD for HAdV være ca. 1 x 102 viral GC/l. Så, relativt små koncentrationer af HAdV kan påvises ved den VirWaTest metode. I Pedernales (Ecuador) præsenterede seks af de seks testede prøver HAdV i koncentrationer tæt på LOD, der spænder fra 3,27 x 101 til 1,80 x 102 GC/L. I Banghi (RCA) blev HAdV påvist i en ud af de fem analyserede prøver ved en koncentration på 3,46 x 102 GC/L. Tilstedeværelsen af HAdV, samt tilstedeværelsen af MS2 som kontrolprocessen i de testede prøver, viser metoden er nyttig til genopretning af virale partikler fra vandprøver, selv når de udføres af nonerfarne brugere.
Tilbagemeldinger opnået indtil nu indikerer, at viral koncentration er en nem procedure til at udføre, uden større problemer, når den anvendes på det punkt af brug af prøverne, selv om 8 h og 5 h trin er påkrævet. Det er vigtigt at bemærke, at disse trin sker uden menneskelig assistance. Desuden er en hurtigere metode baseret på filtrering er ved at blive udviklet som et alternativ til nonturbid vand. Men flokkulering synes at være, indtil nu, den unikke metode, der tillader koncentrationen af prøver præsenterer høj turbiditet. Virale koncentrater kan derefter sendes til ethvert laboratorium rundt om i verden ved stuetemperatur, hvilket også gør det lettere at teste vira, da prøvetagningsområder ikke altid har gode transporttjenester, der giver køle betingelser. Alternativt kan de ekstraktions-og detekterings protokoller, der præsenteres her, tillade testning for viral detektion på det sted, hvor prøverne anvendes.
Så vidt vi ved, dette er den første metode, der rapporteres at være nyttige for koncentrationen og testning for tilstedeværelsen af virus i vandprøver i marken. Der bør gøres en yderligere indsats for at anvende proceduren til vurdering af tilstedeværelsen af humane virale patogener af interesse i flere andre humanitære krisescenarier. Også brugerens feedback vil være nødvendigt at give indsigt i den potentielle implementering for at gøre proceduren venligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
VirWaTest var et forskningsprojekt finansieret af HIF (humanitært innovationsfond) program for ELHRA (styrkelse af lærings & forskning for humanitær bistand). Forfatterne anerkender de vaske hold, der venligt samarbejdede i denne undersøgelse. Analysen af prøverne i Ecuador blev finansieret af Oxfam Ecuador og Dirección de Investigaciones de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas er en Serra-Hunter-stipendiat ved universitetet i Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
